Suficiența stimulării mezolimbice a dopaminei pentru stimularea progresiei adulților (2015)

Introducere

Dependența este o boală care evoluează în mai multe etape (Everitt și colab., 2008, George și colab., 2014). Diagnosticul se pune atunci când uzul recreativ devine compulsiv, persistând în ciuda consecințelor negative. În timp ce o ipoteză importantă a dependenței presupune că drogurile de abuz cauzează boala deoarece cresc excesiv concentrația de dopamină (DA) în creier, nu este clar dacă declanșarea acestui sistem este suficientă pentru a conduce tranziția de la consumul recreațional la dependență (Di Chiara și Bassareo, 2007, Volkow și Morales, 2015). Dovezile care susțin ipoteza DA pentru întărirea drogurilor s-au acumulat de-a lungul mai multor decenii și se bazează pe efectul inițial al medicamentelor. De exemplu, medicamentele care creează dependență reduc pragul de auto-stimulare intracraniană (ICSS) al fasciculului medial al creierului anterior, un tract de fibre care conține, printre altele, proiecția ascendentă DA de la nivelul creierului mediu (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky și colab., 1979). Studiile de farmacologie și leziuni au identificat apoi sistemul DA mezocorticolimbic ca origine a acestui circuit (Wise și Bozarth, 1982). La sfârșitul anilor 1980, o măsură directă a concentrației extracelulare de DA cu microdializă a confirmat că medicamentele care provoacă dependență au împărtășit proprietatea de a evoca o creștere a DA în NAc (Di Chiara și Imperato, 1988). Acest lucru a condus la propunerea unei clasificări mecaniciste a drogurilor care creează dependență (Lüscher și Unngless, 2006).

Se știe mult mai puțin despre modul în care aceste efecte inițiale ale consumului de droguri facilitează tranziția la dependență. Au fost luate în considerare mecanisme independente de DA deoarece medicamentele care creează dependență au alte ținte farmacologice. De exemplu, cocaina, pe lângă inhibarea transportorului DA (DAT), se leagă și de SERT (transportor de serotonine) și NET (transportor de norepinefrină) pentru a scădea recaptarea serotoninei și respectiv a norepinefrinei, crescând astfel concentrația tuturor monoaminelor majore (Han și Gu, 2006, Tassin, 2008). Preocupări similare se pot aplica și altor psihostimulanți. Mai mult, există afirmația că opiaceele sunt, cel puțin în faza inițială, independente DA (Badiani și colab., 2011, Ting-A-Kee și van der Kooy, 2012). Ipoteza DA a fost, de asemenea, contestată pe baza modelelor genetice de șoarece, unde, după interferența cu sistemul DA, unele forme de comportament adaptativ la medicamente erau încă evidente. De exemplu, șoarecii knockout DAT auto-administra cocaină (Rocha și colab., 1998) și abolirea sintezei DA fie farmacologic (Pettit și colab., 1984), fie genetic (Hnasko și colab., 2007) nu au reușit să prevină auto-administrarea drogurilor. sau preferință de loc condiționat. În timp ce o mai bună caracterizare a acestor șoareci transgenici și generarea de transportatori de monoamine duble au rezolvat unele dintre aceste probleme (Rocha, 2003, Thomsen și colab., 2009), este necunoscută suficiența DA pentru a declanșa caracteristicile cardinale ale dependenței. Pentru a evita problemele de nespecificitate, am decis, prin urmare, să le permitem șoarecilor să-și autostimuleze neuronii VTA DA folosind o abordare optogenetică.

Studii recente au arătat că activarea neuronilor DA la nivelul creierului mediu poate induce preferința locului (Tsai și colab., 2009) sau poate întări comportamentul instrumental (Adamantidis și colab., 2011, Witten și colab., 2011, Kim și colab., 2012, Rossi et al., 2013, McDevitt et al., 2014, Ilango et al., 2014). În timp ce această activare selectivă a căilor DA confirmă studiile de autostimulare intracraniană (ICSS) efectuate cu mai bine de 30 de ani în urmă în delimitarea sistemului de recompensă (Fouriezos și colab., 1978), acestea nu demonstrează inducerea comportamentului adaptativ în stadiu avansat care definește dependența și nici nu au identificat adaptările neuronale subiacente. Aici am folosit manipularea optogenetică nu numai pentru a permite testarea directă a criteriului de suficiență pentru semnalizarea DA fazică în inițierea întăririi, ci și pentru a testa trecerea la dependență.

O observație izbitoare a etapelor ulterioare ale bolii este că, chiar și cu cele mai dependente de droguri, doar o parte dintre utilizatori devin dependenți (Warner și colab., 1995, O'Brien, 1997). Dependenții umani vor continua să consume droguri în ciuda consecințelor negative (a se vedea „Definiția dependenței” a Societății Americane pentru Medicină pentru Dependență, DSM5, Asociația Americană de Psihiatrie, 2013), de obicei legate de înfrângerile sociale și psihologice care sunt adesea amânate în timp. În mod similar, la rozătoare, aproximativ unul din cinci animale care dobândesc auto-administrarea de cocaină sunt în cele din urmă clasificate ca dependente (Deroche-Gamonet și colab., 2004, Kasanetz și colab., 2010; dar vezi George și colab., 2014). Perseverența consumului de droguri în ciuda consecințelor negative poate fi modelată și la rozătoare prin introducerea unui simplu stimul aversiv în programul de consum. În timp ce boala umană este mai complexă, asocierea pedepsei cu consumul este un model simplu al unei componente de bază a dependenței.

Aici, am folosit un șoc ușor de picior pentru a evalua consecințele acestuia asupra auto-administrarii de cocaină, zaharoză și autostimulare optogenetică. Investigam în continuare dacă autostimularea neuronilor DA poate induce două comportamente legate de dependență - căutarea recompensei asociate cu indicații și compulsivitatea asociată cu consumul în ciuda consecințelor negative - și caracterizăm plasticitatea neuronală asociată cu aceste comportamente.

REZULTATE

Pentru a controla activitatea neuronului DA, am injectat un virus adeno-asociat inductibil de Cre (AAV) cu un cadru de citire deschis inversat dublu (DIO) care conține ChR2 fuzionat cu proteina fluorescentă galbenă îmbunătățită (eYFP) (Atasoy și colab., 2008, Brown și colab., 2010) în VTA de șoareci DAT-Cre. În plus, a fost plasată o fibră optică pentru a viza VTA (ChR2, A se vedea Proceduri experimentale). Specificitatea ChR2 expresia a fost confirmată prin co-localizarea eYFP cu tirozinhidroxilaza (TH), o enzimă necesară pentru sinteza DA (figura 1A). 

În primul rând, pentru a stabili protocolul de stimulare cu laser, șoarecii au fost plasați într-o cutie operantă unde puteau apăsa o pârghie activă, care declanșa un număr de stimulări cu laser care era variat (1, 2, 8, 32, 60 sau 120 de explozii) la fiecare două sesiuni. Pentru a emula modelul de tragere fazic (Hyland et al., 2002, Mameli-Engvall et al., 2006, Zhang et al., 2009) indus de obicei de recompensa naturală (Schultz, 1998), am folosit stimularea în explozie. O explozie a constat din cinci impulsuri laser de 4 ms, la 20 Hz, și a fost repetată de două ori pe secundă. Am descoperit că șoarecii și-au adaptat comportamentul de apăsare a pârghiei în funcție de exploziile per stimulare cu laser, controlând astfel numărul total de explozii primite (figura 1B). Acest comportament amintea de autoadministrarea de droguri care dă dependență, când doza per perfuzie era variată (Piazza și colab., 2000). Pentru experimentele ulterioare, am ales să administrăm 30 de rafale per apăsare a pârghiei, obținând un număr de rafale jumătate maxim (figura 1B). Pentru a imita întârzierea creșterii DA observată în mod obișnuit atunci când medicamentele sunt administrate intravenos (Aragona și colab., 2008), am întârziat stimularea cu laser cu 5 s și am adăugat o lumină semnal intermitent timp de 10 s (figura 1C).

Pe parcursul a 12 zile consecutive, șoarecilor li s-a permis să se autostimuleze de maximum 80 de ori în 2 ore. Șoarecii au crescut rapid rata de stimulare cu laser, ajungând la 80 de stimulări cu laser (LS) înainte de sfârșitul primei ore a unei sesiuni (Cifrele 1D și 1E). Distincția dintre pârghia activă și cea inactivă a fost obținută rapid, iar numărul de apăsări active a pârghiei a crescut în consecință cu creșterea programelor de raport fix (FR1, 2, 3) (Cifrele 1F și 1G). În experimentele de control folosind șoareci DAT-Cre− sau șoareci care au exprimat ChR2 în neuronii acidului γ-aminobutiric (GABA) (șoareci GAD-Cre+, pentru a viza neuronii inhibitori ai VTA), ratele de autostimulare au fost scăzute și au scăzut continuu sesiuni. Acest lucru s-a aplicat și la două animale Cre+ în care validarea post-hoc a arătat că VTA nu a fost infectată cu ChR2-eYFP (nu este prezentat). Mai mult, nu a fost detectată nicio discriminare între pârghia activă și cea inactivă (Cifrele S1A și S1B).

Am observat că șoarecii DAT-Cre+ au apăsat mai des pe pârghia activă decât era necesar pentru stimularea cu laser. De fapt, astfel de prese de pârghie active „în zadar” au reprezentat mai mult de 30% din toate presele de pârghie active (Figura S2(Cifrele S2B și S2C). Acest comportament singular s-a dezvoltat în timpul achiziției și poate reflecta răspunsuri impulsive.

Luate împreună, activitatea de explozie în neuronii VTA DA întărește puternic răspunsul pârghiei.

Ocluzia autostimularii neuronului VTA DA de către cocaină

Pentru a testa dacă autostimularea neuronului VTA DA se bazează pe aceleași circuite cerebrale care sunt vizate de drogurile care creează dependență pentru a întări comportamentul, am injectat cocaină intraperitoneal (ip) imediat înainte de sesiunile de autostimulare (acces gratuit la laser timp de 45 de minute, figura 2A). La momentul inițial, animalele bine antrenate au apăsat de aproximativ 400 de ori pentru a obține 85 LS în 45 de minute conform programului FR3. După injectarea de cocaină, performanța a scăzut semnificativ în funcție de doză la aproximativ 30 LS pentru 100 de apăsări cu pârghie cu cea mai mare doză (figura 2B). Această ocluzie a fost cel mai pronunțată în primele 30 de minute ale ședinței, reflectând farmacocinetica medicamentului (figura 2C). Acest experiment indică faptul că întărirea prin autostimulare optogenetică și întărirea prin cocaină au în comun circuitele neuronale care stau la baza.

Pentru a compara în continuare autostimularea optogenetică cu medicamentele care creează dependență, apoi am întrebat dacă șoarecii ar recidivă la autostimularea neuronilor VTA DA după câteva săptămâni de retragere. Deoarece căutarea de droguri asociată cu indicații este un model stabilit de recidivă (Epstein și colab., 2006, Soria și colab., 2008, Bossert și colab., 2013), am plasat șoarecii înapoi în camera operantă la 30 de zile după ultima auto- sesiune de stimulare, în care apăsarea activă a pârghiei a declanșat acum lumina indicatoare fără stimulare cu laser (figura 3A). Comportamentul robust de căutare asociat cu indicii, demonstrat de o rată ridicată de apăsări active de pârghie, a fost evident doar la șoarecii cu expresia eYFP-ChR2 în neuronii VTA DA (șoareci DAT-Cre+ dar nu DAT-Cre−, figura 3B).

Studiile anterioare au arătat legătura cauzală dintre recidiva asociată cu indicii și plasticitatea sinaptică evocată de cocaină într-un subtip de neuroni NAc care exprimă DA D1R (Pascoli, Terrier și colab., 2014). Prin urmare, pentru a evalua această plasticitate sinaptică, am generat șoareci DAT-Cre încrucișați Drd1a-tdTomato șoareci pentru a identifica subtipul de neuroni spinoși de dimensiuni medii (MSN) în NAc. În loc de testul de căutare, au fost preparate felii de NAc unde D1R-MSN-urile erau roșii, în contrast cu fibrele verzi de la neuronii VTA DA infectați cu flox-ChR2-eYFP (figura 3C). Înregistrările cu patch-clamp pentru celule întregi ex vivo au dezvăluit o relație de tensiune de curent de rectificare pentru curenții postsinaptici evocați de AMPAR (AMPAR-EPSC) și un raport AMPAR/NMDAR crescut (Cifrele 3D și 3E), în D1R-MSN, dar nu și în D2R-MSN. S-a demonstrat că descoperiri similare obținute anterior după retragerea de la auto-administrarea cocainei indică inserția combinată a AMPAR-urilor lipsite de GluA2 și care conțin GluA2, la intrări separate pe D1R-MSN (Pascoli, Terrier și colab., 2014).

Auto-stimulare în ciuda pedepsei

Consumul de substanțe în ciuda consecințelor negative este o altă caracteristică definitorie crucială a dependenței (vezi definiția DSM5, Asociația Americană de Psihiatrie, 2013). Au fost stabilite modele de șobolan (Deroche-Gamonet și colab., 2004, Pelloux și colab., 2007, Pelloux și colab., 2015, Chen și colab., 2013) în care un șoc electric introdus în programul de autoadministrare a cocainei suprimă cocaina consum la unele animale. După 12 zile de expunere inițială (achiziție), șoarecilor li s-a permis să aibă trei sesiuni suplimentare la FR3, dar cu o întrerupere a sesiunii redusă (60 min sau maximum 40 de recompense). Aceste trei sesiuni au servit ca punct de referință pentru următoarele patru sesiuni, în care fiecare a treia stimulare cu laser a fost asociată cu un șoc picior (500 ms; 0.2 mA) prezis de un indici nou (figura 4A). Intensitatea și durata șocului piciorului au fost ajustate pentru a suprima complet apăsarea pârghiei pentru recompensa de zaharoză (vezi și datele de mai jos). Programul de pedepse a dus la două răspunsuri comportamentale opuse (figura 4B). Unii șoareci au încetat rapid să răspundă atunci când a fost introdusă pedeapsa (numită „sensibilă”), în timp ce alții au continuat să răspundă pentru a obține un număr maxim de stimulări cu laser și pot fi considerați „rezistenți” la pedeapsă. Cele două grupuri de animale au apărut complet la sfârșitul celor patru sesiuni de pedeapsă (figura 4C). „Șoarecii rezistenți” au menținut numărul de stimulări cu laser (reducere cu mai puțin de 20%), în timp ce „șoarecii sensibili” au scăzut autostimularea cu mai mult de 80%. Cu aceste criterii, un singur animal (puncte gri) nu a putut fi atribuit. Această observație demonstrează că activitatea de explozie forțată evocată de auto-stimularea neuronilor VTA DA este suficientă pentru a induce perseverența consumului în ciuda consecințelor negative la o fracțiune de șoareci. Ca martor, într-un grup independent de șoareci care au stabilit rezistență sau sensibilitate la pedeapsa asociată cu autostimularea, nocicepția a fost evaluată folosind testul tail-flick. Nu a fost detectată nicio diferență în latența de a retrage coada scufundată în apă fierbinte între sensibil și rezistent (Figura S3).

Apoi am întrebat, post-hoc, dacă vreo caracteristică specială din timpul fazei de achiziție a autostimularii ar fi putut prezice rezistența la pedeapsă. Șoarecii sensibili și rezistenți au făcut un număr identic de apăsări de pârghie active și inactive în timpul sesiunilor de bază și toți șoarecii au atins maximul de 80 LS (Cifrele S4A și S4B), într-o perioadă similară de timp (Cifrele S4A și S4C). În timp ce fracția de apăsare cu pârghie activă inutilă nu a fost din nou diferită în cele două subpopulații (Cifrele 4D și S4D), numărul de apăsări inutile ale pârghiei înainte de debutul stimulării cu laser a devenit semnificativ mai mare la șoarecii rezistenți până la sfârșitul sesiunilor de achiziție (Cifrele 4E și S4E). Pe măsură ce acest comportament s-a dezvoltat în timpul achiziției, poate contribui, alături de impulsivitatea înnăscută (Econonomidou et al., 2009, Broos et al., 2012, Jentsch et al., 2014), la stabilirea rezistenței la pedeapsă. În plus, a fost efectuat un studiu cu raportul progresiv în ziua 11 pentru a cuantifica motivația pentru stimularea optogenetică (Richardson și Roberts, 1996). Șoarecii rezistenți au prezentat un punct de întrerupere care nu este diferit statistic de șoarecii sensibili (Figura S4F).

Rezistența la pedepse pentru cocaină, dar nu pentru zaharoză

Pentru a testa dacă paradigma consumului, în ciuda consecințelor dăunătoare, împreună cu apăsarea impulsului, ar putea prezice și consumul compulsiv al unui drog care dă dependență, o nouă cohortă de șoareci a suferit 12 zile de auto-administrare de cocaină. Parametrii experimentali pentru autoadministrarea cocainei au fost stabiliți la maximum 80 de perfuzii de cocaină în decurs de 4 ore în timpul achiziției și la 40 de perfuzii în decurs de 2 ore în timpul celor trei sesiuni de bază premergătoare celor patru sesiuni de pedeapsă (Cifrele 5A și S5A). Din nou, două grupuri au apărut după ce au asociat recompensele de cocaină cu șocuri electrice. Într-adevăr, 5 din 22 de șoareci au fost clasificați ca rezistenți (scădere cu mai puțin de 20% față de valoarea inițială), în timp ce 17 s-au calificat ca sensibili (scădere cu peste 80%) și un animal a căzut între ele (13 perfuzii în ziua 19) (figura 5B). Am căutat apoi predictori comportamentali ai rezistenței la pedeapsă. Între cele două grupuri, numărul de perfuzii, viteza de perfuzie și numărul de apăsări cu pârghie active sau inactive nu au fost diferite (Cifrele S5B–S5D), iar punctele de rupere au fost similare (Figura S5E). Ceea ce a diferit a fost evoluția distribuției în timp a apăsărilor inutile pe pârghia activă. În primele patru sesiuni, apăsările inutile cu pârghie au scăzut în mod regulat în timpul perioadelor de time-out atât la șoarecii rezistenți, cât și la cei sensibili, în timp ce la sfârșitul achiziției, numai șoarecii sensibili au menținut acest comportament (Cifrele 5C și 5D și S5F). În schimb, șoarecii rezistenți au avut tendința de a-și crește numărul total de apăsări inutile pe pârghie (Cifrele 5C și S5D), în special în ultimul trimestru al perioadei de time-out (figura 5D). Deși din punct de vedere calitativ similar cu observația făcută anterior cu stimularea optogenetică a neuronilor DA (vezi mai sus), gruparea preselor inutile în timpul perioadei timpurii de time-out nu a fost observată cu cocaină, cel mai probabil din cauza cineticii mai lente cu care drogul. niveluri crescute de DA. Cu toate acestea, concluzii similare ar putea fi trase pe baza acestei evoluții singulare a distribuției inutile a presei cu pârghie în perioada scurtă de timp care precede „detectarea internă a supratensiunii DA”. Observațiile noastre sugerează, astfel, că distribuția preselor cu pârghie active inutile prezice consumul de droguri, în ciuda consecințelor negative.

În cele din urmă, am repetat experimentul cu șoareci hrăniți ad libitum care ar putea apăsa pentru o recompensă de zaharoză. Odată ce pedeapsa a fost introdusă, toți șoarecii au încetat să-și mai administreze zaharoza (figura 5E), demonstrând că acest program a suprimat aportul unei recompense naturale neesențiale, dar a permis detectarea aportului compulsiv al unui drog care dă dependență sau stimularea puternică a neuronului DA.

Luate împreună, aceste rezultate demonstrează că autostimularea VTA DA este suficientă pentru a induce compulsivitate, așa cum arată rezistența la pedeapsă la un subgrup de șoareci (68%). În mod similar, după cocaină SA, unii șoareci au devenit rezistenți la pedepse (23%), ceea ce nu a fost niciodată cazul după zaharoza SA (figura 5F).

Pentru a identifica zona creierului care poate controla decizia de a persevera în auto-administrare în ciuda consecințelor negative, am monitorizat mai întâi „activitatea neuronală” generică prin numărarea numărului de neuroni în care sesiunea de pedeapsă a declanșat expresia imediată a genei precoce cFos în 15 ani. regiuni diferite. Șoarecii au fost perfuzați intracardic cu PFA la 90 de minute după încheierea ultimei sesiuni de pedeapsă. Grupurile de control au inclus animale naive, precum și șoareci legați de șoareci sensibili sau rezistenți pentru a controla efectul posibil de confuzie al numărului de șocuri primite.

În timp ce în majoritatea regiunilor alese, numărul de neuroni cFos-pozitivi a fost cel mai mare în felii de la șoareci rezistenți în comparație cu felii de șoareci naivi, au apărut două tipuri de răspunsuri, dintre care cortexul prelimbic (PL) și OFC lateral sunt exemple. În PL am găsit o creștere similară a celulelor cFos-pozitive la șoarecii rezistenți și martorii lor în jug, în timp ce în OFC această creștere a fost aparentă doar la șoarecii rezistenți și nu la șoarecii cu jugul corespunzător (Cifrele 6A și 6B). Pentru a cuantifica această diferență, toate datele au fost mai întâi normalizate la nivelurile de expresie la animalele naive. Apoi, a fost calculat raportul dintre rezistența peste sensibilă împărțită la jug la rezistent peste jug la sensibil (Raportul_CFOs = (R/S) / (YR/YS), figura 6B). Această procedură a identificat cortexul cingulat, OFC și VTA ca fiind regiunile care sunt activate la șoarecii rezistenți, dar nu sensibili și unde a existat o diferență mică în ambele grupuri de martori cu jug (neuroni similari cu cFos-pozitivi scăzuti în jug, de fapt) . Găsirea VTA nu este surprinzătoare, deoarece este regiunea neuronilor stimulați cu laser. Acest lucru este în conformitate cu un raport anterior care arată că stimularea ChR2 declanșează activarea cFos (Lobo și colab., 2010, Van den Oever și colab., 2013). Un raport scăzut_CFOs a fost găsit în regiunile în care activarea a fost similară la sensibile și rezistente (cum ar fi CeA și PAG). Raportul_CFOs a fost, de asemenea, scăzută atunci când activarea a fost paralelă cu o diferență mare între controalele în jug (cum ar fi PL, figura 6C pentru raportul rezumat_CFOs date). O expresie similară a cFos la șoarecii rezistenți și rezistenți la jug a fost, prin urmare, cel mai probabil determinată de numărul de șocuri la picioare și a avut puțin de-a face cu rezistența la pedeapsă. Luate împreună, raportul ridicat_CFOs în OFC sugerează că activitatea neuronală din această regiune este asociată cu rezistența la pedeapsă și poate astfel favoriza tranziția la dependență.

Pentru a identifica substratul activității neuronale crescute în OFC la șoarecii care rezistă la pedeapsă, am pregătit felii de PL și L-OFC la 24 de ore după ultima sesiune de pedeapsă pentru a testa excitabilitatea intrinsecă. Cele două regiuni au fost alese din cauza modelului lor foarte distinct de expresie a c-Fos în experimentele anterioare. Excitabilitatea neuronală a fost cuantificată prin numărarea numărului de potențiale de acțiune (AP) provocate de injectarea unor cantități crescânde de curent (de la 0 la 600 pA) în înregistrările cu celule întregi. Aceste înregistrări au evidențiat o hipo-excitabilitate susținută în neuronii piramidali ai PL a șoarecilor rezistenți (și controlul lor jug) în comparație cu șoarecii sensibili sau naivi (figura 7A). Potențialul de membrană de repaus (RMP) al neuronilor înregistrați nu a fost diferit între grupurile experimentale (figura 7B). Aceste rezultate sugerează cu tărie că excitabilitatea neuronilor din PL se corelează direct cu numărul de șocuri primite și poate nu cu decizia de a rezista pedepsei. Acest lucru reflectă cel mai probabil o adaptare la feedback negativ declanșată de excitația neuronală provocată de șocurile piciorului cu o zi înainte. Prin contrast, neuronii din L-OFC au fost mai excitabili numai la șoarecii rezistenți. Excitabilitatea neuronilor de la șoareci în jug nu a fost diferită de excitabilitatea neuronilor de la șoarecii naivi, excluzând un efect al șocului piciorului în sine (Cifrele 7C și 7D). Această activitate crescută a neuronilor OFC stă probabil la baza expresiei cFos și poate determina rezistența la pedeapsă.

Pentru a testa cauzalitatea între excitabilitatea neuronului OFC îmbunătățită și rezistența la pedeapsă, am exprimat DREADD inhibitor (receptori de proiectare activați exclusiv de medicamente de proiectare: CamKIIα-hM4D) în neuronii piramidali ai OFC ai șoarecilor DAT-Cre+ (figura 8A). În feliile acute din OFC, aplicarea în baie de CNO (clozapină-N-oxid) a indus un curent lent spre exterior, cel mai probabil mediat de canalele GIRK, care a fost inversat de bariu (Ba²⁺), un blocant nespecific al canalelor de potasiu (figura 8B). CNO a deplasat, de asemenea, curba de intrare/ieșire la dreapta (figura 8C). Șoarecii DAT-Cre+ infectați cu AAV1/CamKIIα-hM4D-mCherry în OFC (figura 8D) paradigma de autostimulare neuronală DA dobândită urmată de două blocuri succesive cu programul de pedeapsă, primul în prezența CNO și al doilea fără CNO. Cele două blocuri au fost întrerupte cu 6 zile fără pedeapsă (figura 8E). La sfârșitul primului bloc de pedeapsă, în prezența CNO, doar 5 din 16 șoareci erau rezistenți (figura 8F, panoul din stânga). În schimb, fără inhibiția OFC, în a doua perioadă de pedeapsă, 14 din 16 au fost clasificați drept „rezistenți” (Cifrele 8F, panoul din dreapta și 8G). Cu alte cuvinte, fracția de șoareci rezistenți a fost semnificativ mai mică în prezența CNO în comparație cu prima cohortă de 34 de șoareci testați anterior în aceleași condiții (comparație între grupuri, figura 8H) și a devenit similar cu prima cohortă fără CNO (comparație în cadrul grupului). În cele din urmă, pentru cei nouă șoareci care s-au schimbat de la sensibili la rezistenți, CNO nu a modificat latența cozii la scufundare în apă fierbinte (figura 8I).

Luat împreună, acest experiment demonstrează că activitatea neuronilor piramidali ai OFC conduce decizia de a continua autostimularea în ciuda consecințelor negative care reprezintă o caracteristică cheie a tranziției la dependență la rozătoare.

Discuție 

Un model de dependență propus recent distinge trei pași în progresia bolii: consumul sporadic de droguri recreaționale, urmat de consumul intens, susținut, escaladat de droguri și, eventual, consumul compulsiv asociat cu pierderea controlului (Piazza și Deroche-Gamonet, 2013; dar vezi George și colab., 2014). Studiul nostru demonstrează că stimularea neuronilor VTA DA este suficientă pentru a conduce această progresie cu un curs de timp relativ rapid.

Imitând un model de ardere în explozie care apare în mod natural, este evocată o eliberare eficientă de DA în regiunile țintă ale VTA, cum ar fi NAc (Bass și colab., 2010). Prin urmare, nivelurile de DA din NAc guvernează probabil auto-stimularea, la fel cum rozătoarele se auto-administrează următoarea perfuzie de cocaină sau heroină odată ce concentrația de DA scade sub pragul (Wise și colab., 1995). Acest lucru este susținut și de observația noastră că cocaina, injectată ip, poate bloca autostimularea. Astfel, autostimularea neuronului DA seamănă îndeaproape cu autoadministrarea medicamentelor, chiar dacă cinetica sa este cu siguranță mai rapidă decât orice substanță farmacologică, inclusiv cocaina, așa cum sugerează rata diferită de răspunsuri observată în studiul de față.

În timp ce am vizat în mod selectiv neuronii DA ai VTA, autostimularea lor optogenetică poate avea grupuri activate de celule cu diferite funcții fiziologice. De exemplu, s-a sugerat recent că unii neuroni DA codifică stimuli aversivi (Lammel și colab., 2012, Gunaydin și colab., 2014). Aceste celule se proiectează către mPFC, în timp ce neuronii VTA DA care se proiectează către învelișul lateral NAc mediază întărirea pozitivă (Lammel și colab., 2012). Ar fi interesant să se evalueze autostimularea și progresia cu țintirea selectivă (Gunaydin și colab., 2014). Deoarece manipularea noastră a activat toți neuronii VTA DA, la fel cum cocaina acționează asupra tuturor neuronilor care exprimă DAT, este de conceput ca unii neuroni DA să conducă învățarea de întărire, în timp ce alți neuroni DA ar conduce învățarea aversiunii. Efectul net ar fi în continuare o întărire a comportamentului; totuși, „neuronii aversiunii” ar putea contribui la inducerea unui proces adversar (Koob, 2013, Wise și Koob, 2014).

După abstinența forțată, reexpunerea la context a indus căutarea de autostimulare, un model de recădere de droguri consacrat la rozătoare. În mod remarcabil, plasticitatea neuronală subiacentă nu se poate distinge de cea observată după retragerea de la autoadministrarea cocainei (Pascoli, Terrier et al., 2014). Acest lucru se adaugă la un studiu care a raportat anterior plasticitate sinaptică identică în neuronii VTA DA evocată de o singură sesiune de stimulare optică sau de o primă injecție a unui drog care dă dependență (Brown și colab., 2010). Un tipar de adaptări sinaptice este în curs de dezvoltare, un comportament adaptativ comun tuturor drogurilor care creează dependență.

O caracteristică izbitoare a studiului nostru este dihotomia în răspunsul la un stimul aversiv care este suficient de puternic pentru a perturba consumul de recompense naturale neesențiale la toate animalele. În contextul nostru, șoarecii rezistenți nu au arătat o motivație semnificativ mai mare pentru auto-livrarea recompensei, ceea ce contrastează cu un studiu cu cocaină la șobolani (Pelloux și colab., 2007). Cu toate acestea, predictorul comportamental pentru rezistența la pedeapsă la șoareci a fost apăsarea inutilă a pârghiei în timpul celor 5 secunde care au precedat debutul stimulării neuronului DA. Prin urmare, incapacitatea de a aștepta până la livrarea recompensei poate fi văzută ca un marker al impulsivității (Dalley și colab., 2011, Olmstead, 2006, Everitt și colab., 2008, Winstanley, 2011, Leyton și Vezina, 2014). Am fost intrigați de observația că luarea impulsivă s-a dezvoltat doar după mai multe sesiuni de autostimulare. Acest lucru ridică posibilitatea ca rezistența la pedeapsă (și, prin extensie, vulnerabilitatea la dependență) să nu fie pe deplin înnăscută, dar să se dezvolte în fazele inițiale spre dependență. Dacă acesta este cazul, atunci dihotomia observată de noi și de alții (Deroche-Gamonet și colab., 2004) poate să nu fie determinată exclusiv de factori genetici. Acest lucru ar explica, de asemenea, că o fracțiune similară de indivizi devine dependenți de tulpini de șoareci relativ omogene din punct de vedere genetic și de populații umane mai diverse din punct de vedere genetic.

Dacă rezistența la pedeapsă dezvăluie vulnerabilitatea individuală pentru dependență, estimată la 20% la oameni chiar și cu cocaină (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997, George et al., 2014), atunci proporția mult mai mare găsită aici ar putea reflecta puterea stimulării directe și selective a neuronului DA. Cu alte cuvinte, stimularea selectivă a neuronilor DA poate crea mult mai dependență decât orice medicament. Acest lucru poate fi explicat prin acțiunea neselectivă a substanțelor farmacologice. În cazul cocainei, de exemplu, monoaminele altele decât DA pot întârzia de fapt inducerea dependenței. Într-adevăr, serotonina se poate opune comportamentelor adaptative dependente de DA, cum ar fi răspunsul pentru recompensă condiționată, autostimulare și preferința de loc condiționat (Wang și colab., 1995, Fletcher și Korth, 1999, Fletcher și colab., 2002) prin facilitarea asocierii. de indicii pentru stimuli aversivi (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternativ, diferența poate rezida în diferența de cinetică dintre autostimularea optogenetică și inducerea farmacologică a creșterii DA extracelulare. O astfel de variație a potenței de dependență poate exista și între diferitele droguri de abuz (George și colab., 2014).

Deși nu putem exclude în mod oficial diferențele în eliberarea DA și/sau semnalizarea relativă pentru a contribui la stabilirea rezistenței la pedeapsă, acest scenariu este puțin probabil deoarece validarea histologică a infecției animalelor incluse în studiu a arătat eYFP-ChR2 expresie în întregul VTA. Mai mult, protocolul de stimulare optogenetică conceput pentru a satura eliberarea DA a condus la autostimulare care a culminat cu valori distribuite unimodal pentru punctul de rupere, reflectând motivația stimulativă.

Un alt rezultat surprinzător este că numărul de șocuri electrice ale piciorului este corelat cu excitabilitatea neuronilor din PL. Scăderea excitabilității neuronilor piramidali și creșterea raportului AMPAR/NMDAR în neuronii piramidali din aceleași celule a fost observată la „șobolanii dependenți”, dar aceste studii nu au controlat efectul șocurilor electrice în sine (Kasanetz și colab., 2010, Kasanetz). et al., 2013, Chen et al., 2013). Nedisocierea poate fi, prin urmare, explicată prin rolul dublu al mPFC atât în ​​procesele de decizie, cât și în integrarea fricii (Peters et al., 2009). Dimpotrivă, modificarea excitabilității neuronilor piramidali din cortexul infralimbic se corelează cu șocurile piciorului (Santini și colab., 2008). Aceste dovezi nu exclud posibilitatea ca mPFC să joace un rol proeminent în decizia de urmărire a aportului. Cu toate acestea, analiza noastră cFos și observațiile privind excitabilitatea intrinsecă indică OFC și cortexul cingulat. În plus, inhibarea excitabilității neuronale în OFC cu DREADD a prevenit rezistența la pedeapsă. Această legătură cauzală reprezintă un pas important în înțelegerea mecanismelor celulare responsabile de tranziția la dependență. Vor fi necesare studii viitoare pentru a testa dacă acest lucru se aplică și întregii game de droguri care creează dependență.

Descoperirile noastre sunt în concordanță cu observațiile conform cărora o disfuncție a OFC poate afecta luarea deciziilor cost-beneficiu (Seo și Lee, 2010, Walton și colab., 2010, Fellows, 2011) și poate conduce la comportamente compulsive (Burguière și colab., 2013). ). La oameni, abuzul de droguri a fost legat de afectarea procesului decizional și de modificarea funcției OFC (Lucantonio și colab., 2012, Gowin și colab., 2013). Luați împreună, activitatea neuronilor OFC apare ca un determinant cheie pentru tranziția la consumul compulsiv de droguri (Everitt et al., 2007). Acest lucru nu exclude un rol pentru plasticitatea evocată de droguri la aferentele excitatorii pe MSN observate aici și în alte studii (Kasanetz și colab., 2010). Va fi interesant de evaluat dacă manipulările care vizează controlul excitabilității OFC afectează motivația la dependenți.

Aici propunem autostimularea neuronilor DA ca un model puternic pentru a studia etapele care conduc la dependență. Reproducem componentele de bază ale dependenței de droguri, cum ar fi recăderea, plasticitatea sinaptică și perseverența consumului, în ciuda consecințelor negative. În timp ce modelul nu este cu siguranță potrivit pentru a studia efectele specifice unui anumit medicament (de exemplu, compararea opioidelor cu psihostimulante), are mai multe avantaje. Permite un control temporal precis al livrării recompensei, activează foarte specific doar neuronii VTA DA și, nu în ultimul rând, oferă posibilitatea studierii șoarecilor pentru un timp mult mai lung decât cu autoadministrarea medicamentului. Concentrându-se pe comunitatea definitorie a drogurilor care creează dependență, speranța este de a dezlega mecanismele neuronale care stau la baza formelor de dependență nedependente de substanțe (Alavi și colab., 2012, Robbins și Clark, 2015) și de a contribui astfel la o teorie generală a dependenței. boala. Modelele de boală optogenetică permit astfel un pas decisiv pentru o înțelegere aprofundată a disfuncției neuronale implicate în stadiile târzii ale dependenței și vor ghida tratamente noi, raționale, pentru o boală în prezent fără tratament.

VP, JT și AH au efectuat experimentele comportamentale, în timp ce VP a făcut înregistrările electrofiziologice și a coordonat analiza. Studiul a fost conceput și scris de toți autorii.

Lucrarea a fost susținută de granturi de la Fundația Națională Elvețiană și grantul avansat ERC (MeSSI), Carigest SA, Societatea Academică din Geneva și Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT este un student MD-PhD plătit de Confederația Elvețiană.

Document S1. Proceduri experimentale complementare și figuri S1-S6

Tabelul S1. Analize statistice