PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
Abstract
Modificările induse de cocaină în expresia genelor provoacă modificări ale morfologiei neuronale și ale comportamentului care pot sta la baza dependenței de cocaină. Am identificat un rol esențial pentru dimetilarea histonei 3 lizinei 9 (H3K9) și a lizinei dimetiltransferazei G9a în plasticitatea structurală și comportamentală indusă de cocaină. Administrarea repetată de cocaină a redus nivelurile globale de dimetilare a H3K9 în nucleul accumbens. Treducerea sa a metilării histonelor a fost mediată prin reprimarea G9a în această regiune a creierului, care a fost reglată de factorul de transcripție ΔFosB indus de cocaină. Folosind mutageneza condiționată și transferul de gene mediat viral, am descoperit că reglarea G9a a crescut plasticitatea coloanei dendritice a neuronilor nucleului accumbens și a sporit preferința pentru cocaină, stabilind astfel un rol crucial pentru metilarea histonelor în acțiunile pe termen lung ale cocainei.
Introducere
Expunerea repetată la cocaină se caracterizează prin modificări persistente ale expresiei genelor și morfologie neuronală alterată în nucleul accumbens (NAc), o componentă cheie a circuitelor de recompensă ale creierului (1-2). Remodelarea cromatinei este importantă în modificările transcripționale aberante din această regiune a creierului care pot sta la baza unor aspecte ale dependenței de cocaină. (3-9). Reglarea cocainei a structurii cromatinei în NAc rezultă, în parte, din modificările directe induse de cocaină ale mașinilor enzimatice cromatinei, ducând la modificări în acetilarea și fosforilarea histonelor (4, 7-9); cu toate acestea, rolurile enzimelor care controlează metilarea histonelor nu au fost încă investigate.
O analiză recentă a promotorului la nivelul întregului genom folosind imunoprecipitarea cromatinei cuplată la microarrays (ChIP-Chip) a identificat modele modificate de metilare represivă a histonei H3 lizină 9 (H3K9) și 27 (H3K27) la promotori specifici de gene în NAc după un tratament repetat cu cocaină (6). Prin urmare, am analizat numeroase lizin metiltransferaze (KMT) și demetilaze (KDM) despre care se știe că controlează metilarea H3K9 sau H3K27 (Fig. 1A). Doar două enzime, G9a și GLP, au prezentat o reglare transcripțională persistentă la 24 de ore după administrarea repetată a cocainei, când expresia ambelor gene a fost redusă semnificativ.. Deoarece G9a și GLP catalizează în mod specific dimetilarea H3K9 (H3K9me2), reglarea lor descendentă de către cocaină este în concordanță cu nivelurile globale scăzute de H3K9me2 eucromatic observate în acest moment (Fig. 1B). În schimb, nivelurile globale de metilare heterocromatică a H3K27 au rămas nealterate de expunerea repetată la cocaină (Fig. S1 în materialul online suport). Datorită nivelurilor sale ridicate de activitate catalitică atât in vitro și in vivo (10), ne-am propus să investigăm în continuare semnificația funcțională a represiunii G9a în urma expunerii repetate la cocaină în NAc. Nivelurile proteinei G9a, ca și nivelurile ARNm, au fost semnificativ reduse la 24 de ore după administrarea repetată de cocaină (Imaginea S2). Deși expresia ARNm G9a a fost redusă cu 35% în NAc, analiza imunohistochimică a evidențiat o reducere mai modestă de 15% a nivelurilor proteinei G9a, în concordanță cu scăderea observată cu 21% a H3K9me2 după administrarea repetată de cocaină (Fig. 1B). Expresia ARNm G9a a fost, de asemenea, reglată în jos în această regiune a creierului cu 20% după autoadministrarea repetată de cocaină (Imaginea S3).
Pentru a identifica dacă modificările H3K9me2 eucromatice se corelează cu modificări la nivelul genomului în expresia genelor în NAc, am folosit analize cu microarray pentru a examina profilurile de expresie a genelor induse de o doză de provocare de cocaină la animale cu sau fără antecedente de expunere anterioară la cocaină (vezi suplimentarea listele de gene în Tabelele S1–S3). Animalele care au primit cocaină în mod repetat au prezentat o expresie a genelor crescută dramatic la 1 oră după o provocare cu cocaină în comparație cu animalele tratate acut (Fig. 1C). Această expresie crescută a genelor a apărut încă ca răspuns la o provocare cu cocaină administrată după 1 săptămână de retragere de la cocaină repetată. În conformitate cu rapoartele anterioare, un mic procent de gene (~10%) au prezentat răspunsuri transcripționale desensibilizate după administrarea repetată de cocaină (Fig. 1C; vedea Tabelul S1) (5). Pentru a investiga în mod direct rolul reglării G9a în expresia îmbunătățită a genei observată după cocaină repetată, șoarecii au primit injecții intra-NAc cu vectori de virus Herpes simplex (HSV) care exprimă fie GFP, fie G9a și au fost tratați cu ser fiziologic sau cocaină repetată pentru a determina dacă supraexprimarea G9a. a fost suficientă pentru a bloca îmbunătățirea repetată a expresiei genelor indusă de cocaină. Dintr-un set de 12 gene selectate aleatoriu care prezintă niveluri crescute de expresie în urma cocainei repetate, am observat că G9a a redus semnificativ expresia îmbunătățită a 50% dintre aceste gene (Tabelul S4).
Pentru a identifica evenimentele transcripționale din amonte care mediază reprimarea repetată a expresiei G9a indusă de cocaină, am investigat un posibil rol pentru ΔFosB, un produs de îmbinare foarte stabil al genei timpurii imediate. fosB. ΔFosB se acumulează în NAc după expunerea repetată la cocaină, unde a fost asociat cu o recompensă crescută pentru cocaină (11). ΔFosB poate acționa fie ca activator transcripțional, fie ca represor, în funcție de gena țintă implicată (3, 5, 6, 12). Folosind NSE bitransgenic-tTA × tetOP-ΔFosB șoareci, în care expresia ΔFosB poate fi indusă selectiv în NAc și striatul dorsal al animalelor adulte (13), am examinat impactul expresiei ΔFosB asupra reglării cocainei a H3K9me2 și a KMT-urilor în NAc. Supraexprimarea ΔFosB a fost suficientă pentru a reduce nivelurile ambelor H3K9me2 (Fig. 1D) și expresia G9a (Fig. 1E), imitând astfel efectele cocainei repetate. În schimb, ΔFosB nu a redus expresia GLP în această regiune a creierului și nu a avut niciun efect asupra SUV39H1 și EZH2, principalele enzime de trimetilare pentru H3K9 și respectiv H3K27 (Imaginea S4). Pentru a confirma aceste date folosind un sistem independent de supraexpresie ΔFosB, șoarecii adulți de tip sălbatic au primit injecții intra-NAc bilaterale de vectori de virus adeno-asociat (AAV) care exprimă fie GFP, fie ΔFosB. Supraexpresia mediată de virus a ΔFosB a scăzut nivelurile de exprimare a G9a în această regiune a creierului (Fig. 1E).
O astfel de reglare pronunțată și specifică a G9a ne-a determinat să investigăm dacă modificarea expresiei G9a în mod specific în neuronii NAc reglează răspunsurile comportamentale la cocaină. Șoarecii de tip sălbatic au primit injecții intra-NAc cu vectori HSV care exprimă GFP sau G9a și apoi au fost analizați folosind o paradigmă imparțială de preferință a locului condiționat de cocaină, care oferă o măsură indirectă a recompensei pentru droguri. Supraexprimarea virală a G9a în neuronii NAc a fost confirmată în urma testelor comportamentale (Fig. 2A). Supraexprimarea G9a a scăzut semnificativ preferința pentru cocaină în comparație cu animalele care supraexprimă GFP (Fig. 2B), și niveluri crescute de H3K9me2 în NAc (Fig. 2C). Supraexprimarea unui mutant mort catalitic al G9a (G9aH1093K) (14) nu a afectat preferința pentru cocaină (Fig. 2B) și nu a avut niciun efect asupra nivelurilor H3K9me2 din această regiune a creierului (Fig. 2C).
Pentru a studia în continuare rolul G9a în efectele comportamentale ale cocainei și, mai precis, pentru a imita reprimarea repetată indusă de cocaină a expresiei G9a în NAc, G9a adultfl / fl șoareci (14) au primit injecții intra-NAc de vectori AAV care exprimă recombinaza Cre sau GFP ca martor. Degradarea AAV-Cre a G9a în NAc, care a fost confirmată imunohistochimic (Imaginea S5), a crescut semnificativ efectele cocainei în experimentele de condiționare a locului și a scăzut nivelurile de H3K9me2 în NAc (Fig. 2D, E). Un inhibitor farmacologic disponibil comercial al G9a și GLP, BIX01294 (15-16), a fost folosit pentru a stabili dacă inhibarea enzimatică afectează în mod similar răspunsurile comportamentale la cocaină. Într-adevăr, inhibarea farmacologică a G9a și GLP a crescut semnificativ preferința pentru cocaină și a scăzut H3K9me2 în NAc (Fig. 2F, G).
Administrarea repetată de cocaină crește densitatea coloanelor dendritice pe neuronii spinoși medii NAc (17), un proces asociat cu modificări funcționale la sinapsele glutamatergice excitatorii pe acești neuroni (18-19) și răspunsuri comportamentale sensibilizate la medicament (17, 20). Astfel, am emis ipoteza că reglarea în jos a activității G9a în NAc de către cocaina repetată ar putea media capacitatea cocainei de a regla densitatea coloanei dendritice a neuronilor NAc. Folosind imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) cu un anticorp anti-G9a, am identificat mai multe ținte presupuse ale genei G9a în NAc, fiecare dintre acestea fiind anterior implicată în plasticitatea dendritică indusă de cocaină (Fig. 3A) (20-26). Am descoperit că administrarea repetată de cocaină a scăzut semnificativ legarea G9a, precum și nivelurile de H3K9me2, la acești promotori de gene (Fig. 3B). În schimb, administrarea acută de cocaină a recrutat rapid G9a la unii dintre acești promotori de gene, în concordanță cu creșterea expresiei G9a observată în NAc la 1 oră după o doză acută de cocaină (Imaginea S6). Deși legarea G9a la promotorii specifici ai genei se corelează cu modificările exprimării sale, rămâne neclar dacă astfel de evenimente sunt mediate de nivelurile globale modificate de G9a în NAc și/sau de diferențe în recrutarea G9a în urma acută. Raport administrarea repetată de cocaină.
Pe baza reglării de către G9a a numeroaselor gene legate de plasticitate în NAc, am examinat direct dacă menținerea expresiei G9a în această regiune a creierului după un tratament repetat cu cocaină a fost suficientă pentru a bloca formarea coloanei dendritice indusă de cocaină. Folosind un protocol de tratament cu cocaină demonstrat anterior pentru a promova inducerea coloanei dendritice în NAc (20), am examinat densitatea coloanei vertebrale la animalele injectate fie cu HSV-GFP, fie cu HSV-G9a. În acord cu descoperirile anterioare, am observat o creștere semnificativă a densității coloanei dendritice în NAc după tratamentul cu cocaină, un efect care a fost blocat complet de supraexprimarea G9a (Fig. 3C). Supraexpresia G9a singură nu a fost suficientă pentru a scădea densitatea coloanei dendritice NAc în absența cocainei. Pentru a completa aceste date, G9afl / fl șoarecii au primit injecții intra-NAc de HSV-Cre și densitatea coloanei vertebrale a fost cuantificată și comparată cu animalele care au primit HSV-GFP în absența cocainei. Reducerea expresiei G9a a crescut semnificativ densitatea coloanei vertebrale pe neuronii spinoși medii NAc (Fig. 3C).
Având în vedere dovezile că reglarea negativă a G9a în NAc după cocaina repetată este mediată de ΔFosB, am examinat în continuare dacă acest factor de transcripție este implicat, de asemenea, în reglarea spinilor dendritici NAc.. Deși ΔFosB nu a fost anterior asociat cauzal cu o astfel de plasticitate dendritică, mai multe dintre țintele sale, inclusiv subunitățile Cdk5 și NFκB, au fost atât de implicate. (20-23), și expresia persistentă a lui ΔFosB în neuronii NAc se corelează cu densitatea crescută a coloanei dendritice după un tratament repetat cu cocaină (27). În primul rând, am descoperit că inducerea ΔFosB la șoarecii bitransgenici în absența cocainei, care a reglat în jos expresia G9a și H3K9me2 (Fig. 1D, E), a scăzut legarea G9a la numeroase gene legate de plasticitate, dintre care multe s-au dovedit, de asemenea, a fi ținte directe ale ΔFosB în sine (Fig. 3D) (3, 6). Apoi am arătat că supraexprimarea virală a ΔFosB în NAc a crescut semnificativ densitatea coloanei dendritice în condiții bazale, similar cu cel observat în urma administrării repetate de cocaină (Fig. 3E). În schimb, supraexprimarea în NAc a ΔJunD, o proteină mutantă negativă dominantă care antagonizează activitatea transcripțională ΔFosB, a blocat capacitatea cocainei repetate de a crește formarea coloanei dendritice în NAc. (Fig. 3C).
Observația noastră că ΔFosB reglează expresia G9a în NAc și că ΔFosB și G9a reglează unele dintre aceleași gene țintă, ne-a determinat să examinăm alte interacțiuni între ΔFosB și G9a. După cocaină acută, când nivelurile G9a au fost crescute, legarea G9a de fosB gena a fost crescută, în timp ce după repetarea cocainei, când expresia G9a a fost suprimată, G9a se leagă de fosB gena a fost scăzută (Fig. 3A). O astfel de scădere a legăturii G9a după cocaină repetată nu a fost observată pentru c-fos, unde legarea G9a este crescută de cocaină repetată (Imaginea S7). Acest lucru este în concordanță cu faptul că, spre deosebire de fosB, c-fos este reprimată, nu indusă, de expunerea cronică la psihostimulant (5). Supraexpresia ΔFosB la șoarecii bitransgenici a fost suficientă pentru a reduce semnificativ legarea G9a la fosb gena (Fig. 3D). În plus, supraexpresia G9a a fost suficientă pentru a reduce expresia crescută a ΔFosB după administrarea repetată de cocaină (Tabelul S4). Aceste date sugerează o buclă de autoreglare prin care G9a limitează inițial inducerea ΔFosB prin administrarea acută de cocaină. Cu toate acestea, pe măsură ce ΔFosB se acumulează cu expunerea repetată la medicamente, reprimă G9a și, prin urmare, își potențează propria inducție ulterioară.
În concluzie, am demonstrat că metilarea histonelor lizinei în NAc este implicată critic în reglarea expresiei genelor neuronale ca răspuns la cocaină. Reprimarea G9a și H3K9me2 în urma administrării repetate de cocaină promovează preferința cocainei, parțial, prin activarea transcripțională a numeroase gene cunoscute că reglează forme aberante de plasticitate dendritică. Obținerea unei mai bune înțelegeri a genelor care sunt reglementate prin astfel de mecanisme ne va îmbunătăți cunoștințele despre bazele biologice complexe ale dependenței de droguri și ar putea ajuta la dezvoltarea unor tratamente mai eficiente ale tulburărilor de dependență.
Materiale și metode
Animale și tratamente
Dacă nu se specifică altfel, șoarecii au fost găzduiți patru până la cinci per cușcă într-o colonie cu un ciclu de lumină/întuneric de 12 ore (lumini aprinse de la 7:00 AM la 7:00 PM) la temperatură constantă (23°C) cu ad libitum acces la apă și hrană. Toate protocoalele pentru animale au fost aprobate de IACUC atât la UT Southwestern Medical Center, cât și la Mount Sinai School of Medicine.
Pentru experimentele cu cocaină [imunohistochimie, western blot, PCR cantitativ (qPCR), analiză cu microarray și imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)], au fost utilizați șoareci masculi C8BL/10J în vârstă de 57 până la 6 săptămâni. Animalele au primit injecții zilnice cu fie „soluție salină” (7 tratamente cu soluție salină, ip), cocaină „acută” (6 tratamente cu soluție salină + un tratament 20 mg/kg cocaină-HCl, ip) sau cocaină „repetată” (7 tratamente 20 mg/kg cocaină-HCl, ip). Șoarecii au fost sacrificați fie la 1 oră, fie la 24 de ore după tratamentul final. Pentru studiile cu microarray, animalele au fost tratate zilnic fie cu „soluție salină” (15 tratamente cu soluție salină, ip), cocaină „acută” (14 tratamente cu soluție salină + 1 tratament 20 mg/kg cocaină-HCl, ip), cocaină „repetată + acută” ( 7 tratamente cu soluție salină + 8 tratamente 20 mg/kg cocaină-HCl, ip) sau „sevraj repetat + acută” cocaină (7 tratamente 20 mg/kg cocaină-HCl + 7 tratamente cu ser fiziologic + 1 tratament de provocare 20 mg/kg cocaină-HCl, ip) și au fost sacrificate la 1 oră după tratamentul final. În experimentele comportamentale, șoarecii au fost găzduiți individual după operație și au fost tratați cu 10 mg/kg cocaină-HCI, ip așa cum este descris mai jos. Pentru analiza coloanei dendritice și validarea micromatricelor în urma infecției cu HSV-GFP și HSV-G9a-GFP, șoarecii au fost tratați cu „soluție salină” (5 tratamente cu soluție salină, ip) sau „cocaină repetată” (5 tratamente 20 mg/kg cocaină-HCl, ip ) pe parcursul a 3 zile, deoarece acest protocol de injectare a fost demonstrat anterior că crește densitatea coloanei vertebrale pe neuronii nucleului accumbens (NAc) în intervalul de timp al expresiei transgenei virusului Herpes simplex (HSV) (Ref suplimentară S1). Șoarecii utilizați pentru analiza coloanei dendritice au fost sacrificați la 4 ore după ultimul tratament.
Pentru a induce ștergerea locală a transcriptului G9a limitat la neuronii NAc, am folosit șoareci mutanți homozigoți pentru o alela G9a floxată, care au fost descrise în detaliu în altă parte (S2). Recombinarea indusă de Cre produce splicing în afara cadrului exonului 22 până la 25 care duce la dezintegrarea mediată de nonsens a transcriptului mutant. Am folosit șoareci floxați G9a care au fost complet retroîncrucișați cu șoareci C57BL/6J. Șoarecii au fost injectați sterotaxic în NAc cu vectori de virus adeno-asociat (AAV) (serotipul 2) care exprimă GFP sau Cre-GFP între vârsta de 7 și 10 săptămâni. Analiza imunohistochimică a fost utilizată pentru a verifica eficiența recombinării mediate de Cre (vezi Suplimentar Fig. S5). Am folosit animale injectate cu AAV la 21 de zile după operație, deoarece recombinarea la șoarecii floxați cu G9a a fost stabilă și maximă în acest moment, în concordanță cu rapoartele publicate (S3-S4). Experimentele de supraexpresie G9a și ΔJunD au fost efectuate în mod similar folosind vectori de virus HSV care exprimă fie GFP, G9a-GFP de tip sălbatic, G9aH1093K-GFP mort catalitic sau ΔJunD-GFP (vezi S2 pentru detalii privind dezvoltarea constructelor G9a). Șoarecii care supraexprima HSV au fost utilizați la 3 zile după operație, deoarece supraexprimarea a fost maximă în acest moment, așa cum s-a observat prin imunohistochimie. Datorită naturii tranzitorii a exprimării HSV și naturii considerabil mai stabile a expresiei AAV, vectorii HSV au fost utilizați în experimente care necesită expresie transgenică rapidă, pe termen scurt, în timp ce vectorii AAV au fost utilizați în experimente care necesită perioade extinse de exprimare a transgenei. Ambii vectori s-au dovedit, în studii anterioare extinse, că infectează numai corpurile celulare neuronale din zona creierului injectată, fără nicio infecție a neuronilor aferenti sau eferenti.
Pentru experimentele comportamentale care utilizează inhibitorul farmacologic G9a/GLP, BIX01294 (25 ng/μl), șoarecii au fost implantați sterotaxic cu două mini-pompe subcutanate, precum și canule de ghidare bilaterale, în NAc. Mini-pompele au fost activate cu 12 ore înainte de implantare, inițiind livrarea continuă (0.25 μl/oră) fie a vehiculului (5 hidroxipropil β-ciclodextrină) fie a medicamentului timp de 14 zile, timp în care au fost efectuate evaluări comportamentale.
Pentru experimentele de supraexpresie ΔFosB [western blot, qPCR și ChIP], NSE bitransgenic masculintTA × tetOP-ΔFosB au fost folosiți șoareci (în vârstă de 10 săptămâni), prin care în absența derivatului de tetraciclină doxiciclină (8 săptămâni fără doxiciclină), animalele au prezentat o expresie constitutivă restrânsă striatală robustă a ΔFosB (S5). Supraexpresia ΔFosB la acești șoareci a fost confirmată prin qPCR. Pentru a confirma constatările utilizând NSE-tTA × tetOP-ΔFosB șoareci, șoareci masculi C8BL/57J de tip sălbatic în vârstă de 6 săptămâni au fost injectați intra-NAc sterotaxic cu vectori AAV care exprimă fie GFP, fie ΔFosB-GFP. Vectorii AAV au fost utilizați, în acest caz, pentru a asigura expresia maximă a ΔFosB la 8 săptămâni după operație, permițând o comparație directă între șoarecii care supraexprimă ΔFosB infectați viral și bitransgenici. Supraexpresia virală a fost confirmată utilizând qPCR la 8 săptămâni după operație (puncurile NAc de calibrul 15 au fost disecate sub locul injectării). Șoarecii care supraexprimă AAV-GFP și AAV-ΔFosB-GFP care nu au fost utilizați pentru qPCR au fost tratați cu soluție salină (14 tratamente cu soluție salină, ip) sau cocaină repetă (14 tratamente 30 mg/kg cocaină-HCl, ip) începând cu 6 săptămâni după interventie chirurgicala. La 4 zile de la tratamentul final, creierele au fost fixate cu paraformaldehidă 4%, secţionate pe un vibratom şi utilizate pentru analiza coloanei dendritice.
Analiza Western blot
Poansonurile NAc de calibrul 14 au fost luate din secțiuni coronale de 1 mm obținute folosind o matrice de creier de șoarece din oțel inoxidabil și au fost supuse cu ultrasunete în tampon de liză HEPES 1 M (1% SDS) care conține inhibitori de protează și fosfatază. 10-Probe de 30 μg de proteină totală au fost supuse electroforezei pe geluri SDS 18%. Proteinele au fost transferate pe membrane PVDF și incubate fie cu anti-H3K9me2 (monoclonal de șoarece, 1:500), anti-β-tubulină (monoclonală de șoarece, 1:60,000), histonă anti-totală H3 (policlonală de iepure, 1:5,000), anti-GFP (utilizat pentru verificarea exprimării virale egale în țesutul perforat) (policlonal de iepure, 1:1000), anticorpi anti-H3K27me3 (policlonal de iepure, 1:500) sau anti-actină (monoclonal de șoarece, 1:60,000) peste noapte la 4°C (toate membranele au fost blocate în lapte 5% sau albumină serică bovină 5%). Membranele au fost apoi incubate cu anticorpi secundari marcați cu peroxidază (1:15,000-1:60,000 în funcție de anticorpul primar utilizat) și benzile au fost vizualizate folosind substrat SuperSignal West Dura. Benzile au fost cuantificate cu NIH Image J Software și benzile H3K9me2 au fost normalizate fie la actină, fie la β-tubulină și la histona totală H3 pentru a controla încărcarea egală. Cocaina repetată nu a avut niciun efect asupra nivelului de actină (Imaginea S8) sau histonă totală 3 (Imaginea S1) în NAc. În plus, infecția cu HSV-G9a-GFP și HSV-G9aH1093K-GFP nu a avut niciun efect asupra nivelurilor totale de β-tubulină din NAc (Imaginea S8).
imunohistochimie
Șoarecii au fost sedați cu o doză letală de hidrat de cloral și perfuzați cu paraformaldehidă 4% înainte de a fi analizați prin imunohistochimie simplă sau dublă așa cum s-a descris anterior (S6). Pe scurt, creierele post-fixate au fost incubate la temperatura camerei peste noapte în zaharoză 30% înainte de a fi secționate la 35 μm (creierele utilizate pentru analiza coloanei dendritice au fost secționate pe un vibratom la secțiuni de 100 μm în absența a 30% zaharoză). Secțiunile de NAc plutitoare au fost spălate cu 1X PBS, blocate (3% ser de măgar normal, 0.1% tritonX, 1X PBS) și mai târziu incubate cu anti-GFP (policlonal de pui, 1:8000) și/sau anti-G9a (policlonal de iepure). , 1:500) anticorpi în soluţie de blocare. Secțiunile analizate pentru spinii dendritici au fost incubate cu un anticorp policlonal anti-GFP de iepure la 1:200. După incubarea peste noapte, secțiunile de NAc au fost clătite de 3 ori timp de 10 minute cu 1X PBS, urmată de incubare cu anticorpi secundari Cy2 și/sau Cy3 cuplați fluorescent în soluție de blocare 1X PBS timp de 2 ore. Secțiunile utilizate pentru studiile de morfologie au fost incubate în anticorp secundar peste noapte la temperatura camerei. Co-colorarea nucleară a fost realizată prin incubarea secțiunilor în 1X PBS care conține DAPI (1:50,000) timp de 10 minute. Secțiunile au fost din nou spălate, urmate de deshidratare cu etanol și montare cu DPX. Toate secțiunile au fost fotografiate folosind microscopie confocală.
Izolarea ARN și qPCR
Poansonele NAc bilaterale de calibrul 14 au fost omogenizate în Trizol și prelucrate conform instrucțiunilor producătorului. ARN-ul a fost purificat cu coloane RNAesy Micro și spectroscopia a confirmat că rațiile de ARN 260/280 și 260/230 au fost >1.8. ARN-ul a fost apoi transcris invers folosind un kit Bio-Rad iScript. ADNc a fost cuantificat prin qPCR utilizând SYBR Green. Fiecare reacție a fost efectuată în duplicat sau triplicat și analizată urmând metoda ΔΔCt, așa cum a fost descrisă anterior, folosind gliceraldehida-3-fosfat dehidrogenază (GAPDH) ca control de normalizare (S7). Vedea Tabelul suplimentar S5 pentru secvențele primerului ARNm.
Analiza microarray ADN
Patru grupuri (3 replici biologice independente per grup) au fost utilizate pentru studiul cu microarray, totalizând 12 microarrays. La 1 oră după ultima injecție de cocaină, animalele au fost decapitate rapid și creierul a fost îndepărtat și așezat pe gheață. Disecțiile de NAc au fost luate folosind un perforator cu ac de calibrul 15 și au fost congelate rapid pe gheață uscată până când a fost extras ARN. Puncturile bilaterale au fost reunite de la patru animale per replicare, însumând 12 șoareci per grup. Izolarea ARN, procesarea microarray și analiza datelor au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (S8). Pe scurt, ARN-ul a fost izolat și purificat așa cum este descris mai sus și a fost verificat pentru calitate folosind Bioanalyzerul Agilent. Transcripția inversă, amplificarea, etichetarea și hibridizarea la matrice Illumina MouseWG-6 v2.0 au fost efectuate folosind proceduri standard de nucleul de microarray al UT Southwestern. Datele brute au fost scăzute de fundal și cuantile normalizate folosind software-ul Beadstudio. Datele normalizate au fost analizate utilizând software-ul GeneSpring și genelistele au fost generate utilizând criterii de semnificație ale unui cutoff de modificare de 1.3 ori cuplat cu o limită nestringentă a valorii p de p < 0.05.
Menținem un grad ridicat de încredere în aceste date din mai multe motive. În primul rând, toate animalele au fost manipulate, tratate și ucise în același timp, în aceleași condiții. De asemenea, toate procesele ARN și matrice au fost efectuate în același timp. În al doilea rând, am efectuat matrice în trei exemplare și am reunit mai multe animale pe eșantion de matrice, minimizând astfel diferențele datorate variabilității individuale și creșterea puterii statistice (S9). În al treilea rând, criteriile de analiză a datelor utilizate pentru studiul nostru sunt recomandate de proiectul MicroArray Quality Control, deoarece aceste criterii au fost validate pentru a oferi un grad ridicat de reproductibilitate intersite și reproductibilitate inter și intraplatformă (S10-S11).
Construcția vectorilor virali
Datorită constrângerilor de dimensiune a inserției vectorului viral, secvențele de codificare fie pentru G9a de tip sălbatic (G9a) fie pentru G9a mort catalitic (G9aH1093K) au fost subclonate în plasmida bicistronic p1005+ HSV care exprimă GFP sub controlul promotorului citomegalovirusului uman imediat timpuriu (promotorul GCMV) dimensiunea de inserție a fost de ~ 9 kb, ceea ce depășește dimensiunea maximă de inserție pentru vectorii AAV-3.96). Promotorul IE2/4 conduce expresia G5a. Fragmentele au fost subclonate în plasmida bicistronică p9+ HSV prin ligări de capăt toci cu Pmel tratat cu Klenow și G1005a digerat cu EcoRI (din pcDNA9) și p3.1+ tratat cu CIP după digestie cu EcoRI. Pentru producerea HSV-AJunD-GFP, secvența de codificare a AJunD flancată de situsuri de restricție EcoRI a fost generată prin PCR utilizând oligonucleotide primer conținând situsul EcoRI. Produsul PCR a fost apoi ligat în situsul EcoRI al vectorului p1005+. Expresia locală a recombinazei Cre în neuronii NAc a fost obținută prin livrarea genei mediate de virus folosind un vector AAV așa cum este descris (S12). GFP sau o fuziune N-terminală a GFP la Cre a fost subclonată într-un vector AAV-2 recombinant care conține un promotor CMV cu o secvență acceptor donor de îmbinare și semnal de poliadenilare. Toate inserțiile vectorului au fost confirmate prin secvențiere dideoxi. Vectorii virali au fost produși folosind o metodă cu triplă transfecție, fără ajutor, așa cum s-a descris anterior (S13). Virusul purificat a fost păstrat la -80°C. Calitatea virală a fost evaluată prin titrul infecțios evaluat în celule HEK293. Virușii AAV-ΔFosB-GFP au fost pregătiți în mod similar. Pentru HSV-Cre, expresia Cre a fost condusă de un promotor IRES, spre deosebire de promotorul IE4/5, pentru a minimiza expresia Cre și a preveni toxicitatea neuronală (vezi S14 pentru construcția virală). În toate cazurile, supraexpresia virală a fost validată, ambele in vitro și in vivo, prin qPCR, iar virușii au fost confirmați imunohistochimic pentru a afișa expresie restricționată de NAc după intervenție chirurgicală.
Operație stereotaxică
Sub anestezie cu ketamina (100 mg/kg)/xilazină (10 mg/kg), șoarecii au fost poziționați într-un instrument stereotaxic pentru animale mici, iar suprafața craniană a fost expusă. Au fost folosite treizeci și trei de ace de seringă calibrate pentru a infuza bilateral 0.5 μl de virus în NAc la un unghi de 10° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV - 4.4) la o viteză de 0.1 μl/min. Animalelor care au primit injecții cu HSV li s-a permis să se recupereze timp de 2 zile după operație, în timp ce șoarecii utilizați pentru testarea comportamentală care au primit vectori AAV au fost lăsați să se recupereze timp de 20 de zile înainte de a fi supuși la condiționarea locului. Acești timpi sunt în concordanță cu perioadele de exprimare maximă a transgenei mediate de virus pentru cei doi vectori. Pentru perfuziile BIX01294, fiecare dintre cele două mini-pompe au fost poziționate subcutanat pe spatele șoarecelui. Amplasarea canulelor s-a realizat prin forarea a două mici găuri craniene deasupra NAc și prin livrarea canulei din bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV - 5.4). Şoarecii au fost lăsaţi să se recupereze după intervenţie chirurgicală timp de 4 până la 5 zile înainte de a începe procedura de condiţionare a locului la cocaină, aşa cum este descris mai jos.
Condiție preferată de locație
Procedura de condiționare a locului a fost efectuată așa cum s-a descris anterior, cu următoarele modificări (S7). Pe scurt, la 3 zile după perfuziile intra-NAc de HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP sau HSV-GFP, șoarecii au fost plasați în camerele de condiționare, care constau din trei medii distincte. Șoarecii care au arătat preferințe semnificative pentru oricare dintre cele două camere de condiționare au fost excluși din studiu (<10% din toate animalele). Grupurile de condiționare au fost apoi echilibrate pentru a se ajusta pentru orice părtinire a camerei care ar putea exista încă. În zilele următoare, animalele au fost injectate cu ser fiziologic și închise într-o cameră după-amiaza timp de 30 de minute, apoi au fost injectate cu cocaină (10 mg/kg, ip) și au fost închise timp de 30 de minute în cealaltă cameră seara timp de 2 zile (două soluție salină și două perechi de cocaină). În ziua testului, șoarecii au fost plasați înapoi în aparat fără tratament timp de 20 de minute și testați pentru a evalua ce parte au preferat. Răspunsurile locomotorii la cocaină au fost evaluate prin întreruperi ale fasciculului în camerele împerecheate cu cocaină pentru a asigura eficacitatea tratamentului medicamentos. Pentru experimentele AAV și BIX01294 CPP, a fost folosit un protocol ușor modificat. Animalele au fost din nou injectate fie cu soluție salină, fie cu cocaină (10 mg/kg, ip) și limitate în camere specifice pentru sesiuni de 30 de minute, dar în schimb au fost condiționate doar o dată pe zi timp de 4 zile, urmate de testul în ziua 5 (animalele au fost condiționate seara şi tratamentele de condiţionare s-au alternat). Pentru toate grupurile, locomoția inițială ca răspuns la soluția salină a fost evaluată pentru a se asigura că locomoția nu a fost afectată de tratamentul viral sau inhibitor.
Autoadministrare intravenoasă de cocaină
Au fost obținuți șobolani Long-Evans adolescenți masculi, cântărind 230-250 g la începutul experimentului. Acestea au fost găzduite într-un mediu controlat de umiditate și temperatură, pe un ciclu inversat de 12 ore lumină/întuneric (luminile stinse la ora 9:00) cu ad libitum acces la alimente și apă. Șobolanii au fost lăsați să se aclimatizeze în noul lor mediu și au fost manipulați zilnic timp de 1 săptămână înainte de începerea experimentului. Toate procedurile au fost efectuate în conformitate cu Ghidul Institutului Național de Sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator și au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din Mount Sinai. Echipamentul de autoadministrare a fost echipat cu fascicule infraroșii pentru măsurarea comportamentului locomotorii. Autoadministrarea a fost efectuată așa cum s-a descris anterior (S15-S16) cu catetere implantate în vena jugulară dreaptă sub anestezie cu izofluran (2.4–2.7%). Cateterele au fost spălate cu 0.1 ml de soluție salină care conține 10 U heparină și ampicilină (50 mg/kg). După o săptămână de recuperare de la operație, antrenamentul de autoadministrare a început în timpul fazei întunecate a ciclului lumină/întuneric. Animalelor li s-a permis accesul zilnic la cocaină timp de 3 ore (0.75 mg/kg/perfuzie) conform unui program de întărire cu raport fix-1 (FR1), în care o apăsare activă a pârghiei a dus la o singură perfuzie de drog. Șobolanii și-au stabilizat consumul de cocaină după 1 zile (<6% variație a ratei de răspuns pe 15 zile consecutive, cu cel puțin 3% răspunzând la pârghia întărită). La 75 de ore după sesiunea finală de autoadministrare, șobolanii au fost decapitați rapid, creierele au fost îndepărtate rapid și procesate pentru izolarea ARN și qPCR.
Imunoprecipitarea cromatinei (ChIP)
Puncurile proaspete de NAc au fost reticulate cu formaldehidă și pregătite pentru ChIP așa cum s-a descris anterior (S17-S18) cu mici modificări. Pe scurt, au fost colectate 4 perforate NAc de calibrul 14 per animal (5 animale reunite per probă), reticulate cu formaldehidă 1% și stinse cu glicină 2 M înainte de congelare la -80 ° C. Cu 1 zi înainte de sonicarea probei, s-au preparat margele magnetice IgG de oaie anti-iepure/șoarece (în funcție de precipitare) prin incubarea granulelor magnetice adecvate fie cu anti-G9a (gradul ChIP policlonal de iepure) fie cu anti-H3K9me2 (gradul ChIP monoclonal de șoarece) anticorpi peste noapte la 4°C sub rotație constantă în soluție bloc. Sonicarea țesuturilor și forfecarea cromatinei au fost efectuate așa cum s-a descris anterior (S17). După sonicare, concentrații egale de cromatină au fost transferate în tuburi noi și ~ 5% din produsele finale au fost salvate pentru a servi drept controale „de intrare”. După spălarea minuțioasă și resuspendarea amestecurilor conjugate de sferele/anticorpi, s-au adăugat volume egale de amestecuri de anticorpi/sferele (~ 7.5 μg anticorp/probă) la fiecare probă de cromatină și s-au incubat timp de ~ 16 ore sub rotație constantă la 4°C. Probele au fost spălate în continuare și reticulate invers la 65°C peste noapte înainte de purificarea ADN-ului folosind un kit de purificare PCR. După purificarea ADN-ului, probele au fost supuse qPCR și au fost normalizate la controalele de „intrare” corespunzătoare, așa cum s-a descris anterior (S17). Imunoprecipitările normale de IgG de șoarece folosind un anticorp policlonal anti-IgG de șoarece au fost de asemenea efectuate pentru a controla îmbogățirea adecvată a amplificării semnalului. Adenin fosforibosiltransferaza (APRT) a fost utilizată ca control negativ pentru experimentele de supraexpresie cu cocaină și ΔFosB. Vedea Tabel suplimentar S5 pentru secvențele primerului promotor.
Analiza coloanei dendritice
Pentru a studia rolul G9a în reglarea morfologiei neuronale in vivo, am folosit metode descrise anterior cu următoarele modificări (S1). La trei zile după injectarea cu HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-ΔJunD-GFP (toți virușii au fost utilizați la șoarecii de tip sălbatic C57Bl/6J) sau HSV-Cre-GFP (folosit în G9afl / fl șoareci), când expresia virală a fost maximă, șoarecii au fost perfuzați, creierul a fost crioprotejat și ulterior secționat la 100 μm pe un vibratom. Secțiunile au fost apoi imunocolorate folosind un anticorp împotriva GFP așa cum este descris mai sus (vezi Imunohistochimia). Pentru a evalua efectele supraexprimării și knockout-ului G9a asupra numerelor coloanei vertebrale, precum și efectul supraexprimării ΔJunD, am măsurat numărul de spini pe aproximativ 1-2 neuriți per neuron echivalent cu cel puțin 299 μm de dendrite secundare din mediul NAc care exprimă GFP. neuroni spinoși (MSN). Având în vedere că MSN-urile sunt morfologic distincte de alte populații neuronale din NAc, precum și rapoartele anterioare care indică faptul că HSV infectează în principal neuronii care exprimă DARPP-32 în această regiune a creierului (S19), suntem încrezători că MSN-urile au fost evaluate exclusiv în aceste studii. Pentru fiecare animal, am examinat ~ 6-8 neuroni la 3-4 animale per grup (7 grupuri), după care s-a obținut o valoare medie pentru fiecare animal pentru analiza statistică. Experimentele concepute pentru a examina efectele supraexprimării ΔFosB asupra densității coloanei vertebrale NAc au fost efectuate în mod similar cu cel descris mai sus, cu excepția faptului că vectorii AAV au fost utilizați pentru a exprima GFP sau ΔFosB-GFP pentru perioade lungi de timp (8 săptămâni). Toate imaginile HSV au fost capturate folosind un microscop confocal cu un obiectiv cu imersie în ulei de 100X (imaginile AAV au fost capturate cu un obiectiv cu imersie în ulei de 63X). Imaginile au fost achiziționate cu orificiul setat la 1 unitate arbitrară și o dimensiune a cadrului de 1024 × 1024. Lungimea dendritică a fost măsurată folosind software-ul NIH Image J, iar numerele coloanei vertebrale au fost numărate orb de către experimentatorul primar, deoarece diapozitivele au fost codificate înainte de scanarea experimentală. S-a calculat numărul mediu de spini la 10 μm de dendrită.
analize statistice
Au fost efectuate ANOVA uni și bidirecționale pentru a determina semnificația preferinței locului condiționat și analiza coloanei dendritice cu mai mult de două grupuri. Testele t Student au fost utilizate pentru alte comparații, inclusiv qPCR, western blot, analiza coloanei dendritice comparând HSV-GFP cu HSV-Cre în G9afl / fl șoareci, analize cu microarray (vezi mai sus) și experimente de imunoprecipitare a cromatinei. Testele t ale studentului planificate au fost utilizate în urma analizei ANOVA bidirecționale a densității coloanei dendritice după supraexprimarea ΔFosB cu confirmarea efectelor principale semnificative ale tratamentului medicamentos și ale virusului. Toate valorile incluse în legendele figurilor reprezintă media ± SEM (*p ≤ 0.05; **p < 0.001). Analize statistice detaliate pentru Fig. 1-3 în textul principal sunt date în: Legende detaliate ale figurilor, inclusiv statistici.
Note de subsol
Certific că niciunul dintre materialele incluse în manuscris intitulat Rolul esențial al histonei metiltransferazei G9a în plasticitatea indusă de cocaină au fost publicate anterior sau sunt luate în considerare în altă parte, inclusiv pe Internet.
Toate lucrările care implică utilizarea animalelor au fost efectuate în conformitate cu ghidurile instituționale și IACUC atât la Centrul Medical de Sud-Vest al Universității din Texas, cât și la Școala de Medicină Mount Sinai.
Referințe și note
;
