PSMC5, o ATPază proteasomală 19S, reglează acțiunea de cocaină în nucleul acumbens (2015)

PLoS Unul. 2015 May 11; 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollecție 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Abstract

OsFosB este un factor de transcripție stabil care se acumulează în nucleul accumbens (NAc), o parte cheie a circuitelor de recompensă ale creierului, ca răspuns la expunerea cronică la cocaină sau alte droguri de abuz. În timp ce ΔFosB se știe că se heterodimerizează cu un membru al familiei Jun pentru a forma un complex factor de transcripție activ, nu a existat până în prezent o explorare deschisă a altor posibili parteneri de legare pentru osFosB în creier. Aici, prin utilizarea testelor cu două hibrizi de drojdie, identificăm PSMC5 - cunoscut și sub numele de SUG1, o subunitate care conține ATPază a complexului proteasomal 19S - ca o proteină interacțională nouă cu ΔFosB. Verificăm astfel de interacțiuni între ΔFosB endogen și PSMC5 în NAc și demonstrăm că ambele proteine ​​formează și complexe cu alte proteine ​​de reglare a cromatinei asociate cu activarea genei. Continuăm să arătăm că cocaina cronică crește nivelurile nucleare, dar nu citoplasmatice, de PSMC5 în NAc și că supraexprimarea PSMC5 în această regiune a creierului promovează răspunsurile locomotorii la cocaină. Împreună, aceste descoperiri descriu un mecanism nou care contribuie la acțiunile osFosB și, pentru prima dată, implică PSMC5 în plasticitatea moleculară și comportamentală indusă de cocaină.

Referirea: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, și colab. (2015) PSMC5, o ATPază 19S proteazomal, reglează acțiunea de cocaină în nucleul acumbens. PLoS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Academic Editor: James Edgar McCutcheon, Universitatea din Leicester, REGATUL UNIT

Primit: Decembrie 10, 2014; Admis: Aprilie 7, 2015; Publicat în: 11 Mai, 2015

Drepturi de autor: © 2015 Ohnishi și colab. Acesta este un articol cu ​​acces deschis, distribuit în condițiile termenului Creative Commons Attribution License, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originale să fie creditate

Disponibilitatea datelor: Toate datele relevante sunt incluse în lucrare.

Finanțarea: Această lucrare a fost susținută de granturile de la Institutele Naționale de Sănătate, Institutul Național pentru Abuzul de Droguri și Fundația Ishibashi și Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei (numerele KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de a publica sau pregătirea manuscrisului.

Concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

ΔFosB, un produs trunchiat al produsului FosB gena, aparține familiei Fos de factori de transcripție, care includ, de asemenea, c-Fos, FosB cu lungime întreagă, Fra-1 și Fra-2. ΔFosB, la fel ca alte proteine ​​Fos, heterodimerizează cu o proteină Jun-Jun, JunB sau JunD, pentru a forma un complex activ al factorului de transcripție AP-1 (protector activator-1), care induce sau reprima expresia genelor țintă specifice [1,2].

Sa demonstrat că ΔFosB joacă un rol-cheie în dependența de droguri [2]. Unic printre proteinele familiei Fos, se acumulează în nucleul accumbens (NAc) și alte regiuni ale creierului legate de recompensă după administrarea repetată a medicamentului datorită nivelului său ridicat de stabilitate [3,4], care este mediată de lipsa domeniilor de degron C-terminal și de fosforilarea prin mai multe proteine ​​kinaze [5-7]. O astfel de inducere a ΔFosB în NAc mediază răspunsuri comportamentale crescute la medicamentele de abuz. Astfel, supraexprimarea ΔFosB în această regiune a creierului animalelor adulte, fie prin utilizarea vectorilor virali sau a șoarecilor bitransgenici inductibili, crește sensibilitatea animalului la efectele locomotor-activatoare și recompensatoare ale cocainei și opiaceelor, precum și motivația animalului de a se autoadministra cocaina [7-11]. În schimb, supraexprimarea antagoniștilor negativi dominanți ai ΔFosB provoacă fenotipurile comportamentale opuse [10-12].

Noi și alții am confirmat anterior, prin folosirea testelor de schimbare a gelului, că proteinele JunD și probabil alte familii Jun sunt principalii parteneri legali ai ΔFosB în creier in vivo [13-15]. Cu toate acestea, până în prezent, nu a existat o evaluare deschisă și imparțială a partenerilor de legare ai ΔFosB în creier. Aici, am căutat să identificăm noi parteneri de legare pentru ΔFosB prin utilizarea unui test de doi hibrizi de drojdie [16,17]. Datele noastre au arătat că PSMC5, cunoscut și ca SUG1, este un partener robust al ΔFosB atât in vitro, cât și în NAc in vivo, unde se alătură ΔFosB ca parte a unui complex de activare a transcripției indusă de cocaină, care conține, de asemenea, CBP ) și p300 - ambele histone acetiltransferaze (HAT) - precum și BRG1 (o proteină de remodelare a cromatinei). Continuăm să arătăm că expunerea cronică la cocaină modifică nivelele nucleare ale PSMC5, o subunitate care conține ATPază a complexului proteasomal 19S, în NAc și că, la rândul său, PSMC5 controlează răspunsurile comportamentale la cocaină.

Material si metode

Examinarea cu două hibrizi de drojdie

Celulele de drojdie MaV203 (Invitrogen Life Technologies) au fost co-transfectate cu pDBLeu conducând diferite fragmente ale proteinei ΔFosB și o bibliotecă de creier de șoarece a fost subclonată în pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Celulele transformate au fost crescute pe mediu SC lipsit de leucină, triptofan și histidină și conținând 10 mM de 3-aminotriazol. Legarea fragmentelor FosB și a unui partener candidat induce trei gene reporter (His3, Ura3, și LacZ), iar inducerea face transformanții capabili să supraviețuiască în condițiile de cultivare utilizate. Clonele pozitive au fost retestate cu fragmente proaspete de pDBLeu-ΔFosB prin teste de retransformare în celule MaV203.

Linii telefonice

Celulele neuroblastomului Neuro 2A de șoarece (ATCC) au fost menținute în mediul esențial minim (Eagle) (ATEM) Eagle, suplimentat cu 10% ser fetal bovin (FBS) la 37 ° C și 5% CO2. Celulele Rat 1A au fost un cadou de la Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonia) [18] și menținută în Dulbecco's MEM (DMEM) (Life Technologies), suplimentat cu 10% FBS la 37 ° C și 5% CO2. Transfecția celulelor cu ADN plasmidic a fost realizată utilizând Effectene (Qiagen) conform instrucțiunilor producătorului.

Constructe PSMC5 și ΔFosB

Mai multe forme mutante de PSMC5, fiecare FLAG-tagged la capătul lor N-terminal, au fost generate pentru utilizare în experimente de transfer de genă imunoprecipitare sau mediate viral. Acestea au inclus: PSMC5-K196M, PSMC5-Coil Domain (PSMC5-ΔCC, lipsit de aminoacizi 27-68), PSMC5-NT (constând din fragmentul N-terminal al proteinei, aminoacizii 1-151) -CT (constând din fragmentul C-terminal al proteinei, aminoacizii 5) (a se vedea Fig 1). De asemenea, am utilizat formate N-terminale MYC de tipul ΔFosB de tip sălbatic, precum și ΔFosB cu o mutație în domeniul său cu leucină-fermoar (mutație a aminoacizilor 182 la 205 care este cunoscută pentru a șterge heterodimerizarea cu proteinele familiei Jun [6].

miniatura
Fig 1. ΔFosB se leagă de PSMC5 in vitro.

 

A. Schematică a ΔFosB, ΔFosB-LZM în care domeniul fermelor leucină este mutat pentru a șterge heterodimerizarea ΔFosB cu proteine ​​Jun și Δ2ΔFosB care nu are primii aminoacizi 78 ai N-terminalului ΔFosB. B. schematică a PSMC5, PSMC5-NT care cuprinde primii aminoacizi 151 ai PSMC5, PSMC5-CT lipsiți de primii aminoacizi 235 ai PSMC5 și PSMC5-ΔCC care nu dispun de domeniul bobinelor spiralate (aminoacizii 28-68) . Domeniul AAA corespunde unui motiv, ATPases asociate cu diverse activități celulare, prezente în multe ATP-uri. C. 2.4 pg de pcDNA3.1-ΔFosB (benzi 1-4) sau ΔFosB-LZM (culoarul 5) a fost co-transfectat cu 2.4 pg de PSMC5 marcat cu FLAG sau diferite mutante de deleție în celule Neuro2a. La două zile după transfecție, celulele au fost lizate și supuse imunoprecipitării cu un anticorp anti-FLAG și apoi Western blot cu anticorp anti-ΔFosB sau anti-FLAG. Rețineți că ΔFosB, dar nu ΔFosB-LZM, se leagă robust la PSMC5 sau PSMC5-NT, dar nu PSMC5-CT sau PSMC5-ΔCC. Datele prezentate în figură au fost replicate în triplicat în fiecare dintre cele trei experimente separate.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

animale

Nouă șoareci de sex masculin C11BL / 57J de săptămână 6 (Laboratorul Jackson) au fost utilizați pentru toate experimentele. Animalele au fost adăpostite pe un ciclu 12-h-lumină-întuneric, cu acces la hrană și apă ad libitum și au fost obișnuiți săptămâna 1 înainte de experiment. Au fost utilizate două scheme de tratament cu cocaină. Pentru a studia efectele biochimice ale cocainei, animalelor li s-au administrat 7 doze zilnice de cocaină (20 mg / kg) sau soluție salină și au fost ucise prin decapitare 24 hr după ultima injecție. Acesta este un protocol standard, care a demonstrat că produce numeroase răspunsuri moleculare și celulare la medicament [7]. Pentru a studia influența PSMC5 asupra nucleului accumbens asupra răspunsurilor comportamentale la cocaină, am folosit o doză sublimă de medicament (7.5 mg / kg, vezi sensibilizarea Locomotor de mai jos) pe baza ipotezei că PSMC5 ar crește, ca ΔFosB, sensibilitatea animalului la cocaina [8]. Toate experimentele pe animale au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale la Muntele Sinai.

Imunoprecipitarea și Western blotting

Celulele neuro 2A au fost transfectate cu forme de tip sălbatic sau mutante de PSMC5. Două zile după transfecție, celulele au fost spălate în PBS, lizate în tampon RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCI, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% deoxicolat de sodiu, 10 mM sodiu butirat, cocktail inhibitor de protează) . Lizatele s-au divizat și s-au incubat fie cu anticorpi IgG non-imunitari (Sigma), fie anti-FLAG (Sigma) pentru 3 hr la 4 ° C. Imunoprecipitarea a fost efectuată cu perle de proteină G (Invitrogen) așa cum s-a descris [19]. Pe scurt, proteinele imunoprecipitate au fost supuse SDS-PAGE și analizate prin Western blot folosind anticorp anti-FosB / ΔFosB (Cell Signaling Technology) pe baza protocoalelor publicate [7]. Pentru testele de legare a proteinei in vivo, am folosit fracțiuni nucleare purificate de la NAc de șoareci disecați cu pumn după tratamentul cronic cu cronică (20 mg / kg IP zilnic pentru 7 zile, șoarecii au folosit 24 hr după ultima injecție). Co-imunoprecipitarea din fracțiunile nucleare s-a efectuat utilizând kitul Nuclear Complex Co-IP (Active Motif) urmând instrucțiunile producătorului. Au fost utilizați următorii anticorpi: MYC sau beta-actina, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 și histone H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 și BRG1, Santa Cruz Biotechnology FLAG M2, Sigma.

imunohistochimie

Imunohistochimia a fost efectuată în conformitate cu procedurile publicate [20]. Șoarecii au fost anesteziați și perfuzați intracardial cu 4% paraformaldehidă în PBS. Creierul a fost crioprotezat cu 30% zaharoză și apoi înghețat și depozitat la -80 ° C până la utilizare. Secțiunile coronale (40 μm) au fost tăiate pe un criostat și tratate pentru imunohistochimie. Secțiunile plutitoare libere au fost pre-incubate într-un tampon de blocare care conține 0.3% Triton și 3% ser de măgar normal. A fost detectat ΔFosB utilizând un anticorp policlonal de capră ridicat împotriva porțiunii N-terminale a proteinei (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 a fost detectat utilizând un anticorp policlonal de iepure (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Imaginile au fost luate cu un microscop confocal (mărire 60x, Zeiss).

Sensibilizarea locomotorie

Toți șoarecii au primit zilnic injecții IP de ser fiziologic pentru zilele 3 pentru a le obișnui cu stresul injectărilor. A doua zi, șoarecii au fost injectați IP cu soluție salină sau o doză subcorespunzătoare de cocaină (7.5 mg / kg, vezi sub Animalele de mai sus) și plasate imediat în cutii locomotorii noi. Activitatea locomotorie a șoarecilor a fost înregistrată utilizând un sistem de fotobeam ca un fascicul de ambulatorie pentru 30 min. Aceste tratamente au fost repetate zilnic pentru zilele 3.

Transfer de gene mediate virale

Am folosit extensiv metode publicate pentru transferul de gene mediate virale [7,8,11,19]. Pe scurt, plasmidele de expresie pentru PSMC5 sau pentru mai multe dintre mutantele sale (vezi constructe PSMC5 și ΔFosB de mai sus) au fost subclonate în plasmida bicistronică p1005 (+) HSV care exprimă GFP sub controlul promotorului CMV și PSMC5 sau mutanții săi sub cea a Promotorul IE4 / 5. Sub anestezie ketamină (100 mg / kg) / xilazină (10 mg / kg), șoarecii au fost poziționați într-un instrument stereotaxic cu animale mici și suprafața craniană a fost expusă. Trei treizeci și trei de seringi au fost utilizați pentru a infuza bilateral 0.5 μl dintr-un vector HSV în NAc la un unghi 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV -4.4) la o rată de 0.1 μl / min. Animalele care au primit injecții HSV au fost lăsate să se recupereze timp de 2 după operație înainte de experiment.

Statistici

Au fost utilizate ANOVA și testele t ale elevilor, corectate pentru comparații multiple, cu semnificația stabilită la p <0.05.

REZULTATE

PSMC5: noul partener de legare al ΔFosB

Am efectuat experimente preliminare pentru a identifica un fragment corespunzător de ΔFosB care a servit ca momeală într-un test de drojdie bi-hibrid fără a autoactiviza sistemul. Holo-ΔFosB a indus activitatea genei reporter pe cont propriu, ca și fragmentul de aminoacizi N-terminal 1-78 al proteinei. Cu toate acestea, un ΔFosB trunchiat de N-terminal (Fig 1A), numit Δ2ΔFosB, care nu are primii aminoacizi 78 ai proteinei, nu a avut acest efect. Prin urmare, am folosit Δ2ΔFosB ca proteine ​​de momeală.

Pentru a examina partenerii de legare potențiali, am folosit o bibliotecă creierului mouse-ului subclonată în pPC86. Am identificat candidații 11 pentru parteneri legali. Deși aceste proteine ​​au inclus partenerii de heterodimerizare cunoscuți ai ΔFosB, c-Jun și JunD (Tabelul 1), cel mai răspândit candidat de departe a fost PSMC5. Deși surprinzător, aceasta a fost o descoperire interesantă, deoarece PSMC5 a fost prezentat într-un singur raport cu ani în urmă, pentru a se lega de c-Fos in vitro [21]. Cu toate acestea, nu există rapoarte anterioare privind implicarea PSMC5 în acțiunea de cocaină. Cu toate acestea, din cauza puterii semnalului PSMC5 din testul de doi hibrizi de drojdie, am stabilit să studiem în continuare posibilele interacțiuni ΔFosB-PSMC5.

miniatura
Tabel 1. Rezultatele screening-ului cu două hibride cu D2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

În primul rând, pentru a confirma interacțiunea fizică dintre ΔFosB și PSMC5, am efectuat experimente in vitro de co-imunoprecipitare. Am constatat că tag-ul FLAG-tagged PSMC5 (Fig 1B), transfectat în celulele Neuro 2A, a tras efectiv ΔFosB (Fig. 1C). În al doilea rând, pentru a identifica regiunea în PSMC5 care este responsabilă de legarea lui la ΔFosB, am generat mai mulți mutanți PSMC5 marcați cu FLAG (Fig 1B) și a repetat experimentul de co-imunoprecipitare. ΔFosB a fost tras în mod eficient cu aminoacizii N-terminal 151 din PSMC5 (PSMC5-NT), dar nu cu fragmentul de aminoacid C-terminal 172 al proteinei (PSMC5-CT) (Fig. 1C). PSMC5 lipsit de domeniul bobinelor spiralate (PSMC5-ΔCC) a fost, de asemenea, ineficient în precipitarea ΔFosB. Aceste descoperiri sugerează că PSMC5 se leagă de ΔFosB prin intermediul domeniului coil-coil (aminoacizii 27-68). Mai mult decât atât, PSMC5 marcat cu FLAG nu a precipitat o formă mutantă de ΔFosB cu un domeniu ferm al fermelor cu leucină (ΔFosB-LZM) (Fig. 1C), indicând faptul că ΔFosB fie leagă PSMC5 prin acest domeniu, fie, mai probabil, că heterodimerizarea ΔFosB este necesară pentru legarea PSMC5.

Legarea PSMC5-ΔFosB în NAc după administrarea cocainei cronice

Pe baza acestor rezultate in vitro, am studiat dacă nivelurile de PSMC5 din NAc sunt modificate ca răspuns la administrarea cocainei cronice. Am constatat prin fracționare subcelulară și Western blotting că cocaina cronică crește concentrațiile nucleare ale PSMC5 în această regiune a creierului fără o schimbare a nivelurilor citoplasmaticeFig 2A). Acest efect nu a fost observat după doze unice de cocaină (datele nu sunt prezentate). Apoi am examinat localizarea PSMC5 și ΔFosB în NAc prin microscopie confocală cu imunofluorescență. Am analizat șoarecii 24 hr după ultima doză repetată de cocaină, un punct de timp în care ΔFosB este singurul care poate fi detectat FosB produs gena (vezi Nestler 2008). Am găsit imunoreactivitate puternică pentru PSMC5 în NAc, incluzând un semnal nuclear puternic. ~ 85% de nuclei ΔFosB + co-colorați pentru PSMC5 (Fig 2B). În plus, am efectuat experimente de co-imunoprecipitare asupra extractelor de NAc și am constatat că, după tratamentul cronic cu cocaină, ΔFosB a fost tras în jos eficient printr-un anticorp anti-PSMC5Fig. 2C). Dimpotrivă, analiza NAc la naștere (după injecții saline repetate) nu a evidențiat scăderea ΔFosB detectabilă (datele nu sunt prezentate). Aceste date sunt conforme cu descoperirile noastre din cultura celulară și confirmă faptul că ΔFosB și PSMC5 interacționează în NAc in vivo.

miniatura
Fig 2. Regulamentul PSMC5 în NAc mouse-ului.

 

A. Western blotting a fracțiunilor nucleare și citosolice de NAc de șoareci tratați zilnic cu soluție salină sau cocaină (20 mg / kg) timp de 7 zile, cu animale analizate 24 de ore după ultima injecție. Cocaina crește nivelurile nucleare, dar nu citosolice ale PSMC5. Histone H3 și ß-actină, care nu au fost afectate de cocaină, au fost utilizate ca controale de încărcare. Datele sunt medii ± SEM (n = 8-10 / grup, * p <0.05). B. Co-localizarea PSMC5 endogen (verde) și ΔFosB (albastru) în NAc de șoareci tratați cronic cu cocaină ca în AC Lizatele nucleare de NAc de șoarece după tratament cronic de cocaină au fost supuse imunoprecipitării cu anticorp anti-PSMC5 sau IgG de șoarece ca martor , și apoi Western șters cu anticorp anti-FosB / ΔFosB. Figura demonstrează interacțiunile PSMC5-ΔFosB în NAc in vivo. Datele din B și C au fost reproduse în triplicat în fiecare din cele trei experimente separate.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 îmbunătățește expresia ΔFosB in vitro

Deoarece PSMC5 este un membru cunoscut al complexului proteazom, am testat dacă reglează nivelurile ΔFosB utilizând celulele Rat 1A. Supraexpresia cu PSMC5 nu a avut niciun efect asupra nivelurilor bazale ale ΔFosB, dar a determinat o creștere mică, dar semnificativă, a inducerii ΔFosB la stimularea serică a celulelor (Fig 3A). O tendință similară a fost observată pentru FosB de lungime întreagă, dar efectul nu a atins semnificația statistică. În schimb, suprimarea expresiei endogene PSMC5 în celulele Rat 1A, realizată prin utilizarea de siRNAs care vizează PSMC5, nu a afectat nivelul bazei ΔFosB, dar a inhibat puternic inducerea ΔFosB prin stimularea serului (Fig 3B). Efecte similare au fost observate pentru FosB cu lungime întreagă. Aceste date sugerează că PSMC5 nu promovează degradarea proteazomală a ΔFosB, așa cum ar putea fi de așteptat ca o subunitate de bază a proteazomului, dar în schimb este necesară pentru acumularea maximă a FosB produse genetice in vitro, probabil prin stabilizarea proteinelor.

miniatura
Fig 3. Reglarea PSMC5 a expresiei FosB / ΔFosB în celule 1A de șobolan.

 

A. Celulele de șobolan 1A au fost transfectate cu 4 μg de PSMC5 sau ADN martor. Supraexprimarea PSMC5 nu a avut niciun efect asupra nivelurilor de expresie bazală ale proteinei FosB sau ΔFosB determinate de Western blot, dar a produs o creștere mică, dar semnificativă a inducției ΔFosB prin stimulare serică (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Celulele 1A de șobolan au fost transfectate cu 5 pmol din oricare dintre cele două ARNsi sau ARN amestecat (martor). Ambele siARN-uri au scăzut efectiv nivelurile de proteine ​​PSMC5 în comparație cu condițiile de control (siARN-ul 1, 23 ± 5% din control; siARN-ul 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Eliminarea PSMC5 nu a avut niciun efect asupra nivelurilor bazale de FosB sau BFosB, dar a atenuat inducerea atât a FosB, cât și a ΔFosB prin stimulare serică (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB și PSMC5 formează complexe cu CBP, p300 și BRG1 în NAc

Pentru a intelege mai bine mecanismele transcriptionale prin care PSMC5 ar putea influenta functia ΔFosB, am investigat posibili parteneri suplimentari de legare pentru cele doua proteine ​​din NAc in conditii cocainice cronice tratate. Există un raport referitor la faptul că PSMC5 se leagă de CBP-a HAT și crește acetilarea histonei H3 la promotorul proximal MHC-II în celulele HeLa [22]. Mai mult, șoarecii cu deficit de CBP afectează sensibilitatea comportamentală redusă la cocaină, precum și acetilarea histonei redusă la FosB promotor [23]. Am testat astfel dacă PSMC5 s-ar putea lega cu ΔFosB ca parte a complexelor care conțin de asemenea CBP și, probabil, alți activatori transcripționali.

Am demonstrat mai întâi că ΔFosB a scos efectiv atât CBP cât și p300, un HAT asociat, în celulele Neuro2A (Fig 4A). Dimpotrivă, forma mutantă cu fermoar de leucină a ΔFosB, așa cum era de așteptat, nu a prezentat această activitate. În mod similar, PSMC5 a tras efectiv CBP și p300 (Fig 4B). Interesant, acest efect a fost observat și pentru PSMC5-ΔCC, care nu a scos ΔFosB, indicând faptul că PSMC5 interacționează cu CBP și p300 prin alte domenii ale proteinei și independent de legarea sa la ΔFosB.

miniatura
Fig 4. ΔFosB și PSMC5 interacționează cu CBP, p300 și BRG1 in vitro și in vivo.

 

A. Celulele Neuro2A au fost transfectate cu 2.4 pg de ΔFosB marcat cu MYC sau cu ΔFosB-LZM marcat cu MYC. Extractele celulare au fost imunoprecipitate cu anticorpi anti-CBP sau anti-p300 și precipitările au fost blotate cu Western cu același anticorp sau cu anticorp anti-MYC. Ambele CBP și p300 interacționează cu ΔFosB și astfel de interacțiuni necesită un fermoar intact al leucinei. B. Celulele Neuro2A au fost transfectate cu 2.4 pg de PSMC5 marcat cu FLAG sau PSMC5-ΔCC cu etichetă FLAG. Extractele celulare au fost imunoprecipitate cu anticorpi anti-CBP sau anti-p300, iar precipitantele au fost blotate Western cu același anticorp sau cu anticorp anti-FLAG. Ambele CBP și p300 interacționează cu PSMC5 și astfel de interacțiuni nu necesită domeniul CC. C. Lizatele nucleare ale NAc de șoarece după tratamentul cocainei cronice au fost supuse imunoprecipitării cu anticorp anti-CBP sau anti-p300. Ulterior, blotarea Western a precipitatelor rezultate cu anticorp anti-FosB / ΔFosB a arătat interacțiuni endogene între ΔFosB și CBP / p300. D. Alicotele acelorași lizate nucleare au fost supuse imunoprecipitării cu anticorp anti-BRG1 sau anti-PSMC5, urmată de blotarea Western a precipitatelor cu anticorp anti-FosB / ΔFosB sau anti-BRG1. Rezultatele arată interacțiuni endogene între ΔFosB și BRG1, și BRG1 și PSMC5. E. Schema ilustrată a complexului de activare transcripțională compus din ΔFosB: heterodimeri JunD care interacționează cu CBP / p300, BRG1 și PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Pentru a confirma că aceste interacțiuni au loc, de asemenea, in vivo, am administrat cocaină cronică pentru a induce nivelurile ΔFosB și PSMC5 nucleare, apoi a extras imunoprecipitat NAc cu anticorpi anti-CBP sau anti-p300. În concordanță cu datele privind cultura noastră de celule, imunoprecipitarea CBP sau a p300 a scos efectiv ΔFosB (Fig. 4C). Am testat dacă BRG1, o subunitate de bază a complexului de remodelare a cromatinei SWI-SNF, se poate lega de asemenea de ΔFosB și PSMC5, pe baza constatării noastre anterioare că BRG1 este recrutat la anumite gene țintă ΔFosB în concert cu activarea lor în NAc după cocaină cronică [24]. Am constatat că imunoprecipitarea BRG1 a scos ΔFosB în extracte NAc și că imunoprecipitarea PSMC5 a coprecipitat de asemenea BRG1 endogen (Fig 4D). Luate împreună, aceste rezultate sugerează că complexele ΔFosB-PSMC5 formează în NAc care includ, de asemenea, CBP / p300 și BRG1 (Fig 4E).

Excesul de suprapresiune PSMC5 crește răspunsurile locomotorii la cocaină

Legarea proeminenta a PSMC5 cu ΔFosB in NAc ne-a determinat sa investigam daca cresterea nivelurilor de PSMC5 in aceasta regiune a creierului reglementeaza raspunsurile comportamentale la cocaina. Am generat un vector Herpes Simplex Virus (HSV) care supraexprimă fie PSMC5 de tip sălbatic, fie unul din mutanții săi și a validat vectorii în NAc in vivo (Fig 5A). Exprimarea mediată de virusul PSMC5 predomină în nucleul celular (Fig 5B). Șoarecii care supraexprimă PSMC5 de tip sălbatic nu au prezentat răspunsuri modificate la dozele inițiale de cocaină, dar au prezentat o creștere a activării locomotorii ca răspuns la dozele repetate de cocaină comparativ cu șoarecii de control care exprimă GFP. Spre deosebire de acestea, șoarecii care supraexprimă o formă mutantă de PSMC5 care nu are domeniul spiralat cu coil (PSMC5-ΔCC) nu au prezentat acest efect (Fig 5B). Interesant, supraexprimarea PSMC5-K196M, care nu are activitate ATPază a proteinei tip sălbatic, a potențat, de asemenea, răspunsurile locomotorii ale cocainei.

miniatura
Fig 5. Excesul de suprapresiune PSMC5 în NAc crește răspunsurile locomotorii la cocaină.

 

A. Expresia transgenă reprezentată de HSV reprezentativă în NAc medial. AC, comisură anterioară. Subregiunile NAc core și shell sunt notate în figură. B. Măriri reprezentative mai mari (60x) ale colorării imunohistochimice a PSMC5 în neuronii NAc după injecția HSV-PSMC5, arătând că proteina este predominant nucleară așa cum este marcată prin colorarea DAPI. C. Șoarecii au primit injecții bilaterale de HSV în NAc urmate de injecții IP zilnice cu doze sub prag de cocaină (7.5 mg / kg). Răspunsurile locomotorii sunt prezentate ca răspuns la prima și ultima dintre cele 3 doze zilnice de medicament. Supraexprimarea PSMC5 sau PSMC5-K196M crește răspunsurile locomotorii la cocaina repetată, efect nevăzut cu PSMC5-ΔCC. Nu a existat un efect semnificativ al transgenelor asupra răspunsurilor locomotorii la dozele inițiale de cocaină. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 prin testul posthoc al lui Dunnett.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Discuție

Rezultatele acestui studiu relevă un nou mecanism prin care ΔFosB mediază efectele sale asupra creierului și un nou mecanism implicat în acțiunea de cocaină. Prin utilizarea unei abordări imparțiale, a unui test de două hibrizi de drojdie, am identificat PSMC5 ca un nou partener de legare pentru ΔFosB. Am validat această constatare atât în ​​celulele culturale in vitro, cât și în NAc in vivo, prin demonstrarea unei legături robuste PSMC5-ΔFosB. Foarte important, nivelurile nucleare de PSMC5 sunt induse în NAc prin administrarea cocainei cronice. Am demonstrat în continuare că legarea de PSMC5-ΔFosB are loc în concert cu alte câteva proteine ​​de activare a transcripției, și anume CBP și p300 (două HAT) și BRG1 (constituent cheie al complexelor SWI-SNF de remodelare a cromatinei). Împreună, concluziile noastre susțin ipoteza că PSMC5 face parte din complexul de activare transcripțională care este recrutat la cel puțin anumite genuri induse de ΔFosB în timpul unui curs de administrare cocaină cronică (Fig 4E). În concordanță cu această ipoteză este constatarea suplimentară că supraexprimarea PSMC5 în NAc, cum ar fi supraexprimarea ΔFosB însăși, promovează răspunsurile comportamentale la cocaină. Ar fi interesant în studiile viitoare să urmărim aceste observații in vivo cu caracterizarea interacțiunilor PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 prin utilizarea testelor reporter in vitro.

Implicarea PSMC5 în acțiunea cocainei este complet nouă. Identificat inițial ca membru al unei familii largi de ATPaze care cuprind proteazomul, PSMC5 a fost demonstrat de-a lungul anilor pentru a interacționa cu câțiva factori de transcripție, incluzând c-Fos, p53, receptorii hormonilor nucleari și constituenții complexului bazic de transcripție [25], totuși, puține studii funcționale au fost realizate de-a lungul anilor [26]. Acțiunea cea mai bine stabilită este promovarea activității factorilor de transcripție MYC în celulele cultivate [27]. Implicarea PSMC5 în mecanismele transcripționale a sugerat un rol potențial pentru activitatea ubiquitină-proteasomală în reglarea transcripției genetice, dar implicarea PSMC5 în astfel de reglementări rămâne practic netestată până în prezent [28,29].

Se știe foarte puțin despre funcția PSMC5 din creier. Un studiu anterior a demonstrat o largă exprimare a ARNm al PSMC5 pe tot parcursul creierului [30], însă activitatea sa funcțională a rămas necondiționată. Descoperirile noastre stimuleaza acum investigatii suplimentare ale acestei proteine ​​interesante pentru a intelege mai bine rolul sau in reglarea transcriptiei genetice si relatia acesteia cu functia ubiquitination-proteasomal in creier. Legarea lui PSMC5 la ΔFosB este mediată de domeniul coil-coil al lui PSMC5. Mai mult, capacitatea lui PSMC5 de a promova răspunsurile locomotorii la cocaină, în timp ce necesită domeniul bobinelor, nu necesită activitatea ATPază care este intrinsecă proteinei. Aceste rezultate ridică posibilitatea ca, cel puțin în sistemul nostru, activitatea principală a PSMC5 să poată fi mediată prin legarea sa la ΔFosB și la alte proteine ​​de reglare transcripțională și nu prin activitatea sa proteasomală în sine. Sunt necesare eforturi suplimentare pentru a testa direct aceste posibilități și alternative. Ipoteza că supraexpresia mediată de virusul PSMC5 a crescut răspunsurile locomotorii la cocaină prin interacțiuni cu ΔFosB este plauzibilă, în ciuda utilizării unui regim de tratament cu cocaină pe zi 3, deoarece este cunoscut faptul că nivelurile apreciabile de ΔFosB se acumulează în creier în acest interval de timp [3].

Constatările prezente susțin în continuare utilitatea utilizării unor abordări experimentale imparțiale, deschise, în studierea bazei moleculare a reglementării creierului. Atenția noastră inițială la PSMC5 sa bazat exclusiv pe legarea sa proeminentă la ΔFosB într-un test de două hibrizi de drojdie, dar pare să fie o componentă importantă a modificărilor transcripționale care sunt recrutați în NAc prin administrarea repetată de cocaină. O mai bună înțelegere a mecanismelor detaliate prin care nivelurile nucleare ale PSMC5 sunt induse de cocaină și, la rândul său, prin care PSMC5 contribuie apoi la complexele de activare transcripțională indusă de cocaină, sunt în centrul investigațiilor actuale. Între timp, testul nostru cu două hibrizi de drojdie a dezvăluit câțiva parteneri suplimentari de legare putativă ai ΔFosB (Tabelul 1) care, de asemenea, justifică examinarea directă a modelelor de cocaină. Împreună, această lucrare contribuie la o înțelegere crescândă a mecanismelor moleculare complexe prin care cocaina modifică funcția NAc.

recunoasteri

Această lucrare a fost susținută de burse din partea Institutului Național pentru Abuzul de Droguri și de Fundația Ishibashi și Societatea Japoneză pentru Promovarea Științei (numerele KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Contribuțiile autorului

Conceperea și proiectarea experimentelor: YHO YNO EJN. Efectuarea experimentelor: YHO YNO PJK RN. Analiza datelor: YHO YNO EJN. Reactivi / materiale / instrumente de analiză: TN MO OY AN RN TT. Scrierea hârtiei: YHO EJN.

Referinte

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Genele imediate-devreme: zece ani mai târziu. Tendințe Neurosci 18: 66-67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Mecanisme transcripționale ale dependenței: rolul deltaFosB. Philos Trans R Soc. Londra B Biol Sci 363: 3245-3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Vezi articolul
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Academic
  6. Vezi articolul
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Academic
  9. Vezi articolul
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Academic
  12. Vezi articolul
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Academic
  15. Vezi articolul
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Academic
  18. Vezi articolul
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Academic
  21. Vezi articolul
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Academic
  24. Vezi articolul
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Academic
  27. Vezi articolul
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Academic
  30. Vezi articolul
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Academic
  33. Vezi articolul
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Academic
  36. Vezi articolul
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Academic
  39. Vezi articolul
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Academic
  42. Vezi articolul
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Academic
  45. Vezi articolul
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Academic
  48. Vezi articolul
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Academic
  51. Vezi articolul
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Academic
  54. Vezi articolul
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Academic
  57. Vezi articolul
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Academic
  60. Vezi articolul
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Academic
  63. Vezi articolul
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Academic
  66. Vezi articolul
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Academic
  69. Vezi articolul
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Academic
  72. Vezi articolul
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Academic
  75. Vezi articolul
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Academic
  78. Vezi articolul
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Academic
  81. Vezi articolul
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Academic
  84. Vezi articolul
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Academic
  87. Vezi articolul
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Academic
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y și colab. (1994) Inducerea unui complex AP-1 de lungă durată compus din proteine ​​modificate Fos în creier prin cocaină cronică și alte tratamente cronice. Neuron 13: 1235-1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) Șoareci mutanți FosB: Pierderea inducției cronice de cocaină a proteinelor legate de Fos și sensibilitate sporită la efectele psihomotorii și satisfăcătoare ale cocainei. Proc Natl Acad Sci SUA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Reglementarea stabilității ΔFosB prin fosforilare. J Neurosci 26: 5131-5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, și colab. (2007) Absența domeniului degron C-terminal conservat contribuie la stabilitatea unică a ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009-3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, și colab. (2013) Răspunsurile comportamentale și structurale la cocaină cronică necesită o buclă de transmitere care implică ΔFosB și CaMKII în cochilia nucleului accumbens. J Neurosci 33: 4295-4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, și colab. (1999) Exprimarea factorului de transcripție ΔFosB în creier controlează sensibilitatea la cocaină. Natura 401: 272-276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB stimulează stimularea cocainei. J Neurosci 23: 2488-2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Reglementarea exprimării genelor și a recompenselor de cocaină de către CREB și DFosB. Nat Neurosci 11: 1208-1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, și colab. (2006) ΔFosB: Un rol esențial pentru ΔFosB în nucleul accumbens în acțiunea morfinei. Natura Neurosci 9: 205-211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, și colab. (2003) Explicația inductivă specifică a regiunii cerebrale a unui mutant negativ dominant al c-Jun la șoarecii transgenici scade sensibilitatea la cocaină. Brain Res 970: 73-86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y și colab. (1995) Reglementarea proteinelor delta FosB și FosB ca urmare a tratamentelor de convulsii electroconvulsive și a cocainei. Mol Pharmacol 48: 880-889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, și colab. (1998) Rolul esențial al genei fosB în acțiunile moleculare, celulare și comportamentale ale convulsiilor electroconvulsive. J Neurosci 18: 6952-6962. PMID: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonismul este însoțit de expresia persistentă a unei proteine ​​asemănătoare D-FosB în căile dopaminergice. Mol Brain Res 53: 41-52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Convertirea unui inhibitor transcripțional eucariot într-un activator. Celula 55: 443-446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Sistemul cu două hibride: o metodă de identificare și clonare a genelor pentru proteine ​​care interacționează cu o proteină de interes. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 88: 9578-9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Activarea proliferativă a celulelor Rat-1A în stare de repaus de delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157-4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, și colab. (2014) Rolul esențial al poli (ADP-ribosil) ation în acțiunea cocainei. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 111: 2005-2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, și colab. (2008) Modele distincte ale inducerii ΔFosB în creier prin medicamente de abuz. Synapse 62: 358-369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Sug1 de mamifer și c-Fos în proteazomul nuclear 26S. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 93: 8236-8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, și colab. (2008) Reglarea acetilare la promotorul proximal de complex clasic de histocompatibilitate de clasa II de către ATPaza 19S proteazomal Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837-5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartz JH (2005) Proteina care leagă CREB controlează răspunsul la cocaină prin histone acetilare la promotorul fosB în striatum de șoarece. Proc Natl Acad Sci Statele Unite ale Americii 102: 19186-19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, și colab. (2005) Remodelarea cromatinei este un mecanism cheie care stă la baza plasticității induse de cocaină în striatum. Neuron 48: 303-314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Funcții duale pentru regulatorii transcripționali: mit sau realitate. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32-40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Interacțiuni ale subunităților de reglementare ale proteazomului 26S, o problemă complexă. Tendințe Biochem Sci 25: 83-88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Implicarea sistemului ubiquitin / proteazom în transcripția reglată de myc. Ciclu de celule 2-5: 403-407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitina și proteazomii în transcripție. Annu Rev Biochem 81: 177-201. doi: 10.1146 / anurev-biochem-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteazomul: un instrument utilitar pentru transcriere? Curr Op Genet Dev 16: 197-202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identificarea unui membru al familiei Sug1 CAD conservat filogenetic care este exprimat diferențial în sistemul nervos al șoarecelui. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5