(HUMAN) Răspunsurile comportamentale și structurale la cocaină cronică necesită o buclă de alimentare care implică ΔFosB și proteina kinază II dependentă de calciu / calmodulină în Shell Nucleus Accumbens Shell (2013)

Factorul de transcripție ΔFosB și protein kinaza II (CaMKIIa) îmbogățită cu creier / calmodulină (CaMKIIa) sunt induse în nucleul accumbens (NAc) prin expunerea cronică la cocaină sau alte medicamente psihostimulante de abuz, în care cele două proteine ​​mediază răspunsurile sensibilizate la medicament . Cu toate că ΔFosB și CaMKIIα reglează atât expresia și funcția receptorului de glutamat AMPA în NAc, formarea coloanei vertebrale dendritice pe neuronii spinali ai NAc (MSNs) și sensibilizarea locomotivă la cocaină, nu a fost explorată până acum o legătură directă între aceste molecule. Aici, demonstrăm că ΔFosB este fosforilat de CaMKIIa la Ser27 stabilizator de proteine ​​și că CaMKII este necesar pentru acumularea mediată de cocaină a ΔFosB la NAc de șobolan.

În schimb, am arătat că ΔFosB este atât necesar, cât și suficient pentru inducerea de cocaină a expresiei genei CaMKIIa in vivo, un efect selectiv pentru D₁de tip MSN în subregiunea shell-ului NAc.

Mai mult, inducerea coloanei dendritice la MSNs NAc și creșterea receptivității comportamentale la cocaină după supraexpresia NAc a ΔFosB sunt dependente de CaMKII.

Este important să demonstram pentru prima dată inducerea ΔFosB și CaMKII în NAc din dependenți de cocaină umană, sugerând posibile obiective pentru viitoarea intervenție terapeutică. Aceste date demonstrează că ΔFosB și CaMKII se angajează într-o buclă de alimentare pozitivă specifică celulei și a regiunii cerebrale ca mecanism cheie pentru reglarea circuitului de recompensare al creierului ca răspuns la cocaină cronică.

Introducere

Dovezile în creștere susțin ideea că modificările expresiei genelor contribuie la mecanismele de dependență de droguri (Robison și Nestler, 2011). Un mediator important al acestor modificări este ΔFosB, un factor de transcripție al familiei Fos (Nestler, 2008). Administrarea cronică a oricărui medicament de abuz induce acumularea îndelungată de ΔFosB în nucleul accumbens (NAc), o regiune limbic esențială pentru comportamentele de recompensă. Sur inducerea apare specific clasei de neuron spinal neuron (MSN) NAc care exprimă receptorii dopaminergici D1. Supraexpresia inductibilă a ΔFosB în aceste MSN Nac tip D1 crește răspunsurile locomotorii și recompensă la cocaină și morfină (Kelz și colab., 1999; Zachariou și colab., 2006), inclusiv creșterea autoadministrării cocainei (Colby și colab., 2003). În plus, blocarea genetică sau virale a activității transcripționale a ΔFosB reduce efectele de recompensare ale acestor medicamente (Zachariou și colab., 2006), indicând faptul că această inducție susținută a ΔFosB este un mediator critic al modificărilor de durată induse în NAc prin administrarea cronică a medicamentului.

Stabilitatea neobișnuită a ΔFosB (relativ la toate celelalte proteine ​​de familie Fos) este atât o proprietate intrinsecă a moleculei, datorită trunchierii domeniilor degron prezente în FosB cu lungime întreagă (Carle și colab., 2007) și un proces reglementat. ΔFosB este fosforilat in vitro și in vivo la Ser27, iar această reacție stabilizează suplimentar ΔFosB, ~ 10-ori, în cultura celulară și NAc in vivo (Ulery-Reynolds și colab., 2009). Deși Ser27-ΔFosB sa dovedit a fi un substrat pentru cazein kinaza-2 in vitro (Ulery și colab., 2006), mecanismul său de in vivo fosforilarea rămâne necunoscută.

Proteina kinaza II de tip calciu / calmodulin (CaMKII) este o serină / treonin kinază foarte exprimată a cărei izoforme α și β formează homo- și hetero-holoenzimele dodecamerice in vivo, și sunt esențiale pentru multiple forme de neuroplasticitate (Lisman și colab., 2002; Colbran și Brown, 2004). CaMKIIα este indus selectiv în coaja NAc prin amfetamină cronică (Loweth și colab., 2010) și blocarea farmacologică a activității CaMKII în carcasa NAc reduce sensibilizarea comportamentală la amfetamină (Loweth și colab., 2008) și cocaină (Pierce și colab., 1998), în timp ce supraexprimarea virală a CaMKIIa în această subregiune NAc sporește sensibilizarea locomotorie și administrarea de sine a amfetaminei (Loweth și colab., 2010). CaMKIIa poate afecta comportamentele de recompensare prin modularea subunităților receptorului de glutamat AMPA (Pierce și colab., 1998), deoarece activitatea CaMKIIa a fost asociată mult timp cu funcția receptorului AMPA și direcționarea sinaptică în mai multe forme de neuroplasticitate (Malinow și Malenka, 2002).

Această literatură demonstrează mai multe paralele între ΔFosB și CaMKII: ambele sunt necesare și suficiente pentru multiplele efecte comportamentale ale medicamentelor de abuz, ambele upregulând spinele dendritice în diferite tipuri de celule neuronale in vivo (Jourdain și colab., 2003; Maze și colab., 2010) și ambele exercită cel puțin unele dintre efectele lor comportamentale prin modularea receptorilor AMPA (Kelz și colab., 1999; Malinow și Malenka, 2002; Vialou și colab., 2010). În ciuda acestor paralele, nu este cunoscută nicio legătură funcțională între ΔFosB și CaMKII. Aici, stabilim o reglementare reciprocă între ΔFosB și CaMKII și demonstrăm că cele două proteine ​​formează o buclă de alimentare cu transmitere specifică MSN-tip D1 în carcasa NAc care este indusă de cocaină și reglează o serie de răspunsuri de cocaină in vivo.

Du-te la:

Materiale și metode

Experimentul 1: analiza proteomică iTRAQ a NAc Shell și core după tratamentul cu cocaină (Fig 1A)

Adult (8 săptămâni) șobolani masculi au fost administrați 20 mg / kg de cocaină sau vehicul salin IP o dată pe zi timp de șapte zile. 24 hr după ultima injecție, carcasa și miezul NAc au fost microdisecționate (Fig 1A) și blitz înghețat. Analizele iTRAQ au fost realizate așa cum s-a descris anterior (Ross și colab., 2004; Davalos și colab., 2010).

Figura 1

Inducerea specifică a CaMKII în NAc de către cocaină

Experimentul 2: cuantificarea modificărilor de proteine ​​în nucleul NAc al șobolanului și în coaja după tratamentul cu cocaină (Fig. 1B-D)

Adult (șobolani 8 săptămâni) de șobolani au fost administrați 10 mg / kg de cocaină sau vehicul salin IP o dată pe zi timp de șapte zile în camerele de înregistrare locomotorii. Răspunsurile locomotorii la o singură injecție de cocaină (5 mg / kg IP) au fost înregistrate la acele animale tratate anterior cu cocaină (numită "cronică") și o parte din aceia tratați cu soluție salină (numit "acut") și răspunsurile locomotorii la soluție salină singur a fost înregistrată în animalele tratate cu soluție salină cronică (denumită "salină"). Analizele de activitate locomotorie s-au efectuat așa cum s-a descris (Hiroi și colab., 1997). Pe scurt, șobolanii masculi adulți au fost plasați în cutii de înregistrare în câmpuri 18 "x 24" PAS (San Diego Instruments) pentru a se obișnui cu 30 min, li s-a administrat o singură injecție IP de soluție salină și au fost monitorizate pentru un 30 min suplimentar, o singură injecție IP de 5 mg / kg de cocaină și monitorizată pentru 30 min.

24 hr după această injecție finală, șobolanii au fost decapitați fără anestezie pentru a evita efectele anestezicelor asupra nivelelor proteinelor neuronale și a stărilor fosfo-statice. Creierii au fost tăiați în serie într-o matrice 1.2 mm (Braintree Scientific) și țesutul țintă a fost îndepărtat în ser fiziologic tamponat cu fosfat conținând inhibitori de protează (Roche) și fosfatază (Sigma Aldrich) folosind un dispozitiv de calibrare 14 pentru nucleul NAc și un dispozitiv 12 țesut pentru coaja NAc (a se vedea Fig 1A) și imediat înghețate pe gheață uscată. Probele s-au omogenizat prin sonicare ușoară în tampon RIPA modificat: bază Xris, 10 mM, clorură de sodiu 150, EDTA xNUMX mM, dodecilsulfat de sodiu 1%, 0.1% Triton X-1, 100% deoxicolat de sodiu, pH 1, inhibitori de protează și fosfatază ca mai sus. După adăugarea tamponului Laemmli, proteinele au fost separate pe geluri de gradient 7.4-4% de poliacrilamaidă (Criterion System, BioRad) și Western blot a fost realizat utilizând sistemul Odyssey (Li-Cor) conform protocoalelor producătorului.

Experimentul 3: cuantificarea modificărilor de proteine ​​în nucleul NAc de șobolan și în coaja după retragerea cocainei (Fig 1E)

Adult (8 săptămâni) șobolani masculi au fost administrați 10 mg / kg de cocaină sau vehicul salin IP o dată pe zi timp de șapte zile. La 14 de zile după injecția finală, animalele tratate cu soluție salină au primit o altă injecție salină (numită "soluție salină"), iar animalelor tratate cu cocaină li sa administrat o altă injecție salină (denumită 14 zi sau "14d WD") sau o singură injecție de cocaină numit "14d WD Chal" pentru provocare). La o oră după injecția finală, animalele au fost decapitate și s-a efectuat Western blot ca în experimentul 2.

Experimentul 4: cuantificarea modificărilor de proteine ​​în nucleul NAc al șobolanului și în coca după administrarea cocainei (Fig. 2A-C)

Șobolanii au fost instruiți să-și auto-administreze 0.5 mg / kg / perfuzie de cocaină în sesiuni de o oră în cadrul unui program stabilit cu 1 pentru 9 zile. După nouă sesiuni de bază, șobolanii au fost împărțiți în două grupuri echilibrate prin aportul de cocaină în ultimele două sesiuni. Un grup de șobolani a fost lăsat să-și administreze cocaină (0.5 mg / kg / perfuzie) în sesiuni de o oră (acces scurt, ShA), în timp ce celălalt grup de șobolani au administrat cocaină în șase ore (acces lung, LgA ) pentru zece zile suplimentare (sesiuni de escaladare).

Secțiunile creierului au fost prelucrate pentru imunohistochimie așa cum s-a descris (Perrotti și colab., 2004). Creierul a fost perfuzat cu 18-24 hr după ultima expunere la medicament, ducând la degradarea oricărei proteine ​​FosB cu lungime întreagă reziduală, astfel încât toată imunoreactivitatea rămasă să reflecte ΔFosB. Această degradare a fost confirmată prin Western blotting, care nu a evidențiat o colorare semnificativă cu un anticorp îndreptat împotriva terminalului C al FosB cu lungime întreagă care nu recunoaște ΔFosB (datele nu sunt prezentate). După tăierea în secțiuni 35 μm, numărul celulelor imunopozitive ΔFosB a fost cuantificat de un observator orb în două secțiuni prin NAc al fiecărui șobolan, iar valorile medii pe câmp 40 × au fost apoi calculate pe regiune pentru fiecare animal. Fiecare animal a fost considerat o observație individuală pentru analiza statistică. Regiunile de interes au fost identificate folosind Paxinos și Watson (Paxinos și Watson, 2007).

Cuantificarea imunoreactivității CaMKIIa a fost efectuată utilizând un sistem Licor așa cum este descris (Covington și colab., 2009). Intensitățile integrate ale CaMKII și GAPDH au fost determinate cu software-ul Odyssey. Rezultatele sunt prezentate ca valori ale intensității integrate pe mm² și sunt prezentate ca mijloace ± sem (n = 4-10 pe grup). Valorile pentru GAPDH au fost utilizate ca referință pentru normalizarea intensității CaMKII pentru grosimea și condițiile de felie.

Figura 2

Inducerea CaMKII în coaja NAc a șobolanilor care administrează în mod individual și a persoanelor dependente de cocaină

Experiment 5: Cuantificarea nivelurilor de proteine ​​la persoanele dependente de cocaină (Fig 2D)

Procedură

Postmortem țesuturile creierului uman au fost obținute de la Quebec Suicide Brain Bank (Institutul Universitar de Sănătate Mentală Douglas, Montreal, Quebec, Canada). Conservarea țesuturilor a urmat în esență așa cum este descris (Quirion și colab., 1987). Pe scurt, după ce a fost extras, creierul este plasat pe gheață umedă într-o cutie de polistiren și s-au grabit la facilitățile Quebec Suicide Brain Bank. Hemispherele sunt imediat separate printr-o tăietură sagitală în mijlocul creierului, tulpina creierului și cerebelul. Vasele de sânge, glanda pineală, plexul coroid, jumătatea cerebelului și tulpina semi-cerebrală sunt de obicei disecate din emisfera stângă care este apoi tăiată coronar în felii groase 1 cm înainte de îngheț. Cea de-a doua jumătate a cerebelului este tăiată sagital în felii groase 1cm înainte de îngheț. Țesuturile sunt congelate rapid în 2-metilbutan la -40 ° C pentru ~ 60 sec. Toate țesuturile congelate sunt păstrate separat în pungi de plastic la -80 ° C pentru depozitare pe termen lung. Zonele specifice ale creierului sunt disecate din felii coronale congelate pe o placă din oțel inoxidabil, cu gheață uscată, pentru a controla temperatura mediului. Western blot a fost efectuată așa cum este descris în experimentul 2.

Cohortă

Cohorta a fost compusă din subiecți de sex feminin 37 și 3, în vârstă între 15-66 ani. Toți subiecții au murit brusc fără o stare agonală prelungită sau boală medicală prelungită. În fiecare caz, cauza decesului a fost constatată de biroul coroner al Quebecului și a fost efectuat un ecran toxicologic cu eșantioane de țesuturi pentru a obține informații despre medicamente și utilizarea substanțelor ilicite în momentul decesului. Grupul de subiecți a constat din indivizi 20 care îndeplineau criteriile SCID-I pentru dependența de cocaină. Grupul de control a fost compus din subiecți 20 fără istoric de dependență de cocaină și fără diagnostice psihiatrice majore. Toți subiecții au murit brusc din cauze care nu au avut o influență directă asupra țesutului cerebral. Grupurile au fost potrivite pentru vârsta medie a subiectului, întârzierea la refrigerare și pH-ul. Pentru toți subiecții, s-au efectuat autopsii psihologice așa cum s-a descris anterior (Dumais și colab., 2005), permițându-ne să avem acces la informații detaliate despre cazurile de istorie psihiatrică și medicală, precum și alte date clinice și sociodemografice relevante. Pe scurt, un intervievator instruit a condus Interviu clinic structurat pentru DSM-IV Tulburări psihiatrice (SCID-I) cu unul sau mai mulți informatori ai decedatului. Un grup de clinicieni au analizat evaluările SCID-I, rapoartele de caz, notele medicului legist și dosarele medicale pentru a obține diagnoze psihiatrice consensuale.

Experimentul 6: imunoprecipitarea cromatinei pentru NAc de șobolan (Fig. 3A-C)

Adult (8 săptămâni) șobolani masculi au fost administrați 10 mg / kg de cocaină sau vehicul salin IP o dată pe zi timp de șapte zile. 24 hr după ultima injecție, carcasa NAc și miezul au fost microdisecționate. S-a realizat imunoprecipitarea cromatinei (ChIP) prin punerea în pungi bilaterale NAc bilaterale de coajă sau miez de șapte șobolani per grup în grupuri totale 14 (totalul animalelor 98, grupuri 7 de cocaină, bazine saline 7). Țesuturile au fost reticulate, spălate și depozitate la -80 ° C până la forfecarea cromatinei prin sonicare. Cromatina cristalizată a fost incubată peste noapte cu anticorpi legați anterior la perle magnetice (Dynabeads M-280, Invitrogen). IgG ne-imunitar a fost utilizat ca martor. După reticulare reversibilă și purificare ADN, qPCR a fost utilizat pentru a măsura nivelurile de ADN promotor de CaMKIIa. Primerii au fost proiectați pentru a amplifica o regiune care conține o secvență de consens AP-1 localizată ~ 450 bp înainte de locul de start al transcrierii (înainte: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Figura 3

Inducerea ΔFosB specifică tipului și regiunii specifice de CaMKIIα in vivo

Experimentul 7: măsurarea transcrierii CaMKII și exprimării proteinei cu supraexpresia ΔFosB specifică tip celulă (Fig 3D)

Șoarecele bitransgenic masculin derivat din NSE-tTA (linia A) × TetOp-ΔfosB (linia 11) și NSE-tTA (linia B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (linia 11) (Chen și colab., 1998; Kelz și colab., 1999; Werme și colab., 2002; Zachariou și colab., 2006) au fost concepute și crescute pe 100 μg / ml doxiciclină pentru a suprima exprimarea ΔFosB în timpul dezvoltării. Coșmarii au fost împărțiți la înțărcare: jumătate au rămas pe doxiciclină și jumătate au trecut la apă și animalele au fost folosite 8 la 11 săptămâni mai târziu, când efectele transcripționale ale ΔFosB sunt maximale (Kelz și colab., 1999; McClung și Nestler, 2003). Pentru analizele transcripționale, șoarecii au fost decapitați rapid și creierele au fost îndepărtate și plasate pe gheață. Disecțiile de NAc au fost luate cu un pumn de ac 14-gauge și congelate rapid pe gheață uscată până când ARN-ul a fost extras. Izolarea ARN, qPCR și analiza datelor s-au efectuat așa cum s-a descris anterior (LaPlant și colab., 2009). Pe scurt, ARN a fost izolat cu reactiv TriZol (Invitrogen), purificat suplimentar cu kitul RNAeasy de la Qiagen și verificat pentru calitate cu Bioanalyzer Agilent. Transcrierea inversă a fost efectuată utilizând iScript (BioRad). qPCR a fost realizat cu un sistem PCR Applied Biosystems 7900HT RT cu următorii parametri de ciclu: 10 min la 95 ° C; 40 cicluri de 95 ° C pentru 1 min, 60 ° C pentru 30 sec, 72 ° C pentru 30 sec; încălzirea la temperatura de 95 ° C pentru generarea curbelor de disociere pentru confirmarea produselor PCR unice. Analizele imunohistochimice ale expresiei proteinei ΔFosB și CaMKIIa s-au efectuat așa cum este descris în experimentul 4.

Experiment 8: Efectele antagoniștilor intra-NAc D1 și D2 ai receptorilor dopaminergici asupra modificărilor de proteine ​​mediate de cocaină (Fig 3H)

Adult (săptămâni 8) de șobolani masculi au fost administrați 10 mg / kg cocaină sau vehicul salin (vehicul "grup") IP o dată pe zi timp de șapte zile. 30 min înainte de fiecare injecție de cocaină, șobolanii au fost tratați cu IP fie cu antagonistul receptorului D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, grupul "D1 Ant"), fie cu etiloprida antagonistului receptorului D2 (0.5 mg / kg, grupul "D2 Ant" , sau o injecție de control salină (grupul "cocaină"). 24 hr după injecția finală, animalele au fost decapitate și proteinele au fost cuantificate prin Western blotting ca pe experimentul 2.

Experimentul 9: Efectele supraexprimării ΔFosB mediată de AAV asupra expresiei proteinei (Fig. 4 A-C)

Operația stereotaxică a fost efectuată pe șobolani masculi adulți (săptămâni 8) pentru a injecta AAV-GFP (proteină fluorescentă verde) sau AAV-GFP-ΔFosB (Maze și colab., 2010). Au fost folosite ace de gabarit 33 (Hamilton) pentru toate intervențiile chirurgicale, în timpul cărora 0.5 μl de virus de înaltă titru purificat a fost infuzat bilateral pe o perioadă de timp 5 min, urmată de o perioadă suplimentară de repaus post-infuzie 5 min. Toate distanțele sunt măsurate în raport cu Bregma: unghi 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = -6.7 mm. La 14 zile după operație, animalelor li s-a administrat o singură injecție IP de 10 mg / kg de cocaină în camerele de monitorizare locomotorie pentru a evalua efectele comportamentale ale supraexprimării ΔFosB. 24 oră după această injecție finală, șobolanii au fost decapitați ca pe experimentul 2, iar microdisecția țesuturilor a fost efectuată sub îndrumarea microscopică fluorescentă pentru a obține țesutul NAc pozitiv la GFP. Apoi s-a efectuat Western blotting ca în sec Experiment 2.

Figura 4

ΔFosB este atât necesar, cât și suficient pentru inducerea inducției CaMKIIa dependentă de receptorul D1 mediată de cocaină în coaja NAc

Experimentul 10: Efectele supraexprimării DJunD mediate de AAV asupra expresiei proteinei dependente de cocaină (Fig. 4 D-F)

Injectarea stereotaxică a AAV-GFP sau AAV-GFP-ΔJunD a fost efectuată ca în felul Experiment 8. La 14 zile după operație, animalelor li s-a administrat 10 mg / kg cocaină sau vehicul cu soluție salină IP o dată pe zi timp de șapte zile în camerele de înregistrare locomotorii. Au fost înregistrate răspunsuri locomotorii la o singură injecție de cocaină (5 mg / kg IP) sau soluție salină. 24 oră după această injecție finală, șobolanii au fost decapitați, țesuturile recoltate și s-au efectuat bloturi Western, ca în Experiment 9.

Experiment 11: in vitro Analiza protein-kinazei (Fig 5A-D)

CaMKIIa recombinantă și ΔFosB au fost purificate din celulele insectelor (Brickey și colab., 1990; Jorissen și colab., 2007), s-au efectuat teste de protein kinază (Colbran, 1993), așa cum a fost descris anterior. Pe scurt, CaMKII a fost preincubat pe gheață cu 2.5 pM (sau indicată concentrație) de ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 μM calmodulin și 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilarea a fost inițiată prin adăugarea de 200 pM ATP cu sau fără [y-³²P] ATP și lăsat să se desfășoare timp de 10 min la temperatura camerei (Fig. 5A & B) sau 2 min pe gheață (Fig. 5C și D). Produsele au fost rezolvate prin Western blotting (Fig. 5A & B) sau prin numărătoare de autoradiograme și scintilații (Fig. B-D).

Figura 5

ΔFosB este un substrat puternic pentru CaMKIIα

Experimentul 12: Identificarea fosforilării Ser27 ΔFosB (Fig 5E)

In vitro kinază au fost efectuate ca în exemplul nr experimentul 11, proteinele au fost separate prin SDS-PAGE, iar benzile corespunzătoare lui ΔFosB au fost tăiate și supuse la spectrometrie de masă tandem. Alocările m / z ale fragmentelor de ion corespunzătoare în toate panourile sunt etichetate pe vârful vârfurilor de ioni. Nu toți ionii de fragment sunt etichetați datorită limitărilor spațiului. În general, textul pentru etichetele de fragment de ioni este colorat în negru, cu excepția cazului în care confirmă direct sau adăugă dovezi în prezența locurilor de fosforilare de interes, caz în care sunt marcate cu roșu. Dovezile pentru produsele de fragmentare a coloanei vertebrale sunt prezentate în citirea succesivă a fosfopeptidei cu situsul detectat de reziduu de fosforilare indicat în roșu cu o singură denumire a literei de aminoacizi. Descrierea numerică a ionilor fragmentului observat este, de asemenea, marcată pe secvența peptidică ca ioni b și y. Factorii de zoom pentru secțiunile axei m / z pentru a arăta ionii de fragment de intensitate inferioară sunt marcați în partea superioară a spectrului de masă al fiecărui fragment. Ionii de fragment prezentați în panoul H confirmă prezența izoformei fosforilate Ser27, totuși, într-un amestec de alte izoforme fosforilate la situsurile Ser28, Ser31, Ser34 și Thr37. Prezența paclorilor pa5, pa5-P, pb5 și pb5-P confirmă în mod unic fosforilarea reziduului Ser27.

Experimentul 13: Cuantificarea fosforilării Ser27 (Fig 5F)

Peptidele standard au fost concepute imitând formele fosfo și non-fosfo ale Ser27 ΔFosB. După sinteză și purificare, fiecare peptidă idiotipică "greu" a fost dizolvată într-un tampon acetonitril / apă 50 / 50 și trimisă pentru analiza aminoacizilor pentru a determina concentrația absolută pe soluția stoc de sinteză peptidică. Fiecare peptidă "greu" a fost apoi infuzată direct în spectrometrul de masă 4000 QTRAP (MS) pentru a determina cea mai bună energie de coliziune pentru fragmentarea MS / MS și două până la patru tranziții MRM. În continuare, peptidele înguste "grele" au fost supuse la LCMS pe 4000 QTRAP pentru a asigura separarea peptidelor. Instrumentul a fost rulat în mod triple quadrupole, Q1 fiind setat pe valoarea m / z precursoare specifică (Q1 nu este scanat) și Q3 setat la valoarea specifică m / z corespunzătoare unui fragment specific al acelei peptide. În modul MRM, s-au măsurat secvențial o serie de reacții individuale (tranziții de precursor / fragment de ioni în care energia de coliziune este reglată pentru a optimiza intensitatea ionilor de fragment de interes) și ciclul (de obicei 1-2 sec) întreaga perioadă de separare HPLC. Tranzițiile MRM au fost determinate din spectrele MS / MS ale peptidelor existente. Două tranziții pe peptidă, corespunzătoare ionilor de fragment de intensitate mare, au fost apoi selectate și energia de coliziune optimizată pentru a maximiza puterea semnalului de tranziții MRM utilizând software-ul de automatizare. Picurile rezultate din peptidele standard și probele ΔFosB expuse la CaMKII sau martor au fost apoi comparate pentru a determina abundența absolută a fiecărei forme de peptidă în reacție. Analiza datelor privind datele LC-MRM se efectuează utilizând software-ul AB Multiquant 1.1.

Experimentul 14: Inducerea ΔFosB în șoareci suprasolicitați cu CaMKII (Fig 5G și H)

Șoarecii transgenici care supraexprimă T286D CaMKII (Mayford și colab., 1996; Kourrich și colab., 2012) și martori de tip sălbatic au fost crescuți în absența doxiciclinei pentru a permite exprimarea transgenei. Șoarecii adulți au primit 20 mg / kg de cocaină sau de soluție salină IP o dată pe zi pentru zilele 14. 24 hr după injecția finală, animalele au fost decapitate, iar imunohistochimia și cuantificarea expresiei ΔFosB au fost efectuate ca în experimentul 4.

Experimentul 15: Efectele supraexprimării cu ΔFosB mediată de HSV și inhibarea CaMKII asupra coloanei dendritice NAc (Fig. 6A-E)

Șoarecii masculi adulți (săptămâni 8) au fost injectați stereotaxic în NAc cu HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson și colab., 2006), HSV-GFPAC3I sau HSV-GFPAC3I-ΔFosB. În aceste constructe, AC3I, un inhibitor pe bază de peptidă al activității CaMKII, este fuzionat la capătul C-terminal al GFP. GFPAC3I a fost clonat prin PCR folosind vectorul pMM400 care conține GFPAC3I ca șablon cu următorii primeri: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Produsul PCR rezultat a fost inserat în vectorii p1005 + și p1005 + -Δ FosB folosind situsurile Nhel și BspEI. Construcția a fost validată prin secvențiere. Coordonatele stereotaxice au fost: Unghiul 10 °, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot și colab., 2002). Perfuzia și secționarea creierului s-au efectuat ca în sec experimentul 4.

Analiza coloanei s-a efectuat așa cum este descris (Christoffel și colab., 2011). Pe scurt, segmentele dendritice 50-150 pm departe de soma au fost alese aleatoriu din celulele infectate cu HSV care exprimă GFP. Imaginile au fost obținute pe un LSM 710 confocal (Carl Zeiss) pentru analiza morfologică folosind NeuronStudio cu algoritmul rayburst. NeuronStudio clasifică spinii drept subțiri, ciuperci sau stubby pe baza următoarelor valori: raportul de aspect (1), raportul cap-gât (2) și diametrul capului (3). Spinii cu gât pot fi clasificați fie subțiri, fie ca ciuperci, iar cei fără gât semnificativ sunt clasificați ca fiind stubbi. Spinele cu gât sunt etichetate sub formă de subțiri sau ciuperci bazate pe diametrul capului.

Figura 6

Blocarea activității CaMKII previne efectele morfologice și comportamentale ale ΔFosB în NAc

Experimentul 16: Efectele supraexprimării ARF mediate de HSV și inhibarea CaMKII asupra răspunsurilor la cocaină (Fig 6F)

Șoarecii masculi adulți au fost injectați cu viruși în felul experimentul 15, iar răspunsurile locomotorii la o singură injecție 5 mg / kg de cocaină au fost măsurate în felul Experiment 9. Datele cu motor sunt exprimate ca întreruperi totale ale fasciculului peste 30 min după injectarea de cocaină.

informatii suplimentare

Locuințe pentru animale

Șobolani masculi Sprague Dawley (250-275 g, Charles River Laboratories) au fost adăpostiți cu pereți. Șoareci de sex masculin C57BL / 6J de șase săptămâni (Laboratorul Jackson) au fost grupați cu un număr maxim de cinci animale per cușcă. Toate animalele au fost obișnuiți cu instalația de animale pentru o săptămână ≥ 1 înainte de manipularea experimentală și au fost adăpostite în camere cu climatizare (23-25 ° C) pe un ciclu 12 hr lumină / întuneric (luminile sunt aprinse la 7: 00 AM) si apa ad libitum. Experimentele au fost efectuate în conformitate cu orientările Societății pentru Neuroștiințe și Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) de pe Muntele Sinai.

Droguri

Medicamentele au fost administrate IP și dizolvate în soluție salină sterilă, inclusiv cocaină (5-20 mg / kg pentru 10 μl pentru șoareci, pentru 1 ml pentru șobolani, NIDA) și SCH 23390 sau clorhidrat de etilopridă (0.5 mg / kg pentru 1 ml, Tocris) . Pentru chirurgia stereotaxică, șoarecii au fost anesteziați cu un "cocktail" de ketamină (100 mg / kg) și xilazină (10 mg / kg) (Henry Schein) în soluție salină sterilă.

anticorpii

CaMKIIα (total): Upstate 05-532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (total): semnal celular 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: fosfosoluții, 1: 500

GluA1 (total): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07-598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Analize statistice

Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând pachetul software Prism 6 (GraphPad). Studiile t-teste au fost utilizate pentru toate comparațiile pereche (indicate în rezultatele unde valoarea t este dată) și s-au folosit ANOVA cu o singură cale pentru toate comparațiile multiple (indicate în secțiunea de rezultate unde este dată valoarea F).

Du-te la:

REZULTATE

Cocaina cronică induce CaMKII în NAc Shell

Multe studii au indicat faptul că MSN-urile din coajă și nucleul NAc au răspunsuri biochimice și fiziologice diferite la expunerea cronică la medicamentele de abuz (Kourrich și Thomas, 2009; Loweth și colab., 2010) și că cele două subregiuni reglementează diferențiat comportamentele care caută consumul de droguri (Ito și colab., 2004). Pentru a determina efectele diferențiate ale cocainei asupra componentelor proteice ale cochiliei NAc Raport miez, am folosit etichetarea Isobar multiplexată (iTRAQ) și spectroscopia de masă tandemă (MS / MS). Sobolanii masculi adulți au fost injectați IP cu cocaină (20 mg / kg) sau cu soluție salină zilnic pentru 7; 24 hr după ultima injecție, carcasa și miezul NAc au fost microdisecționate (Fig 1A) și blitz înghețat. Proteinele din aceste probe au fost apoi cuantificate utilizând iTRAQ. Toate cele patru izoforme CaMKII au prezentat creșteri mari de exprimare după tratamentul cu cocaină care au fost specifice pentru coaja NAc comparativ cu miezul. Mai multe fosfataze proteice, inclusiv subunitățile catalitice și reglatoare PP1 și PP2A, care au fost asociate anterior cu diferite substraturi de CaMKII în alte sisteme (Colbran, 2004), a urmat un model similar. Aceste constatari au furnizat dovezi noi, impartiale ca calea de semnalizare CaMKII este reglementata proeminent de cocaina in NAc intr-o maniera specifica shell-ului.

Pentru a valida această constatare mai cantitativ, am tratat șobolanii ca mai sus cu cocaină (în doze variate) sau cu soluție salină și răspunsuri locomotorii măsurate la o doză de cocaină (5 mg / kg) sau salină. Expunerea repetată la 10 mg / kg de cocaină a determinat modelul tipic al sensibilizării locomotorii (Fig 1B). Studii ulterioare cu acest regim de dozare au evidențiat, prin utilizarea Western blotting, că cocaina repetată induce CaMKIIa selectiv în coaja NAc 24 hr după injecția finală de cocaină (Fig. 1C și D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). În plus, fosforilarea subunității canonice CaMKII Ser831 a subunității GluA1 a receptorului AMPA a fost semnificativ crescută în carcasa NAc și nu în nucleu (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), în timp ce autofosforilarea CaMKIIa Thr286 a avut o puternică, dar nu tendință semnificativă spre inducție numai în cochilie (Fig 1D). Mai mulți alți receptori ai glutamatului nu au fost afectați. În contrast cu aceste măsuri ale CaMKII, aceleași probe de țesut au prezentat inducția ΔFosB în ambele cochilii (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) și nucleul (p = 0.0350; F = 3.807; (Fig. 1C și D), conform concluziilor precedente (Perrotti și colab., 2008).

Deoarece mai multe studii anterioare privind reglementarea cocainei a receptorilor AMPA au analizat animalele după [14 zile de retragere din cocaină cronică (a se vedea Discuție), am repetat aceste analize biochimice în acest moment. Am constatat că 14 zile după injecția finală de cocaină, ΔFosB rămâne ridicată în NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), în timp ce nici CaMKII, nici fosforilarea lui GluA1 Ser831 rămâne crescutăFig 1E). Cu toate acestea, 1 hr după o singură doză 10 mg / kg de provocare de cocaină, niveluri de CaMKII total (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) și de GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; fosforilarea sunt ridicate la un nivel similar cu cel constatat după expunerea cocainei cronice inițiale (Fig 1E). Aceste date indică faptul că neuronii de coajă NAc sunt inițiați pentru inducerea CaMKII în perioade extinse de abstinență, probabil prin amorsarea directă a promotorului genei CaMKII (vezi Discuție). Mai mult, faptul că inducerea ΔFosB este mai persistentă decât inducerea CaMKII sugerează existența unor mecanisme suplimentare, bazate pe cromatină sau altfel, care exercită o "frână" asupra reglementării CaMKII, așa cum este cuprinsă în Discuție.

Pentru a consolida în continuare aceste observații, am analizat modelele de autoadministrare a cocainei, care implică consumul voluntar de droguri. Sobolanii de sex masculin adulți au primit fie acces scurt sau lung la cocaină; cum era de așteptat (Ahmed și Koob, 1998), numai condițiile lungi de acces au condus la escaladarea auto-administrării medicamentului (Fig 2A). ΔFosB a fost indus într-o măsură mai mare de lungă durată Raport accesul scurt la cocaină în ambele cochilii NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) și core (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). În contrast, CaMKIIa a fost indus în cochilia NAc numai prin accesul lung la cocaină (Fig. 2B și C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Este interesant să se compare aportul mediu zilnic de cocaină la animale cu acces scurt (~ 12 mg / kg IV), animale cu acces lung (~ 70 mg / kg IV) și animale administrate experimental (10 mg / kg) întrebați de ce acesta din urmă provoacă o inducție robustă a ΔFosB și CaMKII, în timp ce accesul scurt nu o face. Această discrepanță se datorează probabil diferențelor de niveluri maxime de cocaină (cocaina administrată de către experimenter se administrează ca un singur bolus IP, în timp ce cocaina administrată de sine este administrată prin doze multiple de IV) sau prin diferențe de lungime a expunerii la medicament (7 zile pentru experimentator administrare, zile 19 pentru autoadministrare).

În ciuda literaturii de specialitate despre DFosB și CaMKII în acțiunea de cocaină, nu există studii privind aceste proteine ​​în utilizatorii de cocaină umană. Aici, prezentăm prima dovadă că nivelele ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) și CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32)Fig 2D, Tabelul 1). Aceste date indică faptul că examinarea noastră cu privire la inducția ΔFosB și CaMKII de către cocaină la NAc de rozătoare este relevantă din punct de vedere clinic pentru dependența de cocaină umană.

Tabelul 1

Caracterizarea probelor de la dependenții de cocaină umani și grupul de control corespunzător

ΔFosB reglează transcrierea CaMKII selectiv în MSN-urile D1 de tip NAc Shell

Constatarea că atât CaMKII, cât și ΔFosB sunt reglate în sus de cocaina în NAc de rozătoare ne-a determinat să determinăm dacă ΔFosB ar putea regla transcripția genei CaMKII. Am raportat anterior CaMKIIα ca o posibilă țintă pentru ΔFosB într-o analiză imparțială cu microarray a NAc (McClung și Nestler, 2003), însă această constatare nu a mai fost validată în acest studiu. Am folosit mai întâi CHIP cantitativ (qChIP-ChIP urmat de PCR cantitativ) pentru a determina dacă ΔFosB se leagă la promotorul genei CaMKIIa în NAc la șobolanii masculi adulți și a constatat în mod izbitor că această legare este crescută semnificativ prin administrarea cocainei cronice în coajă p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), dar nu și miezul, subregiunea (Fig 3A). Pentru a înțelege în continuare mecanismele legate de această diferență specifică subregiunii în legarea ΔFosB la promotorul CaMKIIa, am folosit qChIP pentru a caracteriza starea modificărilor histonei la această regiune genomică. Studiile anterioare au demonstrat inducerea cocainei de acetilare H3 la promotorul CaMKIIa în NAc total de șoarece (Wang și colab., 2010). În schimb, am constatat că cocaina scadează acetilarea H3 la promotorul CaMKIIa selectiv în nucleul NAc (Fig 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), fără nici o schimbare aparentă în coajă, în concordanță cu modificările cromatinei specifice subregiunii dincolo de legarea ΔFosB. qChIP pentru marcajul represiv, H3 lizina dimetilată 9 (H3K9me2), a relevat tendințe de scădere atât în ​​coajă, cât și în subregiunea de bază (Fig. 3C).

Pentru a determina dacă ΔFosB reglează transcripția CaMKIIa in vivo, am folosit două linii bitransgenice de șoarece care supraexprimă inductibil ΔFosB în mod specific în D1 Raport MSN de tip D2 într-o manieră controlată prin administrarea de doxiciclină în apa de băut (Chen și colab., 1998; Kelz și colab., 1999; Werme și colab., 2002). Șoarecii adulți masculi care supraexprimă ΔFosB numai în MSNs de tip D1 au crescut semnificativ nivelele de ARNm CaMKIIa în NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), un efect care nu a fost observat la șoareci care supraexprimă ΔFosB predominant în MSNs de tip D2Fig 3D). Creșterea mARN-ului CaMKIIa, indusă de exprimarea ΔFosB în MSNs de tip D1, a fost însoțită de o creștere concomitentă a proteinei CaMKIIa în ambele cochilii NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) și miezul (p = 0.0392; = 2.275; df = 14; Figurile 3E și F). Aceste date demonstrează că ΔFosB este capabil de a conduce expresia genelor CaMKIIa în MSN de tip D1 în ambele subregiuni, deși Figura 3B sugerează că modificările cromatinei mediate de cocaină la promotorul CaMKIIa (de exemplu, acetilarea redusă) împiedică ΔFosB să upregulate CaMKII în subregiunea de bază după cocaină.

Deoarece datele noastre transgenice de la șoareci au indicat faptul că inducerea ΔFosB a expresiei genei CaMKII este specifică MSN-urilor de tip D1 în NAc, am urmărit în continuare să stabilim dacă reglarea în sus a cocainei CaMKII necesită activarea receptorului de dopamină D1. Șobolanilor masculi adulți li s-a administrat cocaină cronică sau soluție salină ca înainte, dar cu 30 de minute înainte de fiecare injecție, șobolanilor din grupul de cocaină li s-a administrat injecție IP de soluție salină, antagonistul D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) sau antagonistul receptorului D2 eticloprida (0.5 mg / kg). Animalele au fost analizate 24 de ore după ultima injecție de cocaină. Western blot a arătat că antagonistul D1, dar nu și D2, a blocat complet creșterea mediată de cocaină a osFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), după cum sa raportat anterior (Nye și colab., 1995), precum și în CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig. 3G și H). Aceste date susțin ipoteza că cocaina angajează o creștere mediată de ΔFosB în expresia genei CaMKII, în mod specific în MSNs de tip D1 ale coajei NAc. Ar fi important în studiile viitoare să se demonstreze direct acest efect specific de tip celular al cocainei asupra exprimării CaMKII în această regiune a creierului.

ΔFosB este atât necesar cât și suficient pentru inducerea de cocaină a CaMKII în NAc Shell

Pentru a completa utilizarea șoarecilor bitransgenici, am studiat în continuare rolul ΔFosB în medierea inducției de cocaină a CaMKIIα prin utilizarea transferului de gene mediate viral la șobolani. Am injectat bilateral particule virale asociate adeno-asociate (AAV) în carcasa NAc a șobolanilor masculi adulți (în cazul în care coaja poate fi vizată în mod selectiv) pentru a supraexprima ΔFosB plus GFP sau GFP în monoterapie. Animalele au primit apoi o singură injecție IP de 10 mg / kg de cocaină. Animalele care supraexprimă ΔFosB / GFP au prezentat un răspuns locomotor crescut în comparație cu animalele care supraexprimă GFP în monoterapie (Fig 4A). 24 hr după injectarea de cocaină unică, țesutul NAc GFP-pozitiv a fost excizat de la aceste animale prin disecție sub o sursă de lumină fluorescentă. Western blotting de acest țesut (Fig. 4B și C) a arătat o supraexprimare puternică a ΔFosB, precum și o creștere semnificativă a proteinei totale CaMKIIa comparativ cu animalele GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), similar cu inducția observată cu administrarea cocainei cronice. În plus, autofosforilarea CaMKIIa la Thr286 (indicând activarea enzimei) a fost mărită prin supraexprimarea ΔFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), așa cum a fost fosforilarea substratului CaMKII, Ser831 de GluA1 (p = 0.0540; df = 2.012), repetând din nou acțiunile de cocaină cronică (Fig. 1C și D). Tîmpreună, aceste date oferă dovezi suplimentare că expresia ΔFosB în coaja NAc este suficientă pentru sensibilizarea locomotorie la cocaină și pentru inducerea și activarea CaMKII în această subregiune.

Am folosit o abordare similară pentru a determina dacă ΔFosB este, de asemenea, necesară pentru inducerea mediată de cocaină a CaMKIIα în coaja NAc. AAV a fost utilizat pentru a supraexprimă o proteină JunD trunchiată, denumită ΔJunD, care este un regulator negativ al activării transcripționale ΔFosB (Winstanley și colab., 2007) plus GFP sau GFP în monoterapie. Două săptămâni mai târziu, când expresia transgenei este maximă, animalelor li s-a administrat cocaină (10 mg / kg) sau soluție salină zilnic timp de 7 zile și testat pentru răspunsuri locomotorii la o provocare de cocaină (5 mg / kg) 24 hr după ultima injectare cronicăFig 4D). Supraexpresia ΔJunD a împiedicat sensibilizarea locomotorie la cocaină și, de asemenea, a împiedicat inducerea și activarea CaMKIIa în carcasa NAc (Fig. 4E și F; p = 0.0437; F = 2.997; total df = 38), indicând faptul că activitatea transcripțională ΔFosB este necesară pentru inducerea mediată de cocaină a CaMKIIα în această subregiune. Interesant, am constatat că ΔJunD a redus nivelele de ΔFosB atât în ​​condițiile tratate cu soluție salină cât și cu cocaină (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), ridicând posibilitatea ca ΔFosB să depindă de activitatea AP-1 pentru propriile niveluri de exprimare.

CaMKII fosforilează ΔFosB la Ser27

Utilizarea in vitro determinări ale protein kinazei, am stabilit că ΔFosB purificat este un substrat robust pentru CaMKIIa. Incubarea lui₆-ΔFosB cu CaMKIIα și ATP a determinat o deplasare ascendentă în mobilitatea electrophoretică a ΔFosB (Fig 5A); mai multe benzi rezultate au sugerat multiple situri de fosforilare. asemănător in vitro kinază folosind [y-³²P] ATP a prezentat încorporarea fosfatului radiomarcat în benzile ΔFosB deplasate (Fig 5B), care demonstrează fosforilarea directă a proteinei. Am generat un anticorp specific fosfos la Ser27 caracterizat anterior de ΔFosB (Ulery și colab., 2006). Deși acest anticorp nu produce un semnal împotriva extractelor creierului care conțin DFosB fosforilat de Ser27 (datele nu sunt prezentate), am putut detecta fosforilarea Ser27 în in vitro kinazei folosind CaMKII (Fig 5B). Analizele cinetice ale fosforilării CaMKII a ΔFosB indică faptul că acesta este un substrat puternic pentru kinază (Fig. 5C), cu un aparent K_M de 5.7 ± 2.0μM și K_CAT din 2.3 ± 0.3min^-1. Aceste rezultate sunt comparabile cu multe bine caracterizate in vivo substraturile de CaMKII (Colbran și Brown, 2004). În plus, am stabilit că CaMKII fosforilează ΔFosB cu o stoichiometrie de 2.27 ± 0.07 mol / mol (Fig 5D), indicând faptul că există cel puțin trei situsuri de fosforilare cu CaMKII în His₆- Proteina ΔFosB, în acord cu Fig 5A.

Pentru a investiga site-urile individuale de fosforilare, am folosit analize MS ale probelor de la noi in vitro kinază. Fig 5E demonstrează fosforilarea ΔFosB la Ser27 caracterizat anterior și la câteva situsuri adiționale (datele nu sunt prezentate). Având în vedere caracterizarea funcțională prealabilă a Ser27, ne-am concentrat pe acest loc prin generarea peptidelor sintetice marcate imită stadiile fosfo- și nefosfatice ale Ser27, apoi am folosit cantități cunoscute de aceste peptide ca standarde în analizele MRM ale ΔFosB înainte și după in vitro fosforilarea prin CaMKII. Cuantificarea ulterioară (Fig 5F) confirmă faptul că Ser27 este un substrat puternic pentru CaMKII. Aceste rezultate indică faptul că, printre resturile fosforilate multiple din ΔFosB, Ser27 este un substrat deosebit de eficient pentru CaMKII.

CaMKII mediază acumularea de cocaină a ΔFosB în NAc Shell

Deoarece CaMKII poate fosforila ΔFosB in vitro la un loc care-i îmbunătățește dramatic stabilitatea in vitro și in vivo (Ulery și colab., 2006; Ulery-Reynolds și colab., 2009), am determinat dacă activitatea CaMKII controlează nivelul ΔFosB în NAc in vivo. Pentru a aborda această întrebare, am folosit mai întâi o linie de șoarece care supraexprimă un mutant independent de calciu de CaMKIIα (T286D) în multiple regiuni ale creierului, incluzând NAc (Mayford și colab., 1996; Kourrich și colab., 2012). Am injectat adulți masculi de sex masculin, adulți masculi, de sex masculin și alții de tip sălbatic, cu 20 mg / kg de cocaină sau soluție salină o dată pe zi pentru zilele 14, apoi au analizat animalele la o zi după injecția finală. Am constatat că nivelele bazale ale ΔFosB au fost crescute la animalele mutante din coaja NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), dar nu de bază (Fig. 5G și H). Surprinzător, inducerea dependenței de cocaină a ΔFosB a fost blocată la animalele mutante atât în ​​cochilie, cât și în miez, sugerând că, deși CaMKII poate regla direct stabilitatea ΔFosB în coaja NAc, ea poate de asemenea să se situeze în amonte de ΔFosB în căile activate cu cocaină în ambele subregiuni NAc .

Activitatea CaMKII este necesară pentru plasticitatea structurală și comportamentală mediată de ΔFosB

Inducerea de cocaina a coloanei dendritice pe MSNN NAc este una dintre cele mai bine stabilite induse de medicamente adaptate în această regiune a creierului, și o astfel de inducere a coloanei vertebrale a fost corelată cu răspunsurile comportamentale sensibilizate la medicament (Robinson și Kolb, 2004; Russo și colab., 2010) și raportate a fi selective pentru MSN-uri tip D1 (Lee și colab., 2006). Am demonstrat recent că inducerea de cocaină a coloanei dendritice în NAc depinde de ΔFosB și de programul transcripțional în aval (Maze și colab., 2010). Deși există o literatură extensivă privind implicarea CaMKII în morfologia și inducerea coloanei vertebrale dendritice în alte regiuni ale creierului și sisteme experimentale (Jourdain și colab., 2003; Penzes și colab., 2008; Okamoto și colab., 2009), rolul său în formarea coloanei vertebrale NAc MSN nu a fost studiat. De aceea, am determinat dacă este necesară activitatea CaMKII pentru inducerea splinei dendritice MSN mediată de ΔFosB prin utilizarea supraexprimării mediate de HSV a peptidei inhibitor de CaMKII AC3I fuzionată cu GFP, un construct anterior arătat că inhibă activitatea CaMKII in vivo (Zhang și colab., 2005; Klug și colab., 2012). Supraexprimarea virală a osFosB în coaja NAc a șoarecilor adulți a indus o creștere semnificativă a densității coloanei dendritice MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig. 6A și B), după cum sa raportat anterior (Maze și colab., 2010), iar această creștere a fost determinată în principal de tipurile de coloană subțire (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59;) și de stubby (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59);Fig. 6C-E). Nu a fost observat nici un efect asupra coloanei mai mature, în formă de ciupercă. Cu toate acestea, atunci când GFP-AC3I a fost coexprimat, inducerea ΔFosB de spini a fost complet abrogată (Fig. 6A-E), indicând faptul că activitatea CaMKII este necesară pentru inducerea ΔFosB a coloanei dendritice în coaja NAc.

Apoi am folosit aceleași instrumente virale pentru a determina dacă este necesară activitatea CaMKII pentru efectele ΔFosB asupra sensibilității comportamentale la cocaină. 72 oră după injectarea virală în coajă NAc, animalelor i sa administrat o singură injecție de 5 mg / kg de cocaină și a fost înregistrată activitatea lor locomotorie. Așa cum am arătat anterior cu o supraexprimare mai mare a AAV a ΔFosB (Fig 4A), Supraexpresia mediată de HSV a ΔFosB a crescut sensibilitatea locomotorie la cocaină (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Fig 6F). Ca și la inducerea coloanei dendritice, inhibarea activității CaMKII prin coexprimarea GFP-AC3I a blocat complet creșterea ADN-ului mediată de ΔFosB în sensibilitatea cocainei, indicând faptul că activitatea CaMKII este necesară pentru modificările induse de ΔFosB în efectele comportamentale ale cocainelor.

Du-te la:

Discuție

Prezentul studiu descrie un nou mecanism de avansare în care cocaina induce DFosB în NAc, care reglează în mod selectiv transcripția genei CaMKIIa selectiv în carcasa NAc. CaMKIIa ulterior fosforilează și stabilizează ΔFosB conducând la o acumulare mai mare de ΔFosB și la o inducție suplimentară a CaMKIIa (Fig 6G). Nivelurile co-escaladate ale celor două proteine ​​în timpul expunerii cronice la cocaină contribuie apoi în moduri esențiale la răspunsurile comportamentale sensibilizate la medicament. Aceasta este o ipoteză deosebit de atrăgătoare, deoarece atît ΔFosB, cît și CaMKII s-au dovedit a fi anterior necesare pentru creșterea răspunsurilor comportamentale la cocaină (Pierce și colab., 1998; Peakman și colab., 2003) și replicăm această constatare pentru ΔFosB în coaja NAc folosind în mod specific o abordare virală (Figurile 4 și and66).

Deși o supraexprimare transgenică a ΔFosB în MSN de tip D1 poate conduce inducția CaMKII atât în ​​cochilia NAc, cât și în miezul animalelor naive cu cocaină, în contextul cocainei, acumularea de ΔFosB endogen, care apare în ambele subregiuni, conduce inducerea CaMKII în special în coaja NAc . Această diferență se poate referi la nivelele mai ridicate de ΔFosB induse în modelul nostru bitransgenic, cu toate acestea, ar putea de asemenea să reflecte capacitatea cocainei de a modifica diferențiat promotorul CaMKIIa în coajă Raport MSN-urile de bază să promoveze legarea ΔFosB în prima sau să o excludă în subregiunea din urmă. De fapt, datele ChIP noastre, care dezvăluie o deacetilare mediată de cocaină a histonilor la promotorul genei CaMKIIa din nucleul NAc, susțin posibila implicare a unui mecanism cromatinei. În conformitate cu această ipoteză, supraexprimarea ΔFosB în MSNs tip D1 a fost capabilă să conducă inducerea CaMKIIα în nucleul NAc în absența cocainei (Fig 3F), sugerând că există modificări active ale promotorului de CaMKIIa care împiedică această inducție în timpul expunerii cocainice cronice. Reglarea peisajului cromatinei la promotorul CaMKII ar putea explica, de asemenea, de ce CaMKII este indus de o doză de provocare de cocaină în coaja NAc a șobolanilor cronici coborâți cronicFig 1E), dar nu și a animalelor naivă (Fig 1D). Aceasta ar putea reprezenta un efect epigenetic "de primare a genei" al ΔFosB (Robison și Nestler, 2011) și ar putea fi astfel un mecanism molecular al incubării poftei de cocaină (Pickens și colab., 2011). Cu toate acestea, pentru ca această modificare a cromatinei să fie legată cauzal de incubarea dorinței, ar trebui să crească în timp. Va fi interesant să se determine dacă acest lucru este cazul și să se studieze dacă alte gene prezintă reguli specifice subregiunii dependente de ΔFosB de către cocaină. De asemenea, este important de menționat că bucla de feed-forward pe care o descriem nu duce la o acumulare nesfârșită de CaMKII sau ΔFosB (Fig 1E); descoperirea "frânei" moleculare responsabilă de acest lucru este un obiectiv important al studiilor viitoare.

Funcțiile cunoscute ale ΔFosB și CaMKII în mai multe sisteme experimentale și regiuni ale creierului se convertesc la mai multe niveluri (Fig 6F). Ambele molecule sunt în strânsă legătură cu creșterea coloanei dendritice: CaMKII interacționează cu citoscheletul actinic (Okamoto și colab., 2009), reglează dimensiunea capului coloanei vertebrale (Matsuzaki și colab., 2004) și este atât necesară, cât și suficientă pentru creșterile induse de plasticitate în numărul de filopodie și sinapsă în culturile de felie hipocampală (Jourdain și colab., 2003), wDFosB este atât necesar, cât și suficient pentru formarea coloanei dendritice induse de cocaină în MSNs NAc (Maze și colab., 2010). În plus, ambele molecule au fost asociate cu reglarea receptorilor de glutamat AMPA. CaMKII nu reglează nivelurile totale ale subunităților receptorului AMPA, ci conduce inserția receptorilor AMPA în sinapse și mărește conductivitatea canalului AMPA prin fosforilarea GluA1 la Ser831 în neuronii piramidali hippocampali în cultură și in vivo (revizuit în (Malinow și Malenka, 2002; Colbran și Brown, 2004)). Un astfel de trafic crescut de GluA1 la sinapse a fost implicat și în acțiunea cocainei cronice (Boudreau și Wolf, 2005). Mai mult, răspunsurile comportamentale la activarea receptorului AMPA în NAc sunt îmbunătățite prin supraexprimarea CaMKIIa într-o manieră dependentă de receptorul de dopamină D1 (Singer și colab., 2010). Supraexpresia specifică D1-specifică lungă a ΔFosB sa dovedit a induce transcripția GluA2 în NAc (Kelz și colab., 1999), care atenuează răspunsurile AMPA mediate prin GluA1, în timp ce arătăm aici că o suprapresiune a ΔFosB pe termen scurt - precum și o expunere mai scurtă la cocaină - nu au niciun efect asupra acestei subunități (Fig 1). Cu toate acestea, am constatat recent că supraexpresia ΔFosB pe termen scurt reduce cu toate acestea răspunsurile AMPA în MSN-uri tip D1 în NAc (Grueter și colab., 2013). Aceste date sugerează mecanisme temporare distincte care ar putea constitui o serie de neuroadaptări dependente de timp pentru cocaină care stau la baza diferitelor aspecte ale progresiei dependenței care încă nu au fost bine înțelese. La nivelul comportamentului, atât CaMKII, cât și ΔFosB sunt necesare pentru sensibilizarea locomotorie la cocaină (vezi mai sus), ambele fiind necesare pentru autoadministrarea cocainei susținută la rozătoare (Colby și colab., 2003; Wang și colab., 2010), sugerând că cele două proteine ​​sunt importante atât pentru adaptarea comportamentală pe termen scurt, cât și pentru cea pe termen lung la expunerea la medicament, deși prin mecanisme subiacente parțial distincte. Probabil, ΔFosB și CaMKII reglementează astfel de adaptări comportamentale complexe prin modificări ale funcției sinaptice NAc, deși sunt necesare mult mai multe eforturi pentru a lega direct fenomenele sinaptice la schimbările comportamentale.

Holoenzima CaMKII simultan interacționează cu o varietate de proteine ​​asociate sinapselor (Robison și colab., 2005) care se crede că reglează direcționarea spre densitatea postsynaptică (PSD), un fenomen sugerat a fi important pentru plasticitatea sinaptică. În particular, sa demonstrat recent că interacțiunea CaMKII cu subunitatea GluN2B a receptorului glutamat de tip NMDA a reglat atât plasticitatea sinaptică cât și învățarea (Halt și colab., 2012). În timp ce peptida AC3I imită domeniul autoinhibitor al CaMKII și astfel inhibă activitatea catalitică enzimatică, blochează de asemenea multiple interacțiuni proteine-proteine ​​(Strack și colab., 2000; Robison și colab., 2005). Astfel, efectele comportamentale și morfologice ale HSV-GFP-AC3I raportate aici ar putea apărea prin reducerea fosforilării proteinelor țintă cu CaMKII, modificări ale direcționării cu CaMKII sau o schimbare a rolului structurat propus al CaMKII la sinapse (Lisman și colab., 2002).

Restrictionarea buclei propuse de ΔFosB-CaMKII la coaja NAc este o nota speciala, deoarece lucrarile recente au demonstrat mai multe diferente fiziologice intre coaja NAc si nucleul ca raspuns la administrarea cocainei, o notiune confirmata de datele noastre impartite iTRAQ (Tabelul S1) . MSN în carcasa NAc prezintă o depresie în capacitatea de ardere după cocaină cronică, care este susținută timp de săptămâni, în timp ce MSN-urile de bază din aceleași animale prezintă o creștere tranzitorie (1-3 zi) a capacității de ardere care revine la nivelurile bazale în săptămânile 2Kourrich și Thomas, 2009). În plus, numeroase proteine ​​sinaptice sunt reglementate diferențial în coaja NAc Raport miezul animalelor expuse cocainei cronice, inclusiv GluA2 (Knackstedt și colab., 2010). Deoarece amfetamina cronică induce CaMKIIa specific în coaja NAc (Loweth și colab., 2010), nu este surprinzător faptul că găsim un efect similar cu cocaina. Cu toate acestea, deoarece ΔFosB este indus în cochilia și nucleul NAc de cocaină cronică (Perrotti și colab., 2008) și deoarece arată că inducerea CaMKIIa în coajă este dependentă de ΔFosB, descoperirile noastre oferă noi dovezi pentru mecanismele transcripționale distincte la promotorul CaMKIIa între aceste două subregiuni, care sunt responsabile pentru inducerea selectivă a CaMKIIα în coajă.

O multitudine de lucrări recente s-au concentrat asupra delimitării diferențelor dintre MSN-urile Nc de tip D1 și D2. Deși ambii receptori D1 și D2 sunt implicați în efectele recompensatoare ale cocainei (Self, 2010), lucrarea recentă demonstrează că activarea optogenetică a MSN de tip D1 crește răspunsurile comportamentale la cocaină, în timp ce activarea MSN de tip D2 are efectul opus (Lobo și colab., 2010). În concordanță cu aceste constatări, șoarecii D1-receptor knock-out sunt deficienți în achiziția de auto-administrare a cocainei (Caine și colab., 2007), în timp ce D2 knockouts nu sunt (Caine și colab., 2002). Administrarea agonistă D1 direct în NAc declanșează comportamentul de căutare a cocainei în paradigmele de restaurare (Self, 2010). Interesant, acest efect necesită creșteri dependente de receptorul D1 în activitatea CaMKII în coaja NAc, dar nu de bază (Anderson și colab., 2008), un rezultat care se potrivește frumos cu buclă DFosB-CaMKII specifică D1 și shell propusă aici.

Am raportat anterior că Ser27 în ΔFosB poate fi fosforilat de casein kinază-2 (Ulery și colab., 2006), totuși, stabilim aici că CaMKII fosforilează ΔFosB la acest și la alte situsuri cu cinetică mult mai mare și stoechiometrie și poate replica cea mai mare aparentă M_r observat pentru ΔFosB (Fig 5A) cu expunerea la cocaină in vivo (Nestler, 2008). Știm deja că fosforilarea Ser27 mărește stabilitatea ΔFosB și activitatea transcripțională (Ulery și colab., 2006; Ulery și Nestler, 2007; Ulery-Reynolds și colab., 2009). Activitatea viitoare se va concentra acum pe identificarea și consecințele funcționale ale siturilor noi ale fosforilării ΔFosB indicate de prezentul studiu.

Buclele de alimentare descrise aici oferă un nou mecanism plauzibil prin care administrarea repetată de cocaină conduce la anomalii progresive în NAc. Ca atare, această cale biochimică poate oferi o țintă importantă pentru intervenția terapeutică viitoare în tulburările de dependență. Deoarece CaMKII este omniprezent și necesar pentru multe funcții bazale neuronale și comportamentale, utilizarea directă a inhibitorilor de CaMKII a fost evitată ca tratament de dependență. Datele noastre sugerează că direcționarea mai subtilă a mecanismului de inducere a CaMKII, care este specific unui tip de celulă și subregiune individuală a circuitului recompensat al creierului, ar putea oferi o țintă terapeutică care să evite complicațiile inhibării sistemice a CaMKII.

Du-te la:

Mulţumiri

Această lucrare a fost susținută de granturile de la Institutul Național pentru Abuzul de Droguri (EJN), Centrul de Proteomică NIDA-Yale DA018343 (AJR și EJN) și Fundația Hartwell (AJR). Autorii ar dori să-i mulțumească lui Gabby Rundenko pentru darul generos al ΔFosB purificat și Roger Colbran pentru darul generos de CaMKIIα purificat.

Du-te la:

Referinte

1. Ahmed SH, Koob GF. Tranziția de la consumul de droguri moderat la excesiv: schimbarea punctului de referință hedonic. Ştiinţă. 1998; 282: 298-300. [PubMed]
2. Anderson SM, Celebrul KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: o punte biochimică care leagă sistemele accumbens de dopamină și glutamat în căutarea cocainei. Nat Neurosci. 2008; 11: 344-353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Sensibilizarea comportamentală față de cocaină este asociată cu creșterea expresiei suprafeței receptorului AMPA în nucleul accumbens. J Neurosci. 2005; 25: 9144-9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Exprimarea și caracterizarea subunității alfa a protein kinazei II de tip Ca2 + / calmodulin dependentă folosind sistemul de expresie a baculovirusului. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578-584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L., Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Rolul receptorilor de dopamină D2 în autoadministrarea cocainei: studii cu șoareci mutanți receptor D2 și noul receptor D2 antagoniști. J Neurosci. 2002; 22: 2977-2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Lipsa autoadministrării cocainei în șoarecii cu dopamină D1 knock-out. J Neurosci. 2007; 27: 13140-13150. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mecanisme dependente de proteazom și independente pentru destabilizarea FosB: identificarea domeniilor FosB degron și implicațiile pentru stabilitatea DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007; 25: 3009-3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Animale transgenice cu expresie genică inductibilă, țintită în creier. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495-503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robinson AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinaza reglementează plasticitatea sinaptică și comportamentală indusă de stresul social provocat de pierderea socială. J Neurosci. 2011; 31: 314-321. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inactivarea protein kinazei II dependente de calminul Ca2 + / / calmomulină prin autofosforilarea bazală. J Biol Chem. 1993; 268: 7163-7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteina fosfatazelor și plasticitatea sinaptică dependentă de proteina kinază II dependentă de calciu / calmodulină. J Neurosci. 2004; 24: 8404-8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Proteina kinaza II dependentă de calciu / calmodulin și plasticitatea sinaptică. Curr Opin Neurobiol. 2004; 14: 318-327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Supraexpresia specifică de tip celular de tip Striatal a DeltaFosB sporește stimularea cocainei. J Neurosci. 2003; 23: 2488-2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler E J. Acțiunile antidepresive ale inhibitorilor de deacetilază ai histonei. J Neurosci. 2009; 29: 11451-11460. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Proteomica cantitativă a proteinelor reglate de caveolin-1: caracterizarea polimerazei i a factorului de eliberare a transcripției / celulelor endoteliale CAVIN-1 IN. Mol Cell Proteomics. 2010; 9: 2109-2124. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Factori de risc pentru completarea suicidului în depresie majoră: un studiu de caz-control al comportamentelor impulsive și agresive în bărbați. Am J Psihiatrie. 2005; 162: 2116-2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB modulează în mod diferențial funcția nucleului accumbens direct și indirect. Proc Natl Acad Sci SUA. 2013 în presă. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Legarea CaMKII la GluN2B este critică în timpul consolidării memoriei. EMBO J. 2012; 31: 1203-1216. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Șoareci mutanți FosB: pierderea inducției cronice de cocaină a proteinelor legate de Fos și sensibilitate sporită la efectele psihomotorii și recompensante ale cocainei. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397-10402. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Controlul diferențial asupra comportamentului de căutare a cocainei de către nucleul nucleului accumbens și coajă. Nat Neurosci. 2004; 7: 389-397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizarea și proprietățile de legare a ADN ale factorului de transcripție DeltaFosB. Biochimie. 2007; 46: 8360-8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Proteina kinaza II dependentă de calciu / calmodulin contribuie la dezvoltarea filopodiei și a coloanei vertebrale dependentă de activitate. J Neurosci. 2003; 23: 10645-10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Exprimarea factorului de transcripție deltaFosB în creier controlează sensibilitatea la cocaină. Natură. 1999; 401: 272-276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Inhibarea genetică a CaMKII în neuronii spinali ai mediei striate dorsale reduce sinapsele funcționale și stimulează excitația intrinsecă. Plus unu. 2012; 7: e45323. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Exercițiul de extincție după administrarea de cocaină autoadministrează plasticitatea glutamatergică pentru a inhiba căutarea cocainei. J Neurosci. 2010; 30: 7984-7992. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Similar neuroni, adaptări opuse: experiența psihostimulantului modifică diferențial proprietățile de ardere în nucleul accumbens față de coajă. J Neurosci. 2009; 29: 12275-12283. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Efectul independent al alphaCaMKII Striatal promovează sensibilizarea recompensei de cocaină. J Neurosci. 2012; 32: 6578-6586. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Rolul factorului nuclear kappaB în hipersensibilitatea la stres mediată de hormonul ovarian la șoarecii de sex feminin. Biol Psihiatrie. 2009; 65: 874-880. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Cocaina indusă de formarea coloanei dendritice în D1 și D2 receptorul dopaminergic conținând neuroni spini medii în nucleul accumbens. Proc Natl Acad Sci SUA A. 2006; 103: 3399-3404. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Baza moleculară a funcției CaMKII în memoria sinaptică și comportamentală. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175-190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler E J. Pierderea specifică a tipului de celule de semnalizare BDNF imită controlul optogenetic al recompensei de cocaină. Ştiinţă. 2010; 330: 385-390. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibarea CaMKII în carcasa nucleului accumbens scade aportul crescut de amfetamină la șobolanii sensibilizați. Neurosci Lett. 2008; 444: 157-160. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
33. Lowe JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamin H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Supraexpresia tranzitorie a proteinei kinazei alfa-Ca2 + / calmodulin dependentă în nucleul accumbens shell îmbunătățește răspunsul comportamental la amfetamină. J Neurosci. 2010; 30: 939-949. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Traficul AMPA receptor și plasticitatea sinaptică. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103-126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Bazele structurale ale potențierii pe termen lung în coloanele unice dendritice. Natură. 2004; 429: 761-766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Controlul formării memoriei prin expresia reglementată a transgenei CaMKII. Ştiinţă. 1996; 274: 1678-1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Rolul esențial al histonmetiltransferazei G9a în plasticitatea indusă de cocaină. Ştiinţă. 2010; 327: 213-216. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Reglementarea expresiei genelor și a recompensei cocainei de către CREB și DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003; 6: 1208-1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Revizuire. Mecanisme transcripționale ale dependenței: rolul DeltaFosB. Philos Trans R. Soc Lond. B Biol Sci. 2008; 363: 3245-3255. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Studii farmacologice privind reglarea inducției cronice asociate cu FOS cu cocină în striatum și nucleul accumbens. J. Pharmacol Exp Ther. 1995; 275: 1671-1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Rolul CaMKII și F-actinei în plasticitatea structurală a coloanei dendritice: o identitate moleculară potențială a unei etichete sinaptice? Fiziologie (Bethesda) 2009; 24: 357-366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB în nucleul accumbens reglează comportamentul instrumental și motivația armată de alimente. J Neurosci. 2006; 26: 9196-9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Creierul șobolanului în coordonate stereotaxice. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Explicarea specifică a regiunii cerebrale a unui mutant negativ dominant al c-Jun la șoarecii transgenici reduce sensibilitatea la cocaină. Brain Res. 2003; 970: 73-86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Convergentul CaMK și semnalele RacGEF controlează structura și funcția dendritică. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405-413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Inducția deltaFosB în structurile cerebrale legate de recompense după stresul cronic. J Neurosci. 2004; 24: 10594-10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Modele distincte ale inducției DeltaFosB în creier prin medicamente de abuz. Synapse. 2008; 62: 358-369. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiologia incubării poftei de droguri. Tendințe Neurosci. 2011; 34: 411-420. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Calculele mediate secundar modulează expresia sensibilizării comportamentale la cocaină. J. Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171-1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autoradiografia receptorului creierului uman folosind secțiunile întregi ale emisferei: o metodă generală care minimizează artefactele tisulare. Synapse. 1987; 1: 446-454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Plasticitate structurală asociată expunerii la medicamente de abuz. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Mecanisme transcripționale și epigenetice ale dependenței. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623-637. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Interacțiuni interacțioase ale protein kinazei II cu calciu / calmodulin dependent cu proteinele de densitate postsynaptică NR2B, densin-180 și alfa-actinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329-35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, Pappin DJ. Multiplicarea cantității de proteină multiplicată în Saccharomyces cerevisiae utilizând reactivi de etichetare izobric reactiv cu amină. Mol Cell Proteomics. 2004; 3: 1154-1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Sinapsei dependente: mecanismele plasticității sinaptice și structurale în nucleul accumbens. Tendințe Neurosci. 2010; 33: 267-276. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
56. Auto DW. În: Receptorii de dopamină. Neve KA, redactor. New York: Humana Press; 2010. pp. 479-524.
57. Singerul BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Supraexpresia mediată de virală tranzitorie a proteinei kinazei alfa-calciu / calmodulin dependentă în coaja nucleului accumbens conduce la o reglare funcțională de lungă durată a alfa-amino-3-hidroxil-5 receptori metil-4-izoxazol-propionat: receptor de tip dopaminat-1 și dependență de protein kinază A. Eur J Neurosci. 2010; 31: 1243-1251. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mecanismul și reglarea protein kinazei II dependentă de calciu / calmodulină care vizează subunitatea NR2B a receptorului N-metil-D-aspartat. J Biol Chem. 2000; 275: 23798-23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilarea lui DeltaFosB mediază stabilitatea sa in vivo. Neuroscience. 2009; 158: 369-372. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Reglarea activității de transcripție DeltaFosB prin fosforilare Ser27. Eur J Neurosci. 2007; 25: 224-230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Reglarea stabilității DeltaFosB prin fosforilare. J Neurosci. 2006; 26: 5131-5142. [PubMed]
62. Vialou V, și colab. DeltaFosB în circuitele de recompensare a creierului mediază rezistența la stres și răspunsurile antidepresive. Nat Neurosci. 2010; 13: 745-752. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Acetilarea H3 indusă de cocaină cronică și activarea transcripțională a CaMKIIalpha în nucleul accumbens este critică pentru motivația pentru întărirea medicamentului. Neuropsychopharmacology. 2010; 35: 913-928. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reglează rularea roților. J Neurosci. 2002; 22: 8133-8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Inducția DeltaFosB în cortexul orbitofrontal mediază toleranța la disfuncția cognitivă indusă de cocaină. J Neurosci. 2007; 27: 10497-10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Un rol esențial al DeltaFosB în nucleul accumbens în acțiunea morfinei. Nat Neurosci. 2006; 9: 205-211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, prețul EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibarea calmodulin kinazei II protejează împotriva bolilor cardiace structurale. Nat Med. 2005; 11: 409-417. [PubMed]