PLoS Unul. 2010; 5(10): e15401.
Abstract
Completarea modelului, abilitatea de a prelua memorii complete inițiate de indiciile parțiale, este o caracteristică critică a procesului de memorie. Cu toate acestea, se știe puțin despre mecanismele moleculare și celulare care stau la baza acestui proces. Pentru a studia rolul dopaminei în rechemarea memoriei, am analizat șoarecii heterozigoși cu transfer de dopamină (DAT+/-), și au descoperit că, în timp ce acești șoareci posedă învățare normală, consolidare și reamintire a memoriei în condiții complete, acestea prezintă deficite specifice în completarea modelului în condiții parțiale. Această formă de deficit de rechemare a memoriei la șoarecii knockout heterozigoti ai transportorului de dopamină poate fi inversată printr-o doză mică de haloperidol antagonist dopamină, confirmând în plus că incapacitatea de a prelua tiparele de memorie este rezultatul dezechilibrului dopaminei. Prin urmare, rezultatele noastre dezvăluie că un control delicat al nivelului de dopamină al creierului este esențial pentru finalizarea modelului în timpul rechemării asociative a memoriei.
Introducere
Rechemarea memoriei implică o recapitulare a informațiilor obținute anterior [1], [2]. În funcție de starea de reamintire, regăsirea memoriei poate avea loc cu majoritatea sau cu toate semnalele întâlnite anterior asociate învățării (de exemplu, a vedea o persoană și a auzi vocea simultan sau revizuirea propriei orașe care nu s-a schimbat mult, etc.). Pe de altă parte, în multe cazuri, regăsirea memoriei are loc de obicei atunci când sunt prezente doar subseturi de indicii inițiale (de exemplu, reconstruirea hărților vechi ale orașului natal când doar câteva repere vechi au rămas neschimbate). Aceasta este cunoscută sub denumirea de completare a modelului în care creierul reconstruiește și preia patternuri de memorie întregi din indicii externe parțiale sau procese interne auto-inițiate. În prezent, nu se cunoaște prea multe despre mecanismele moleculare și celulare reale care stau la baza completării modelului de rechemare a memoriei. Cu toate acestea, studii emergente indică faptul că semnalizarea monoaminelor poate juca un rol în recuperarea memoriei [3].
În acest studiu, ne-am propus să examinăm modul în care neurotransmițătorul modulator dopamină joacă un rol în reglarea realizării modelului de memorie în timpul rechemării parțiale. Dopamina este un neurotransmițător cheie care poate influența cogniția, emoția și mișcarea. Transmiterea anormală dopaminergică a fost implicată într-o serie de tulburări psihiatrice și neurologice incluzând deficitul de atenție și tulburarea de hiperactivitate (ADHD), Schizofrenia și boala Parkinson [4]-[8]. Deși neuronii dopaminergici provin numai din zona tegmentală ventrală și substantia nigra compacta, producțiile lor se proiectează aproape peste tot în creier, incluzând cortexul prefrontal, lobul temporal medial și hipocampul, regiuni cunoscute a fi activate în timpul recuperării memorieil [3], [9]-[14].
De asemenea, trebuie remarcat faptul că dopamina a fost considerată funcțional crucială pentru atenția și memoria de lucru mediată de regiunile creierului de mai sus [15]-[18], ambele fiind implicate în procesul de recuperare a memoriei în condiții parțiale [19]. Ca mecanism celular primar pentru a termina semnalarea dopaminei, transportorul de dopamină (DAT), localizat la terminalele presinaptice neuronale, recuperează dopamina din cleștele sinaptice înapoi în neuronii dopaminergici. Ca atare, DAT este o moleculă critică în reglarea nivelelor sinaptice de dopamină și, în consecință, determinarea duratei temporale a acțiunilor dopaminei asupra circuitelor neuronale locale. Într-adevăr, distrugerea genetică a genei transportoare de dopamină are ca rezultat deficiențe profunde. Șobolanii homozigoți DAT-KO suferă de anomalii vizuale, incluzând întârzierea creșterii, hiperactivitatea locomotorie puternică și multe alte deficiențe incluzând deficiențe în obișnuință și interacțiune socială, precum și motilitate intestinală afectată, control respirator etc. [6], [20], [21]. Defectele globale la șoarecii homozigoți DAT-KO l-au făcut mai puțin potriviți pentru a cerceta rolul dopaminei în reglarea proceselor de memorie.
Interesant este faptul că șoarecii heterozigotari knock-out (DAT+/- șoareci), care încă posedă o alelă a genei funcționale DAT, par a fi destul de normale în comportamentele globale globale [6], [20], [21]. Astfel, DAT+/- soarecii pot oferi un model valoros pentru studierea unora dintre fenotipurile delicate, dar importante, cum ar fi procesele de memorie asociativă și mecanismele aferente reglementate de circuitele dopaminergice. Aici, am folosit un set de paradigme comportamentale pentru a evalua consecințele funcționale ale dezechilibrului dopaminei asupra finalizării modelului în timpul rechemării memoriei asociative.
REZULTATE
Pentru a investiga rolul dopaminei în recuperarea memoriei, am folosit șoarecii heterozigoși ai transportorului de dopamină (DAT+/-). Am folosit o baterie de măsurători comportamentale de bază pentru a evalua activitatea locomotorie a câmpului deschis (Figura 1A), performanțe rotarod (Figura 1B și 1C), și a constatat că acești șoareci heterotrogici knock-out sunt complet normali. Am confirmat de asemenea că DAT+/- șoarecii prezintă performanțe indistinguizabile în nivelul de anxietate măsurat prin labirintul plus plus (Figura 1D).
În plus, am evaluat funcțiile elementare de învățare și memorie din DAT+/- soareci. În primul rând, am folosit noul test de recunoaștere a obiectelor și am observat că acești șoareci au prezentat performanțe comportamentale normale în timpul testelor de reținere a zilei 1, comparativ cu controlul de tip littermat sălbatic (Figura 1E). Mai mult, acești șoareci prezintă, de asemenea, o retenție condiționată de frică normală 1-zi, care este indisolubilă față de șoarecii lor de control sălbatic (Figura 1F). Prin urmare, aceste rezultate sugerează că DAT+/- soarecii au funcții normale de învățare și memorie în aceste două forme de teste de memorie primară.
Testul de memorie spațială de referință a fost folosit anterior pentru a evalua finalizarea modelului de rechemare a memoriei. Am supus DAT+/- șoareci și controale de tip sălbatic la această sarcină. Folosind protocolul de memorie spațială de referință descris anterior [22], am antrenat aceste șoareci în labirintul de apă al platformei ascunse. Formarea a constat din patru studii pe zi, cu un interval de o oră între încercări. Am constatat că atât DAT+/- șoarecii și șoarecii de tip sălbatic au prezentat o consolidare a învățării și memoriei comparabile pe parcursul sesiunilor de zi 10 și cu viteze similare de înot (Figura 2A și 2B).
Apoi, am examinat amintirile despre locația ascunsă a platformei utilizând testul sondei (P1) în ziua 11, la o zi după finalizarea ultimei sesiuni de antrenament. După cum se măsoară prin ocuparea cuadrantului, atât DAT+/- șoarecii și colegii lor de control au reușit să-și concentreze căutarea în cadranul țintă în prezența indicațiilor complete (Figura 3A). Mai mult decât atât, DAT+/- șoarecii au prezentat, de asemenea, o preferință puternică în zona platformei fantomă și nu a existat nicio diferență în comparație cu ocupația platformei de control (Figura 3B). În plus, după cum era de așteptat, atât DAT+/- șoareci și șoarecii de tip sălbatic au prezentat o creștere semnificativă a numărului de traversări (Figura 3C). Astfel, toate aceste măsurători sugerează că DAT+/- șoarecii pot învăța în mod obișnuit această sarcină și pot recupera memoria asociativă în condiții normale.
Pentru a determina dacă echilibrul delicat al dopaminei este esențial pentru completarea modelului în condiții parțiale, am efectuat cel de-al doilea test de sondă (P2) a doua zi, eliminând trei din cele patru indici distal (ziua 12). Pentru a evita orice eventuală dispariție din sesiunea de rechemare anterioară, încă un bloc (4 trialuri) de instruire a fost livrat la ora 1 după testul sondei P1. În timpul acestui studiu cu sonda parțială, în timp ce șoarecii de control au continuat să își concentreze timpul de căutare în cadranul țintă mai degrabă decât pe celelalte cadrane, DAT+/- șoarecii au prezentat numai performanțe la nivel de șansă măsurate prin ocuparea cu cadran țintă (Figura 3D). Mai mult decât atât, măsurarea gradului de ocupare a zonelor cu platformă fantomă a confirmat în continuare că aceste DAT+/- șoarecii au fost afectați de amintirea locației platformei (Figura 3E). Acest deficit de regresie a fost evidențiat și de lipsa unei creșteri a numărului de puncte de trecere a platformei (Figura 3F), în timp ce colegii de tip sălbatic erau pe deplin capabili să efectueze rechemări de memorie parțială. Prin urmare, aceste date sugerează că DAT+/- șoarecii au deficiențe în recuperarea amintirilor spațiale de referință în condiții parțiale.
În cele din urmă, am întrebat dacă am putea restabili completarea modelului în aceste DAT+/- șoareci utilizând metode farmacologice. Sa raportat că o doză mică de antagonist al dopaminei, haloperidol, ar putea fi utilă în ameliorarea anumitor tulburări de dopamină [20]. Motivul este ca doza mica de haloperidol poate fi capabila sa atenueze oarecum efectul dopaminei crescute la soarecii heterozygosi care au insuficienta recaptare a dopaminei datorita pierderii unei alele a genei normale a transportorului de dopamina. Am aplicat același set de șoareci la experimentul de salvare. În ziua 13 și în ziua 14, am supus șoarecii de mai sus la cea de-a treia probă (P3) în condiții de vârf complet și a patra probă (P4) în condiții parțiale. Din nou, pentru a contracara eventualele extincții care s-au produs în timpul probei, am efectuat încă un bloc (4 trialuri) de instruire 1 oră după terminarea testului P2 sau P3. Măsurătorile noastre privind gradul de ocupare al cadranului țintă pe testul P3 arată că atât DAT+/- șoarecii și grupurile de control au concentrarea căutării în cadranul țintă în prezența unor indicații complete (Figura 4A). În plus, rechemarea lor obișnuită a memoriei a fost evidențiată din nou prin măsurarea gradului de ocupare a platformei (Figura 4B), precum și numărul de treceri ale platformelor (Figura 4C). Astfel, acești șoareci mutanți au fost pe deplin capabili de a recupera memoria spațială în condiții de vârf complet.
În ziua 14, am înlăturat trei din cele patru indici distal și am condus studiile a patra sondă (P4) sub condiția parțială. Am injectat DAT-ul+/- șoareci intraperitoneal cu o doză mică de haloperidol (0.002 mg / kg greutate corporală) 30 minute înainte de testele de retenție. Tiparele de tip sălbatic au primit o injecție salină ca control. Am descoperit că DAT+/- șoarecii și-au concentrat timpul de căutare în cvadrantul țintă și au prezentat performanțe similare din punct de vedere statistic în comparație cu omologii de tip sălbatic (Figura 4E). De asemenea, măsurarea gradului de ocupare a zonelor de platformă fantomă a demonstrat în continuare că aceste DAT+/- șoarecii pot aminti locația platformei (Figura 4F). Memorarea lor normală de memorie a fost confirmată din nou de o creștere a numărului de puncte de trecere a platformei, care era la același nivel cu cel al șoarecilor sălbatici (Figura 4G). Astfel, aceste experimente sugerează că deficitele de completare a modelului observate inițial în DAT+/- șoarecii pot fi cauzați de dezechilibrul dopaminei.
Pentru a exclude posibilitatea ca rezultatele pentru fenotipul injectat cu haloperidol în studiul cu probă P4 să se datoreze suprasolicitării în timpul testelor repetate ale probei, am utilizat un alt set de DAT+/- și a reușit să reia întregul experiment. După cum era de așteptat, ambele DAT+/- șoarecii și șoarecii lor de tip sălbatic au prezentat rate bune de învățare pe parcursul sesiunilor de formare 10 (Figura 5A). În ziua 11, am supus acești șoareci la testele de reamintire completă, nu există o diferență semnificativă în rezultatele testelor de reținere a memoriei între DAT+/- șoareci și martorii de control, măsurați prin ocuparea în cvadrant (Figura 5B), ocuparea cadranului țintă (Figura 5C) și numărul de puncte de trecere a platformei (Figura 5D). La o oră după finalizarea testului cu sonda completă, am recalificat aceste șoareci cu încă un bloc de antrenament pentru a preveni orice efect de extincție. În ziua 12, acești șoareci au fost supuși testelor de rechemare parțială. O doză mică de haloperidol (sau soluție salină) pentru martorii a fost injectată șoarecilor la șoareci intraperitoneal 30 minute înainte de studiul parțial. Am constatat că acest tratament a dus, într-adevăr, la performanțele normale la șoarecii mutanți. Soarecii mutanți și de control au prezentat performanțe comparabile în gradul de ocupare în cadran (Figura 5E), ocuparea cadranului țintă (Figura 5F) și numărul de puncte de trecere a platformei (Figura 5G). De asemenea, măsurarea vitezei lor de înot nu a evidențiat diferențe (Figura 5H). Prin urmare, aceste date au demonstrat în mod clar că deficitul de recuperare parțială a scorului salvat în DAT+/- șoareci de către haloperidol nu se datorează suprasolicitării repetate în cursul studiilor multiple de sonde.
Discuție
În timp ce sistemul dopaminic este bine cunoscut ca fiind esențial pentru reglementarea multor procese cognitive [8], [16]-[18], [23]-[25], studiul nostru prezent demonstrează pentru prima dată că dezechilibrul dopaminei, care rezultă din pierderea unei alele a genei normale a transportatorului de dopamină, a cauzat un deficit specific în completarea modelului în timpul rechemării memoriei spațiale asociative. Acest deficit de memorie a memoriei este evident numai în condițiile parțial-spațiale, dar nu în condițiile de înălțime completă. Mai mult, acest deficit de amintire a memoriei pare să reflecte o formă foarte specifică a deficitului de memorie, deoarece aspectele largi ale comportamentelor de bază (locomoție deschisă, rotarod și anxietate) și alte forme de memorie, cum ar fi condiționarea contextuală a fricii și recunoașterea obiectelor noi rămân normale.
Există câteva potențiale molecule și scenarii celulare care pot contribui în mod colectiv la deficitul recapitalizat parțial declanșat, printre care se consideră că dopamina este o moleculă candidată majoră care stă la baza acestui proces de memorie, deoarece atenția și memoria de lucru, controlate în primul rând de dopamine, sunt raportate a fi critice pentru recuperarea amintirilor spațiale [15]-[18], [26]. Este bine cunoscut faptul că neuronii dopaminergici, originari numai din zona tegmentală ventrală și substantia nigra compacta, proiectează aproape peste tot în creier, inclusiv cortexul prefrontal, lobul temporal medial și hipocampul [5], [19], [27]-[28], regiuni cunoscute ca fiind activate în timpul recuperării memoriei, precum și a proceselor de atenție [3], [9]-[14], [29], [30]. Având în vedere dovezile ample că dopamina este esențială pentru atenția și memoria de lucru [15]-[18] si ca polimorfismul genetic in gena DAT este considerat a fi implicat in ADHD [31]-[33], este posibil ca atât atenția, cât și memoria de lucru să joace un rol în completarea modelului de recuperare a memoriei în condițiile parțiale prin regularea dopaminei mediată de DAT. Astfel, deficiențele de completare a modelului de memorie observate la șoarecii mutanți heterozigoti DAT se pot datora incapacității mouse-ului de a satisface cerințele atenționale crescute în timpul rechemării parțiale pe bază de memorie ca urmare a perturbării dopaminei sinaptice.
Constatarea noastră conform căreia dezechilibrul de dopamină a dus la un deficit de recuperare a memoriei este, de asemenea, interesant în lumina demenței clinice observate la pacienții Parkinson. Acești pacienți, de obicei, par să-și păstreze capacitatea de a învăța, consolida și păstra memoria nouă, dar sunt profund afectați în regăsirea amintirilor, în special în urma unor semne externe parțiale sau a unei reamintiri auto-inițiate [34], [35]. Acest deficit este deosebit de profund atunci când indicii expliciți au fost absenți [8], [23], [34]-[36], indicând astfel faptul că dopamina ar putea fi implicată în procesul de rechemare a memoriei. Aceste tipuri de deficiențe în amintirea memoriei la pacienții Parkinson sunt în contrast puternic cu deficiențele de memorie din alte sisteme de neurotransmițător [37] sau demența precoce la pacienții cu Alzheimer, care sunt de obicei afectate în învățarea și consolidarea noilor amintiri, păstrând în același timp capacitatea de a-și aminti de amintirile vechi [34], [35]. Acest lucru ilustrează nevoia de a dezvolta diferite strategii terapeutice din cauza diferitelor vulnerabilități la procesele moleculare și temporale distincte din circuitele de memorie.
Demonstrația noastră conform căreia completarea modelului poate fi complet salvată prin injectarea haloperiodolului la momentul rechemării întărește ideea despre rolul nivelurilor echilibrate ale dopaminei în recuperarea memoriei. Acest experiment de salvare farmacologică oferă dovezi suplimentare pentru specificitatea temporală care determină deficitul de rechemare parțială pe bază de tac. Trebuie remarcat faptul că disfuncțiile dopaminei în DAT+/- șoarecii și la pacienții Parkinson sunt destul de diferiți unul de altul, dar ambele duc la deficite de recuperare a modelului. Această comunitate oferă sprijin colectiv pentru ideea că echilibrul delicat al sistemului de dopamină este crucial pentru recuperarea memoriei, iar dezechilibrul în ambele direcții (în sus sau în jos) ar provoca deficite la finalizarea modelului de memorie în timpul rechemării. Este important să subliniem faptul că analiza noastră actuală nu trebuie interpretată ca dovadă pentru utilizarea șoarecilor mutanți DAT ca model de boală Parkinson. Pe de altă parte, in vivo măsurarea dopaminei la șobolanii homozigoți DAT care arată o reducere semnificativă a eliberării dopaminei declanșată de stimularea de spargere [38]-[40]. Acest lucru indică faptul că abilitatea de a transpune activitatea neurală izbucnită în semnale de dopamină în diferitele regiuni ale creierului la șoarecii knockout poate fi deficitară. Este de conceput că modificările reduse ale raportului de dopamină pot duce la modificări fiziologice modificate în modelele de ardere în circuitele neuronale implicate în procesarea memoriei. În prezent, nu se cunoaște dacă alterarea similară are loc și la șoarecii knockout heterozigoti DAT sau la pacienții cu boala Parkinson.
Deși se știe puțin despre circuitele neuronale activate în timpul reamintirii memoriei spațiale, este probabil ca aceasta să recruteze mai multe regiuni incluzând cortexul prefrontal, cortexul temporal medial și hipocampul. Acest lucru se potrivește bine cu dovezile anatomice ale ieșirilor dopaminergice din zona tegmentală ventrală proeminentă în zona ventrală CA1 și în cortexul entorhinal[13], [28]. Această buclă prefrontal-hipocampală-VTA poate juca un rol crucial pentru generarea familiarității contextuale care, la rândul său, promovează completarea modelului în timpul reluării memoriei spațiale pe bază de tac cu întârziere prin facilitarea atenției reglementate de dopamină [3], [14], [26], [28]. În studiile viitoare va fi important să definim în continuare locurile anatomice de la care provin deficiențele de finalizare a modelului observate. Ar fi deosebit de interesant să se investigheze situsurile candidate, cum ar fi cortexul cingular anterior, cortexul temporal și hipocampul utilizând tehnici farmacologice, genetice și de mari dimensiuni in vivo de înregistrare [11], [41]-[44]. De asemenea, este important să se evalueze dacă compensarea genetică sau modificările lentă ale creierului mutant contribuie la deficitele observate la rechemare. Există, de asemenea, indicii că alte sisteme de neurotransmițători pot fi, de asemenea, implicate critic în reglarea recuperării memoriei [3], [37], [45], [46], și ar fi foarte interesant să examinăm și să le comparăm interacțiunile dinamice între finalizarea modelului parțial declanșat de tac și recuperarea completă a memoriei bazată pe tac. În concluzie, studiul nostru sugerează că un echilibru delicat în nivelurile de dopamină este esențial pentru completarea modelului în timpul rechemării memoriei spațiale asociative.
Materiale și metode
Declarații etice
Toate lucrările pe animale descrise în studiu au fost efectuate în conformitate cu instrucțiunile NIH și au fost aprobate de către comitetul instituțional IACUC la Colegiul Medical din Georgia (număr de aprobare AUP: BR07-11-001).
Producția și genotiparea șoarecilor mutanți
Șoarecii DAT au fost un cadou generos din partea laboratorului Dr. XiaoXi Zhuang de la Universitatea din Chicago. Reproducerea și genotiparea șoarecilor heterozigot DAT sunt aceleași cu cele descrise [6]. Pentru experimentele noastre, șoarecii masculi și femele au fost utilizați în mod egal la un raport de 1![[raport]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
1. PCR pentru DAT+/- șoareci a fost urmată de protocolul descris [6]. Toți șoarecii au fost menținuți în condiții standard (23.1 ° C, umiditate 50.5%) la Facultatea de Animale a Colegiului Medical din Georgia. Toate experimentele au fost realizate într-o cameră de comportament specializată în izolarea fonică și specializată. Toți experimentatorii au fost orbi față de genotipul animalului individual.
Sarcina de recunoaștere a obiectelor noi
Protocolul experimental a fost același cu cel descris anterior [37], [47]. Pe scurt, șoarecii au fost obișnuiți cu o cutie cu câmp deschis (20 × 20 × 10 înălțime) pentru zilele 3. În timpul sesiunilor de instruire, două obiecte noi au fost plasate în câmp deschis, iar animalul a fost lăsat să exploreze pentru 15 min. Timpul petrecut în explorarea fiecărui obiect a fost înregistrat. În timpul testelor de repetare de o oră, animalul a fost plasat înapoi în aceeași cutie, în care unul dintre obiectele familiare în timpul antrenamentului a fost înlocuit cu un obiect nou și i sa permis să exploreze liber pentru min. 15. Un indice de preferință, un raport al timpului petrecut în explorarea unuia dintre cele două obiecte (sesiune de antrenament) sau unul nou (sesiune de reținere) în timpul total petrecut în explorarea ambelor obiecte, a fost utilizat pentru a măsura memoria de recunoaștere.
Open Field și Rota-Rod Test
Protocoalele au fost aceleași cu cele descrise [48]. Pentru măsurarea activității câmpului deschis, șoarecii au fost plasați într-un câmp deschis, realizat dintr-o cutie neagră 14 × 14 inch. Cutia a fost marcată cu grinzi mici pătrată 2 × 2 inch (7 pătrate cu 7 pătrate cu 49 pătrate în total). Activitatea câmpului deschis a animalelor a fost măsurată prin numărul de cruci care au trecut șoarecii în perioada 3-minute. Pentru măsurarea testului Rota-rod, șoarecii au fost plasați pe o tijă de lemn rotativă acceleratoare. Tija este înălțată 12 lungime și 1 inch în diametru. Viteza inițială de rotație a fost la 4 rpm și apoi a fost accelerată constant la 40 rpm. Performanța a fost măsurată cu durata de timp (în secunde) pe care soarecii a reușit să rămână pe tija rotativă în timpul fiecărui test de reapelare de cinci minute sau de o oră.
Elevează testele Maze Plus
Protocoalele au fost aceleași cu cele descrise [49]. Labirintul plus este realizat din oțel inoxidabil, care este vopsit negru mat, și este alcătuit din patru brațe (două deschise fără pereți și două închise cu pereți înalți 15.25 cm) 30 cm lungime și 5 cm lățime. Fiecare braț al labirintului este atașat la picioare metalice robuste, astfel încât este ridicat de 40 cm deasupra mesei pe care se sprijină. Activitatea a fost înregistrată de o cameră digitală (Camera Logitech, Model nr. N231) plasată 130 cm deasupra labirintului. În timpul fazei ușoare a ciclului circadian (între 40 h și 60 h), testarea a avut loc sub lumină slabă (un bec 0900-W și un bec alb moale 1400-W, ambele înclinate pentru a crea iluminarea indirectă pe labirint). Labirintul a fost curățat cu acid acetic 5% între teste. Zgomotul alb (30 dB) a zgomotat în fundal străin. În ziua testului, animalele au fost aduse în camera de testare în cuștile lor și fiecare pereche de animale a fost apoi scoasă din cușcă și plasată într-o cușcă separată pentru 5 min înainte de a fi introdusă în labirint. Animalele au fost plasate individual în centrul labirintului, poziția capului fiind contrabalansată între șoareci, iar comportamentul a fost înregistrat pentru 5 min. timpul petrecut pe brațul deschis și pe brațul închis (când toate cele patru labe ale rozătoarelor se află pe brațul deschis sau închis) au fost înregistrate și analizate.
Condiționarea fricii Condiționarea
Frica de condiționare a fost efectuată așa cum s-a descris mai înainte [45]. Experimentul a fost realizat într-un sistem de condiționare a fricii, o cameră situată într-o cutie atenuată, cu o lumină de casă pe tavan și o podea din oțel inoxidabil (Coulbourn Instruments, Whitehall, PA). Podeaua rețelei era conectată la un generator de șoc și un semnal auditiv provenit dintr-un difuzor atașat pe peretele camerei. Toți stimulii au fost controlați automat utilizând un calculator personal cu un program grafic de stat. O cameră video a fost plasată în fața cuștii pentru a înregistra comportamentul. Șoarecii au fost manevrați timp de 3 zile și apoi obișnuiți cu camera de antrenament pentru 5 min. Stimul condiționat (CS) folosit a fost un sunet 85 dB la 2.8 kHz, în timp ce stimulul necondiționat (US) a fost un șoc continuu de șoc la picioare la 0.8 mA pentru 2 s. După o singură co-terminare a CS / US paring, animalul a rămas în cameră pentru un alt 30 s pentru măsurarea înghețării imediate. În timpul testului de reținere, fiecare șoarece a fost plasat înapoi în aceeași cameră, iar răspunsurile de îngheț au fost înregistrate pentru 5 min (răspuns contextual de înghețare). Toate testele au fost înregistrate sub lumină roșie. Timpul total de congelare a fost măsurat ca un indice al memoriei de frică. Condiția de înghețare a fost definită ca o lipsă totală de mișcare, excluzând respirația. Conținutul de congelare a fost marcat de software (Coulbourn Instruments) și a fost transformat în răspuns la îngheț [răspunsul la îngheț 
= (timpul total de congelare / timpul total de testare) × 100%].
Teste de memorie de referință spațiale
Testul de memorie spațială de referință a fost labirintul de apă al platformei ascunse. Am urmat protocolul descris anterior de Nakazawa et al. [22]. Formarea a constat din patru studii pe zi, cu o oră între procese. Mișcarea șoarecilor a fost urmărită de camera video și măsurată prin software (Noldul Information Technology, Olanda). Latența de ieșire la platformă, ocuparea cuadrantului și traversarea platformei au fost înregistrate și analizate. Piscina are un diametru de 118 cm iar platforma are un diametru de 9.5 cm. Au fost efectuate patru teste ale sondelor. Primul test de sondă (P1) a fost efectuat în ziua următoare ultimei sesiuni de antrenament în condiții de vârf complet (ziua 11). Cel de-al doilea test de probă (P2) a fost efectuat în ziua 12 în condiții parțiale (prin eliminarea a trei din cele patru repere vizuale pe peretele cortinei negre). Pentru DAT+/- (P3) în ziua 13 în condiții complete și în a patra probă (P4) în ziua 14, în condiții parțiale. Încă un bloc (studiile 4) de instruire a fost livrat 1 oră după testele P1, P2 și P3, pentru a contracara eventualele extincții care s-au produs în timpul procesului de testare. Mai mult decât atât, pentru a exclude efectul de comprimare a suprasolicitării înaintea P4 (testul sondei cu injectare parțială și haloperidol), am supus un alt grup de DAT+/- șoareci, precum și controlul lor de gunoi de tip sălbatic pentru două teste suplimentare de sondă (încercări P3 ′ și P4 ′). Testul de sondă P3 a fost efectuat la o zi după ultima sesiune de antrenament în condiții complete (ziua 10). Testul sondei P4 a fost efectuat în ziua 11 în condiții parțiale. În timpul tuturor testelor noastre de probă, platforma a fost îndepărtată și șoarecii au fost lăsați să înoate în bazin pentru aceeași perioadă de timp ca în timpul antrenamentului (60 sec). Timpul petrecut în fiecare cadran a fost înregistrat. Pentru a restabili nivelurile de dopamină [6], [20], [21], șoareci din DAT+/- și grupurile de control au fost toate injectate intraperitoneal fie cu haloperidol (0.002 mg / kg greutate corporală), fie cu soluție salină cu 30 de minute înainte de studiile sondei P4 și P4.
Analiza datelor
Pentru a ține cont de corelațiile intra-animale dintre măsurătorile repetate, s-au folosit modele mixte liniare pentru a estima performanța comportamentală în labirintul de apă Morris, recunoașterea obiectului nou, condiționarea contextului de frică și testele rotație. Metoda Tukey-Kramer a fost utilizată pentru a determina semnificația măsurătorilor comportamentale dintre DAT+/- șoareci și colegii de control. În câmp deschis și teste crescute plus labirint, ANOVA unidirecțional și testul Dunnett post-hoc au fost utilizate pentru a determina efectele genotipului. Variabilele continue sunt prezentate ca eroare medie și standard a mediei (SEM). Datele au fost analizate folosind versiunea SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Diferențele au fost considerate semnificative atunci când P <0.05.
recunoasteri
Îi mulțumim Dr. Xiaoxi Zhuang de la Universitatea din Chicago pentru furnizarea DAT+/- Șoareci KO și Brianna Klein pentru asistență tehnică pentru experimente.
Note de subsol
Interese interesante: Autorii au declarat că nu există interese concurente.
Finanțarea: Această cercetare a fost susținută de fonduri de la NIMH (MH060236), NIA (AG024022, AG034663 & AG025918), USAMRA00002, Georgia Research Alliance și Science and Technology Commission din Shanghai Municipality (10140900500) (toate către JZT). National Science Foundation of China (81000592), Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (10DZ2272200, 09DZ2200900, 10PJ1407500 and 10JC1411200), Shanghai Municipal Education Commission (11ZZ103) către FL și XMS. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
;
