Optogenetica dezvăluie un rol pentru neuronii stocați medii spinați care exprimă receptorii D2 ai dopaminei în sensibilizarea comportamentală indusă de cocaină (2014)

Shelly Sooyun Song,^1,† Byeong Jun Kang,^1,† Lei Wen,^2,3,4,† Hyo Jin Lee,¹ Hye-ri Sim,¹ Tae Hyong Kim,¹ Seyoun Yoon,¹ Bong-iunie Yoon,¹ George J. Augustine,^2,3,4 și Ja-Hyun Baik^1,*

Informații de autor ► Note despre articol ► Informații despre licență și licență

Eforturile de lungă durată, induse de droguri în nucleul accumbens (NAc), au fost propuse pentru a contribui la comportamentele dependente de medicamente. Aici am folosit o abordare optogenetică pentru a examina rolul neuronilor SPN medii spinați (MSN) care exprimă receptorii dopaminei D2 (D2Rs) în sensibilizarea comportamentală indusă de cocaină. Vectorii virali adeno-asociați care codifică canalul rhodopsin-2 (ChR2) au fost eliberați în NAc al șoarecilor transgenici D2R-Cre. Acest lucru ne-a permis să selectiv fotostimulate D2R-MSNs în NAc. D2R-MSN formează circuite locale de inhibiție, deoarece fotostimularea D2R-MSN a evocat curenții postsynaptici inhibitori (IPSC) în MSN-urile vecine. Fotostimularea NAc D2R-MSN in vivo nu a afectat nici inițierea, nici expresia sensibilizării comportamentale induse de cocaină. Cu toate acestea, fotostimularea în timpul perioadei de retragere a medicamentului a atenuat exprimarea sensibilizării comportamentale induse de cocaină. Aceste rezultate arată că D2R-MSNs ale NAc joacă un rol cheie în plasticitatea indusă de retragere și pot contribui la recadere după întreruperea consumului de droguri.

Mouse-uri

Șoarecii transgenici D2-Cre BAC pe fundal C57Bl / 6 au fost obținuți de la MMRRC (Centre de resurse regionale Mutant Mouse, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). În experimentele comportamentale, ca martori pentru șoarecii D2-Cre s-au folosit littermates lipsiți de transgenul D2-Cre. Șoarecii au fost menținuți într-o instalație de barieră fără patogeni în condiții constante de temperatură și umiditate, iar pe o lumină 12-h, programul de întuneric 12-h. Îngrijirea și manipularea animalelor au fost efectuate în conformitate cu standardele aprobate de Comitetul instituțiilor de îngrijire și utilizare a animalelor din Coreea și KIST.

Prepararea vectorului de virus

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE a fost generos oferită de Karl Deisseroth (Stanford Univ.). Pentru prepararea AAV, celulele HEK293T au fost crescute în mediu DMEM cu antibiotice și FBS. Cu o zi înainte de transfecție, patru plăci dincolo de 90% confluență din vase 10-cm au fost placate pe cinci vase 15-cm și incubate pentru 18-22 h sau până la confluența 60-70%. Celulele HEK293T au fost transfectate cu pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ și pHelper utilizând reactivul de transfecție jetPEI (QBiogene). Cocteilul ADN / DMEM / PEI a fost vortexat și incubat la temperatura camerei pentru 20 min. După incubare, amestecul de transfecție a fost adăugat la fiecare vas 15 cm. Celulele transfectate au fost recoltate 48 h după transfecție și incubate cu 0.5% deoxicolat de sodiu (Sigma; D6750) și 50 unități / ml de benzonază nuclează (Sigma; E1014) la 37 ° C pentru 1 h. După îndepărtarea resturilor celulare prin centrifugare la 3000 xg pentru 15 min, supernatantul a fost filtrat printr-un filtru 0.45 mm PVDF (Millipore). Purificarea particulelor de AAV-DJ a fost efectuată utilizând coloane de afinitate pentru heparină HiTrap (GE Healthcare). Pentru concentrația de AAV, s-au utilizat unitățile centrifuge de filtrare Amicon ultra-15 cu o cavitate de greutate moleculară 100,000. Concentrat de virus alicot și congelat pentru depozitare la -80 ° C. Concentrațiile virale finale au fost 3 ~ 6 × 10¹² particule de virus per ml pentru fiecare AAV.

Injecția stereotaxică și plasarea fibrei optice

Animalele au fost anesteziate prin injecții ip de 1.6 pl de Zoletil și 0.05 pl de xilazină (Rompun, Bayer) per gram de greutate corporală și plasate într-un aparat stereotaxic (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Pentru injectarea de viruși, un ac de seringă cu calibru 31 a fost utilizat pentru a infuza bilateral 2 µl de virus în NAc la un unghi de 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV −4.5) la o rată de 0.1 ul / min. Acul a fost lăsat în poziție timp de 10 minute după injectare înainte de a fi retras încet. Canula cu fibră optică pentru implantare a constat dintr-o virulă de zirconiu (1.25 mm în diametru și 4.5 mm lungime) și un vârf plat al unei fibre optice (200 µm în diametru). Implantarea canulei de fibră optică în NAc pentru iluminarea D2-MSN a fost efectuată imediat după injectarea de viruși. Coordonatele pentru implantarea canulei cu fibră optică au fost un unghi de 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV −4.2) pentru țintirea NAc. Pentru a ajuta la ancorarea fibrei optice, două șuruburi au fost ancorate în craniu în partea din spate a locului de implantare a canulei cu fibră optică. Pentru fixarea canulei cu fibră optică pe craniu, C&B Superbond (Sun Medical) a fost aplicat pe suprafața craniului în jurul bazei canulei. Odată ce C&B Superbond s-a întărit, canula a fost eliberată din suport și s-a aplicat ciment dentar (Poly-F, Dentsply) în jurul canulei și șuruburilor. Pentru a închide incizia în jurul locului de canulare, s-a folosit adeziv tisular Vetbond (3 M, 7003449). După implantare, șoarecilor li s-a administrat injecție subcutanată de antibiotice (Enrofloxacin, 5 mg / kg, q 12 h) și analgezie (Carprofen, 5 mg / kg, q 24 h) timp de 3 zile consecutive.

In vivo fotostimulării

Un cordon de patch-uri 200 μm a fost conectat la porțiunea externă a fibrei optice cronice implantabile folosind un manșon. Fibrele optice au fost atașate printr-un adaptor FC / PC la o diodă laser albastră (473 nm, MBL-III 473-150 mW) și impulsuri luminoase au fost generate printr-un stimulator (BNC 575). Pentru fotostimularea neuronilor care exprimă ChR2, paradigma de stimulare a fost frecvența 20 Hz, durata pulsului 5 ms și puterea de lumină 2-5 mW. Puterea luminii emise din cordonul de patch-uri a fost măsurată utilizând un contor de putere (PM100D) cu un senzor de lumină S121C.

Analiza comportamentală

Experimentele comportamentale s-au efectuat cu șoareci masculi D2-Cre la săptămâni de vârstă 11-13, cu excepția șoarecilor supuși analizei electrofiziologice care au fost 5-6 săptămâni de vârstă. Șoarecii de control D2-Cre și Cre negativi, potriviți în funcție de vârstă, au fost injectați cu virus și au fost adăpostiți individual și lăsați să se aclimatizeze cu cușca până la testul comportamental. Pentru fiecare manipulare, soarecii au fost transferați în sala experimentală 60 min înainte de debutul experimentului pentru a permite habitatul și pentru a reduce stresul (luminozitatea camerei experimentale a fost 70 lux). Fiecare aparat experimental a fost curățat cu 70% etanol între experimente pentru a elimina indicii potențiali de miros.

Sensibilizarea cocainei

Pentru inițierea sensibilizării cocainei, șoarecii au fost obișnuiți cu injecții saline (ip) pentru zile consecutive 3 și apoi injectați cu soluție salină sau cocaină (15 mg kg^-1, ip) pentru zile consecutive 5. Șoarecii au fost injectați intraperitoneal (ip) cu clorhidrat de cocaină (Johnson Mattney, Edinburgh, Marea Britanie) dizolvat în soluție salină (0.9% NaCl) sau soluție salină cu un ac 30 G. Imediat după fiecare injectare, șoarecii au fost testați pentru o activitate locomotorie orizontală într-o cameră cu câmp deschis pentru 30 min. Pentru măsurarea efectului fotostimulării asupra inițierii și exprimării sensibilizării (Figura 1) (Figura​​​5), 5), șoarecii au primit iluminare albastră albastră bilaterală prin cabluri duble cu fibră optică pe NAc timp de patru perioade 3-min în timpul sesiunilor minime 30 în cuștile de uz casnic. Șnururile de patch-uri din canula fibro-optică situată pe craniul șoarecelui au fost îndepărtate, iar șoarecii au primit cel puțin 10 min odihnă. Șoarecii au fost apoi injectați fie cu cocaină, fie cu soluție salină (coc 1d-coc 5d). După inițierea sensibilizării, cocaina a fost retrasă timp de 14 zile fără injecție de soluție salină. În timpul acestei perioade de așteptare, nu sa aplicat fotostimulare. Expresia sensibilizării comportamentale la cocaină a fost apoi determinată prin injectarea unei doze de provocare a medicamentului (10 mg kg^-1, ip) după fotostimularea NAc așa cum este ilustrat în figura Figure5A.5A. Pentru a măsura efectul fotostimulării în timpul perioadei de așteptare a cocainei (Figura 1) (Figure6), 6), șoarecii au fost supuși aceluiași protocol pentru sensibilizare așa cum s-a descris mai sus (pentru Figura Figure5) 5) cu excepția fotostimulării. După inițierea sensibilizării cocainei, fotostimularea a fost aplicată zilnic pentru NAc pentru 1 h în timpul perioadei totale de așteptare a zilelor 14. După 14 zile de retragere, toate grupurile de șoareci au fost injectați cu doza de provocare de cocaină (10 mg kg^-1).

 

Figura 1

Fotostimularea selectivă a neuronilor spinoși medii în nucleul accumbens. (A) Expresia selectivă a ChR2 în neuronii NAc D2R prin eliberarea vectorilor virali AAV-DIO-ChR2-EYFP. bare de bare: figura de fundal, 1 mm: inserați, 200 μm. (B) Imagini confocale ...

 

Figura 2

Fotostimularea celulelor D2RCre-MSN conduce circuite locale inhibitoare. (A) Imaginea confocală a unei foi NAc vii, prezentând un neuron plin cu coloranți care nu exprimă ChR2 și o celulă vecină (vârful săgeții) care a exprimat ChR2 și ar putea fi fotostimulată. (B) IPSC ...

 

Figura 3

Proprietățile celulelor NAc. (A) Imagine fluorescentă cu două fotoni a neuronilor umpluți cu Alexa 594. (A1) arată un neuron din grupul ChR2 + / AP, în timp ce (A3) arată un neuron din grupul ChR2- / IPSC. (A2) și (A4) sunt imagini cu mărire mare din ...

 

Figura 4

Efectele activării optogenetice in vivo a D2-MSNs în NAc asupra activității locomotorii bazale. (A) Viziunea sagitală a șoarecilor D2 Cre injectate la NAc cu AAV-DIO-ChR2-EYFP urmată de implantarea bilaterală a canulei cu fibră optică. 473 nm stimulare lumină albastră ...

 

Figura 5

Efectele activării D2-MSN în timpul sensibilizării la cocaină. (A) Schema experimentală pentru fotostimularea D2-MSN în timpul inițierii și exprimării sensibilizării la cocaină. Iluminarea cu iluminare albastră (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) a fost livrată timp de patru ...

 

Figura 6

Efectele activării D2-MSN în timpul retragerii la expunerea repetată la cocaină. (A) Schema experimentală pentru fotostimularea D2-MSN în timpul retragerii la cocaină. Iluminarea cu iluminare albastră (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) a fost livrată pentru opt perioade 3-min ...

Imunofluorescență și microscopie laser confocală

Pentru imunofluorescență, șoarecii au fost anesteziați cu Zoletil (Virbac, 1.6 μl / g, intraperitoneal) și 0.05 μl / g Rompun (Bayer) și perfuzate cu 0.1 M PBS sterilizat cu filtru urmată de fixare utilizând soluție 4% paraformaldehidă / PBS soluție (Sigma). Creierul a fost apoi îndepărtat și post-fixat pentru 4 h cu fixativ rece la rece, ca mai sus. Creierii au fost apoi deshidratați în 30% zaharoză / 0.1 M PBS pentru zile 2. Crenele au fost apoi înghețate și s-au preparat secțiuni coronale consecutive groase 40-μm pe un criostat (Leica CM 1900, Germania). Secțiunile (40 μm) au fost blocate pentru 1 h în 0.1 M PBS conținând 5% ser de capră normală și 0.2% Triton X-100 și incubate cu anti-D2R policlonale de iepure (1: 500, Millipore, AB5084P) la 4 ° C peste noapte. După spălări cu PBS conținând 0.2% Triton X-100, probele au fost incubate la RT pentru 1 h cu IgG anti-iepure de capră Alexa Fluor 568 (1: 500; Molecular Probes, Eugene, OR, SUA) și 0.2l / 4-diamidino-6-fenil-indol HCI (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, SUA) în PBS conținând 2% ser de capră normală și 1% Triton X-0.2. Ca un control negativ, probele au fost incubate numai cu DAPI și cu anticorpul secundar. Secțiunile au fost examinate pe un sistem de scanare cu laser confocal cu laser C100 Plan Apo × 1 / 40 (LSM 1.4, Zeiss, Berlin, Germania).

Electrofiziologie și fotostimulare în felii nucleu accumbens

Șoarecii au fost utilizați pentru experimente 4 săptămâni după injectarea virusului, pentru a obține o exprimare optimă a ChR2-EYFP. Șoarecii au fost apoi anesteziați și decapitați pentru prepararea de felii de creier acut. Creierul a fost îndepărtat rapid și plasat imediat în soluție de răcire cu gheață conținând (în mM) 250 Sucrose, 26 NaHCO₃, 10 D-glucoză, 3 Myo-inozitol, 2.5 KCI, 2 Na-piruvat, 1.25 NaH₂PO₄, 0.5 acid ascorbic, acid 1 Kynurenic și 7 MgCl₂ care a fost barbotat cu 95% O₂/ 5% CO₂ (pH = 7.4). Corpurile creierului coronarian (grosime 250 μm) conținând NAc au fost preparate utilizând un vibratom (Leica VT 1200 S) și apoi au fost incubate în lichid cefalorahidian (ACSF) cu gaze conținând (în mM): 11 D-glucoză, 125 NaCl, 25 NaHCO₃, 1.25 NaH₂PO₄, 2.5 KCI, 1.25 MgCl₂ și 2.5 CaCl₂ la 34 ° C pentru 1 h înainte de înregistrare. Secțiunile au fost apoi transferate într-o cameră de înregistrare submersă în care O₂Soluția ACSF saturată a fost continuu superfuzată. Celulele din NAc și VTA au fost vizualizate utilizând un microscop 2-foton (Olympus FV1000 MPE, Tokyo, Japonia) echipat cu lentilă cu imersie de apă 25X și optică DIC în infraroșu. Înregistrările clemelor pentru patch-uri au fost obținute din celule NAc cu un amplificator Multiclamp 700B și digitizatorul Digidata 1440A (Molecular Devices, LLC). Datele au fost prelevate utilizând software-ul pCLAMP 10.2 și au fost analizate în continuare utilizând software-ul Clampfit 10.2 (Molecular Devices, LLC). Electrozii de patrat cu rezistențe între 3-5 MΩ au fost umpluți cu o soluție internă care conține (în mM): X-gluconat 130, 2 NaCl, 2 MgCl₂, 20 HEPES, 4 Na₂ATP, 0.4 Na₃GTP, 0.5 EGTA și 10 Na₂- fosfocreatină, cu pH ajustat la 7.3 folosind 1 N KOH. Bicuculina (10 uM) a fost aplicată pe baie pe felia creierului pentru a bloca receptorii GABA într-un subset de experimente.

Celulele NAc care exprimă ChR2-EYFP au fost fotostimulate de o sursă de lumină LED (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Lumina albastră a LED-ului a fost ulterior filtrată și atenuată de un cub filtru echipat cu un filtru de excitație (470-495 nm); intermitențe de lumină (durata 10 ms, 0.0366-0.354 mW / mm²) au fost transmise la felia creierului prin intermediul obiectivului 25X la frecvențele 5-40 Hz. Într-un subgrup de experimente, fotocurenții au fost măsurați în celule care exprimă ChR2 ca răspuns la scurgerile de lumină ale duratei 2.

Analiza statistică

Datele sunt prezentate ca mijloace ± sem și au fost analizate cu ajutorul studenților cu două ochiuri t-test sau cu o analiză bidirecțională a varianței, urmată de Bonferroni post hoc Test. A P-valoarea <0.05 a fost considerată semnificativă statistic.

Fotostimularea selectivă a neuronilor spinoși medii în nucleul accumbens

Pentru a determina rolul NAc D2R-MSNs în comportamentele de dependență mediate de cocaină, am folosit o abordare optogenetică pentru stimularea neuronilor NAc D2R. Pentru a controla selectiv activitatea D2R-MSNs în NAc prin lumină, vectorii virali care codifică AAV-DIO-ChR2-EYFP au fost injectați stereotaxic în NAc al șoarecilor transgenici D2R-Cre BAC. După săptămâni 4 după injectarea virală, a fost observată o expresie robustă a ChR2-EYFP în NAc (Figura (Figure1A) .1A). Specificitatea expresiei ChR2 în D2R-MSNs a fost confirmată prin analiza confocală cu imunofluorescență: expresia ChR2 marcată cu YFP a fost co-localizată cu D2R în NAc (Figura (Figure1B), 1B), arătând că ChR2 a fost exprimat în neuronii care exprimă D2R în NAc.

Deși o astfel de abordare a fost utilizată în alte studii (de exemplu, Lobo și colab., 2010), detaliile procedurilor de injectare a virusului vor varia de la un laborator la altul, ceea ce face importantă documentarea controlului optogenetic în condițiile experimentale specifice. Am evaluat expresia funcțională a lui ChR2, făcând înregistrări ale clemelor de patch-uri din celule întregi din MSNs în felii NAc. MSNs au fost identificate prin: (1) un potențial relativ hiperpolarizat de membrană de repaus (RMP), de obicei mai mult negativ decât -80 mV; (2) un model obișnuit de ardere a AP ca răspuns la impulsurile de curent aplicate; (3) latență lungă la arderea primului AP în timpul unui impuls curent; (4) absența unei "căderi" de tensiune în timpul hiperpolarizării provocată de un curent de cation activat prin hiperpolarizare (I_h); și (5) dimensiuni relativ mici ale corpurilor lor de celule (Chang and Kitai, 1985; O'Donnell și Grace, 1993; Le Moine și Bloch, 1996; Taverna și colab., 2008). Lumina albastră (470 nm) a fost aplicată pe întregul câmp vizual (0.78 mm²) în timp ce fixează tensiunile MSN-urilor la un potențial de menținere a lui -69 mV. Unele MSN-uri au exprimat ChR2, evident ca fluorescență YFP în somatele lor (săgeți în Figuri 1C1, C3). Astfel de neuroni au prezentat fotocurente substanțiale, cu stimuli lumini mai luminoși care generează fotocurenți mai mari (figura (Figure1D) .1D). Relația dintre amplitudinea maximă fotocurrentă și intensitatea luminii (Figura 1) (Figure1E) 1E) a avut o sensibilitate la lumină maximă jumătate de 0.054 ± 0.0023 mW / mm² și o amplitudine maximă a vârfului 1.16 ± 0.16 nA (media ± sem, n = 4).

În condițiile de clampare curentă, MSN-urile care exprimă ChR2 au alimentat AP în mod fiabil ca răspuns la trenurile de impulsuri luminoase (durata 10 ms; Figura Figure1F) .1F). În aceste condiții, intensitățile luminoase sunt mai mari decât 0.1 mW / mm² au fost suficiente pentru a evoca AP-urile (fig (Figure1G, 1G, n = 5). AP au fost evocate în mod fiabil la frecvențe fotostimulare până la 20 Hz, în timp ce la 40 Hz răspunsurile induse de lumină s-au însumat pentru a determina o depolarizare susținută care a fost mai puțin eficace la evocarea AP 1F, G).

Fotostimularea celulelor D2R-MSN conduce circuite locale inhibitoare

Pentru a investiga consecințele activității D2R-MSNs asupra circuitelor locale în NAc, am fotostimulat MSN presinaptic care exprimă ChR2 în timp ce măsoară răspunsurile postsynaptice la MSNs ChR2-negative (Figura (Figure2A) .2A). Neuronul prezentat în Figura Figure2A2A nu exprimă ChR2, așa cum este indicat de absența fluorescenței EYFP, precum și de absența fotocurenților cu latență scurtă, precum cei arătați în figura Figure1D.1D. Cu toate acestea, atunci când MSN-urile postsynaptice au fost păstrate ca un potențial al -69 mV, lumina de durată 10 ms clipește curenți evacuați evacuați după o latență de 9.0 ± 0.42 ms (Figura (Figure2B, 2B, n = 15). Pentru a determina natura acestor răspunsuri, potențialul membranei postsynaptice a fost variat între -99 mV la -39 mV, în timp ce s-a aplicat un bliț lumină (Figura (Figure2C) .2C). Răspunsurile induse de lumină au variat cu potențialul membranei (Figura (Figure2D, 2D, n = 6) și a inversat polaritatea lor la -81 ± 3.4 mV. Având în vedere că potențialul de echilibru al ionilor de clor este -80 mV în condițiile ionice, curenții exteriori induse de lumină ar putea fi datorate fluxului de clor mediat de GABA postsynaptic_A receptori. Pentru a testa această posibilitate, GABA_A receptorul bicuculinei antagonist (10 pM) a fost adăugat la soluția externă. Acest medicament a blocat complet răspunsurile induse de lumină (Fig (Figure2B), 2B), confirmând că răspunsurile induse de lumină au fost curenți postsynaptici inhibitori GABAergici (IPSC).

Pe baza răspunsurilor lor la fotostimulare, MSN-urile pe care le-am înregistrat pot fi clasificate într-unul dintre grupurile 4: celulele (1) care exprimă o cantitate suficientă de ChR2 pentru a focaliza AP-urile ca răspuns la fotostimularea (ChR2 + / AP) (2) care exprimă o cantitate mică de ChR2, care a evidențiat o depolarizare sub-prag ca răspuns la lumină (ChR2 + / nr AP); (3) care nu au avut expresia ChR2, dar au primit IPSC-uri induse de lumină din MSNs presinaptice care exprimă ChR2 (ChR2- / IPSC); și (4) ChR2-negative care nu au prezentat IPSC ca răspuns la fotostimularea altor MSNs (ChR2- / Nu IPSC). Proporția relativă a celulelor din fiecare dintre aceste categorii este prezentată în Figura Figure2E2E (n = 53). În general, aproape jumătate din celule (45.3%) au exprimat ChR2 (suma grupurilor (1) și (2)). Niciunul dintre MSN-urile pe care le-am înregistrat nu a prezentat atât fotocurante, cât și IPSC ca răspuns la fotostimulare; acest lucru indică faptul că MSN-urile D2R-pozitive nu inervază alți membri ai aceleiași populații de celule în cadrul NAc.

Această clasificare a răspunsurilor la lumină indică faptul că fotostimularea celulelor ChR2 + / Nu AP (grup 2) și ChR2- / Nu IPSC (grupul 4) nu va genera semnale electrice care ar putea contribui la activitatea circuitului. Astfel, pentru a defini efectele fotostimulării asupra funcției circuitului, am caracterizat în detaliu proprietățile ChR2 + / AP MSNs (grup 1), care vor genera AP atunci când NAc este fotostimulat și celule ChR2- / IPSC (grupul 3), care sunt postsynaptice la MSN ChR2 + / AP deoarece primesc IPSC-uri induse de lumină. Celulele ChR2 + / AP și ChR2- / IPSC în NAc au fost identificate atât ca neuroni spinoși (Figura (Figure3A) .3A). Nu au existat diferențe semnificative în proprietățile morfologice sau electrofiziologice ale neuronilor în aceste două grupuri. De exemplu, somatele neuronilor din cele două grupuri au fost similare în mărime (Figura (Figure3B) .3B). În plus, RMP-urile lor (-83.0 ± 1.7 vs -85.0 ± 1.8 mV; medie ± sem; n = 10, Figura Figure3C) 3C) și rezistențe de intrare (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, Figura Figure3D) 3D) nu au fost, de asemenea, diferite (p > 0.05 student cu două cozi t-test) în timp ce modelele lor de ardere AP ca răspuns la impulsurile curente (Fig 3E, F) au fost de asemenea similare (p > 0.05 student cu două cozi t-Test, n = 6). In rezumat, fotostimularea D2R-MSNs in NAc activeaza circuitele inhibitorii locali cu neuroni postsynaptici care sunt foarte asemanatori cu D2R-MSNs dar nu exprima D2R.

Stimularea optogenetică a NAc D2R-MSNs în sensibilizarea comportamentală indusă de cocaină

Am examinat în continuare consecințele comportamentale ale lui in vivo fotostimularea NAc D2R-MSNs. Deoarece fotostimularea D2R-MSNs în striat dorsal scade activitatea locomotorie (Kravitz și colab., 2010), am început prin caracterizarea efectelor activării accumbens D2R-MSN asupra activității locomotorii bazale. În acest scop, șoarecii D2R-Cre au fost injectați bilateral cu virus DIO-AAV-ChR2-EYFP în NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSNs au fost apoi fotostimulate cu lumină albastră (473 nm, durata 5 ms puls, 20 Hz) livrate la NAc printr-o fibră optică. Fotostimuli au fost aplicați pe parcursul a patru perioade de durată 3-min în cadrul sesiunii minime 50 atunci când șoarecii au fost păstrați în camera de înregistrare a activității locomotorii (Figura (Figure4A) .4A). În paralel, ca șoareci de control non-Cre WT littermate au fost injectați în mod similar virusul și au primit iluminare simplă a luminii albastre. Șoarecii NAX-ChR2 de la D2-Cre (+) NAc-ChR2 au prezentat un nivel comparabil sau ușor crescut al activității locomotorii bazale în comparație cu șoarecii de control D2R-Cre (-) NAc-ChRXNUMX (Figurile 4B, C). Fotostimularea D2R-MSNs la șoarecii D2-Cre (+) NAc-ChR2 a determinat o scădere semnificativă a activității locomotorii care a revenit după stoparea stimulului luminos (Figura (Figure4B) .4B). Nu s-au observat astfel de efecte la șoarecii de control D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (Figurile 4B, C), indicând faptul că efectele fotostimulării au fost cauzate de activarea ChR2, mai degrabă decât posibilele efecte nespecifice cum ar fi încălzirea țesutului cerebral. Prin urmare, datele noastre au indicat că fotostimularea D2R-MSNs în NAc a provocat o scădere a activității locomotorii.

Aceste rezultate ne-au stabilit abilitatea de a controla activitatea D2R-MSN în cadrul NAc in vivo. Apoi am folosit această capacitate pentru a examina influența activității D2R-MSN asupra sensibilizării comportamentale la administrarea repetată de cocaină. Sensibilizarea comportamentală se referă la procesul care permite o expunere inițială la psihostimulante, cum ar fi cocaina, pentru a spori capacitatea expunerilor ulterioare de medicament pentru a stimula activitatea locomotorie. Acest proces poate fi separat în faze de inițiere și de exprimare: inițierea descrie evenimentele neuronale imediate care induc sensibilizarea comportamentală (Vanderschuren și Kalivas, 2000; Sim și colab., 2013), în timp ce expresia este cunoscută a fi o formă de lungă durată a plasticității comportamentale care persistă după retragerea de droguri (Vanderschuren și Kalivas, 2000; Sim și colab., 2013). Prin urmare, am examinat sensibilizarea comportamentală indusă de cocaină în timpul injecțiilor repetate intraperitoneale (ip) de cocaină, în timp ce am folosit optogenetice pentru a controla activitatea D2R-MSNs în NAc în timpul fiecărei faze.

După obișnuirea cu injecția salină peste zile 3, șoarecii au fost injectați cu cocaină (15 mg / kg) în zile consecutive 5 și răspunsurile locomotorii au fost înregistrate pentru 30 min după fiecare injecție (Figura (Figure5A) .5A). Fotostimulii au fost eliberați în timpul sesiunilor minime 30 înainte de injectarea de cocaină, intercalând perioadele de iluminare 3 min cu perioade 5 min în care lumina a fost oprită (Figura (Figure5A) .5A). Având în vedere că fotostimularea D2R-MSNs în NAc scade activitatea locomotorie bazală (Figura (Figure4), 4), fotostimuli au fost eliberați imediat înainte de administrarea cocainei pentru a evita posibila interferență cu răspunsurile comportamentale la injectarea de cocaină.

Ambii șoareci care au controlat șoarecii D2-Cre (-) NAc-ChR2 și șoarecii D2-Cre (+) NAc-ChR2 au prezentat o creștere marcată a activității locomotorii ca răspuns la injectările repetate de cocaină (Figure5B), 5B), indicând inițierea sensibilizării. Fotostimularea D2R-MSN în NAc nu pare să afecteze inițierea sensibilizării comportamentale, deoarece sensibilizarea comportamentală indusă de cocaină a fost similară la șoarecii D2-Cre (+) NAc-ChR2 și a controlat șoarecii D2-Cre (-) NAc-ChR2.

După inducerea sensibilizării comportamentale prin repetarea unor astfel de injecții de cocaină (15 mg / kg) pentru zilele 5, medicamentul a fost retras pentru zilele 14 și gradul de exprimare a sensibilizării a fost examinat prin provocarea șoarecilor cu o doză mai mică de cocaină (10 mg /kg). Exprimarea sensibilizării este o formă de lungă durată a plasticității comportamentale care persistă după retragerea de droguri (Steketee și Kalivas, 2011; Sim și colab., 2013). Pentru a examina rolul D2R-MSNs în exprimarea sensibilizării, NAc a fost fotostimulat imediat înainte de administrarea cocainei (Figura (Figure5A) 5A) și sensibilizarea a fost măsurată ca fiind cantitatea de activitate locomotorie indusă de injectarea de cocaină.

În ambele grupuri de șoareci pre-tratați cu cocaină de șoareci D2-Cre (-) NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) : coc-coc) - a apărut o expresie a sensibilizării (fig (Figure5C) .5C). Cursul de timp al schimbărilor de locomoție stimulată de cocaină a fost, de asemenea, similar între cele două grupuri (Figura (Figure5C), 5C), fără diferențe semnificative observate între două grupuri. Luate împreună, aceste două experimente fotostimulare indică faptul că activarea D2R-MSN în NAc nu afectează inițierea sau exprimarea sensibilizării comportamentale induse de cocaină.

Fotostimularea NAc D2R-MSNs în timpul retragerii medicamentului

Stresul cronic în timpul retragerii medicamentului după expunerea repetată la cocaină conduce la recrutarea selectivă a unui mecanism de adaptare dependent de D2R care controlează creșterea indusă de stres în comportamentele care caută cocaina și recaderează în asociere cu modificările plasticității sinaptice în NAc (Sim et al. 2013). Acest lucru indică faptul că mecanismele angajate prin retragerea de medicamente sunt diferite de cele implicate în sensibilizarea la medicamente. Prin urmare, am examinat ulterior dacă fotostimularea D2R-MSNs în NAc în timpul retragerii cocainei afectează expresia sensibilizării comportamentale induse de cocaină.

După inducerea sensibilizării comportamentale prin injectarea repetată de cocaină ca mai sus, șoarecii D2-Cre (-) și D2-Cre (+) au fost subdivizați în două grupe pentru perioada de așteptare pentru ziua 14: un grup a fost supus stimulării zilnice cu lumină albastră NAc pentru 1 h (3 min × 8 ori), în timp ce celălalt grup nu a fost (Figura (Figure6A) .6A). Fotostimularea repetată a D2R-MSN în NAc în timpul retragerii cocainei nu a afectat expresia sensibilizării la șoarecii D2-Cre (-) :: coc-coc (Figura (Figure6B) .6B). În contrast, la șoarecii D2-Cre (+) :: coc-coc, expresia sensibilizării a fost semnificativ atenuată prin fotostimularea repetată în timpul retragerii medicamentului (Figura (Figure6B), 6B), deși cursul de timp al stimulării induse de cocaină a locomoției nu a fost afectat (Figura (Figure6C) .6C). Astfel, fotostimularea D2R-MSNs a NAc în timpul retragerii medicamentului a redus expresia sensibilizării comportamentale induse de cocaină (interacțiunea de cocaină x foto-stimulare F_(1,18) = 11.08, P = 0.0037, Figura Figure6B) .6B). Aceste date indică faptul că activarea MSNs D2R-NAc în timpul perioadei de retragere a medicamentului influențează comportamentele care caută cocaina și recadere.

Aceasta lucrare a fost sustinuta de Grantul National al Fundatiei de Cercetare din Coreea (NRF), finantat de catre Ministerul Stiintei, TIC si Planificarea Viitoare de catre Programul de cercetare a creierului (Ja-Hyun Baik, Grant No. 2013M3C7A1056101) si de Bio si Medical Technology Programul de Dezvoltare (către Ja-Hyun Baik, Grant Nr. 2013M3A9D5072550) și programul Institutului de Clasă Mondială (WCI) al Fundației Naționale de Cercetare din Coreea (NRF) finanțat de Ministerul Științei, TIC și Planificarea Viitoare , WCI 2009-003), precum și de către o Grant universitar din Coreea (către Ja-Hyun Baik) și un grant CRP de la Fundația Națională de Cercetare din Singapore (către George J. Augustine).

1. Baik JH (2013). Semnalarea dopaminei în comportamente legate de recompense. Față. Circuite neuronale 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., și colab. (1995). Insuficiența locomotorie de tip parkinsonian la șoarecii care nu au receptori dopaminici D2. Natura 377, 424-428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
3. Berridge KC (2007). Dezbaterea cu privire la rolul de dopamină în recompensă: cazul de stimulare a salienței. Psihofarmacologie (Berl) 191, 391-431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF și colab. (2013). Îmbunătățirea căii indirecte acumulate promovează rezistența la utilizarea compulsivă a cocainei. Nat. Neurosci. 16, 632-638 10.1038 / nn.3369 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., și colab. (2013). Cocaina dezinhibă neuronii dopaminergici prin potențarea transmiterii GABA în zona tegmentală ventrală. Știință 341, 1521-1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovic M., Wolf ME (2007). Receptorii receptorului AMPA la nivelul nucleului accumbens de șobolan cresc în timpul retragerii cocainei, dar se internalizează după provocarea cu cocaină în asociere cu activarea modificată a protein kinazelor activate de mitogen. J. Neurosci. 27, 10621-10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Sensibilizarea comportamentală față de cocaină este asociată cu creșterea expresiei suprafeței receptorului AMPA în nucleul accumbens. J. Neurosci. 25, 9144-9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH și colab. (2013). Optogenetic inhibarea D1R care conțin nucleul accumbens neurons modifică cocaina-mediată de reglementare a Tiam1. Față. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
9. Chang HT, Kitai ST (1985). Neuronii de proiecție ai nucleului accumbens: un studiu de etichetare intracelulară. Brain Res. 347, 112-116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
10. Chausmer AL, Elmer GI, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Activitatea locomotorie indusă de cocaină și discriminarea cu cocaină la șoarecii mutanți ai receptorului dopaminic D2. Psihofarmacologie (Berl) 163, 54-61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Dezinhibarea ca proces de bază în exprimarea funcțiilor striatale. Tendințe Neurosci. 13, 277-280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Transmitere rapidă sinaptică între neuronii proiecției striate striate. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 99, 15764-15769 10.1073 / pnas.242428599 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., și colab. (2011). Inhibarea neuronală tranzitorie dezvăluie rolurile opuse ale căilor indirecte și directe în sensibilizare. Nat. Neurosci. 14, 22-24 10.1038 / nn.2703 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
14. Goto Y., Grace AA (2005). Modularea dopaminergică a unității limbic și corticale a nucleului accumbens în comportamentul orientat spre țintă. Nat. Neurosci. 8, 805-812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
15. Grofová I. (1975). Identificarea neuronilor striatali și pallidali care se proiectează la substantia nigra. Un studiu experimental prin intermediul transportului axonal retrograd al peroxidazei de hrean. Brain Res. 91, 286-291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). ΔFosB modulează în mod diferențial funcția nucleului accumbens direct și indirect. Proc. Natl. Acad. Sci. Statele Unite ale Americii 110, 1923-1928 10.1073 / pnas.1221742110 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). O analiză comparativă a tensiunii și a curentului-clemă a feedback-ului și a transmisiei sinaptice feed-forward în microcircuit striatal in vitro. J. Neurophysiol. 95, 737-752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Roluri distincte ale transmisiei sinaptice în căile directe și indirecte ale striatalelor pentru a recompensa și comportamentul aversiv. Neuron 66, 896-907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Efectul tratamentului acut și zilnic asupra cocainei asupra dopaminei extracelulare în nucleul accumbens. Synapse 5, 48-58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Un rol de sensibilizare în dorința și recaderea în dependența de cocaină. J. Psychopharmacol. 12, 49-53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Compararea IPSC-urilor evocate de neuronii spinoși și rapid-spiking în neostriatum. J. Neurosci. 24, 7916-7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Experiența cocainei controlează plasticitatea sinaptică bidirecțională în nucleul accumbens. J. Neurosci. 27, 7921-7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., și colab. (2010). Reglarea comportamentelor motorii parkinsoniene prin controlul optogenetic al circuitelor ganglionare bazale. Natura 466, 622-626 10.1038 / nature09159 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Roluri distincte pentru neuronii striatali direcți și indirecți în armare. Nat. Neurosci. 15, 816-818 10.1038 / nn.3100 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Striatal plasticitate și funcția circuitului ganglionului bazal. Natura 60, 543-554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
26. Le Moine C., Bloch B. (1996). Exprimarea receptorului de dopamină D3 în neuronii peptidergici ai nucleului accumbens: comparație cu receptorii dopaminergici D1 și D2. Neuroștiință 73, 131-143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., și colab. (2010). Pierderea specifică a tipului de celule de semnalizare BDNF imită controlul optogenetic al recompensei de cocaină. Știință 330, 385-390 10.1126 / science.1188472 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Actul de echilibrare striatală în dependența de droguri: roluri distincte ale căilor directe și indirecte ale neuronilor medii spinoși. Față. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
29. Lüscher C., Malenka RC (2011). De la medicamente, plasticitatea sinaptică în dependență: de la modificările moleculare la remodelarea circuitelor. Neuron 69, 650-663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Proprietățile fiziologice și morfologice ale neuronilor nucleului accumbens și cochiliei înregistrate in vitro. Synapse 13, 135-160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Inversarea potențării sinaptice evocate de cocaină restabilește comportamentul adaptiv indus de medicamente. Natura 481, 71-75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
32. Preston RJ, Episcopul GA, Kitai ST (1980). Proiecția neuronilor spinoși medii de la neostriat de șobolan: un studiu intracelular de peroxidază de hrean. Brain Res. 183, 253-263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Baza neurală a poftei de droguri: o teorie de stimulare-sensibilizare a dependenței. Brain Res. Brain Res. Rev. 18, 247-291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Dependenta. Annu. Rev. Psychol. 54, 25-53 10.1146 / anurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Neuroadaptările induse de cocaină în transmisia de glutamat: ținte terapeutice potențiale pentru poftă și dependență. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35-75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
36. Sesack SR, Grace AA (2010). Corpul rețelei de recompensare a ganglionilor cortico-bazali: microcircuit. Neuropsihopharmacologie 35, 27-47 10.1038 / npp.2009.93 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL și colab. (2013). Rolul receptorilor de dopamină D2 în plasticitatea comportamentelor dependente de stres induse. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Adapțiile induse de cocaină în neuronii D1 și D2 accumbens (o dihotomie care nu este neapărat sinonimă cu căile directe și indirecte). Curr. Opin. Neurobiol. 23, 546-552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). De droguri care doresc: sensibilizare comportamentale și recidiva la comportamentul de căutare de droguri. Pharmacol. Rev. 63, 348-365 10.1124 / pr.109.001933 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). Conexiunile colaterale recurente ale neuronilor spirali medii striatali sunt perturbate în modelele de boală Parkinson. J. Neurosci. 28, 5504-5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
41. Taverna S., van Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Dovezi fiziologice directe pentru conectivitatea sinaptică între neuronii spini de dimensiune medie în nucleul accumbens de șobolan in situ. J. Neurophysiol. 91, 1111-1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplasticitatea în sistemul mezolimbic de dopamină și dependența de cocaină. Br. J. Pharmacol. 154, 327-342 10.1038 / bjp.2008.77 [Articol gratuit PMC] [PubMed] [Cross Ref]
43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Inhibitorii interacțiunilor dintre neuronii de proiecție spinoși în striatum de șobolan. J. Neurophysiol. 88, 1263-1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Alterarea transmiterii dopaminergice și glutamatergice în inducerea și exprimarea sensibilizării comportamentale: o analiză critică a studiilor preclinice. Psihofarmacologie (Berl) 151, 99-120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Structura fină și conexiunea sinaptică a neuronului spinal comun al neostriatului de șobolan: un studiu care utilizează injecția intracelulară de peroxidază de hrean. J. Comp. Neural. 194, 599-615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]

• Wise RA (2004). Dopamina, învățarea și motivația. Nat. Rev. Neurosci. 5, 483-494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]