Sursă
Institutul Nathan Kline, Orangeburg, New York, 10962, SUA. [e-mail protejat]
Abstract
Copiii și adolescenții sunt din ce în ce mai expuși la psihostimulante, fie în mod ilicit, fie în tratamentul afecțiunilor neuropsihice comune, cum ar fi tulburarea de deficit de atenție cu sau fără hiperactivitate. În ciuda utilizării pe scară largă a stimulentelor psihomotorii la grupurile de vârstă mai mică, este puțin cunoscută răspunsurile neuroadaptative moleculare cronice la acești agenți în creierul imatur. Aici demonstrăm că, după administrarea cronică a psihostimulanților cocaină și amfetamina, factorul de transcripție DeltaFosB este reglată în nucleul accumbens al lui periadolescent soareci dar nu în post-weanling sau adult soareci. Inducerea DeltaFosB apare și în exclusivitate în periadolescent soareci după amfetamina administrare. Aceste rezultate demonstrează plasticitatea unică în creierul adolescent al unei molecule critice care reglează acțiunea psihostimulantă și sugerează că aceste modificări neuroadaptative pot fi implicate în medierea sporită tendințe dependente de adolescent față de adult.
Introducere
Psihostimulantele sunt utilizate în tratamentul tulburărilor copilariei frecvente, cum ar fi tulburarea de hiperactivitate cu deficit de atenție. În plus, abuzul de stimulente, inclusiv amfetamina și cocaina, este obișnuit în rândul adolescenților, o vârstă la care există dovezi ale tendințelor de dependență sporite față de adulți (Estroff și colab., 1989; Myers și Anderson, 1991). În ciuda datelor care indică efecte comportamentale reglementate în dezvoltare, este puțin cunoscută răspunsurile neuroadaptive moleculare la creierul imatur care apar în timpul administrării acestor agenți. Cocaina și amfetamina pot provoca schimbări comportamentale de lungă durată parțial prin stimularea dopaminei D1receptorilor și creșterea nivelurilor factorilor de transcripție, incluzând ΔFosB, în striatum dorsal (adică caudate putamen) și striatum ventral (adică nucleus accumbens) (Chen și colab., 1997). Creșterea nivelului ΔFosB, probabil prin stabilizarea produselor proteice, este susținută timp de câteva săptămâni după expunerea cronică la cocaină sau amfetamină și este reglementată cel puțin parțial de calea de transducție a semnalului dopaminic (Chen și colab., 1997; Nestler și colab., 2001).
Sistemul central dopaminergic al animalelor tinere este foarte mult în flux, ca rezultat al modificării nivelurilor de molecule critice în timpul dezvoltării normale, incluzând dopamina D1receptorul DARPP-32 (fosfoproteină reglementată de dopamină și cAMP;r de 32 kDa) și cAMP (Ehrlich și colab., 1990;Teicher și colab., 1993; Perrone-Capano și colab., 1996; Tarazi și colab., 1999;Andersen, 2002). Expunerea în această perioadă la psihostimulante, care sporesc neurotransmisia dopaminergică, poate duce, prin urmare, la răspunsuri moleculare cantitative și / sau calitativ diferite, inclusiv modificări ale expresiei ΔFosB. Pentru a testa ipoteza existenței răspunsurilor neuroadaptive dependente de vârstă în timpul expunerii cronice la psihostimulante, trei grupuri de șoareci au fost analizate în experimente seriale: adulți (60 d vechi la debutul injecțiilor), periadolescenți (33 d vechi la debutul injecțiilor) și după înțărcare (24 d vechi la debutul injecției). Aceasta este prima comparație directă dintre răspunsurile neuroadaptive moleculare și expunerea psihostimulantă cronică la aceste trei grupe de vârstă. Am constatat ca, dupa paradigme de tratament identice, soareci periadolescent arata cresterea Upregulation ΔFosB ca raspuns la ambele cocaina si amfetamina.
MATERIALE SI METODE
Animale și administrarea de medicamente. Șoarecii CD-1 masculi (Charles River Laboratories, Kingston, NY) au fost găzduiți pe un ciclu 12 hr lumină / întuneric (6: 00 AM la 6: 00 PM) cu ad libitumaccesul la hrană și apă. Animalele au fost lăsate să se găsească în camera de animale pentru un minim de 10 d înainte de inițierea injecțiilor. Animalele au fost manipulate de doi cercetători care au efectuat toate injecțiile în aceeași cameră în care au fost adăpostite animalele. Toate animalele au fost înțărcate la 21 d de vârstă. Injectiile au început la 24 (post-weanling), 33 (periadolescent) sau 60 (adult) d de vârstă. Animalele au primit 20 mg / kg de cocaină (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamină (Sigma) sau un volum egal de soluție salină intraperitoneal între 4: 00 și 5: 00 PM zilnic pentru 7 d. Animalele au fost ucise prin decapitare după o scurtă expunere la CO2 la 10: 00 AM în ziua următoare injecției finale. Creierul a fost imediat eliminat din craniu, iar putamenul putamen și nucleul accumbens au fost rapid disecate pe gheață. Toate disecțiile au fost efectuate din feliile creierului coronal de către un singur investigator, iar extractele de proteine au fost preparate din țesut proaspăt fără îngheț. Toate procedurile pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale și au fost în concordanță cu Institutele Naționale de Sănătate Ghid pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.
Analiza Western blot. Pentru analizele Western blot, în fiecare bandă a unui gel 40% SDS-poliacrilamidă s-au încărcat cantități egale de proteină (20 pg pentru caudate putamen și 10 μg pentru nucleus accumbens) după măsurarea concentrațiilor de proteină cu testul BCA (Pierce, Rockford, IL). Încărcarea egală cu proteine a fost, de asemenea, verificată prin vizualizarea proteinei totale de către Ponceau Red după transferul în nitroceluloză și / sau prin blotarea cu anticorp anti-actin (1: 500, Sigma). Antiserul antigenului FOS (FRA), care recunoaște izoformele ΔFosB, a fost generos furnizat de Dr. M. Iadarola (National Institutes of Health, Bethesda, MD) și utilizat la o concentrație de 1: 4000. Studii anterioare (Chen și colab., 1997; Hiroi și colab., 1997), incluzând preadsorbția antiserului FRA cu imunogenul peptidei M, a demonstrat specificitatea acestui antiser. Anticorpul monoclonal DARPP-32 5a, utilizat la 1: 10,000, a fost generos furnizat de doctorii. Hugh Hemmings și Paul Greengard (Universitatea Rockefeller, New York, NY). Anticorpul transportatorului de dopamină (DAT) a fost de la Chemicon (Temecula, CA). Bloturile au reacționat cu sistemul de chemiluminescență NEN-DuPont (Boston, MA) și au fost expuse filmului. Valorile densitometrice pentru imunoreactivitatea ΔFosB au fost obținute folosind ScanAnalysis for Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Semnificația statistică a fost determinată utilizând un ANOVA cu o singură cale, urmată de post hoc Testul de comparație multiplă al lui Tukey sau un student cu două cozi nepereche t test așa cum este indicat în legendele figurii. Pentru experimentele de tratament cu medicamente, analiza fiecărui grup de vârstă a fost efectuată pe o blot separată și, prin urmare, fiecare grupare salină a fost atribuită în mod arbitrar cu o valoare 100% pentru compararea grupurilor de vârstă. Pentru studiile ontogene, mostrele din toate grupele de vârstă au fost analizate împreună pe o singură pată.
REZULTATE
Inducerea ΔFosB după cocaină și amfetamină apare în nucleul accumbens al șoarecilor numai periadolescenți
Expresia ΔFosB a fost măsurată în nucleul accumbens și caudate putamen de șoareci post-weanling, periadolescent și adulți după 7 d de administrare a amfetaminei sau cocainei. Nucleul accumbens este regiunea creierului considerată a fi cea mai critică pentru medierea efectelor recompensatoare ale psihostimulanților. Imunoreactivitatea ΔFosB (35 kDa) a fost indusă selectiv în nucleul accumbens al animalelor periarice după administrarea cronică de amfetamină (Fig. 1 A) sau cocaina (Fig. 1 B). Dimpotrivă, nivelele ΔFosB (35 kDa) nu au fost modificate semnificativ în nucleul accumbens al animalelor post-adulți sau adulți (Fig.1 A,B). La nivelul putamenului caudat, nivelele ΔFosB (35 kDa) au fost, de asemenea, semnificativ reglate după administrarea cronică de amfetamină numai la animalele periarice (Fig.2 A). Toate cele trei grupe de vârstă au prezentat creșteri semnificative în exprimarea ΔFosB (35 kDa) în caulman putamen după administrarea cronică de cocaină (Fig.2 B). Cu toate acestea, magnitudinea de inducție a fost cea mai mare la animalele periarolezente, în special în comparație cu animalele post-ameliorare (Fig. 2 B). Alte izoforme FRA și Fos au fost nemodificate în toate grupele de vârstă (datele nu sunt prezentate).
Imunoreactivitatea ΔFosB în nucleul accumbens după administrarea psihostimulantă cronică. Șoarecii CD-1 au fost injectați o dată pe zi cu soluție salină, amfetamină sau cocaină pentru 7 d începând cu ziua 24 (P24; post-weanling), ziua 33 (P33; periadolescent) sau zi 60 (Adult). Nivelurile imunoreactivității ΔFosB (35 kDa) în nucleul accumbens sunt prezentate după amfetamină cronică (A) sau cocaină (B) administrare. Imunobloturi reprezentative din soluții saline- (S), amfetamină- (A) și cocaină (C) injectat după înțărcare (P24), periadolescent (P33) și șoarecii adulți sunt afișați în panouri de sus. Panouri de fund arată procentajul mediu ± SEM al expresiei bazale ΔFosB. n valorile pentru fiecare grup sunt afișate în baruri. Creșteri semnificative ale ΔFosB s-au găsit în nucleul accumbens al șoarecilor periadolescenți. *p <0.05; **p <0.01 (Student's t Test; soluție salină față de medicament).
Imunoreactivitatea ΔFosB la caudate putamen după administrarea cronică de psihostimulant. Șoarecii CD-1 au fost injectați o dată pe zi cu soluție salină, amfetamină sau cocaină pentru 7 d începând cu ziua 24 (P24; post-weanling), ziua 33 (P33; periadolescent) sau zi 60 (Adult). Nivelurile de imunoreactivitate ΔFosB (35 kDa) în caleenul putamen sunt prezentate după amfetamina cronică (A) sau cocaină (B) administrare. Imunobloturi reprezentative din soluții saline- (S), amfetamină- (A) și cocaină (C) șoareci periadolescenți injectați (P33) sunt afișate înpanouri de sus. Panouri de fund arată procentajul mediu ± SEM al expresiei bazale ΔFosB. n valorile pentru fiecare grup sunt afișate în baruri. Creșteri induse de amfetamină induse de imunoreactivitatea ΔFosB au fost găsite în putamenul putamen al șoarecilor numai periadolescenți (A). Administrarea cocainei cronice a produs creșteri ale ΔFosB în toate cele trei grupe de vârstă (B). *p <0.05; **p <0.01 (Student's t Test; soluție salină față de medicament).
Nivelurile DAT și DARPP-32 nu sunt modificate după cocaină cronică sau amfetamină
Mai multe molecule-cheie exprimate prin neuroni dopaminergici și / sau dopaminoceptivi, incluzând DARPP-32, D1 dopamină și DAT, contribuie la răspunsurile acute și cronice la psihostimulanți (Moratalla și colab., 1996; Fienberg și colab., 1998; Sora și colab., 1998; Gainetdinov și colab., 2001). Datele de la DARPP-32, D1 receptor și DAT null și șobolanii DAT indică o relație complicată între nivelurile lor, regulamentul activității dopaminergice și răspunsurile la psihostimulante. De fapt, inducerea ΔFosB nu apare la șoarecii NARPP-32 care primesc cocaină cronică (Fienberg și colab., 1998). Cu toate acestea, la șoarecii adulți, expunerea 7 d la 20 mg / kg de cocaină nu modifică concentrațiile totale de DARPP-32 (Fienberg și colab., 1998). Controlul proteinei DAT nu a fost raportat anterior la șoareci expuși cronic la psihostimulanți, deși au fost raportate modificări ale radioligandului care se leagă la transportorul de dopamină după expunerea la psihostimulante la unele speciiLetchworth și colab., 2001). Aici am măsurat nivelele de proteine DARPP-32 și DAT pentru a determina dacă expresia acestor proteine este modificată după administrarea psihostimulantă cronică în oricare dintre cele trei vârste de șoareci. Constatările noastre indică faptul că nu s-au înregistrat modificări semnificative ale nivelurilor DARPP-32 sau DAT totale în întregul putamen sau nucleul accumbens caudate după administrarea cronică de cocaină sau amfetamină în oricare dintre cele trei grupe de vârstă (tabelul 1).
Valorile relativ de densitometrie pentru DARPP-32 și DAT în P24, P33 și șoareci adulți tratați cu amfetamină și cocaină față de control, valori saline, setate arbitrar la 100%
Nivelurile de bază ale ΔFosB sunt reglementate din punct de vedere al dezvoltării
Am examinat ontogeniile ΔFosB deoarece șoarecii adulți cu expresie crescută a ΔFosB în striat au crescut cu un răspuns comportamental crescut la psihostimulante (Kelz și colab., 1999). Am constatat că nivelele inițiale ale ΔFosB au fost semnificativ mai mici la animalele mai tinere comparativ cu cele adulte atât în caudate putamen cât și nucleus accumbens (Fig.3 A). Nivelurile markerilor funcționali ai sistemului dopaminic, incluzând DARPP-32 (Ehrlich și colab., 1990), DAT (Perrone-Capano și colab., 1996) și receptorii dopaminergici (Teicher și colab., 1993; Tarazi și colab., 1999) sunt, de asemenea, reglementate de dezvoltare. Rapoartele anterioare la șoarecii CD-1 indică un vârf în DARPP-32 striatal la ziua postnatală 28 (P28) (Ehrlich și colab., 1990). La șobolani caudate putamen și nucleu accumbens, D1nivelul vârfurilor receptorilor de la P28 la P40 (Teicher și colab., 1993; Tarazi și colab., 1999), dar studii similare nu au fost efectuate la șoarece. În schimb, aici am constatat că nivelurile de proteine DAT în putamenul caudate și nucleul accumbens au fost constante între ziua postnatală 24 și vârsta adultă (Fig. 3 B). Astfel, raporturile relative dintre D1 receptorii, DAT, DARPP-32 și ΔFosB diferă între grupurile de vârstă, ceea ce poate duce la diferențe în D1 receptor care ar putea influența gradul de inducție a ΔFosB.
Dezvoltarea expresiei ΔFosB și DAT. A, Imunofluorescența ΔFosB (35-37 kDa) în putamenul caudat și nucleul accumbens al șoarecilor nativi CD-1 în funcție de vârstă. Reprezentarea imunobloturilor este prezentată în panouri de sus.Panouri de fund arată mijloace ± SEM de trei șoareci pe grup. *p <0.05, adult versus P24; #p <0.05, adult versus P36 (testul comparativ multiplu al lui Tukey după ANOVA). B, Valorile densitometrice ale imunoreactivității DAT în putamenul caudat și nucleul accumbens pentru șoarecii nativi CD-1 în funcție de vârstă. Nivelurile DAT nu diferă între cele trei grupe de vârstă.
DISCUŢIE
Efectele comportamentale ale stimulanților psihomotori sunt dependente de vârstă. Tendințele dependenței sunt cele mai mari în adolescență, când escaladarea substanțelor ilicite (Estroff și colab., 1989; Myers și Anderson, 1991). De fapt, copiii mai mici devin frecvent disforici atunci când sunt expuși la psihostimulanți, în timp ce adolescenții și adulții suferă de euforie (Rapoport și colab., 1980). În cazul modelelor de rozătoare, unele studii sugerează că animalele periarice au niveluri de activitate mai ridicate (Spear și frână, 1983) și a modificat răspunsurile la psihostimulante în raport cu animalele mai tinere și mai mari. Astfel, ele prezintă o stimulare locomotorie mai mică și o noutate care caută ca răspuns la administrarea acută de doze mici de psihostimulante în raport cu animalele de cântăi și adulți, dar hiperactivitatea crescută după tratamentul cu doze mari. În cazul administrării cronice, sensibilizarea la locomoția indusă de cocaină este mai mare la șobolanii periadolescenți comparativ cu adulții, în timp ce sensibilizarea la stereotipie este mai mică. De asemenea, datele de microdializă au evidențiat diferențe între șobolanii periadienți și adulți în ceea ce privește sensibilizarea la eliberarea de dopamină indusă de amfetamină (Laviola și colab., 1995; Adriani și colab., 1998; Adriani și Laviola, 2000;Laviola și colab., 2001). Cu toate acestea, există studii contradictorii privind reactivitatea pe termen lung a cocainei după administrarea de metilfenidat la șobolani adolescenți (Brandon și colab., 2001; Andersen și colab., 2002). Aceste două rapoarte evidențiază dificultatea comparării studiilor atunci când se folosesc diferite paradigme experimentale. Încercările de a compara studiile comportamentale la animalele mai tinere sunt în continuare confundate prin utilizarea diferitelor specii și tulpini.
Șoarecele devine un model animal din ce în ce mai important în studiul utilizării și abuzului de psihostimulante și aceasta este prima analiză sistematică a răspunsurilor neuroadaptive moleculare în trei vârste de dezvoltare diferite la șoarece sau la orice altă specie singură. Studiile anterioare din care am derivat paradigmele noastre de tratament au demonstrat o creștere a ΔFosB în striatul dorsal și ventral izolat al șobolanilor adulți de tip sălbatic după administrarea cocainei și amfetaminei cronice (Hope și colab., 1994; Nye și colab., 1995; Turgeon și colab., 1997), dar numai în striatum dorsal și ventral combinat sau striatum dorsal izolat de soareci adulți de tip sălbatic după cocaină cronică (Fienberg și colab., 1998; Zachariou și colab., 2001).
Acum demonstrăm o diferență spațială și cantitativă în ΔFosB indusă de psihostimulant în șoarecii post-ținuți, periadienți și adulți. Observarea unui răspuns sporit la animalele periarice, comparativ cu adulții și postanaliile, este întărită de faptul că răspunsul este similar la șoarecii tratați cu cocaină și amfetamină. Psihostimulantele cocainei și amfetaminei cresc atât dopamina sinaptică, cât și serotonina și norepinefrina, dar prin mecanisme diferite. Cocaina se leagă de transportatorii de plasmalemă pentru dopamină, serotonină și norepinefrină și inhibă recaptarea lor în terminale presinaptice. În schimb, amfetamina promovează eliberarea acestor transmițătoare. Inducerea selectivă a ΔFosB în nucleul accumbens numai din grupa de vârstă periatrolicentă după 7d de administrare a stimulantului și inducția relativ înaltă a ΔFosB în putamenul caudat poate fi o reprezentare neurobiologică sau cauza tendinței crescute menționate anterior de abuz de psihostimulanți în acest caz grupă de vârstă (Estroff și colab., 1989; Myers și Anderson, 1991) și alte modificări pe termen lung ale expresiei genelor, care diferă între grupele de vârstă (Andersen și colab., 2002). Mai mult decât atât, aceste diferențe pot fi reglate intrinsec prin modificări ale nivelurilor de molecule-cheie, inclusiv DFosB. Implicațiile potențiale ale diferențelor de niveluri inițiale ale ΔFosB între grupele de vârstă sunt analoge cu cele propuse în ceea ce privește diferențele dintre tulpinile de șobolan (Haile și colab., 2001). De fapt, anticipăm că diferențe de tulpină similare se vor regăsi printre șoarecii încrucișați. De asemenea, este posibil ca șoarecii de vârste diferite să prezinte diferite modificări moleculare în zonele creierului, altele decât nucleul accumbens. Analiza suplimentară care utilizează șoareci periadolescenți cu modificări genetice modificate în nivelurile de molecule-cheie și observații comportamentale concurente va testa în continuare aceste ipoteze.
Note de subsol
- Primit Aprilie 8, 2002.
- Revizuirea a fost primită August 6, 2002.
- Admis August 8, 2002.
Această lucrare a fost susținută de Institutul Național de Sănătate / Institutul Național de Tulburări neurologice și de Stroke Grant NS41871 (MEE și UEM) și de Institutul Național pentru Prevenirea Abuzului de Droguri P30-DA13429 (UEM).
Corespondența trebuie adresată Dr. Michelle E. Ehrlich, Universitatea Thomas Jefferson, Curtis 310, Strada 1025 Walnut, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [e-mail protejat].
- Copyright © 2002 Societatea pentru Neuroștiințe
;