Cdk5 fosforilează dopamina receptorului D2 și atenuează semnalizarea în aval (2013)

Referirea: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y și colab. (2013) Cdk5 fosforilează dopamina D2 Receptor și atenuează semnalizarea în aval. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Universitatea din Dakota de Nord, Statele Unite ale Americii

Primit: Mai 20, 2013; Admis: Noiembrie 14, 2013; Publicat în: December 31, 2013

Drepturi de autor: © 2013 Jeong și colab. Acesta este un articol cu ​​acces deschis, distribuit în termenii lui Creative Commons Attribution License, care permite utilizarea, distribuirea și reproducerea nerestricționată în orice mediu, cu condiția ca autorul și sursa originale să fie creditate.

Finanțarea: Această activitate a fost susținută de granturile (NRF-2012R1A2A2A01012923 și NRF-2012R1A4A1028200) de la guvernul coreean (MSIP) și a fost sprijinită și în cadrul programului de cooperare internațională gestionat de NRF Coreea (2012K2A1A2033117) și Coreea de Cercetare a Institutului Brain (KBRI) Programul de bază de cercetare al MSIP (2031-415). SKP a fost beneficiar al 2004 și al 2006 Alianței Naționale pentru Cercetarea Schizofreniei și Depresiei (NARSAD) Young Investigator Awards. Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de a publica sau pregătirea manuscrisului.

Concurente: Autorii au declarat că nu există interese concurente.

Introducere

Semnalarea dopaminei este implicată în diferite funcții ale creierului, inclusiv coordonarea motorului, controlul dispoziției și mecanismele de recompensă [1]. O componentă majoră a semnalizării dopaminei în vertebrate este exercitată de neuronii spinal netedi (MSN) striatali care exprimă selectiv un subset de receptori ai dopaminei și primesc o contribuție dopaminergică în principal din zona tegmentală ventrală (VTA) și substantia nigra (SN) [2]. Receptorii dopaminici sunt receptori cuplați cu proteină G (GPCR) cu șapte domenii transmembranare și constau din două subtipuri, Receptorii D1 și D2, care mediază acțiunile reciproce în semnalizarea dopaminei [1]. De exemplu, receptorii dopaminergici D1 (D1, D5) activează adenilil ciclaza prin G_aS și cresc nivelul intracelular al cAMP, dar receptorii dopaminergici D2 (D2, D3, D4) inhibă adenilil ciclaza prin G_αi și scăderea nivelului intracelular al cAMP [1], [3].

Dintre receptorii dopaminergici, receptorul D2 (DRD2) este implicat în patofiziologia multiplelor tulburări psihiatrice majore, incluzând schizofrenia și dependența de droguri [4], astfel încât multe medicamente antipsihotice țintesc parțial DRD2. De asemenea, este cunoscut faptul că activitatea DRD2 se corelează bine cu consecințele comportamentale ale medicamentelor de abuz în modelele animale [5]. Antidepresivele și eficacitatea stabilizatorului de dispoziție au fost, de asemenea, legate de alterarea exprimării suprafeței celulare a DRD2 sau de semnalizarea intracelulară în aval mediată de PKA, ERK și GSK3 [1], [4], [6]. În ciuda acestor roluri critice pentru DRD2 în creier, mecanismele detaliate de reglementare care conferă eterogenitate și complexitate proprietăților DRD2 nu sunt complet înțelese.

Liniile de convergență a dovezilor indică faptul că mai multe modificări posttranslaționale sunt implicate în reglarea fină a activității DRD2. Glicozilarea extensivă a DRD2 a fost dezvăluită în studiile de etichetare foto-afinitate timpurii [7], și formarea legăturii disulfidice în cadrul DRD2 a fost, de asemenea, identificată ca o modificare importantă pentru legarea ligandului [8]. Mai mult, site-urile de fosforilare ale DRD2 au fost identificate inițial prin in vitro analiza cu radioizotopi, oferind căi pentru diferite căi de reglementare mediate de diferite kinaze [9]. Într-adevăr, protein kinaza C (PKC) reglează mobilizarea DRD2 mediată de calciu intracelular și modulează interacțiunea DRD2 cu proteinele citoscheletale [10]. Fosforilarea de către GPCR kinaza 2 (GRK2) reglează modelele de sensibilizare induse de agoniști ai DRD2 [11].

Cyclin-dependent kinaza 5 (Cdk5) este o serină / treonin kinază direcționată cu prolină care are activitate preferențială datorită exprimării specifice a creierului activatorilor săi esențiali, p35 și p39 [12]. Cdk5 este implicat în diverse procese neuronale, incluzând migrația neuronală și ghidarea axonilor, iar șoarecii null Cdk5 și p35 prezintă defecte în stratul cortical [13]. Recent, s-a arătat că fosforilarea WAVE1 și ephexinei de către Cdk5 reglează morfogeneza coloanei dendritice [14]. Mai mult, Cdk5 reglează de asemenea nivelurile de exprimare a suprafeței curenților NMDA mediate de receptorul NMDA, NR2B și NR2A [15], [16]. Este demn de remarcat faptul că mai multe dovezi sugerează o relație intimă între Cdk5 și sistemul dopaminic. Cdk5 fosforilează hidroxilaza tirozinei (TH), reglând stabilitatea sa și menținând astfel homeostazia dopaminergică [17]. În cazul neuronilor postsynaptici, atunci când reziduul T75 al fosfoproteinei-32kD (DARPP-32) este fosforilat de Cdk5, se poate inhiba activitatea PKA și astfel se antagonizează semnalul PKA mediată de dopamina DRD1 [18]. Interesant, atunci cand cocaina, un agonist indirect al receptorilor dopaminergici, este administrata cronic la sobolani, nivelele mRNA si proteinele Cdk5 cresc in neuronii spini medii [19]. În mod colectiv, Cdk5 pare să fie implicat în adaptările sinaptice induse de medicamente. În acest studiu, prezentăm o interacțiune funcțională între DRD2 și Cdk5 care extind în continuare rolul Cdk5 în semnalizarea dopaminei.

Materiale și metode

anticorpii

Serurile anti-iepure au fost ridicate împotriva peptidelor care conțin fosfo-serină 321 (pS321) a celei de a treia buclă intracelulare a DRD2 (D2i3). Fosfo-peptida, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), a fost utilizată pentru a realiza o coloană de peptidă-conjugată pentru purificarea prin afinitate (20401, PIERCE). Anticorpul anti-pS321 a fost îmbogățit cu un sistem de purificare a afinității, urmând instrucțiunile producătorului. Fosfo-anticorpul purificat a fost depozitat în PBS cu azime de sodiu 0.1% și gelatină 0.1%. Anticorpul anti-Cdk5 anti-șoarece (sc-249) și anticorpul anti-p35 anti-iepure (sc-820) au fost utilizați pentru Western blotting și imunocytochimia Cdk5 / p35. Anticorpul anti-GFP anti-șoarece (sc-9996) a fost utilizat pentru imunoprecipitare și Western blotting de DRD2-GFP. Anticorpul anti-FLAG anti-iepure (sc-807), anticorpul anti-HA anti-iepure (sc-805), anticorpul anti-GST anti-șoarece (sc-138) și anticorpul anti-GAPDH anti- 32293) au fost achiziționate de la Santa Cruz Biotechnologies.

animale

Mouse-ul knockout p35 a fost un cadou bun de la Dr. Katsuhiko Mikoshiba de la RIKEN Brain Science Institute din Japonia și folosit pentru cultura primară a neuronilor. Seturile de godeuri pentru genotipare au fost 5'-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC și 5'-TCCATCT GCACGAGACTAGT așa cum s-a descris anterior [20]. Șoarecii ICR și șobolanii Sprague Dawley au fost utilizați pentru prepararea lizatului cerebral. Toate procedurile pe animale au fost aprobate de către Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor din instituțiile de știință și tehnologie din cadrul Universității Pohang.

Structurile plasmidelor

Sa utilizat o izoformă lungă umană DRD2 într-un vector plasmidic EGFP-N1 și s-a utilizat a treia buclă intracelulară a DRD2 (reziduuri de aminoacid 212-373 incluzând resturile de aminoacid suplimentare 29 unice pentru izoforma lungă DRD2) într-un vector plasmidic pFLAG-CMV-2. Cdk5 uman a fost inserat într-un vector plasmidic pCMV-HA și p35 uman a fost inserat într-un vector plasmidic pcNNA 3.1. Cdk5 uman a fost inserat sub un promotor de citomegalovirus (CMV) împreună cu p35 uman într-un vector pcNNA 3.1 pentru a realiza un construct de expresie duală (Cdk5 / p35) pentru imunocitochimie, testul de internalizare a receptorului,³⁵S] -GTP_γTestul de legare S, testul de legare a radioligandului și testul imunoenzimatic al enzimei cAMP.

in vitro Analiza kinazei

IP-linked in vitro kinaza a fost efectuată după cum urmează. Un creier de șoarece întreg a fost lizat în tampon de liză 3 mL de eritrocite de liză (ELN) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCI, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) prin curbele 20 ale unui omogenizator Dounce pentru obținerea de lizați de creier omogenizați . Lizatele au fost incubate pe gheață timp de 30 min, sonicate și centrifugate la 16,000X g pentru 10 min. Supernatanții au fost imunoprecipitați cu anticorp anti-p35 anti-iepure pentru a obține un complex activ Cdk5 / p35. Cdk5 / p35 complex și proteină de fuziune GST purificată a fost amestecată cu adenozină 5'-triposfat, [y-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) și incubate în tampon kinază (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCI₂, 0.2 mM DTT) pentru 1 h la temperatura camerei [18], [21]. Complexul Cdk5 / p25 purificat (14-516, Millipore) a fost de asemenea utilizat pentru in vitro kinază, așa cum s-a descris mai sus. Tamponul de încărcare a probei 2 × a fost adăugat la amestecul de reacție și fiert la 100 ° C. Probele au fost apoi supuse SDS-PAGE și gelul uscat a fost evaluat prin autoradiografie.

Cromatografie lichidă (LC) - Spectrometrie de masă (MS) / MS

Proteina recombinantă GST-D2i3 a fost analizată prin LC-MS / MS urmărind legătura IP in vitro kinază. Am efectuat identificarea peptidelor pentru datele LC-MS / MS folosind X !! Tandem (versiunea Dec-01-2008). Fiecare fișier de date RAW a fost mai întâi convertit în mzXML folosind conducta trans-proteomică (TPP, versiunea 4.3). Scannările MS / MS în mzXML-urile convertite au fost supuse apoi cercetării împotriva bazei de date a secvenței proteinelor de șoarece UniProt (eliberarea 2010_07) incluzând secvența GST-D2i3 folosind X !! Tandem. Toleranța a fost stabilită la 3 Da pentru ionii precursori și 2 Da pentru ionii de fragment. S-a utilizat specificitatea enzimei pentru tripsină. S-au folosit opțiuni de modificare variabilă pentru carbamidometilarea cisteinei (57.021 Da), oxidarea metioninei (15.995 Da), hidroliza asparaginei (0.987 Da) și fosforilarea serinei (79.966 Da).

Imunoprecipitarea

Imunoprecipitarea a fost efectuată pe lizatele de celule în tampon de liză ELB. Anticorpul anti-GFP a fost adăugat la lizate și incubat pentru 3 h la 4 ° C. Imunocomplexele au fost purificate folosind agaroză de proteină-A. Precipitanții au fost incubați cu tampon de încărcare a probei SDS timp de 30 min la 37 ° C și supuși SDS-PAGE și bloturi Western.

Examenul de tragere GST

10 pg de GST purificat și GST-D2i3 au fost incubate cu lizat creier de șobolan pentru 1.5 h la 4 ° C. S-au adăugat 30 uL de perle de Sepharose 4B conjugate cu glutation (GSH) (17-0756-01, GE Healthcare) echilibrat cu tampon de liză și incubate pentru 1 h suplimentar. Perlele au fost colectate prin centrifugare la 2,000 ×g și clătită cu tampon de liză 4 ori [22], [23]. Precipitatile au fost analizate prin Western blot folosind anticorpi anti-Cdk5 si anti-p35.

imunocitochimie

Celulele HEK 293 transfectate și neuronii striatali, cultivate pe coperți, au fost spălate o dată cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și fixate prin imersie în paraformaldehidă rece 4% / PBS pentru 30 min. Anticorpul primar a fost diluat în soluția de blocare (2% ser de cal și 1% Triton X-100 în PBS). Anticorp anti-șoarece conjugat cu Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) și anticorp anti-iepure conjugat cu Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen) au fost utilizați ca anticorpi secundari. Hoechst au fost folosite pentru colorarea nucleului. Imaginile au fost obținute prin microscopie confocală (Olympus, FluoView-1000).

Testul de internalizare a receptorului

24 h după transfecție, celulele au fost tratate cu 1 μM chinpirole (Q102, Sigma) pentru 30 min și 90 min la 37 ° C. Celulele au fost re-suspendate în 2 mL de PBS rece și s-au folosit alicote 200 uL pentru fiecare reacție. Tratamentele medicamentoase au fost efectuate la temperatura camerei pentru 3 h la următoarele concentrații; 3 nM [³H] -spiperonă (NET-565, PerkinElmer), sulpiridă 3MM (895, TOCRIS), haloperidol 10 (H1512, Sigma). Hidrofobic [³H] -spiperona pentru a eticheta receptorii exprimați în totalitate și sulpirida hidrofilă a fost utilizată pentru a înlocui [³H] -spiperonă. Semnalul receptorului asociat membranei a fost calculat prin scăderea valorilor receptorului intracelular din valorile totale exprimate ale receptorului. Celulele s-au filtrat pe un filtru GF / B (Millipore) și s-au spălat 3 ori cu tampon de spălare (50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 100 mM NaCI). Filtrele au fost uscate și s-a măsurat radioactivitatea reziduală utilizând un contor de scintilație lichid [24].

Pregătirea membranelor celulare

Celulele confluente în culturile de culturi 100 mm după transfecție au fost spălate cu PBS rece pe gheață și recoltate în tampon XMEXX ml HME (1 mM HEPES (pH 25), 7.5 mM MgCI₂, 1 mM EDTA). Lizatele omogenizate au fost centrifugate cu 500 x g pentru 15 min și supernatantele au fost ulterior centrifugate cu 36,000 x g pentru 30 min. Peletele resuspendate în tampon HME au fost utilizate pentru teste.

[³⁵S] -GTP_γS-Test de legare

Fracțiunile membranelor celulare au fost pre-incubate cu chinpirole 1 pM (Q102, Sigma) în tamponul de testare (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCI₂, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA și 0.01 mM GDP) pentru 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) a fost adăugată la concentrația finală de 3 nM în 30 uL și incubată suplimentar pentru 90 min. 170 uL de tampon rece cu gheață (10 mM Tris-HCI (pH 8.0), 100 mM NaCI, 10 mM MgCI₂și 0.1 mM GTP) pentru a opri reacția. Membranele s-au filtrat pe un filtru GF / B (Millipore) și s-au spălat 3 ori cu tampon de spălare (50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 100 mM NaCI). Filtrele au fost uscate și s-a măsurat radioactivitatea utilizând contorul de scintilație [25], [26].

Test de legare la radioligand

Celulele de celule preparate au fost incubate cu 0.01 nM [³H] -spiperona (NET-565, PerkinElmer) și concentrații crescătoare de quinpirole (Q102, Sigma) pentru 30 min în tamponul de testare (25 mM HEPES (pH 7.5)₂, 100 mM NaCI, 1 mM EDTA). Membranele s-au filtrat pe un filtru GF / B (Millipore) și s-au spălat 3 ori cu tampon de spălare (50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 100 mM NaCI). Reacția a fost terminată prin filtrare rapidă prin filtre GF / C. A fost măsurată radioactivitatea reziduală utilizând un contor de scintilație lichid [27]-[29].

cAMP Enzima Immunoassay

Celulele HEK 293 transfectate au fost pretratate cu 10 μM rolipram (R6520, Sigma) pentru 1 h și apoi tratate cu 0.1 μM forskolin (F6886, Sigma) și concentrații crescătoare de quinpirole (Q102, Sigma) pentru 30 min. Neuronii striatali cultivați primar au fost tratați cu 10 μM rolipram pentru 1 h și apoi 1 μM dopamină pentru 1 h [22]. S-au preparat lizate de celule cu 0.1 M HCI și nivelurile de cAMP au fost detectate de kitul de imunotestare cu enzima cAMP (Sapphire Bioscience) urmând instrucțiunile producătorului.

Primul Neuron Striatal Cultured

A fost izolată zona striatală din creierul embrionar de șoarece (E15). Tesutul disecat a fost disociat în mediu minimal esențial (MEM) (11095, Invitrogen) conținând 0.25% tripsină (T4549-100, Sigma) și 0.1% DNaza I pentru 6 min la 37 ° C. Celulele au fost resuspendate în mediul de suprapunere (MEM cu 0.01 M HEPES (pH 7.4) și 10% (vol / vol) ser de cal (16050-122, GIBCO)). Neuronii au fost cultivați pentru zilele 7 in vitro (DIV 7) în MEM cu supliment B27 (17504-044, Invitrogen) înainte de a fi aplicat imunotestelor enzimatice cAMP.

REZULTATE

Cdk5 fosforilează serin 321 în a treia buclă intracelulare a DRD2 in vitro

Pentru a identifica noi substraturi Cdk5, am efectuat o căutare sistematică folosind (S / T) PX (K / H / R) ca secvențe consensuale de recunoaștere Cdk5 [30] și a identificat DRD2 ca un substrat candidat. Secvența de consens, inclusiv serina 321, este localizată în a treia buclă intracelulară a DRD2 (D2i3) în care au fost implicate diferite mecanisme de reglementare [3], [10], [11]. Secvența este conservată evolutiv în DRD2 la vertebrate, ceea ce implică o importanță funcțională a reziduului (Fig. 1A).

Descarcă:   

• PPT

  Diapozitiv PowerPoint

• PNG

  imagine mare (2.08MB)

• TIFF

  imagine originală (4.36MB)

Figura 1. Cdk5 fosforilează serina 321 în a treia buclă intracelulară a DRD2 in vitro.

(A) Alinierea secvenței de aminoacizi care arată regiunile conservate ale DRD2 din diferite specii (umbrite). Posibilitatea site-ului de fosforilare Cdk5 este indicată printr-un asterisc. (B) legate de IP in vitro kinazei cu proteine ​​mutante GST-D2i3 și GST-D2i3 recombinate. Complexul Cdk5 / p35 îmbogățit din extractul creierului de șoarece prin imunoprecipitare anti-p35 a fost utilizat pentru reacțiile kinazei. Un autoradiograf de proteine ​​fosforilate este prezentat împreună cu colorarea albastră a Coomassie albastră a aceluiași gel. Arrowhead indică semnalul radioactiv corespunzător GST-D2i3s și capul săgeții deschis indică semnalele radioactive de la p35. (C) Spectrul MS / MS al fragmentului peptidic fosforilat al D2i3. Modelele de fragmentare teoretice sunt prezentate sub spectru. Dintre toți ionii de fragment, ionii de y și b detectați sunt desemnați în spectru. Ei₆ și y₇ ionii indică puternic fosforilarea serinei 321. (D) In vitro kinază cu complex Cdk5 / GST-p25 purificat utilizând proteine ​​mutante GST-D2i3 și GST-D2i3. Proteinele fosforilate s-au arătat într-un autoradiograf, împreună cu colorarea cu Coomassie albastru strălucitor. Arrowhead indică semnalul radioactiv corespunzător GST-D2i3 și capul cu săgeți deschis indică semnalele radioactive de la GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Pentru a evalua capacitatea Cdk5 de a fosforila D2i3, am realizat conexiuni IP in vitro kinazelor utilizând un complex activ Cdk5 / p35 îmbogățit din lizatul creierului de șoarece prin imunoprecipitare p35 cu proteine ​​recombinate GST-D2i3 (resturi de aminoacizi 212-373) ca substraturi. Am observat semnale de fosforilare în proteinele purificate GST-D2i3 și GST-D2i3 S297A, dar semnalul a fost semnificativ diminuat utilizând GST-D2i3 S321A (Fig. 1B). Pentru a verifica în continuare fosforilarea serinei 321 în GST-D2i3, am efectuat analiza LC-MS / MS a probelor din IP-uri in vitro kinază folosind spectrometria de masă LTQ XL. În mod consecvent, s-au recuperat fosfo-peptide corespunzătoare masei peptidelor fosfo-serine 321 (Fig. 1C). Considerând că achiziția dependentă de date în timpul analizei LC-MS / MS tinde să detecteze proteinele abundente din probă [31], aceste date sugerează că restul serin 321 este situsul dominant de fosforilare al Cdk5 în regiunea D2i3. Pentru a demonstra fosforilarea directă a serinei 321 în GST-D2i3 de către Cdk5, in vitro kinază utilizând complexul Cdk5 / GST-p25 purificat cu proteine ​​GST-D2i3 recombinate purificate. Am identificat un semnal semnificativ de fosforilare în GST-D2i3 care a fost absent în GST-D2i3 S321A (Fig. 1D). Luate împreună, aceste rezultate indică faptul că reziduul D2i3 S321 este o țintă preferențială pentru fosforilarea mediată de Cdk5.

Cdk5 fosforilează serin 321 în a treia buclă intracelulară a DRD2 în celule

Pentru a identifica fosforilarea serinei 321, am ridicat anticorpul specific pentru fosfo-serina 321 (pS321). Probele din cadrul legat de IP in vitro kinază au fost analizate prin Western blot utilizând anticorp anti-pS321. Bloturile au arătat o bandă distinctă în reacția kinazei care era dependentă de GST-D2i3 (Fig. 2A). Pentru a verifica fosforilarea potențială a serinei 321 în DRD2 de către Cdk5 în celule, imunoprecipitatele anti-GFP din celulele HEK 293 care exprimă DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP cu sau fără HA-Cdk5 și p35 au fost analizate prin Western blot folosind anti-GFP și anticorpi anti-pS321. Caracteristicile semnalelor de bandă murdară de anticorpi anti-GFP despre care se știe că se datorează glicozilării excesive a DRD2 sunt observate numai în prezența DRD2-GFP, iar anticorpul anti-pS321 a detectat semnale similare DRD2 numai cu expresia co-Cdk5 / p35Fig. 2B) [7]. Pentru a verifica în continuare fosforilarea serinei 321 de către Cdk5, s-au generat D2i3 (FLAG-D2i3) și forma mutantă a D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 și FLAG-D2i3 S321A exprimate cu sau fără HA-Cdk5 și p35 în celulele HEK 293 au fost analizate printr-un test de deplasare a mobilității SDS-gel. O modificare semnificativă a mobilității dependentă de Cdk5 a fost observată pentru FLAG-D2i3, dar nu pentru FLAG-D2i3 S321A (Fig. 2C). De asemenea, am evaluat nivelul de fosforilare al DRD2 la Ser321 după stimularea agonistă. Celulele HEK 293 care exprimă complexul DRD2-GFP și complexul Cdk5 / p35 au fost stimulate de quinpirole, iar imunoprecipitatele anti-GFP din lizatele celulare au fost analizate prin Western blot folosind anticorpi anti-GFP și anti-pS321. Am constatat că fosforilarea mediată de Cdk5 a DRD2 la Ser321 nu a fost afectată de stimularea agonistă, care apare diferită de fosforilațiile mediate de GRK și PKC (Fig. 2D) [32], [33]. Împreună, aceste rezultate indică faptul că Cdk5 poate fosforila restul seric 321 al DRD2 în mediul celular.

Descarcă:   

• PPT

  Diapozitiv PowerPoint

• PNG

  imagine mare (1.92MB)

• TIFF

  imagine originală (3.5MB)

Figura 2. Cdk5 fosforilează serina 321 în a treia buclă intracelulară a DRD2 în celule.

S-a analizat fosforilarea mediată de Cdk5 a serinei 321 folosind anticorp anti-pS321. (A) Eșantioane din IP-uri in vitro kinază utilizând proteine ​​GST-D2i3 au fost analizate prin Western blotting (WB) cu anticorpi indicați. Săgețile indică GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP au fost exprimate cu sau fără HA-Cdk5 și p35 în celulele HEK 293. Anticorpii anti-GFP au fost analizați prin Western blot folosind anticorpi anti-GFP și anti-pS321. Suportul indică semnale DRD2 și capul săgeții deschis indică semnale nespecifice din imunoprecipitatele anti-GFP. "% de intrare" este% din volumul total de lizat pentru o reacție IP. Semnalele Cdk5 endogene slabe au fost indicate cu asteriscuri. (C) Test de deplasare a mobilității gelului. Celulele HEK 293 transfectate așa cum s-a indicat au fost analizate prin Western blot. (D) Celule transfectate HEK 293 au fost tratate cu chinpirole și imunoprecipitatele anti-GFP au fost analizate prin Western blot cu anticorpi anti-GFP și anti-pS321. Deschide vârful săgeții indică semnale nespecifice din imunoprecipitatele anti-GFP.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Complexul Cdk5 / p35 și DRD2 sunt asociate fizic

Am investigat interacțiunea fizică potențială dintre complexul Cdk5 / p35 și DRD2 deoarece multe substraturi Cdk5 sunt cunoscute a fi asociate fizic cu complexul Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Mai întâi, a fost efectuat experimentul de retragere GST. Proteina GST-D2i3 recombinată purificată a fost incubată cu lizatul creierului de șobolan și precipitările GST-pull-down au fost analizate pentru Western blot. Așa cum se arată în Fig. 3A, Cdk5 endogen și p35 au fost identificate în precipitațiile descendente, indicând o interacțiune fizică între DRD2 și complexul Cdk5 / p35 (Fig. 3A). Mai mult, HA-Cdk5 și p35 au fost detectate în imunoprecipitatele anti-GFP din lizatele de celule HEK 293 care exprimă DRD2-GFP și Cdk5 / p35 (Fig. 3B). În plus, am efectuat analize imunocitochimice și am observat că DRD2-GFP, HA-Cdk5 și p35 prezintă semnale semnificative de co-localizare la nivelul zonei membranoase a celulelor HEK 293Fig. 3C, panouri superioare). De asemenea, am investigat co-localizarea DRD2 și Cdk5 / p35 în contextul neuronal. În mod consecvent, DRD2-GFP a prezentat, de asemenea, o co-localizare semnificativă cu Cdk5 endogen și p35 în neuronii striatali cultivați (DIV7), susținând în continuare legăturile funcționale dintre DRD2 și Cdk5 / p35Fig. 3C, panouri de fund). Rezultatele indică faptul că DRD2 și Cdk5 / p35 pot forma un complex și, astfel, susțin ideea că DRD2 este un substrat fiziologic al Cdk5.

Descarcă:   

• PPT

  Diapozitiv PowerPoint

• PNG

  imagine mare (3.91MB)

• TIFF

  imagine originală (5.35MB)

Figura 3. Cdk5 / p35 poate forma un complex cu DRD2.

(A) test GST descrescător folosind proteina GST-D2i3 recombinată purificată cu extract de creier de șobolan. Precipientele de rupere GST au fost supuse unor analize Western blotting. "Bead" indică precipitatul descendent fără proteine ​​GST. (B) Imunoprecipitarea complexului DRD2 și Cdk5 / p35. Anticorpii anti-GFP din lizatele de la celulele transfectate au fost supuse analizelor Western blotting. Suportul indică semnale DRD2 și capul săgeții deschis indică semnale nespecifice din imunoprecipitatele anti-GFP. Un blot supraexpusat pentru intrări este de asemenea prezentat în partea dreaptă. (C) Analize imunocitochimice ale DRD2 și Cdk5 / p35. Celulele HEK 293 care exprimă DRD2-GFP și Cdk5 / p35 au fost colorate cu anticorpi anti-Cdk5 și anti-p35 (panouri superioare). DRD2-GFP a fost exprimată singură în neuronii striatali cultivați și colorată cu anticorpi anti-Cdk5 și anti-p35 (panourile inferioare). Hoechst au fost folosite pentru colorarea nucleului. Bara de scară este 5 μm. Toate imaginile au fost obținute folosind microscopie confocală (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-mediată de fosforilare a DRD2 atenuează activitatea receptorului

S-a raportat că fosforilarea modulează proprietățile critice ale GPCR-urilor cum ar fi cuplarea proteinei G, internalizarea receptorului, localizarea intracelulară și asocierea cu proteinele modulatoare [9], [11], [24]. Ointernalizarea receptorului indusă de gonist este un proces critic de reglementare a transducției semnalului. Am investigat modularea mediată de Cdk5 a internalizării DRD2. Celulele HEK 293 care exprimă DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP cu sau fără Cdk5 / p35 au fost incubate cu chinpirole 1 pM pentru a induce internalizarea DRD2 stimulată de agonist (Fig. 4A). [³H] semnele de spiperonă ale celulelor care exprimă DRD2-GFP au fost semnificativ reduse la tratamentul cu 30 min quinpirole și recuperate la 90 min. Interesant, [³H] semnele de spiperonă ale celulelor care exprimă DRD2-GFP și Cdk5 / p35 au fost de asemenea reduse la tratamentul cu 30 min quinpirole dar nu au fost recuperate la 90 minFig. 4A, a doua secțiune). Pe de altă parte, [³H] semnele de spiperonă ale celulelor care exprimă DRD2 S321A-GFP au fost reduse la 30 min și recuperate la 90 min, indiferent de co-expresie cu Cdk5 / p35. Studiile anterioare au arătat că DRD2 internalizat reciclează înapoi la membrana plasmatică după stimularea agonistă prelungită [11]. Tse pare că fosforilarea mediată de Cdk5 a DRD2 este implicată în procesele de resensibilizare după internalizarea DRD2 indusă de agonist.

Descarcă:   

• PPT

  Diapozitiv PowerPoint

• PNG

  imagine mare (387KB)

• TIFF

  imagine originală (1.31MB)

Figura 4. Cdk5 mediată de fosforilare atenuează exprimarea suprafeței DRD2 și semnalizarea în aval.

(A) exprimarea suprafeței DRD2 măsurată prin [³H] -spiperonă. Celulele HEK293 transfectate au fost stimulate cu chinpirole 1 μM pentru timpul indicat și recoltate, urmate de 3 nM [³Tratament cu H] -spiperonă timp de 3 ore. Radioactivitatea a fost măsurată și semnalele de suprafață au fost calculate. Barele de eroare reprezintă media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ANOVA unidirecțională cu testul Dunnett post hoc: comparați toate coloanele vs. coloana de control). (B) [³⁵S] -GTP_γTestul de legare S. Membranele celulare au fost preparate din celulele transfectate așa cum s-a indicat. Preparatele cu membrană au fost incubate cu chinpirole 1 uM urmat de 3 nM [³⁵S] -GTP_γS timp de 90 min. Barele de eroare reprezintă media ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; ANOVA unidirecțională cu testul Bonferroni post hoc: comparați toate perechile de coloane). (C) Quinpirol concurent [³H] -spiperonă. Preparatele cu membrană din celulele transfectate au fost incubate cu 0.01 nM [³H] -spiperonă și creșterea concentrațiilor de chinpirol timp de 30 de minute. Regresia neliniară a fost obținută de GraphPad. Barele de eroare indică media ± SE (n = 3). (D) imunoanalize enzimatice AMPc în celule HEK 293 transfectate. Celulele transfectate au fost pretratate cu 10 uM rolipramă timp de 1 oră, și ulterior co-tratate cu 0.1 uM forskolin și creșterea concentrațiilor de chinpirol timp de 30 de minute. Regresia neliniară a fost obținută de GraphPad. Barele de eroare reprezintă media ± SE (n = 4; ** p <0.01; cu două cozi t-tests). (E) Neuronii striatali cultivați din embrioni de tip sălbatic și p35 knockout (DIV 7) au fost tratați cu 10 μM rolipram pentru 1 h urmat de 1 μM dopamină pentru 1 h. Barele de eroare reprezintă media ± SE (n = 4; **p<0.01; cu două cozi t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Am evaluat în continuare o schimbare potențială a cuplării cu proteină G stimulată de agonist la DRD2 asociată cu fosforilarea mediată de Cdk5 utilizând [³⁵S] -GTP_γTestul de legare S [25], [26]. DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP cu sau fără Cdk5 / p35 au fost exprimate în celule HEK 293. Membranele s-au preparat și s-au stimulat cu 1 uM chinpirole și s-a permis în continuare [³⁵S] -GTP_γS încorporare. DRD2-GFP și membrana celulară care exprimă Cdk5 / p35 au prezentat o afectare semnificativă a [³⁵S] -GTP_γS în comparație cu toate celelalte membrane celulare (Fig. 4B). Aceste rezultate indică faptul că fosforilarea mediată de Cdk5 scade în jos legarea legată de agonistul G legată la DRD2.

În plus, chinpirole-concurente [³H] -spiperonă au fost efectuate pentru a investiga orice schimbare potențială a afinității agoniste la DRD2 prin fosforilarea mediată de Cdk5. Legarea competitivă a [³H] -spiperonă după tratamentul concentrațiilor crescânde de quinpirole la preparatul din membrană din celulele transfectate. Legarea competitivă a quinpirole și [³H] -spiperonă la DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP a făcut logK similar_i (-9.789 pentru DRD2-GFP; -9.691 pentru DRD2 S321A-GFP), indicând faptul că afinitatea ligandului la DRD2 nu este semnificativ afectată de fosforilarea mediată de Cdk5 la DRD2 (Fig. 4C).

Cromul mediat de Cdk5 reglează în jos calea de semnalizare DRD2-cAMP

Apoi, am investigat dacă modificarea DRD2 de către Cdk5 afectează căile de semnalizare din aval. Am monitorizat inhibarea mediată de DRD2 a producției de cAMP stimulată de forskolin de adenilil ciclază în celulele care exprimă DRD2-GFP și DRD2 S321A-GFP utilizând imunoteste enzimatic cAMP. Celulele care exprimă DRD2 au prezentat scăderea nivelurilor de AMPc ca răspuns la chinpirole într-o manieră dependentă de doză. Remarcabil, co-exprimarea Cdk5 / p35 a redus semnificativ inhibarea maximă a formării AMPc (Figura 4D, panoul din stânga). Pe de altă parte, în celulele care exprimă DRD2 S321A-GFP, formările cAMP au fost inhibate efectiv ca răspuns la tratamentul cu quinpirole, indiferent de exprimarea Cdk5 / p35 (Figura 4D, panoul din dreapta). Aceste rezultate indică faptul că fosforilarea mediată de Cdk5 a DRD2 atenuează activitatea inhibitoare a DRD2 pe calea de semnalizare cAMP în aval. Pentru a confirma în continuare fenomenul într-un context mai relevant din punct de vedere fiziologic, am utilizat neuronii primari cultivați din embrionii knock-out cu deficit de p35, un activator esențial Cdk5. Neuronii striatali de cultură primară au fost tratați cu dopamină 1 pM și analizați prin imunoteste enzimatice cAMP. Neuronii de la șoarecii knock-out p35 au prezentat niveluri scăzute de AMPc comparativ cu neuronii de tip sălbatic când au fost stimulați cu dopamină (Fig. 4E). Tîmpreună, am concluzionat că fosforilarea mediată de Cdk5 a DRD2 are ca rezultat o scădere a tonului inhibitor pe calea cAMP exercitată de DRD2.

Discuție

Am identificat DRD2 ca un substrat nou al lui Cdk5. Fosforilarea pare să reglementeze exprimarea suprafeței DRD2 prin afectarea soartei DRD2 după internalizarea receptorului, reducând astfel DRD2 G_i- cuplarea și calea cAMP în aval. Deoarece reziduul de fosforilare S321 există atât în ​​izoformele DRD2 lungi și scurte, mecanismul propus în acest studiu poate fi un mod general de reglementare în semnalizarea mediată de DRD2.

DRD2 în neuronii cu spinoasă medie nu a fost privit doar ca un subtip tipic de receptor dopaminic, ci a fost recunoscut și pentru susceptibilitatea sa la schimbări în disponibilitate ca răspuns la stimulii de mediu. Dezagresibilizarea indusă de agonist și resensibilizarea DRD2 au fost studiate pe larg [11], [24]. În special, o serie de studii au arătat că efectele expunerii psihostimulante cronice, cum ar fi cocaina și amfetamina, care ridică nivelul extracelular al dopaminei în sinapse striatale, sunt însoțite de schimbări dinamice ale DRD2 postsynaptic [36]. Într-adevăr, utilizatorii cronici cronici sunt cunoscuți pentru a avea niveluri reduse de DRD2 în zona striatală, iar disponibilitatea DRD2 în nucleul accumbens (NAcc) prezintă o corelație negativă cu comportamentul de căutare și de întărire a drogurilor la șoareci și primate [37]-[39]. Aceste constatări indică faptul că funcționalitatea DRD2 este foarte susceptibilă la o reglementare adaptivă sau compensatorie ca răspuns la diverși stimuli, inclusiv expunerea cronică la medicament. Rezultatele noastre arată că restul S321 din a treia buclă intracelulară a DRD2 poate fi fosforilat de Cdk5, ceea ce are ca rezultat o scădere a influenței inhibitoare a DRD2 pe calea cAMP. Această interacțiune propune un mecanism de reglementare nou asociat cu Cdk5 în neuronii dopaminoceptivi care ar putea fi legați de natura dinamică a disponibilității suprafeței DRD2.

Trebuie remarcat faptul că Cdk5 este cunoscut a fi o componentă cheie în medierea schimbărilor adaptive ale mediului neuronal. De exemplu, modificările structurale și funcționale ale coloanei dendritice în neuronii circuitului limbic sunt una dintre consecințele expunerii psihostimulante repetate [40]. Aceste modificări sunt însoțite de diferite modificări moleculare, incluzând inducerea proteinei care leagă elementul de răspuns CAMP (CREB) și ΔFosB, factorii de transcripție care prezintă o reglementare susținută în sus ca răspuns la administrarea cocainei cronice [41], [42]. Foarte important, Cdk5 este o țintă a ΔFosB [19], și multe componente critice implicate în dinamica coloanei dendritice, cum ar fi PSD-95, kinaza activată de p21 (PAK), β-catenină și spinofilină, au fost raportate ca substraturi Cdk5 [43]-[46]. În mod consecvent, manipularea genetică sau farmacologică a activității Cdk5 provoacă modificări ale morfologiei coloanei vertebrale dendritice și răspunsurilor comportamentale la cocaină, implicând roluri critice pentru Cdk5 în modificările moleculare și morfologice ale circuitelor mezolimbice de dopamină [47], [48]. Rezultatele noastre care arată că DRD2 este o țintă nouă a Cdk5 oferă o perspectivă suplimentară asupra modificărilor adaptive ale sistemului dopaminic ca răspuns la expunerile cronice de medicamente din cauza administrării ulterioare a ADPosB mediată de Cdk5 poate induce o creștere tonică a fosforilării DRD2 . Mai mult, este cunoscut faptul că DRD2 afectează numeroase procese celulare, incluzând reglarea căilor kinazei cAMP și MAP și evenimente transcripționale în aval [42], [49]. Astfel, constatările din acest studiu ar putea nu numai să descrie o reglementare directă a DRD2 de către Cdk5, ci și să ofere o perspectivă nouă asupra răspunsurilor adaptive ale sistemului dopaminei la expunerea cronică la medicament.

Contribuțiile autorului

Conceperea și proiectarea experimentelor: JJ YUP DH SKP. Efectuarea experimentelor: JJ YUP DKK YK. Analiza datelor: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Reactivi / materiale / instrumente de analiză contribuite: YHS. Scrierea hârtiei: JJ SKP.