Rolul esențial al histonei metiltransferazei G9a în plasticitatea indusă de cocaină (2010)

Versiunea editată finală a acestui articol este disponibilă la Ştiinţă
Vezi alte articole din PMC că citează articolul publicat.

Abstract

Modificările induse de cocaină în expresia genelor provoacă modificări ale morfologiei și comportamentului neuronal care pot sta la baza dependenței de cocaină. Am identificat un rol esențial pentru dimetilarea histonei 3 lizina 9 (H3K9) și lizina dimetiltransferaza G9a în plasticitatea structurală și comportamentală indusă de cocaină. Administrarea repetată de cocaină a redus nivelele globale de dimimelare H3K9 în nucleul accumbens. Treducerea lui în metilarea histonei a fost mediată prin reprimarea G9a în această regiune a creierului, care a fost reglată de factorul de transcripție indus de cocaină ΔFosB. Folosind mutageneza condiționată și transferul de gene mediate viral, am constatat că reducerea reglajului G9a a mărit plasticitatea dendritică a coloanei vertebrale a neuronilor nucleului accumbens și preferința crescută pentru cocaină, stabilind astfel un rol crucial pentru metilarea histonei în acțiunile pe termen lung ale cocainei.

Introducere

Repetarea expunerii la cocaină se caracterizează prin modificări persistente în expresia genelor și modificarea morfologiei neuronale în nucleul accumbens (NAc), o componentă cheie a circuitului recompensat al creierului (1-2). Remodelarea cromatinei este importantă în modificările transcripționale aberante în această regiune a creierului, care pot sta la baza aspectelor legate de dependența de cocaină (3-9). Reglarea cu cocaină a structurii cromatinei în NAc rezultă, în parte, din modificările induse de cocaină directă ale mașinilor enzimatice cromatinei, ceea ce duce la modificări în acetilarea și fosforilarea histonei4, 7-9); cu toate acestea, rolurile pentru enzimele care controlează metilarea histonului nu au fost încă investigate.

O analiză recentă a promotorului la nivelul genomului, utilizând imunoprecipitarea cromatinei cuplată la microarrays (ChIP-Chip), a identificat modele modificate de metilare a histonei H3 lizină 9 (H3K9) și 27 (H3K27) la promotori genei specifice în NAc după tratamentul repetat cu cocaină6). Prin urmare, am elaborat numeroase metiltransferaze de lizină (KMT) și demetilaze (KDM) care sunt cunoscute pentru a controla metilarea H3K9 sau H3K27 (Fig. 1A). Numai două enzime, G9a și GLP, au prezentat o reglare transcripțională persistentă timp de 24 după administrarea repetată de cocaină, când expresia ambelor gene a fost semnificativ scăzută. Deoarece G9a și GLP catalizează în mod specific dimimelarea H3K9 (H3K9me2), reglarea lor în jos de către cocaină este în concordanță cu scăderea nivelurilor globale de H3K9me2 eucromatice observate la acest moment (Fig. 1B). În contrast, nivelurile globale de metilare heterocromatică H3K27 au rămas neschimbate prin expunerea repetată la cocaină (Imagine S1 în susținerea materialului online). Datorită nivelului ridicat de activitate catalitică, atât in vitro și in vivo (10), ne-am propus sa investigam in continuare semnificatia functionala a represiunii G9a dupa expunerea repetata la cocaina in NAc. Nivelurile de proteine ​​G9a, la fel ca nivelele ARNm, au fost reduse semnificativ 24 ore după administrarea repetată de cocaină (Imaginea S2). Deși expresia ARNm G9a a fost redusă cu 35% în NAc, analiza imunohistochimică a relevat o reducere mai redusă cu 15% a nivelurilor de proteine ​​G9a, în concordanță cu scăderea 21% observată în H3K9me2 după administrarea repetată de cocaină (Fig. 1B). Expresia mRNA G9 a fost, de asemenea, scăzută în această regiune a creierului cu 20% după administrarea repetată de cocaină (Imaginea S3).

Fig. 1  

Cocaina repetată reprimă expresia G9a în NAc printr-un mecanism dependent de ΔFosB. (A) expresia mRNA a H3K9 / K27 KMTs și KDMs în NAc 24 hr după cocaina repetată. (B) Nivelurile H3K9me2 în NAc 24 hr după cocaina repetată. (C) Analiza genei ...

Pentru a identifica dacă modificările în H3K9me2 eucromatice se corelează cu modificările genomului în expresia genică în NAc, am folosit analize microarray pentru a examina profilurile expresiei genelor induse de o doză de provocare de cocaină la animale cu sau fără antecedente de expunere anterioară la cocaină gena listele în Tabele S1-S3). Animalele care au primit cocaina repetată au prezentat o creștere drastică a expresiei genelor timp de 1 după o provocare de cocaină în comparație cu animalele tratate acut (Fig. 1C). Această expresie crescută a genei a apărut încă ca răspuns la o provocare de cocaină dată după săptămâna 1 de retragere din cocaina repetată. În concordanță cu rapoartele anterioare, un procent mic de gene (~ 10%) a prezentat răspunsuri transcripționale dezagregate după administrarea repetată de cocaină (Fig. 1C; vedea Tabelul S1) (5). Pentru a investiga direct rolul reducerii G9a în expresia genei îmbunătățită observată după cocaina repetată, șoarecii au primit injecții intra-NAc ale vectorilor virusului Herpes simplex (HSV) care exprimă GFP sau G9a și au fost tratați cu soluție salină sau cocaină repetată pentru a determina dacă supraexprimarea G9a a fost suficientă pentru a bloca amplificarea indusă de cocaina repetată a expresiei genei. Dintr-un set de gene 12 selectate aleatoriu care prezintă niveluri crescute de exprimare după cocaina repetată, am observat că G9a a redus semnificativ expresia crescută a 50% din aceste gene (Tabelul S4).

Pentru a identifica evenimentele transcripționale din amonte care mediază represiunea repetată indusă de cocaină a expresiei G9a, am investigat un rol posibil pentru ΔFosB, un produs de îmbinare extrem de stabil al genei imediate fosB. ΔFosB se acumulează în NAc după expunerea repetată la cocaină, unde a fost legată de creșterea recompenselor de cocaină (11). ΔFosB poate acționa fie ca un activator transcripțional, fie ca represor în funcție de gena țintă implicată (3, 5, 6, 12). Utilizând NSE-tTA X tetOP-ΔFosB șoareci, în care expresia ΔFosB poate fi indusă selectiv în NAc și striatumul dorsal al animalelor adulte (13), am examinat impactul expresiei ΔFosB asupra controlului cocainei asupra H3K9me2 și KMTs în NAc. Supraexpresia ΔFosB a fost suficientă pentru a reduce nivelurile ambelor H3K9me2 (Fig. 1D) și expresia G9a (Fig. 1E), mimetizând astfel efectele cocainei repetate. În contrast, ΔFosB nu a redus expresia GLP în această regiune a creierului și nu a avut niciun efect asupra SUV39H1 și EZH2, principalele enzime trimetilare pentru H3K9 și respectiv H3K27 (Imaginea S4). Pentru a confirma aceste date utilizând un sistem independent de supraexprimare ΔFosB, șoarecii adulți de tip sălbatic au primit injecții intra-NAc bilaterale de vectori ai virusului adeno-asociat (AAV) care exprimă fie GFP, fie ΔFosB. Supraexpresia mediată de virusul ΔFosB a scăzut nivelurile expresiei G9a în această regiune a creierului (Fig. 1E).

O astfel de reglementare pronunțată și specifică a G9a ne-a determinat să investigăm dacă modificarea expresiei G9a specifică în neuronii NAc reglează răspunsurile comportamentale la cocaină. Soarecii de tip sălbatic au primit injecții intra-NAc ale vectorilor HSV care exprima GFP sau G9a și au fost apoi analizați utilizând o paradigmă de preferență de preferință a locului condiționat de cocaină, care oferă o măsură indirectă a recompensei de droguri. Supraexpresia virală a G9a în neuronii NAc a fost confirmată după testarea comportamentală (Fig. 2A). Supraexpresia G9 a scăzut semnificativ preferința pentru cocaină în comparație cu animalele care supraexprimă GFP (Fig. 2B) și nivelurile crescute de H3K9me2 în NAc (Fig. 2C). Supraexpresia unui mutant catalitic mort de G9a (G9aH1093K) (14) nu a afectat preferința de cocaină (Fig. 2B) și nu a avut nici un efect asupra nivelurilor de H3K9me2 din această regiune a creierului (Fig. 2C).

Fig. 2 

G9a din NAc reglementează plasticitatea comportamentală indusă de cocaină. (A) Imaginea reprezentativă a expresiei transgene mediate de HSV în NAc. Desenul cu creionul creierului coronarian a fost preluat din atlasul creierului mouse-ului. (B) Condiții preferate de locație pentru cocaină și ...

Pentru a studia în continuare rolul G9a în efectele comportamentale ale cocainei și, mai precis, pentru a imita represiunea repetată indusă de cocaină a expresiei G9a în NAc, adultul G9afl / fl șoareci (14) au primit injecții intra-NAc ale vectorilor AAV care exprimă Cre recombinază sau GFP ca un martor. Reducerea AAV-Cre a G9a în NAc, care a fost confirmată imunohistochimic (Imaginea S5), au crescut semnificativ efectele cocainei în experimentele de condiționare și au scăzut nivelurile de H3K9me2 în NAc (Fig. 2D, E). Un inhibitor farmacologic disponibil în comerț al G9a și GLP, BIX01294 (15-16), a fost utilizată pentru a stabili dacă inhibarea enzimei afectează în mod similar răspunsurile comportamentale la cocaină. Într-adevăr, inhibarea farmacologică a G9a și GLP a crescut semnificativ preferința pentru cocaină și a scăzut H3K9me2 în NAc (Figura 2F, G).

Administrarea repetată de cocaină crește densitatea coloanei dendritice pe neuronii spinoși ai NAc (17), un proces asociat cu modificări funcționale la sinapsele glutamatergice excitatorii asupra acestor neuroni (18-19) și răspunsurile comportamentale sensibilizate la medicament (17, 20). Am presupus astfel că reducerea reglării activității G9a în NAc prin cocaina repetată ar putea media capacitatea cocainei de a regla densitatea dendritică a coloanei vertebrale a neuronilor NAc. Folosind imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) cu un anticorp anti-G9a, am identificat mai multe ținte de gene G9a presupuse în NAc, fiecare dintre acestea fiind implicate anterior în plasticitatea dendritică indusă de cocaină (Fig. 3A) (20-26). Am constatat că administrarea repetată de cocaină a redus semnificativ legarea de G9a, precum și nivelurile de H3K9mexNUMX, la acești promotori genetici (Fig. 3B). În contrast, administrarea acută de cocaină a recrutat rapid G9a la unii dintre acești promotori genetici, în concordanță cu expresia G9a crescută observată în timpul NAc 1 după o doză acută de cocaină (Imaginea S6). Deși legarea G9a la promotori genei specifice se corelează cu modificările expresiei sale, rămâne neclar dacă astfel de evenimente sunt mediate de nivele globale modificate de G9a în NAc și / sau de diferențele în recrutarea G9a ca urmare a acută Raport administrarea repetată de cocaină.

Fig. 3  

G9a din NAc reglementează plasticitatea coloanei dendritice indusă de cocaină. (A) Cantitate G9a ChIP în NAc de la animale tratate acut sau în mod repetat cu cocaină, la 1 sau 24 hr, respectiv. APRT a fost utilizat ca un control negativ. Datele sunt prezentate ca fiind rude ...

Bazandu-ne pe reglementarea G9a a numeroaselor gene legate de plasticitate in NAc, am examinat direct daca mentinerea expresiei G9a in aceasta regiune a creierului dupa tratamentul repetat cu cocaina a fost suficienta pentru a bloca formarea coloanei dendritice induse de cocaina. Folosind un protocol de tratament cu cocaină demonstrat anterior pentru a promova inducerea dendritică a coloanei vertebrale în NAc (20), am examinat densitatea coloanei vertebrale la animale injectate fie cu HSV-GFP, fie cu HSV-G9a. În concordanță cu constatările anterioare, am observat o creștere semnificativă a densității dendritice a coloanei vertebrale în NAc după tratamentul cu cocaină, un efect care a fost blocat complet prin supraexprimarea G9a (Fig. 3C). Supraexpresia cu G9a nu a fost suficientă pentru a reduce densitatea de coloană dendritică a NAc în absența cocainei. Pentru a completa aceste date, G9afl / fl șoarecii au primit injecții intra-NAc de HSV-Cre și densitatea coloanei vertebrale a fost cuantificată și comparată cu animalele care au primit HSV-GFP în absența cocainei. Knockdown expresiei G9a a crescut semnificativ densitatea coloanei vertebrale pe neuronii spinoși ai NAc (Fig. 3C).

Având în vedere dovezile că reducerea reglajului G9a în NAc după cocaina repetată este mediată de ΔFosB, am examinat în continuare dacă acest factor de transcripție este de asemenea implicat în reglarea coloanelor dendritice NAc. Deși ΔFosB nu a fost anterior legat cauzal de o astfel de plasticitate dendritică, mai multe dintre obiectivele sale, inclusiv subunitățile Cdk5 și NFκB, au fost atât de implicate (20-23), și expresia persistentă a ΔFosB în neuronii NAc corelează cu creșterea densității dendritice a coloanei vertebrale după tratamentul repetat cu cocaină (27). În primul rând, am constatat că inducerea ΔFosB la șoarecii bitransgenici în absența cocainei, care a redus expresia G9a și H3K9me2 (Fig. 1D, E), a scăzut legătura G9a cu numeroase gene legate de plasticitate, dintre care multe s-au dovedit a fi ținte directe ale ΔFosB (Fig. 3D) (3, 6). Mai jos am aratat ca supraexpresia virala a ΔFosB in NAc a crescut semnificativ densitatea dendritica a coloanei vertebrale in conditii bazale, similar cu cel observat după administrarea repetată de cocaină (Fig. 3E). În schimb, supraexprimarea în NAc a ΔJunD, o proteină dominantă mutantă negativă care antagonizează activitatea transcripțională a ΔFosB, a blocat capacitatea cocainei repetate de a crește formarea coloanei dendritice în NAc (Fig. 3C).

Observația noastră că ΔFosB reglează expresia G9a în NAc și că ΔFosB și G9a reglează unele dintre aceleași gene țintă ne-a determinat să examinăm alte interacțiuni între ΔFosB și G9a. După cocaina acută, când au fost crescute nivelurile G9a, legarea lui G9a la fosB gena a fost crescută, în timp ce după cocaina repetată, când expresia G9a a fost suprimată, G9a se leagă de fosB gena a fost redusă (Fig. 3A). Această reducere a legării G9a după repetarea cocainei nu a fost observată c-fos, unde legarea G9a este crescută prin repetarea cocainei (Imaginea S7). Acest lucru este în concordanță cu faptul că, spre deosebire de fosB, c-fos este reprimată, nu indusă, prin expunerea cronică la psihostimulant (5). Supraexpresia ΔFosB la șoarecii bitransgenici a fost suficientă pentru a reduce semnificativ legarea G9a la fosb gena (Fig. 3D). Mai mult, supraexpresia G9a a fost suficientă pentru a reduce expresia crescută a ΔFosB după administrarea repetată de cocaină (Tabelul S4). Aceste date sugerează o buclă de autoreglare prin care G9a limitează inițial inducerea ΔFosB prin administrarea acută de cocaină. Cu toate acestea, pe măsură ce ΔFosB se acumulează cu expunere repetată la medicament, acesta reprimă G9a și, prin urmare, potențează propria inducție suplimentară.

În concluzie, am demonstrat că metilarea histin lizinei în NAc este implicată critic în reglarea exprimării genelor neuronale ca răspuns la cocaină. Reprimarea G9a și H3K9me2 după administrarea repetată de cocaină promovează preferința de cocaină, parțial prin activarea transcripțională a numeroaselor gene despre care se știe că reglează forme aberante de plasticitate dendritică. Obținerea unei mai bune înțelegeri a genelor care sunt reglementate prin astfel de mecanisme va îmbunătăți cunoștințele noastre privind baza complexă biologică a dependenței de droguri și ar putea ajuta la dezvoltarea unor tratamente mai eficiente ale tulburărilor de dependență.

Materiale și metode

Animale și tratamente

Dacă nu se specifică altfel, șoarecii au fost adăpostiți între patru și cinci per cușcă într-o colonie cu un ciclu de lumină / întuneric 12 oră (lumini de la 7: 00 AM la 7: 00 PM) la o temperatură constantă (23 ° C) cu ad libitum accesul la apă și alimente. Toate protocoalele de animale au fost aprobate de IACUC la ambele UT Southwestern Medical Center si la Scoala de Medicina din Mount Sinai.

Pentru experimentele cu cocaină [imunohistochemie, Western blotting, PCR cantitativ (qPCR), analiza microarray și imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)] s-au utilizat șoareci C8BL / 10J de sex masculin în vârstă de 57-6. Animalele au primit injecții zilnice fie cu soluție salină (tratamentul cu 7 salină, ip), cocaina "acută" (tratamentul 6 salină + un tratament cu 20 mg / kg cocaină-HCI, ip) sau cocaina "repetată" cocaina-HCI, ip). Șoarecii au fost sacrificați fie la ora 7, fie la 20 ore după tratamentul final. Pentru studiile cu microarray, animalele au fost tratate zilnic fie cu soluție salină (tratamentul cu 1 salină, ip), cu cocaină "acută" (tratament 24 cu soluție salină + 15 14 mg / kg cocaină-HCI, ip) 1 tratamente cu soluție salină + 20 tratamente 7 mg / kg cocaină-HCl, ip) sau cocaina "retragere repetată + acută" (8 tratamente 20 mg / kg cocaină-HCl + tratamente cu 7 soluție 20 7 mg / kg cocaină- ip) și au fost sacrificați la ora 1 după tratamentul final. În experimentele comportamentale, șoarecii au fost adăpostiți individual după operație și au fost tratați cu 20 mg / kg de cocaină-HCI, ip așa cum este descris mai jos. Pentru analiza coloanei vertebrale dendritice și validarea microarray după infecția cu HSV-GFP și HSV-G1a-GFP, șoarecii au fost tratați cu "soluție salină" (soluție salină 10, ip) sau "repetată cocaină" (9 tratamente 5 mg / kg cocaină- ) pe parcursul zilelor 5, deoarece acest protocol de injectare a demonstrat anterior că crește densitatea coloanei vertebrale pe neuronii nucleului accumbens (NAc) în intervalul de timp al expresiei transgene a virusului Herpes simplex (HSV) (Suplimentar ref S1). Șoarecii utilizați pentru analiza coloanei dendritice au fost sacrificați timp de 4 de la ultimul tratament.

Pentru a induce deleția locală a transcripției G9a restrânsă la neuronii NAc, am folosit șoareci mutanți homozigoți pentru o alelă G9a floxed, care au fost descriși în detaliu în altă parte (S2). Recombinarea indusă de Cre produce exon 22 la 25 splicing out-of-frame, conducând la dezintegrarea mediată de nonsens a transcripției mutante. Am folosit șoareci G9a flotați care au fost complet reîncadrați la șoarecii C57BL / 6J. Șoarecii au fost injectați sterotaxic în vectorii NAc cu virusul adeno-asociat (AAV) (serotip 2) care exprimă GFP sau Cre-GFP între vârsta săptămânilor 7 și 10. Analiza imunohistochimică a fost utilizată pentru a verifica eficiența recombinării mediate de Cre (a se vedea Figura complementară S5). Am folosit AAV animale injectate la 21 zile postoperator, deoarece recombinarea la șoarecii G9a floxed a fost stabilă și maximă la acest moment dat, conform rapoartelor publicate (S3-S4). Experimentele de supraexprimare G9a și ΔJunD au fost realizate în mod similar folosind vectori de virus HSV care exprimă fie GFP, G9a-GFP de tip sălbatic, G9aH1093K-GFP mortal catalitic sau ΔJunD-GFP (vezi S2 pentru detalii privind dezvoltarea construcțiilor G9a). Șoarecii suprapresivi HSV au fost utilizați după 3 zile după operație, deoarece supraexprimarea a fost maximă la acest moment, așa cum s-a observat prin imunohistochimie. Datorită naturii tranzitorii a expresiei HSV și a naturii considerabil mai stabile a expresiei AAV, vectorii HSV au fost utilizați în experimente care necesită expresie transgenă rapidă, pe termen scurt, în timp ce vectorii AAV au fost utilizați în experimente care necesită perioade extinse de exprimare a transgenei. Ambii vectori s-au arătat, în studiile anterioare extinse, de a infecta numai corpurile celulare neuronale în zona creierului injectat, fără nici o infecție a neuronilor aferenți sau eferii.

Pentru experimentele comportamentale care utilizează inhibitorul farmacologic G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), șoarecii au fost implantați sterotaxic cu două mini-pompe subcutanate, precum și canule de ghidare bilaterale, în NAc. Mini-pompele au fost activate 12 ore înainte de implantare inițiând livrarea continuă (0.25 μl / oră) a fiecărui vehicul (5 hidroxipropil β-ciclodextrină) sau medicament pentru zile 14, timp în care au fost efectuate evaluări comportamentale.

Pentru experimentele de supraexprimare ΔFosB [Western blotting, qPCR și ChIP], NSE-tTA × tetOP-ΔFosB au fost utilizați șoareci (10 de o săptămână), în care, în absența derivatului de tetraciclină doxiciclină (8 săptămâni în afara doxiciclinei), animalele au prezentat o expresie constitutivă robustă striatală restrictivă a ΔFosBS5). Supraexpresia ΔFosB la acești șoareci a fost confirmată prin qPCR. Pentru a confirma rezultatele folosind NSE-tTA × tetOP-ΔFosB șoareci, șoareci de sex masculin C8BL / 57J cu vârstă de șapte săptămâni 6 au fost injectați intra-NAc sterotaxic cu vectori AAV care exprimă fie GFP, fie ΔFosB-GFP. Vectorii AAV au fost utilizați, în acest caz, pentru a asigura o exprimare maximală a ΔFosB la 8 săptămâni postoperator, permițând o comparație directă între șoarecii supraexprimați ΔFosB infectați și bitransgenici. Supraexpresia virală a fost confirmată utilizând qPCR la 8 săptămâni postoperator (pictorii NAc de calibru 15 au fost disecați sub locul injectării). AAV-GFP și AAV-ΔFosB-GFP șoareci supraexprimați care nu au fost utilizați pentru qPCR au fost tratați cu soluție salină (tratamentul 14 salină, ip) sau cocaină repetată (14 tratamente 30 mg / kg cocaină-HCI, ip) interventie chirurgicala. După 6 zile după tratamentul final, creierul a fost fixat cu 4% paraformaldehidă, secționat pe un vibratom și utilizat pentru analiza coloanei dendritice.

Analiza Western blot

14-gauge Navele NAc au fost luate din secțiuni coronale 1 mm obținute utilizând o matrice de creier de șoarece din oțel inoxidabil și au fost sonicate în tampon de liză 1 M HEPES (1% SDS) conținând inhibitori de protează și fosfatază. 10-30 μg de probe de proteină totală s-au supus electroforezei pe geluri 18% SDS. Proteinele au fost transferate în membrane PVDF și incubate fie cu anti-H3K9me2 (monoclonală de șoarece, 1: 500), tubulină anti-β (monoclonală de șoarece, 1: 60,000), histon anti-total H3 (policlonal iepure, 1: 5,000) anti-GFP (utilizate pentru verificarea expresiei virale egale în țesutul perforat) (policlonale iepure, 1: 1000), anticorpi anti-H3K27me3 (iepure policlonali 1: 500) sau anticorpi anti-actinici (monoclonali mouse 1: 60,000) 4 ° C (toate membranele au fost blocate în lapte 5% sau albumină serică bovină 5%). Membranele au fost apoi incubate cu anticorpi secundari marcați cu peroxidază (1: 15,000-1: 60,000 în funcție de anticorpul primar folosit) și benzi au fost vizualizate folosind substratul SuperSignal West Dura. Benzile au fost cuantificate cu NIH Image J Software și benzile H3K9me2 au fost normalizate fie la actin, fie la β-tubulină și la histonul total H3 pentru a controla încărcarea egală. Cocaina repetată nu a avut niciun efect asupra nivelurilor de actină (Imaginea S8) sau histonei totale 3 (Imaginea S1) în NAc. Mai mult, infecția cu HSV-G9a-GFP și HSV-G9aH1093K-GFP nu a avut niciun efect asupra nivelurilor totale ale β-tubulinei în NAc (Imaginea S8).

imunohistochimie

Șoarecii au fost sedați cu o doză letală de hidrat de clor și perfuzați cu paraformaldehidă 4% înainte de a fi analizați prin imunohistochimie unică sau dublă așa cum s-a descris anterior (S6). Pe scurt, creierii post-fixați au fost incubați la temperatura camerei peste noapte în 30% zaharoză înainte de a fi tăiați la 35 μm (creierele utilizate pentru analiza coloanei dendritice au fost secționate pe un vibratom la secțiunile 100 μm în absența 30% zaharoză). Secțiunile NAc cu flotare liberă au fost spălate cu 1X PBS, blocate (3% ser de măgar normal, 0.1% tritonX, 1X PBS) și ulterior incubate cu anti-GFP (policultură de pui, 1: 8000) , 9: 1) în soluția de blocare. Secțiunile analizate pentru coloane dendritice au fost incubate cu un anticorp anti-GFP policlonal de iepure la 500: 1. După incubarea peste noapte, secțiunile NAc au fost spălate timp de 200 timp de 3 minute cu 10X PBS, urmată de incubarea cu anticorpi secundari cuplați cu Cy1 și / sau Cy2 în soluție de blocare 3X PBS timp de 1. Secțiunile utilizate pentru studii de morfologie au fost incubate în anticorp secundar peste noapte la temperatura camerei. Co-colorația nucleară a fost realizată prin incubarea secțiunilor în 2X PBS conținând DAPI (1: 1) pentru minute 50,000. Secțiunile au fost spălate din nou, urmate de deshidratare cu etanol și montare cu DPX. Toate secțiunile au fost înregistrate folosind microscopia confocală.

Izolarea ARN și qPCR

Pumnele NAc bilaterale cu calibru 14 au fost omogenizate în Trizol și prelucrate conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul a fost purificat cu coloane RNAesy Micro și spectroscopia a confirmat că rațiile ARN 260/280 și 260/230 au fost> 1.8. ARN-ul a fost apoi transcris invers utilizând un kit Bio-Rad iScript. ADNc a fost cuantificat prin qPCR folosind SYBR Green. Fiecare reacție a fost efectuată în duplicat sau triplicat și analizată urmând metoda ΔΔCt descrisă anterior folosind gliceraldehidă-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) ca control de normalizare (S7). Vedea tabelul suplimentar S5 pentru secvențele de primer ARNm.

Analiza microarray ADN

Patru grupe (3 replicate biologic independent pe grup) au fost utilizate pentru studiul microarray, în totalitate 12 microarrays. La ora 1 de la ultima injecție de cocaină, animalele au fost decapitate rapid și creierele au fost îndepărtate și plasate pe gheață. Disecțiile de NAc au fost luate utilizând un pumn de ac 15-gauge și au fost congelate rapid pe gheață uscată până când ARN-ul a fost extras. Dălcările bilaterale au fost colectate de la patru animale pe replicat, cu un număr total de șoareci 12 per grup. Izolarea ARN, prelucrarea microarray și analiza datelor s-au efectuat așa cum s-a descris anterior (S8). Pe scurt, ARN-ul a fost izolat și purificat așa cum s-a descris mai sus și a fost verificat pentru calitate folosind Bioanalizatorul Agilent. Transcrierea inversă, amplificarea, etichetarea și hibridizarea la matrice Illumina MouseWG-6 v2.0 au fost efectuate folosind proceduri standard de către nucleul microarray al UT Southwestern. Datele brute au fost scăzute în fundal și cuantificate normalizate utilizând software-ul Beadstudio. Datele normalizate au fost analizate folosind software-ul GeneSpring și genelistele au fost generate folosind criterii de semnificație ale unei limite de 1.3 ori cuplate cu o valoare non-strictă de p <0.05.

Menținem un înalt grad de încredere în aceste date din mai multe motive. În primul rând, toate animalele au fost manipulate, tratate și ucise în același timp, în aceleași condiții. De asemenea, toate procesele de prelucrare cu ARN și array au fost efectuate în același timp. În al doilea rând, am realizat matrice triplicate și am combinat mai multe animale pe eșantion de matrice, reducând astfel diferențele datorate variabilității individuale și creșterii puterii statisticeS9). În al treilea rând, criteriile de analiză a datelor utilizate pentru studiul nostru sunt recomandate de proiectul MicroArray Quality Control, deoarece aceste criterii au fost validate pentru a oferi un grad ridicat de reproductibilitate interstitată și reproductibilitate inter- și intra-platformă (S10-S11).

Construcția de vectori virali

Datorită constrângerilor de mărime a inserției vectorului viral, secvențele de codificare fie pentru G9a de tip sălbatic (G9a), fie pentru G9a moarte catalitic (G9aH1093K) au fost subclonate în plasmida bicistronică p1005 + HSV care exprimă GFP sub controlul promotorului citomegalovirus (CMV) mărimea inserției a fost ~ 9 kb, care depășește dimensiunea maximă de inserție pentru vectorii AAV-3.96). Promotorul IE2 / 4 conduce expresia G5a. Fragmentele au fost subclonate în plasmida bicistronică p9 + HSV prin legături de capăt tangent cu G1005a digerată cu Plen și EcoRI (de la pcDNA9) și P3.1 + tratate cu CIP după digestia cu EcoRI. Pentru producerea HSV-ΔJunD-GFP, secvența de codificare a ΔJunD flancată de situsurile de restricție EcoRI a fost generată prin PCR folosind oligonucleotide de primer care conțin situsul EcoRI. Produsul PCR a fost apoi ligat în situl EcoRI al vectorului p1005 +. Expresia locală a recombinazei Cre în neuronii NAc a fost realizată prin administrarea genei mediată viral utilizând un vector AAV așa cum este descrisS12). GFP sau o fuziune N-terminală a GFP cu Cre a fost subclonată într-un vector AAV-2 recombinant care conține un promotor CMV cu o secvență acceptor donor de îmbinare și semnal de poliadenilare. Toate inserțiile vectorilor au fost confirmate prin secvențierea dideoxi. Vectorii virali au fost produși folosind o metodă fără transfecție triplă, fără ajutor, așa cum s-a descris anterior (S13). Virusul purificat a fost păstrat la -80 ° C. Calitatea virală a fost evaluată prin titru infecțios evaluat în celulele HEK293. Virusurile AAV-ΔFosB-GFP au fost preparate în mod similar. Pentru HSV-Cre, expresia Cre a fost condusă de un promotor IRES, spre deosebire de promotorul IE4 / 5, pentru a minimiza expresia Cre și pentru a preveni toxicitatea neuronală (a se vedea S14 pentru construirea virale). În toate cazurile, a fost validată o supraexprimare virală, ambele in vitro și in vivo, prin intermediul qPCR, iar virusurile au fost confirmate imunohistochimic pentru a afișa expresia limitată de NAc după o intervenție chirurgicală.

Operație stereotaxică

Sub anestezie ketamină (100 mg / kg) / xilazină (10 mg / kg), șoarecii au fost poziționați într-un instrument stereotaxic cu animale mici și suprafața craniană a fost expusă. Trei treizeci și trei de seringi de seringi au fost utilizați pentru a infuza bilateral 0.5 μl de virus în NAc la un unghi 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) cu o viteză de 0.1 μl / min. Animalele care au primit injecții HSV au fost lăsate să se recupereze pentru 2 zile după operație, în timp ce șoarecii utilizați pentru testarea comportamentului primesc vectori AAV lăsându-se să se recupereze pentru 20 zile înainte de a fi supuși condiționării locului. Aceste vremuri sunt în concordanță cu perioadele de expresie transgenă mediată maximă viral pentru cei doi vectori. Pentru perfuziile BIX01294, fiecare dintre cele două mini-pompe a fost poziționată subcutanat pe spatele mouse-ului. Deplasările canulei au fost realizate prin forarea a două găuri craniene mici deasupra NAc și prin eliberarea canulei din bregma (AP + 1.5, ML + 1.0, DV-5.4). Șoarecii au fost lăsați să se recupereze de la intervenția chirurgicală timp de 4 la 5 zile înainte de a începe procedura de condiționare a locului la cocaină, așa cum este descris mai jos.

Condiție preferată de locație

Procedura de condiționare a locului a fost realizată așa cum s-a descris anterior, cu următoarele modificări (S7). Pe scurt, la 3 zile după perfuziile intra-NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP sau HSV-GFP, șoarecii au fost plasați în camerele de condiționare, care constau din trei medii distincte. Șoarecii care au prezentat o preferință semnificativă pentru oricare dintre cele două camere de condiționare au fost excluși din studiu (<10% din toate animalele). Grupurile de condiționare au fost apoi echilibrate pentru a se adapta la orice prejudecată a camerei care ar putea exista în continuare. În zilele următoare, animalele au fost injectate cu ser fiziologic și închise într-o cameră după-amiaza timp de 30 de minute și apoi injectate cu cocaină (10 mg / kg, ip) și închise timp de 30 de minute în cealaltă cameră seara timp de 2 zile (două soluție salină și două perechi de cocaină). În ziua testului, șoarecii au fost repuși în aparat fără tratament timp de 20 de minute și testați pentru a evalua care parte au preferat. Răspunsurile locomotorii la cocaină au fost evaluate prin spargerea fasciculului în camerele asociate cocainei pentru a asigura eficacitatea tratamentului cu droguri. Pentru experimentele CPV AAV și BIX01294, a fost utilizat un protocol ușor modificat. Animalele au fost din nou injectate fie cu soluție salină, fie cu cocaină (10 mg / kg, ip) și închise în camere specifice pentru ședințe de 30 de minute, dar au fost condiționate doar o dată pe zi timp de 4 zile, urmate de test în ziua 5 (animalele au fost condiționate seara s-au alternat tratamente de condiționare). Pentru toate grupurile, locomoția inițială ca răspuns la soluție salină a fost evaluată pentru a se asigura că locomoția nu a fost afectată de tratamentul viral sau inhibitor.

Administrarea cocainei intravenoasă

S-au obținut șobolani masculi adolescenți Long-Evans, cântărind 230-250 g la începutul experimentului. Acestea au fost adăpostite într-un mediu cu umiditate și temperatură controlat într-un ciclu de lumină / întuneric 12 inversat (se aprinde la 9: 00 am) cu ad libitum accesul la hrană și apă. Șobolanilor i sa permis să se aclimatizeze în noul lor mediu și au fost manipulați zilnic pentru săptămâna 1 înainte de începerea experimentului. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de la Muntele Sinai. Echipamentul de administrare auto a fost echipat cu grinzi infrarosu pentru a masura comportamentul locomotor. Auto-administrarea a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (S15-S16) cu catetere implantate în vena jugulară dreaptă sub anestezie cu izofluran (2.4-2.7%). Cateterele au fost spălate cu 0.1 ml soluție salină conținând 10 U heparină și ampicilină (50 mg / kg). După o săptămână de recuperare după o intervenție chirurgicală, instruirea de auto-administrare a început în timpul fazei întunecate a ciclului lumină / întuneric. Animalelor li s-a permis accesul zilnic timp de 3 ore la cocaină (0.75 mg / kg / infuzie) sub un program fix de întărire a raportului 1 (FR1), unde o presă activă cu pârghie a dus la o singură infuzie de medicament. Șobolanii și-au stabilizat consumul de cocaină după 1 zile (variație <6% a ratei de răspuns în 15 zile consecutive, cel puțin 3% răspunzând pe pârghia întărită). La 75 de ore de la ultima sesiune de autoadministrare, șobolanii au fost rapid decapitați, creierele au fost îndepărtate rapid și procesate pentru izolarea ARN și qPCR.

Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)

Stropitoarele NAc proaspete au fost reticulate din punct de vedere formaldehidic și au fost preparate pentru ChIP așa cum a fost descris anterior (S17-S18) cu modificări minore. Pe scurt, s-au colectat dungi de calibru NAc pe animal (animale 4 grupate pe probă), reticulate cu 14% formaldehidă și stins cu glicină 5 M înainte de îngheț la -1 ° C. (În funcție de anticorpul de precipitare) s-au preparat perle magnetice IgG prin incubarea perlelor magnetice adecvate fie cu anti-G2a (clasa ChIP policlonal de iepure), fie cu anti-H80K1me9 (grad de ChIP monoclonal de șoarece) anticorpi peste noapte la 3 ° C sub rotație constantă în soluție bloc. Testarea cu ultrasunete a țesuturilor și forfecarea cromatinei au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (S17). După sonicare, concentrații egale de cromatină au fost transferate în tuburi noi și s-au economisit ~ 5% din produsele finale pentru a servi drept controale de intrare. După spălarea și resuspendarea completă a amestecurilor de bile / anticorpi conjugați, la fiecare probă de cromatină s-au adăugat volume egale de amestec de anticorpi / bile (~ 7.5 μg anticorp / probă) și incubate timp de ~ 16 sub rotație constantă la 4 ° C. Probele au fost spălate în continuare și inversate încrucișate la 65 ° C peste noapte înainte de purificarea ADN folosind un kit de purificare PCR. După purificarea ADN, probele au fost supuse la qPCR și au fost normalizate la controalele lor de intrare adecvate așa cum s-a descris anterior (S17). Au fost de asemenea efectuate imunoprecipitări IgG de șoarece folosind un anticorp anti-IgG policlonal de șoarece pentru a controla îmbogățirea adecvată a amplificării semnalului. Sa utilizat adenin fosforibosiltransferaza (APRT) ca un control negativ pentru experimentele de supraexprimare a cocainei și ΔFosB. Vedea Tabel suplimentar S5 pentru secvențele de primer promotor.

Analiza coloanei vertebrale dendritice

Pentru a studia rolul G9a în reglarea morfologiei neuronale in vivo, am folosit metodele descrise anterior cu următoarele modificări (S1). La trei zile după injectarea HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (toți virusii au fost utilizați la șoareci C57Bl / 6J de tip sălbatic) sau HSV-Cre-GFPfl / fl șoareci), atunci când exprimarea virală a fost maximă, șoarecii au fost perfuzați, creierii au fost crioprotecați și apoi secționați la 100 μm pe un vibratom. Secțiunile au fost apoi imunologiate cu ajutorul unui anticorp împotriva GFP așa cum s-a descris mai sus (vezi Immunohistochemistry). Pentru a evalua efectele supraexprimării și knockout-ului G9a asupra numărului coloanei vertebrale, precum și efectul supraexprimării ΔJunD, am măsurat numărul de spini pe aproximativ neuron 1-2 pe neuron egal cu cel puțin 299 μm de dendrite secundare din mediul NAc care exprimă GFP neuroni spinoși (MSN). Dat fiind faptul că MSN sunt distincte morfologic față de alte populații neuronale din NAc, precum și rapoarte anterioare care indică faptul că HSV infectează în principal neuronii care exprimă DARPP-32 în această regiune a creierului (S19), suntem încrezători că MSNs au fost evaluate exclusiv în aceste studii. Pentru fiecare animal, am examinat neuronii 6-8 la animale 3-4 pe grup (grupuri 7), după care s-a obținut o valoare medie pentru fiecare animal pentru analiza statistică. Experimentele concepute pentru a examina efectele supraexprimării ΔFosB asupra densității coloanei vertebrale NAc au fost efectuate în mod similar cu cele descrise mai sus, cu excepția faptului că vectorii AAV au fost utilizați pentru a exprima GFP sau ΔFosB-GFP pentru perioade lungi de timp (săptămâni 8). Toate imaginile HSV au fost capturate folosind un microscop confocal cu un obiectiv de imersie cu ulei 100X (imaginile AAV au fost capturate cu un obiectiv de imersie cu ulei 63X). Imaginile au fost obținute cu orificiul setat la unitatea arbitrară 1 și o dimensiune a cadrului 1024 × 1024. Lungimea dendritică a fost măsurată utilizând software-ul NIH Image J, iar numerele coloanei vertebrale au fost considerate orbite de către experimentatorul primar, deoarece diapozițiile au fost codificate înainte de scanarea experimentală. A fost calculat numărul mediu de spini per 10 μm de dendrit.

analize statistice

S-au efectuat ANOVA-uri cu una sau două căi pentru a determina semnificația pentru preferința locului condiționat și pentru analiza coloanei dendritice cu mai mult de două grupe. Studiile t teste au fost utilizate pentru alte comparații, inclusiv qPCR, Western blotting, analiza coloanei dendritice comparând HSV-GFP cu HSV-Cre în G9afl / fl șoareci, analize microarray (a se vedea mai sus) și experimente de imunoprecipitare a cromatinei. T-testele planificate ale studenților au fost utilizate în urma analizei ANOVA bidirecționale a densității coloanei dendritice după supraexprimarea osFosB, cu confirmarea efectelor principale semnificative ale tratamentului medicamentos și ale virusului. Toate valorile incluse în legendele figurii reprezintă media ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Analize statistice detaliate pentru Fig. 1-3 în textul principal sunt date în: Legendele din figura detaliată, inclusiv statisticile.

Material suplimentar

Note de subsol

Certific că nici unul dintre materialele incluse în manuscrisul intitulat Rolul esențial al histonei metiltransferazei G9a în plasticitatea indusă de cocaină au fost publicate anterior sau sunt luate în considerare în altă parte, inclusiv pe Internet.

Toate lucrările care implică utilizarea animalelor au fost efectuate în conformitate cu orientările instituționale și IACUC atât la Universitatea din Texas Southwestern Medical Center cât și la Școala de Medicină Mount Sinai.

Referințe și note

1. Robinson TE, Kolb B. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33. [PubMed]
2. Hyman SE, Malenka RC, Nestler EJ. Annu Rev Neurosci. 2006; 29: 565. [PubMed]
3. Kumar A, și colab. Neuron. 2005; 48: 303. [PubMed]
4. Renthal W, și colab. Neuron. 2007; 56: 517. [PubMed]
5. Renthal W, și colab. J Neurosci. 2008; 28: 7344. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
6. Renthal W, și colab. Neuron. 2009; 62: 335. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
7. Stipanovich A, și colab. Natură. 2008; 453: 879. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
8. Borrelli E, Nestler EJ, Allis CD, Sassone-Corsi P. Neuron. 2008; 60: 961. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
9. Brami-Cherrier K, Roze E, Girault JA, Betuing S, Caboche J. JNeurochem. 2009; 108: 1323. [PubMed]
10. Tachibana M, Sugimoto K, Fukushima T, Shinkai Y. J Biol Chem. 2001; 276: 25309. [PubMed]
11. Nestler EJ. Philos Trans R Soc. Londra, B Biol Sci. 2008; 363: 3245. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
12. McClung CA, Nestler EJ. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208. [PubMed]
13. Kelz MB, și colab. Natură. 1999; 401: 272. [PubMed]
14. Sampath SC, și colab. Mol Cell. 2007; 27: 596. [PubMed]
15. Kubicek S și colab. Mol Cell. 2007; 25: 473. [PubMed]
16. Chang Y, și colab. Nat Struct Mol Biol. 2009; 16: 312. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
17. Robinson TE, Kolb B. J Neurosci. 1997; 17: 8491. [PubMed]
18. Unghel MA, Whistler JL, Malenka RC, Bonci A. Nature. 2001; 411: 583. [PubMed]
19. Thomas MJ, Malenka RC. Philos Trans R. Soc Lond. B Biol Sci. 2003; 358: 815. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
20. Russo SJ, și colab. J Neurosci. 2009; 29: 3529. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
21. Bibb JA, și colab. Natură. 2001; 410: 376. [PubMed]
22. Norrholm SD, și colab. Neuroscience. 2003; 116: 19. [PubMed]
23. Pulipparacharuvil S, și colab. Neuron. 2008; 59: 621. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
24. Ujike H, Takaki M, Kodama M., Kuroda S. Ann NY Acad Sci. 2002; 965: 55. [PubMed]
25. Toda S, și colab. J Neurosci. 2006; 26: 1579. [PubMed]
26. Graham DL. Nat Neurosci. 2007; 10: 1029. [PubMed]
27. Lee KW, și colab. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2006; 103: 3399. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
28. Această lucrare a fost susținută de subvenții de la Institutul Național pentru Abuzul de droguri: P01 DA08227 (EJN), R01 DA07359 (EJN) și P0110044 (PG).