Proc Natl Acad Sci US A. 29 apr 2014; 111(17): 6455–6460.
Publicat online Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neuroştiinţe
Teruko Danjo,a Kenji Yoshimi,b Kazuo Funabiki,a Satoshi Yawata,a și Shigetada Nakanishia,1
Acest articol a fost citat de alte articole din PMC.
Semnificația
Neuronii dopaminergici (DA) din zona tegmentală ventrală (VTA) reacționează la stimuli aversivi în principal prin tăcere tranzitorie. Rămâne neclar dacă această reacție induce direct răspunsuri aversive la șoarecii care se comportă. Am examinat această întrebare prin controlul optogenetic al neuronilor DA din VTA și am constatat că inactivarea neuronilor DA a dus la un răspuns aversiv și la învățare. Nucleul accumbens (NAc), nucleele majore de ieșire a neuronilor VTA DA, a fost considerat a fi responsabil pentru acest răspuns, așa că am examinat care dintre căile fundamentale din NAc a fost critică pentru acest comportament prin utilizarea declanșării receptorului D1 sau D2, și a constatat că calea specifică receptorului D2 a fost crucială pentru acest comportament.
Abstract
Transmiterea dopaminei (DA) din zona ventrală tegmentală (VTA) este esențială pentru controlul atât a comportamentelor de recompensă, cât și a celor aversive. Atenuarea tranzitorie a neuronilor DA este unul dintre răspunsurile la stimulii aversivi, dar consecințele și mecanismele neuronale ale acestuia privind răspunsurile aversive și învățarea au rămas în mare măsură evazive.. Aici, raportăm că inactivarea optogenetică a neuronilor VTA DA a redus rapid nivelurile DA și a indus o reglare în sus a activității neuronale în nucleul accumbens (NAc) așa cum este evaluată prin expresia Fos. Tsuprimarea sa optogenetică a declanșării neuronului DA a evocat imediat răspunsuri aversive la camera întunecată preferată anterior și a condus la învățarea aversivă față de locul condiționat optogenetic. Important, această aversiune a locului a fost abolită prin distrugerea receptorilor dopaminergici D2, dar nu prin cea a receptorilor D1 din NAc.. Reducerea la tăcere a neuronilor DA în VTA a fost astfel indispensabilă pentru inducerea de răspunsuri aversive și pentru învățare prin receptorii dopaminergici D2 din NAc.
Sistemul dopaminergic mezolimbic nu joacă doar un rol esențial într-o gamă largă de motivații și învățare (1-3), dar disfuncția sa a fost, de asemenea, implicată în tulburările neuropsihiatrice severe, așa cum este exemplificat în boala Parkinson, schizofrenie și dependența de droguri. Neuronii dopaminergici (DA) din zona ventrală tegmentală (VTA) reacționează la stimuli de recompensă prin declanșare fazică, iar funcția principală a acestei declanșări este teoretizată să codifice „eroarea de predicție a recompensei”, diferența de valoare dintre recompensa prezisă și recompensa reala (4). Spre deosebire de răspunsul la stimulii recompensatori, reacțiile lor la stimulii aversivi sunt departe de a fi omoloage; adică, unii neuroni DA sunt activați ca răspuns la stimuli aversivi, în timp ce majoritatea altora reacționează prin suprimarea tranzitorie a declanșărilor lor. (5-9). De fapt, studii recente au arătat că activarea optogenetică a neuronilor GABAergici și inactivarea rezultată a neuronilor DA suprimă consumul de recompense și induc un răspuns aversiv (10, 11). Cu toate acestea, a rămas în mare măsură evaziv cu privire la mecanismele din circuitele neuronale care sunt esențiale pentru dobândirea de învățare aversivă după inactivarea neuronilor DA în VTA și cu privire la modul în care răspunsurile comportamentale sunt controlate pentru suprimarea consumului de recompense și inducerea comportamentelor aversive.
Dovezile acumulate au arătat că învățarea motivațională și cognitivă ca răspuns la stimuli pozitivi și negativi este în mare măsură reglată de circuitele neuronale, inclusiv de ganglionii bazali (12), care primesc o mare cantitate din proiecția dopaminergică de la mezencefal. În striat, două circuite neuronale fundamentale sunt constituite din neuroni spinoși (MSN) de mărime medie, fiecare exprimând un tip distinct de receptor DA (13).
- Un circuit este calea directă, constând din MSN-urile care se proiectează direct către nucleii de ieșire ai ganglionilor bazali, substanța nigra pars reticulata (SNr) și care exprimă predominant receptorii dopaminergici D1 (D1Rs).
- Cealaltă este calea indirectă, constând din MSN-uri care se proiectează indirect prin globus pallidus către SNr și exprimă în primul rând receptorii dopaminergici D2 (D2R).
Semnalele DA de la nivelul creierului mediu modulează dinamic aceste două căi paralele în mod opus prin intermediul D1R și D2R, iar această modulare se presupune că facilitează învățarea motivațională (3, 14).
- În ceea ce privește stimulii recompensatori, se consideră că nivelurile DA suprareglate induse de semnalele de recompensă activează D1R și, astfel, facilitează în mod predominant calea directă în nucleul accumbens (NAc).
- Pe de altă parte, suprimarea declanșărilor neuronilor DA ca răspuns la stimuli aversivi scade nivelul DA din NAc; și se presupune că această reacție promovează în mod specific transmisia semnalului pe calea indirectă prin D2R activate.
Deși studiile care utilizează strategiile farmacologice și metoda de blocare reversibilă a neurotransmisiei (RNB) au susținut acest mecanism de reglare în NAc (15, 16), a rămas necunoscut dacă suprimarea declanșării neuronilor DA este suficientă pentru a promova activitatea căii indirecte și, ulterior, pentru a induce comportamentul de evitare. În acest studiu de față, am abordat această problemă prin inactivarea selectivă a neuronilor DA în VTA prin manipularea optogenetică a proteinei Arch hiperpolarizante membranare (17) și a demonstrat în mod explicit că suprimarea neuronilor DA în VTA a scăzut ulterior nivelurile DA în NAc și a indus reacție și învățare aversivă. În plus, am investigat mecanismele de reglare a acestei reacții și am dezvăluit că această reacție aversivă a fost controlată în mod specific de D2R în NAc.
REZULTATE
Inactivarea optogenetică a neuronilor DA blochează preferința pentru camera întunecată.
Pentru a inactiva selectiv declanșările neuronilor DA, am injectat un construct viral adeno-asociat inductibil de Cre care codifică Arch-eGFP [AAV-double-floxed inverted open reading frame (DIO)-Arch] (17) unilateral în VTA al șoarecilor adulți tirozin hidroxilază (TH)-Cre (18) și de tip sălbatic (WT) și a plasat o fibră optică deasupra VTA (Imaginea S1 A și C). La două săptămâni după operație, Arch-eGFP a fost detectat în mod restrictiv în VTA (Imaginea S1B). Am testat efectul hiperpolarizant al proteinei Arch prin înregistrarea electrofiziologică și am măsurat efectul stimulării optice a VTA la șoareci TH-Cre injectați cu AAV-DIO-Arch. Înregistrările electrofiziologice in vivo de la VTA ale șoarecilor TH-Cre anesteziați au dezvăluit că stimularea optică a neuronilor DA presupusi a inhibat declanșările acestora (Imaginea S2), indicând faptul că stimularea optică a hiperpolarizat suficient potențialul de membrană al celulelor DA care exprimă Arch și astfel a inhibat declanșarea lor spontană.
Folosind acești șoareci, am examinat în continuare dacă inactivarea optică a neuronilor DA în VTA ar putea servi ca un semnal aversiv pentru învățarea comportamentală. Șoarecii au o tendință înnăscută de a prefera un mediu întunecat (19). Am proiectat un aparat comportamental în care șoarecii ar putea explora liber camera întunecată și să deschidă spațiu luminos (Fig. 1A). După obișnuință, șoarecii WT au rămas de preferință în camera întunecată fie cu sau fără stimulare optică în camera întunecată (Imaginea S1D), asigurându-se că stimularea optică în sine nu a avut nicio influență asupra comportamentului lor care preferă camera întunecată. Am programat experimentul comportamental al animalelor pentru a testa efectul inactivării optice a neuronilor DA asupra comportamentului lor (Imaginea S1E). După obișnuire și pretest, șoarecii au fost condiționați prin stimularea optică a neuronilor DA din VTA atunci când au stat în camera întunecată. Chiar și în primele 5 minute de condiționare, șoarecii TH-Cre au rămas în afara camerei întunecate preferate anterior și au evitat succesiv camera întunecată pe tot parcursul condiționării (Fig. 1B). Șoarecii TH-Cre nu și-au inversat evitarea împotriva camerei întunecate, chiar dacă nu au primit nicio stimulare optică la posttest (Fig. 1C). Aceste date indică faptul că hiperpolarizarea neuronilor DA nu numai că a indus un comportament aversiv tranzitoriu, ci a servit și ca un semnal pentru învățarea aversivă împotriva camerei întunecate și demonstrează, de asemenea, că inactivarea neuronilor DA a jucat un rol cauzal atât în comportamentul aversiv tranzitoriu, cât și în învățarea aversivă prelungită.
Reglarea optogenetică în jos a nivelurilor DA în NAc.
Apoi am investigat dacă inactivarea neuronilor DA în VTA a modificat de fapt concentrația de DA în regiunea sa principală de țintire, NAc. Am măsurat nivelurile DA în NAc prin voltametrie ciclică cu scanare rapidă (FSCV) la șoareci TH-Cre anesteziați care au fost injectați cu AAV-DIO-Arch în VTA lor. Nivelurile DA din NAc au fost rapid crescute prin stimularea electrică a VTA, iar eliberarea DA evocată a fost redusă semnificativ prin stimularea optică simultană a VTA (Imaginea S3). Apoi am testat dacă stimularea optică a VTA ar putea reduce nivelul tonic DA din NAc. În aceleași setări experimentale, am observat că nivelul DA din NAc a fost scăzut tranzitoriu cu 20 de secunde de stimulare optică a VTA (Fig. 2), care este în concordanță cu reacția FSCV raportată împotriva stimulilor aversivi (20). Aceste date demonstrează că stimularea optică a VTA a fost suficient de eficientă pentru a inactiva neuronii VTA DA și pentru a diminua nivelul DA din NAc în timpul experimentului comportamental.
Reglarea în sus a expresiei genei Fos prin inactivarea optică a neuronilor DA în VTA.
Schimbarea comportamentală cauzată de inactivarea condiționată a neuronilor DA în VTA a sugerat că stimularea optică a modificat direct activitatea neuronală și a dus la schimbarea performanței comportamentale. Așadar, am investigat apoi regiunile în care activitatea neuronală a fost crescută de inactivarea condiționată a neuronilor DA prin examinarea expresiei Fos, o genă imediată timpurie. La scurt timp după ce condiționarea a fost efectuată în testul în cameră întunecată, șoarecii au fost procesați rapid pentru a determina cantitatea de expresie Fos prin analiză cantitativă de hibridizare in situ (Fig. 3 și Imaginea S4). NAc, regiunea care primește o cantitate mare de proiecții dopaminergice de la VTA, a arătat o cantitate semnificativ crescută de expresie Fos la șoarecii TH-Cre (Fig. 3). Această suprareglare a fost detectată și în partea contralaterală a stimulării optice, care se presupune că a fost cauzată de o cantitate mică de infecție cu virus în acea parte. Cu toate acestea, reglarea în sus a fost mult mai mare pe partea ipsilaterală decât pe partea contralaterală a stimulării optice, sugerând că inactivarea optică a neuronilor DA a reglat direct activitatea neuronală a NAc. Expresia crescută a Fos a fost observată și în alte regiuni ale creierului, inclusiv în sept, regiunile periventriculare ale striatului, amigdala bazolaterală (BLA) și hipotalamus lateral, dar nu și în habenula laterală sau cortexul prefrontal medial (mPFC; Imaginea S4). Aceste rezultate indică faptul că regiunile activate prin inactivarea optică a neuronilor DA nu au fost limitate la regiunile țintă directe ale neuronilor DA VTA, ci mai degrabă au inclus regiunile care ar putea fi activate indirect într-un mod dependent de circuitul neuronal. Această observație sugerează că inactivarea optică a neuronilor DA a modificat activitatea neuronală la nivelul întregului circuit și ar putea nu numai să evoce o reacție aversivă, ci și să declanșeze câteva alte funcții ale creierului, cum ar fi anxietatea, frica și răspunsurile la stres.21).
Semnalizarea DA prin D2R este critică pentru aversiunea la locul condiționat indusă optogenetic.
Majoritatea semnalelor dopaminergice de la VTA sunt transmise către MSN din NAc prin receptorii DA, D1R și D2R. D1R este aproape exclusiv exprimat în MSN-urile care exprimă substanța P (codificată de gena Tac1), iar D2R este exprimată predominant în MSN-urile care exprimă encefalina (codificată de gena Penk); fiecare tip de MSN constituie căile directe și, respectiv, indirecte în NAc (3). Deoarece afinitatea pentru DA este mult mai mare pentru D2R (ordine nM) decât pentru D1R (ordine µM) (22, 23), se crede că o reducere a nivelurilor de DA are ca rezultat inactivarea Gi- D2R cuplat, dar să nu aibă niciun efect apreciabil asupra D1R (3, 24), reglând astfel activitatea neuronală în mod specific în calea indirectă. Mai mult, activarea Fos a fost observată mai proeminent în celulele care exprimă Penk sau Drd2 (D2R) decât în celulele care exprimă Tac1 sau Drd1a (D1R).Imaginea S5). Pe baza acestor observații, am emis ipoteza că semnalizarea DA prin D2R ar putea juca un rol major în condiționarea aversivă observată.
Pentru a testa această ipoteză, am efectuat testul de aversiune la locul condiționat (CPA) cu trei camere (Imaginea S6). Am pregătit un aparat comportamental care conține două camere cu circumstanțe practic identice și un coridor mic. Această condiție de mediu imparțială din testul CPA ne-a permis să examinăm în continuare dacă inactivarea neuronilor VTA DA este capabilă să inducă o reacție aversivă și să învețe, pe lângă blocarea preferinței camerei întunecate. Când animalelor li s-a permis să se miște liber în jurul întregului aparat, majoritatea au rămas în două camere fără nicio diferență tipică de comportament la pretest. Condiționarea optică a fost apoi efectuată prin împerecherea stimulării optice cu o cameră fixă. Chiar și atunci când oricare dintre camere a fost folosită pentru condiționare, șoarecii TH-Cre au evitat în mod persistent și semnificativ să rămână în camera condiționată optic în timpul condiționării și la posttest (Imaginea S6 B-E). Analiza statistică a validat o reducere semnificativă a timpului de ședere al șoarecilor TH-Cre în camera condiționată optic la posttest în comparație cu timpul de ședere pentru șoarecii WT (Imaginea S6F).
Apoi am încercat să specificăm subtipurile de receptor DA implicate în acest comportament aversiv prin suprimarea specifică a fiecărui receptor DA din NAc (Fig. 4 și Imaginea S7). Am proiectat și validat vectori lentivirali care conțin ARN scurt în ac de păr (shRNA) specifici fiecărui receptor DA cu expresia constitutivă a mCherry. La trei săptămâni după injectarea lentivirusului în NAc, expresia robustă a mCherry a fost localizată în NAc (Fig. 4B). Reducerea efectivă a expresiei ARNm a fiecărui receptor a fost confirmată prin analiza PCR cantitativă în timp real (Fig. S7A). Măsurarea nivelurilor de proteine prin Western blotting a arătat, de asemenea, că injectarea fiecărui lentivirus a redus selectiv produsul proteic țintă fără a afecta expresia celuilalt subtip de receptor DA (Fig. 4C și Imaginea S7 B-G). Lentivirusurile care exprimă shD1R și shD2R și-au scăzut nivelul de proteină țintă la 46.2 ± 1.1% și, respectiv, 38.4 ± 4.9%, în comparație cu nivelul virusului martor (Fig. 4C). Aceste rezultate au verificat că vectorii lentivirali care exprimă shARN specific pentru D1R și D2R și-au suprimat selectiv și suficient ARN-urile țintă și au reglat în jos cantitatea de produse proteice respective. De asemenea, am confirmat că expresia mCherry mediată de virus nu a fost detectată în VTA, excluzând posibilitatea ca shRNA mediat de lentivirus să afecteze direct VTA.
Folosind aceste lentivirusuri care conțin shRNA, am testat ce tip de receptor DA a fost responsabil pentru comportamentul aversiv indus de inactivarea optogenetică a neuronilor DA. Am injectat lentivirus care conține shRNA sau lentivirus de control în NAc bilateral împreună cu AAV-DIO-Arch în VTA stânga a șoarecilor TH-Cre. Fibra optică a fost de asemenea introdusă deasupra VTA (Fig. 4A). Când testul CPA cu trei camere a fost efectuat la trei săptămâni după operație, șoarecii TH-Cre injectați cu lenti:shD1R-mCherry au arătat încă CPA explicit față de camera asociată cu stimulare optică comparabilă cu cea a șoarecilor TH-Cre injectați cu control lentivirus (lenti:mCherry). În schimb, șoarecii TH-Cre injectați cu lenti:shD2R-mCherry nu au reușit să prezinte un CPA evident în timpul condiționării (Fig. 4D). Deficitul exclusiv de învățare al șoarecilor TH-Cre injectați cu lenti:shD2R-mCherry a fost confirmat în continuare prin analiza învățării aversive la posttest (Fig. 4E). Aceste rezultate demonstrează că comportamentul aversiv față de locul condiționat de inactivarea neuronului DA a fost evocat în mod specific prin D2R, și nu prin D1R, în NAc.
Discuție
În striat, studiile au arătat că activarea Gs-D1R cuplat facilitează tragerea acestuia, în timp ce activarea Gi-D2R cuplat are ca rezultat reducerea eficienței tragerii (25). Acconform specificității expresiei receptorului DA, declanșările fazice ale neuronilor DA activează în principal calea directă prin D1R, în timp ce o scădere tranzitorie a declanșărilor neuronilor DA promovează în mod predominant competența căii indirecte prin D2R. (3, 26). Pe baza acestui mecanism de reglare, s-a propus că tăcere neuronilor DA ca răspuns la stimuli aversivi este procesată în principal prin calea indirectă și are ca rezultat un comportament aversiv. (3). Studii recente au arătat că blocarea transmisiei sinaptice a căii indirecte afectează dobândirea unui comportament aversiv provocat de un șoc electric (15) și că această afectare este cauzată de inhibarea transmisiei de semnal mediată de D2R (16). euÎn plus, reglarea optogenetică a MSN-urilor care exprimă D2R în calea indirectă evocă evitarea comportamentală (27). Cu toate acestea, deoarece neuronii DA prezintă atât declanșări îmbunătățite, cât și suprimate ca răspuns la stimuli aversivi și pentru că alte informații senzoriale legate de șoc sunt procesate simultan în creier, rămâne încă de clarificat dacă tăcere neuronilor DA ar putea declanșa direct reacții aversive și învățare, și dacă această reacție este reglată prin MSN-uri care exprimă D2R în calea indirectă.
În acest studiu, am folosit controlul optogenetic al declanșărilor neuronilor DA în cele două teste comportamentale: testul de preferință pentru camera întunecată și testul CPA cu trei camere. Manipularea noastră optogenetică a arătat suprimarea eficientă a declanșărilor neuronilor DA în VTA și reglarea în jos a nivelurilor DA în NAc. Inactivarea noastră optogenetică precisă a declanșărilor neuronilor DA numai în perioada în care animalele au stat în camera condiționată a evocat în mod explicit o reacție aversivă și o învățare, demonstrând că tăcere tranzitorie DA a cauzat în mod direct un comportament pasiv de evitare. Mai mult, această investigație a elucidat că procesarea semnalului mediată de D2R este un factor cheie pentru inducerea acestei reacții aversive și a învățării.
Deși datele noastre au demonstrat că D1R nu a avut niciun efect în experimentele comportamentale pentru a evoca CPA, mai multe studii au documentat că declanșarea fazică a neuronilor DA este necesară pentru răspunsurile la frică și învățarea aversivă (28, 29). Această diferență se datorează setării experimentale; adică, abordarea noastră optogenă a exclus posibilitatea semnalizării prin neuronii DA activați de a evoca un comportament aversiv, ceea ce indică faptul că inactivarea neuronilor DA a fost suficientă pentru a induce un comportament aversiv și învățare. Funcția și procesarea semnalului declanșării DA activate evocate de stimuli aversivi ar avea contribuții diferite la comportamentele aversive față de cele studiate aici și trebuie clarificate în viitor.
Neuronii DA se proiectează și în diverse alte regiuni, inclusiv mPFC, amigdala și hipocampus. Un studiu recent a indicat că activarea optogenetică a neuronilor habenulelor laterale care se proiectează către neuronii DA în VTA sunt capabile să inducă un comportament aversiv, iar acești neuroni DA vizează în principal și în mod specific mPFC (30), deși condiționarea lor optogenetică a fost diferită de cea din studiul nostru actual, deoarece stimularea lor optogenetică a fost prelungită pentru o întreagă sesiune de condiționare. Deoarece aportul dopaminergic la mPFC a fost raportat a fi activat nu numai de stimuli aversivi, ci și de stresul cronic (31, 32), este posibil ca activarea lor continuă a neuronilor DA care proiectează mPFC să fie percepută ca semnale dintr-un mediu extrem de stresant; și, ca urmare a acumulării de condiționări stresante, animalele ar prezenta un comportament aversiv față de camera condiționată. Prin contrast, am inhibat declanșarea neuronilor DA numai în timp ce animalele stăteau în camera condiționată. Rezultatele experimentelor noastre comportamentale care utilizează condiționarea potrivită în timp au indicat că o suprimare bruscă a semnalului DA ar fi percepută ca o intrare aversivă bruscă, ceea ce a dus la răspunsul lor aversiv rapid.
Neuronii DA se proiectează și în amigdală, regiunea care contribuie în mare măsură la răspunsul la frică. Într-adevăr, semnalizarea DA către amigdala a fost implicată în răspunsul la frică și în dobândirea memoriei fricii. (33, 34). În studiul nostru, etichetarea neuronilor DA în VTA a identificat un set de neuroni DA proiectați către BLA, dar amploarea acestor proiecții a fost mult mai mică decât cea care se proiectează către NAc. Deși nu am putut exclude un efect subtil al semnalizării DA proiectate de amigdală asupra comportamentului nostru aversiv observat, efectul principal al inactivării optogenetice a neuronilor DA ar trebui să fie asupra NAc, deoarece experimentele noastre cu distrugerea specifică a D2R în NAc s-au diminuat dramatic. comportamentul aversiv. Investigațiile viitoare care abordează semnalizarea DA specifică țintei sunt necesare pentru a elucida efectele modificării la nivelul circuitului a neuronilor DA asupra stimulilor aversivi și condiționării fricii.
Materiale și metode
Subiecte.
Tirozin-hidroxilaza::Șoareci IRES-Cre (TH-Cre) knock-in (EM:00254) (18) au fost obținute din Arhiva Europeană Mouse Mutant. Toate animalele experimentale au fost reîncrucișate cu tulpina C57BL/6J timp de mai mult de 10 generații. Șoarecii au fost împerecheați cu șoarecii C57BL/6J WT și găzduiți cu un ciclu standard de 12 ore lumină/12 ore întuneric și au primit hrană și apă ad libitum. Cre+ si Cre- Pentru experimente au fost folosiți șoareci din aceleași pui (3-6 luni). Toate experimentele pe animale au fost aprobate de comitetul pentru animale al Institutului de Bioștiință din Osaka, în conformitate cu liniile directoare ale experimentelor pe animale.
Teste de comportament.
În timpul tuturor testelor de comportament, șoarecii au fost conectați cu o fibră optică și au fost lăsați să se miște în întregul aparat. Mișcarea șoarecilor a fost monitorizată astfel încât să se poată deplasa fără obstacole chiar și atunci când erau conectați cu o fibră optică pe cap. Poziția unui mouse a fost detectată de o cameră video suspendată peste aparatul comportamental și analizată printr-un program personalizat folosind software-ul Labview.
Test de preferință pentru camera întunecată.
Aparatul comportamental personalizat utilizat în test a fost compus dintr-o cameră întunecată (15 × 9.5 cm) și un spațiu deschis luminos (15 × 11 cm). Camera întunecată avea pereți, podea și acoperiș, toate colorate în negru și aveau o intrare (4.5 cm lungime) în spațiul deschis și luminos. Spațiul deschis și luminos avea forma unei elipse și avea o podea cu grilă metalică și pereți limpezi, fără acoperiș. Înainte de test, toți șoarecii au fost obișnuiți timp de 10 minute în aparat. Testul a constat în trei sesiuni: în prima jumătate a zilei 1 (pretest: 5 min), șoarecii au fost lăsați să exploreze întregul aparat. Din jumătatea târzie a zilei 1 până în ziua 4 (condiționare: 35 de minute în total), șoarecii au primit stimulare optică atunci când au stat în camera întunecată. În ziua 5, preferința camerei întunecate a fost testată fără stimulare optică (posttest: 5 min; Imaginea S1E).
Test CPA cu trei camere.
Aparatul de preferință a locului condiționat/CPA cu trei camere personalizat utilizat în test a fost compus din două camere (10 × 17 cm) și un coridor de legătură. Testul a constat din trei sesiuni. Ziua 1 (pretest: 15 min): șoarecilor li s-a permis să exploreze liber întregul aparat. Șoarecii care au stat de 1.5 ori mai mult într-o cameră decât în cealaltă au fost excluși din test. Zilele 2 și 3 (condiționare: 15 minute fiecare): șoarecii au primit stimulare optică atunci când au stat în camera cu pereche de lumină. Selecția camerei cu pereche de lumină a fost contrabalansată. Ziua 4 (posttest: 15 min): Testul a fost efectuat în aceleași condiții ca și în pretest (Imaginea S6A).
În sesiunea de condiționare, stimularea optică a fost oprită timp de 30 de secunde când șoarecii au stat continuu peste 30 de secunde în camera întunecată sau în camera cu pereche de lumină pentru a evita supraîncălzirea. Puterea laserului a fost controlată să fie de aproximativ 5 mW la vârful fibrei optice în toate testele de comportament.
Voltametrie ciclică In Vivo Fast-Scan.
Experimentele FSCV au fost efectuate folosind metoda descrisă în studiile anterioare (35-37). Șoarecii au fost anesteziați cu un amestec de ketamina/xilazină așa cum este descris în SI Materiale și metode și plasate într-un cadru stereotaxic. O fibră optică folosită pentru stimularea neuronilor DA care exprimă Arch a fost situată aproape de electrodul de stimulare. Optrodul de stimulare a fost apoi plasat în VTA (din bregma: anterior-posterior, -3.2 mm; lateral, 0.5 mm; și dorsal-ventral, 3.5 mm) și coborât la intervale de 0.25 mm. Un microelectrod din fibră de carbon (300 µm lungime) pentru înregistrarea voltametrică a fost coborât în NAc (din bregma: anterior-posterior, 1.0 mm; lateral, 1.0 mm; și dorsal-ventral, 3.5 mm). Măsurătorile voltametrice au fost făcute la fiecare 100 ms prin aplicarea unei forme de undă triunghiulară (-0.4 V la +1.3 V la -0.4 V față de Ag/AgCl, la 400 V/s) microelectrodului din fibră de carbon. A fost folosit un potențiostat personalizat pentru izolarea formei de undă și amplificarea curentului. Eliberarea DA a fost evocată prin stimularea electrică a neuronilor DA prin utilizarea stimulării cu 24 de impulsuri (100 pA, durată de 5 ms, 30 Hz). O stimulare optică a neuronilor DA (532 nm, ~ 5 mW putere la vârful fibrei) a fost aplicată timp de 10 s începând cu 5 s înainte de debutul unei stimulări electrice. Microelectrozii din fibră de carbon au fost calibrați într-o soluție cu concentrații cunoscute de DA (0.2 uM, 0.5 uM și 1.0 uM). Toate datele de voltametrie au fost analizate prin programe personalizate folosind software-ul Labview și Matlab. Reducerea nivelurilor DA prin stimulare optică a fost rezolvată cu analiza componentelor principale, prin utilizarea formelor de undă DA șablon obținute din stimulările electrice VTA pentru a separa semnalele de dopamină (35, 36).
Analize statistice.
Analiza statistică a fost efectuată utilizând GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Datele au fost analizate prin măsuri repetate ANOVA (Fig. 1B, , 4D,4D, și Imaginea S6 D și E) sau ANOVA unidirecțional (Fig. 1C, , 3D,3D, 4 C și E, și Figurile. S4 K-M, S6F, și S7A), iar analizele post-hoc au fost efectuate folosind testul Bonferroni. Toate semnele/coloanele și barele au reprezentat media și, respectiv, ± SEM.
Alte proceduri experimentale, inclusiv prepararea și injectarea virusului, înregistrarea electrofiziologică și analiza imunohistochimică și ARNm sunt descrise în detaliu în SI Materiale și metode.
recunoasteri
Mulțumim lui E. Boyden pentru construcția Arch, lui R. Matsui pentru sfatul tehnic în producția și purificarea lentivirusului și lui Y. Hayashi pentru sfatul tehnic în programarea analizei datelor. Această activitate a fost susținută de Granturi de cercetare în ajutor 22220005 (către SN), 23120011 (către SY și SN), 24700339 (către TD) și 25871080 (către SY) de la Ministerul Educației, Culturii, Sportului, Științei și Tehnologia Japoniei și un grant de la Takeda Science Foundation (către SN).
Note de subsol
Autorii nu declară nici un conflict de interese.
Acest articol conține informații de asistență online la www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referinte
;