Decodificarea circuitelor neuronale care controlează solicitarea de zahăr compulsiv (2015) (MECANISMUL BINGE)

Pentru a identifica neuronii LH care furnizează input monosinaptic la VTA in vivo și pentru a le observa activitatea în timpul comportamentelor în mișcare liberă, am folosit o strategie cu dublu virus pentru a exprima selectiv channelrhodopsin-2 (ChR2) în neuronii LH care furnizează input monosinaptic la VTA (Cifrele 1A și S1). Am injectat un vector viral adeno-asociat (AAV₅) purtând ChR2-eYFP într-un cadru de citire deschis dublu inversat (DIO) dependent de Cre-recombinază în LH pentru a infecta somata locală și a injectat un virus herpes simplex (HSV) care călătorește retrograd purtând Cre-recombinaza în VTA. Recombinarea ulterioară a permis expresia opsinei și fluoroforului în mod selectiv în neuronii LH care furnizează intrare monosinaptică la VTA. Pentru a confirma abordarea noastră, am efectuat înregistrări ex vivo cu patch-clamp cu celule întregi în felii orizontale de creier care conțin LH și înregistrate din neuronii care exprimă ChR2-eYFP, precum și neuronii LH vecini care au fost negativi pentru ChR2-eYFP (figura 1B). Latențele vârfurilor evocate de lumină, măsurate de la debutul pulsului de lumină până la vârful potențialului de acțiune, au variat între 3-8 ms (figura 1C). De asemenea, am constatat că niciuna dintre celulele neexprimatoare (ChR2-negative) înregistrate nu a prezentat răspunsuri excitatoare la fotostimulare (n = 14; figura 1C), în ciuda apropierii lor de celulele care exprimă ChR2.

Pentru a efectua fotoidentificare mediată optogenetic in vivo, un optrod a fost implantat în LH pentru a înregistra activitatea neuronală în timpul unei sarcini de căutare a zaharozei. În aceeași sesiune de înregistrare, am furnizat mai multe modele de fotostimulare pentru a identifica neuronii LH-VTA care exprimă ChR2 (Cifrele 1D și S1). Am examinat distribuția latențelor fotorăspunsului excitator în toți neuronii LH care afișează o schimbare blocată în timp a ratei de declanșare ca răspuns la iluminare și am observat o distribuție bimodală (figura 1E). Am observat o populație de neuroni în timpul înregistrărilor in vivo cu latențe într-un interval de 3-8 ms. Acesta a fost identic cu intervalul de latență găsit în neuronii LH-VTA care exprimă ChR2 când am înregistrat ex vivo. Am numit aceste unități unități de „tip 1” (Cifrele 1C, 1E și 1F). În plus, a existat o populație distinctă de celule cu latențe fotorăspuns de aproximativ 100 ms (Cifrele 1E și 1G) și am numit aceste unități de „Tip 2”. Am observat, de asemenea, neuroni care au fost inhibați ca răspuns la fotostimularea neuronilor LH-VTA (Figura S2), și am numit aceste unități de „Tip 3”. Am comparat durata potențialului de acțiune (măsurată de la vârf la minim) și ratele medii de tragere ale unităților de tip 1 și tip 2, precum și ale celor care nu au prezentat un răspuns foto (figura 1H). Distribuția duratelor potențialului de acțiune de tip 1 (figura 1I) și tipul 2 (figura 1J) unități arată că majoritatea unităților de tip 1 au o durată potențial de acțiune mai mică de 500 μs (84%; n = 16/19, distribuție binomială, p = 0.002).

Deși unitățile de tip 1 se potrivesc criteriilor standard pentru a fi clasificate ca exprimând ChR2 (Cohen și colab., 2012, Zhang și colab., 2013), nu a fost clar dacă fotorăspunsul cu latență mai lungă a unităților de tip 2 a indicat neuronii care exprimă ChR2 care au răspuns. mai lent la fotostimulare sau dacă acest efect s-a datorat activității rețelei. Având în vedere că neuronii LH care exprimă ChR2 (Tip 1) se proiectează direct la VTA, o posibilitate a fost ca neuronii de tip 2 să primească feedback de la VTA (figura 1K). O altă posibilitate a fost ca neuronii de tip 2 să fie activați de colateralele axonilor de la neuronii de tip 1 (figura 1L). Pentru a diferenția între aceste două modele posibile de circuite, am inhibat VTA împreună cu fotoidentificarea în LH.

Pe baza modelelor noastre de circuit, ne-am aștepta ca inhibarea distală să nu aibă niciun efect asupra fotorăspunsurilor neuronilor LH care exprimă ChR2. Cu toate acestea, dacă fotoresponsivi, dar neexprimanți, neuronii LH s-au bazat pe feedback-ul de la VTA pentru a provoca un răspuns blocat în timp la iluminare (figura 1K), ne-am aștepta la o atenuare a fotorăspunsurilor în acești neuroni la inhibarea VTA. Am exprimat ChR2 în celulele LH-VTA ca mai sus, dar de această dată am exprimat și halorhodopsina îmbunătățită 3.0 (NpHR) în VTA și am implantat o fibră optică în VTA în plus față de optrodul din LH (figura 2A). Am livrat aceleași modele de iluminare cu lumină albastră în LH pentru toate cele trei epoci, dar am fotoinhibat VTA cu lumină galbenă în a doua epocă (figura 2A).

Fotorăspunsurile unităților de tip 1 la iluminarea cu lumină albastră în LH nu au fost afectate de fotoinhibarea VTA, care este în concordanță cu expresia ChR2 în neuronii LH-VTA de tip 1 (figura 2B). În schimb, majoritatea unităților de tip 2 (87%; n = 13/15, distribuție binomială, p = 0.004) au arătat o atenuare semnificativă a fotorăspunsurilor la impulsurile de lumină albastră furnizate în LH la fotoinhibarea neuronilor VTA. Răspunsurile unităților de tip 1 și tip 2 în timpul fotoinhibării VTA au fost semnificativ diferite (chi-pătrat = 7.64, p = 0.0057; Cifrele 2B și 2C). Aceste diferențe pot fi observate și în scorurile Z max în timpul epocilor individuale (figura 2D) și cu epoca galben-ON normalizată la epoca galben-OFF (figura 2E). Aceste date sugerează că neuronii LH de tip 2 primesc input (direct sau indirect) de la VTA (figura 1K) mai degrabă decât prin colaterale axonilor locale (figura 1L).

După ce am identificat aceste două tipuri distincte de neuroni LH în bucla LH-VTA, am vrut să examinăm activitatea neuronală care apare în mod natural în timpul unei sarcini de autoadministrare a zaharozei (figura 3A). Șoarecii au fost antrenați să efectueze răspunsuri la nas pentru un indiciu care prezice livrarea de zaharoză într-un port adiacent (ca în Tye și colab., 2008). Pentru a ne permite să diferențiem răspunsurile neuronale la nosepoke și cue, tacul și zaharoza au fost livrate pe un program parțial de întărire, în care 50% din nosepokes au fost asociate cu un tac și livrare de zaharoză.

Unitățile de tip 1 au prezentat răspunsuri fazice la intrarea în portul de zaharoză, așa cum se vede într-o unitate reprezentativă de tip 1 (figura 3B), precum și datele populației pentru toate unitățile de tip 1 (figura 3C). Cu toate acestea, răspunsurile fazice ale unităților de tip 2 au reflectat în principal răspunsuri la indiciul predictiv de recompensă (Cifrele 3D și 3E). Tiparele de declanșare normalizate ale tuturor neuronilor înregistrați (n = 198, împărțiți în unități de tip 1, 2, 3 și neresponsive) sunt afișate pentru fiecare componentă a sarcinii: nosepokes asociate cu tacul, nosepokes în absența tacului și intrare port zaharoză (figura 3F). Toate unitățile de tip 1 care au prezentat modificări fazice relevante pentru sarcină (74%; n = 14/19) au fost fie excitate fazic, fie inhibate de intrarea în portul de zaharoză, un număr mic arătând, de asemenea, inhibarea fazică a indiciului predictiv de recompensă (Cifrele 3B, 3C și 3G). În contrast, unitățile de tip 2 au fost mai eterogene, neuronii care răspund la sarcină codifică tacul selectiv (35%), intrarea în portul de zaharoză în mod selectiv (26%) sau ambele tac și intrarea în portul (12%); Cifrele 3D, 3E și 3H). Pentru a ilustra puterea răspunsurilor unităților de tip 1 și tip 2 la evenimente legate de sarcini, am trasat fiecare celulă pe un grafic tridimensional în funcție de scorul Z (figura 3I). Pentru a arăta distribuția modificărilor fazice în declanșare la mai multe evenimente legate de sarcini la nivel calitativ, am trasat numărul de celule din fiecare tip de fotorăspuns care se încadrează într-o anumită categorie (figura 3J).

Având în vedere rolul bine definit al VTA în eroarea de predicție a recompensei (de exemplu, reducerea fazică a declanșării neuronului DA ca răspuns la omisiunea neașteptată a unei recompense și excitația fazică ca răspuns la livrarea neașteptată a recompensei) (Schultz și colab., 1997), am investigat dacă neuronii LH ar codifica omisiunea neașteptată a unei recompense de zaharoză. Pentru a face acest lucru, am înregistrat activitatea neuronală a neuronilor fotosensibili în timpul aceleiași sarcini de recompensă la animale bine antrenate, dar am omis aleatoriu 30% din livrările de zaharoză în urma indiciului (figura 4A).

Majoritatea unităților de tip 1 (88%; n = 15/17, distribuție binomială, p = 0.001) au fost insensibile la omisiune de recompensă (Cifrele 4B și 4D), în timp ce un subset mare de unități de tip 2 (67%; n = 12/18) a arătat un răspuns semnificativ diferit la studiile prezentate cu recompensă și cele omise de recompensă (Cifrele 4C și 4D). Am ajuns la concluzia că neuronii LH-VTA (Tip 1) au codificat acțiunea de a intra în port, deoarece aceste răspunsuri la intrarea în port au fost persistente chiar și la omiterea recompensei (figura 4D), spre deosebire de unitățile de tip 2 (chi-pătrat = 10.9804, p = 0.0009).

Pentru a determina dacă răspunsurile de tip 1 la intrarea în port codificau cu adevărat răspunsul condiționat (CR), spre deosebire de comportamentul general de căutare a recompensei sau de explorare, am înregistrat la șoareci neantrenați care nu au dobândit încă sarcina. La șoarecii naivi cu sarcini, am livrat zaharoză în port în absența unui indiciu predictiv (livrare neprevăzută a recompensei) și am constatat că unitățile de tip 1 nu au arătat răspunsuri fazice la intrarea în port (Cifrele 4E, 4F și 4I), în concordanță cu modelul conform căruia neuronii de tip 1 codifică CR (figura 4J).

Apoi, pentru a determina dacă activitatea unității de tip 2 este în concordanță cu un profil de răspuns asemănător erorii de predicție a recompensei, am înregistrat, de asemenea, acești neuroni la animale bine antrenate în timpul livrării recompensei neprevăzute (figura 4G). Am descoperit că un subset de unități de tip 2 au răspuns la livrările neprevăzute de zaharoză (50%; Cifrele 4G–4I). Luate împreună, subseturile de unități de tip 2 sunt sensibile la omiterea neașteptată a recompensei (Cifrele 4C și 4D) și livrarea recompenselor neprevăzute (Cifrele 4G–4I), în concordanță cu un profil de răspuns asemănător erorii de predicție a recompensei.

După cum am arătat mai sus, unitățile de tip 1 reprezintă o corelație neuronală a CR. Este important că creșterea ratei de tragere începe înainte de CR, crescând până la finalizarea CR (Cifrele 3B, 3C și 4B). Pentru a determina dacă activarea căii LH-VTA ar putea promova CR, am vrut să testăm capacitatea activării LH-VTA în conducerea CR în fața unei consecințe negative. La șoarecii de tip sălbatic, am exprimat ChR2-eYFP sau eYFP singur în corpurile celulare LH și am implantat o fibră optică peste VTA (Cifrele 5A și S4). În schimb, pentru a testa rolul căii LH-VTA în medierea CR sau a comportamentelor legate de hrănire, am exprimat bilateral NpHR-eYFP sau eYFP singur în celulele LH și am implantat o fibră optică deasupra VTA (Cifrele 5A și S4).

Am proiectat o sarcină de condiționare pavloviană în care șoarecii lipsiți de hrană trebuiau să traverseze o rețea de șoc pentru a recupera o recompensă de zaharoză (figura 5B). În prima epocă „de bază” (cu grila de șoc oprită), am verificat că fiecare șoarece a dobândit sarcina de abordare condiționată pavloviană. În a doua epocă („Șoc”), grila de șoc a produs șocuri ușoare ale picioarelor în fiecare secundă. În cele din urmă, în a treia epocă („Soc+Light”), am continuat să furnizăm șocuri pentru picioare, dar și terminale LH iluminate în VTA cu lumină albastră (10 Hz) la șoareci care exprimă ChR2 și controale eYFP potrivite și lumină galbenă (constantă) pentru șoarecii care exprimă NpHR și controalele lor eYFP (figura 5B).

Am observat un număr semnificativ mai mare de intrări de port per tac în timpul epocii Shock+Light și un scor semnificativ mai mare de diferență (Shock+Light epoch - Shock-only epoch) la șoarecii ChR2 în comparație cu șoarecii eYFP (figura 5C și Filmul S1). În schimb, fotoinhibarea căii LH-VTA a dus la o reducere semnificativă a intrărilor de port per indiciu și a scorurilor diferențelor la șoarecii NpHR față de șoarecii eYFP (figura 5D și Filmul S2). Experimentele de extincție în cadrul sesiunii, în timpul cărora prezentările de indici nu au fost urmate de livrări de zaharoză, au arătat tendințe similare în vigoare (Figura S4).

Foarte important, am vrut să determinăm dacă modificările în căutarea de zaharoză pe care le-am obținut au fost cauzate de schimbări în comportamentul legat de hrănire sau de sensibilitatea la durere. Am observat că fotoactivarea proiecției LH-VTA a crescut semnificativ timpul petrecut hrănirea la șoarecii bine hrăniți din grupul ChR2 (figura 5E). Cu toate acestea, fotoinhibarea căii LH-VTA nu a redus semnificativ hrănirea (figura 5F), chiar dacă aceste animale au fost lipsite de hrană pentru a spori capacitatea noastră de a detecta o reducere în raport cu epoca de referință (comparativ cu animalele săturate din figura 5E). Nici în ChR2 (figura 5G) nici grupul NpHR (figura 5H) am observat o diferență în latența la retragerea cozii din apa fierbinte (Ben-Bassat și colab., 1959, Grotto și Sulman, 1967), ceea ce indică faptul că manipularea proiecției LH-VTA nu a alterat analgezia.

Pentru a studia compoziția componentelor de transmisie rapidă a intrărilor LH la VTA care declanșau aceste efecte, am efectuat înregistrări de patch-clamp cu celule întregi de la neuronii VTA într-o pregătire acută a feliei în timp ce activăm optic intrările LH care exprimă ChR2-eYFP (Cifrele 6A și S5). Având în vedere că există o eterogenitate bine stabilită în VTA, incluzând ~ 65% neuroni DA, ~ 30% neuroni GABA și ~ 5% neuroni glutamat (Margolis și colab., 2006, Nair-Roberts și colab., 2008, Yamaguchi și colab. al., 2007), am umplut celulele cu biocitină în timpul înregistrării pentru a permite identificarea tipului de celule utilizând imunohistochimie post-hoc pentru tirozin hidroxilază (TH; figura 6B), pe lângă înregistrarea curentului cationic activat de hiperpolarizare (I_h) și cartografierea locației celulei (Cifrele 6Grup S5).

În primul rând, am înregistrat în clemă de curent în timpul fotostimularii intrărilor de LH care exprimă ChR2 și am observat că 23 din 27 de neuroni au prezentat un răspuns blocat în timp la fotostimularea intrărilor de LH (figura 6C). Majoritatea neuronilor DA eșantionați în VTA au primit un aport excitator net de la LH (56%), în timp ce un alt subset a prezentat inhibare netă (30%; figura 6C). Distribuția spațială a acestor neuroni DA este mapată pe un atlas pentru felii orizontale care conțin VTA (figura 6D).

Pentru a stabili contribuția monosinaptică a intrărilor LH la neuronii VTA DA, am folosit cartografierea circuitelor asistate de ChR2, în care înregistrările cu clemă de tensiune au fost efectuate în prezența tetrodotoxinei (TTX) și a 4-aminopiridinei (4AP; Petreanu și colab., 2007) . În concordanță cu observațiile noastre din înregistrările curent-clamp, am observat că majoritatea neuronilor VTA DA înregistrați au primit exclusiv input monosinaptic excitator de la LH (67%), în comparație cu neuronii VTA DA care au primit exclusiv input monosinaptic inhibitor (11%) sau ambele (22%; Cifrele 6E și S6).

Am identificat neuronii VTA GABA prin injectarea unui fluorofor dependent de Cre (AAV₅-DIO-mCherry) în VTA de șoareci VGAT::Cre și a utilizat expresia mCherry pentru a direcționa înregistrarea neuronilor VTA GABA (n = 24; figura 6F). Patruzeci și șase la sută dintre neuronii VTA GABA au răspuns cu excitație netă, în timp ce 54% au răspuns cu inhibiție netă, la fotostimularea intrărilor LH care exprimă ChR2 (figura 6G). Distribuția spațială a acestor celule este prezentată în figura 6H. La examinarea inputului monosinaptic din LH (așa cum este descris mai sus), am constatat că 18% dintre neuronii GABA prelevați au primit input exclusiv excitator și 9% au primit input exclusiv inhibitor (figura 6I). Cu toate acestea, în raport cu neuronii VTA DA, am constatat că mai mulți neuroni VTA GABA au primit atât GABA excitator mediat de AMPAR, cât și inhibitor._AIntrare monosinaptică mediată de R din LH (73%; chi-pătrat = 5.0505, p = 0.0246; Cifrele 6eu si S6).

Având în vedere că înregistrările noastre ex vivo au furnizat dovezi care susțin o contribuție robustă atât de la proiecțiile LH GABAergice, cât și cele glutamatergice către VTA, apoi am analizat rolul fiecărei componente în mod independent. Pentru a face acest lucru, am folosit linii de șoarece transgenice care exprimă Cre-recombinaza în neuroni care au exprimat fie transportorul vezicular de glutamat 2 (VGLUT2) fie transportorul vezicular GABA (VGAT). Am injectat AAV₅-DIO-ChR2-eYFP sau AAV₅-DIO-eYFP în LH la șoareci VGLUT2::Cre și VGAT::Cre și a implantat o fibră optică peste VTA (Figura S7). Aceste animale au fost apoi efectuate pe fiecare dintre testele comportamentale prezentate în figura 5.

Nu am observat diferențe detectabile în numărul de intrări de porturi făcute pe indiciu între șoarecii care exprimă ChR2 sau eYFP în LH^saturare-proiecție VTA (figura 7A) sau în LH^GABA-proiecție VTA (figura 7B). Cu toate acestea, la analiza video, am observat comportamente aberante de roadere în LH^GABA-VTA:Grupul ChR2 la iluminarea cu lumină albastră (vezi Filme S3 și S4). În LH^saturare-Șoarecii VTA, deși a existat o tendință către o reducere a hrănirii prin fotostimulare în grupul ChR2 comparativ cu grupul eYFP, aceasta nu a fost semnificativă statistic (figura 7C). În schimb, am observat o creștere puternică a timpului petrecut hrănindu-se la șoarecii săturați la iluminare în LH.^GABA-VTA:grupul ChR2 în raport cu martorii (figura 7D și Filmul S3). La niciunul dintre grupurile de animale nu a existat un efect de stimulare a luminii în testul de retragere a cozii (Cifrele 7E și 7F).

În timpul sarcinii de hrănire, așa cum am făcut și în timpul sarcinii de căutare a zaharozei, am observat din nou secvențe motorii aberante legate de hrănire care nu erau îndreptate către alimente. Am filmat un șoarece reprezentativ în LH^GABA-VTA:Grupul ChR2 într-o cameră transparentă goală, iar la fotostimulare de 20 Hz, am observat secvențe motorii apetitive neobișnuite, cum ar fi linsul și roaderea podelei sau spațiului gol (Filmul S4). Am cuantificat aceste comportamente de „rângere” în timpul sarcinii de hrănire în LH-VTA de tip sălbatic (figura 7G), LH^saturare-VTA (figura 7H) și LH^GABA-VTA (figura 7I) grupează și a arătat că LH^GABA-VTA:Șoarecii ChR2 au roade mai mult decât cei de tip sălbatic sau LH^saturare-VTA:șoarecii ChR2 atunci când sunt fotostimulați, în comparație cu grupurile lor respective eYFP (figura 7J). Am luat în considerare dacă comportamentele aberante legate de hrănire ar putea fi separate de hrănirea direcționată corespunzător la frecvențe mai mici. Cu toate acestea, când am testat LH^GABA-VTA:Grupul ChR2 cu trenuri de lumină albastră de 5 Hz și 10 Hz, am observat o relație proporțională între frecvența stimulării și atât hrănire, cât și roadă (figura 7K).

Proiecția LH la VTA a fost explorată cu studii de coliziune cu stimulare electrică (Bielajew și Shizgal, 1986) și s-a emis de multă vreme ipoteza că joacă un rol în procesarea recompensei (Hoebel și Teitelbaum, 1962, Margules și Olds, 1962), totuși evidențiind acest lucru. rolul a fost o provocare. Aici, oferim o disecție detaliată a modului în care componentele individuale ale buclei LH-VTA procesează diferite aspecte ale unei sarcini legate de recompensă.

Prin utilizarea fotoetichetării mediate de optogenetic (figura 1), am identificat două populații separate de neuroni LH: celule care trimit proiecții către VTA (Tipul 1) și celulele care primesc feedback de la VTA (Tipul 2; figura 2) - deși aceste populații nu trebuie să se excludă reciproc, deoarece este posibil ca neuronii LH să trimită și să primească intrări către și de la VTA. Interesant, am descoperit că relativ puțini neuroni fotoresponsivi au căzut în afara distribuției bimodale care încapsulează aceste două populații (Cifrele S2Grup 1E). Având în vedere acest lucru, în combinație cu întârzierea lungă a latenței în fotorăspunsurile de tip 2 (~100 ms), speculăm că ar putea exista o cale dominantă care să contribuie la activitatea neuronilor de tip 2. În plus, deoarece DA leagă receptorii cuplați cu proteina G, cinetica este mai lentă decât majoritatea sinapselor glutamatergice (Girault și Greengard, 2004) și poate explica acest grup de unități fotoresponsive cu latență de 100 ms. Este, de asemenea, posibil ca VTA să furnizeze feedback indirect prin alte regiuni distale, prin regiuni intermediare excitatoare, cum ar fi amigdala, sau cu dezinhibare prin nucleul accumbens (NAc) sau nucleul pat al striei terminale (BNST).

Interesant, în timp ce fotostimularea unităților de tip 1 evocă răspunsuri excitatorii în unitățile de tip 2, unitățile de tip 1 și 2 prezintă proprietăți de codificare comportamentale distincte. De exemplu, numerele de unități de tip 1 și tip 2 care codifică selectiv indiciul predictiv de recompensă sunt semnificativ diferite (n = 0/19 de tip 1 față de n = 12/34 de tip 2, chi-pătrat = 8.67, p = 0.003) . Acest model de răspuns paradoxal s-ar putea datora proceselor de calcul la un element de circuit intermediar, cum ar fi VTA, care poate juca un rol activ în timpul sarcinii comportamentale, dar inactiv în timpul fotoetichetării. În plus, starea comportamentală a animalului ar putea influența modul în care sunt procesate aceste date.

Experimentele noastre de omisiune de recompensă ne-au permis să distingem între codificarea neuronală LH a CR și consumul de stimul necondiționat (SUA). În aceste experimente, un subset de unități de tip 2 a răspuns la indicația predictivă a recompensei (CS) și SUA și, de asemenea, a arătat o scădere a ratei de tragere atunci când recompensele așteptate au fost omise. În plus, un subset de unități de tip 2 prezintă, de asemenea, excitație fazică la livrarea neașteptată a recompensei (Cifrele 4G și 4H). Aceste date amintesc de modul în care neuronii DA din VTA codifică eroarea de predicție a recompensei (Cohen și colab., 2012, Schultz și colab., 1997). Noi speculăm că neuronii VTA pot transmite semnale de eroare de predicție a recompensei unui subset de neuroni LH, care sunt bine poziționați pentru a integra aceste semnale pentru determinarea unei ieșiri comportamentale adecvate. Mai exact, LH este puternic interconectată cu o multitudine de alte zone ale creierului (Berthoud și Münzberg, 2011) și a fost legată cauzal de stări homeostatice, cum ar fi somnul/excitarea și foamea/sațietatea (Carter și colab., 2009, Jennings și colab. , 2013).

Comportamentul compulsiv de căutare a recompensei a fost discutat în primul rând în contextul dependenței de droguri, în care o paradigmă clasică pentru căutarea compulsivă de droguri a fost examinarea gradului în care comportamentul de căutare de droguri persistă în fața unei consecințe negative, cum ar fi șocul piciorului. (Belin și colab., 2008, Pelloux și colab., 2007, Vanderschuren și Everitt, 2004). Am adaptat această sarcină pentru căutarea zaharozei pentru a ne permite să investigăm dacă activarea căii LH-VTA a fost suficientă pentru a promova căutarea compulsivă a zaharozei. Având în vedere că o diferență distinctă între droguri și recompensa naturală este că recompensele pentru droguri nu sunt necesare pentru supraviețuire, există controverse cu privire la comportamentele care ar constitui un comportament compulsiv de sucroză sau de căutare de hrană. O interpretare alternativă a datelor noastre este că activarea căii LH-VTA pur și simplu crește impulsul motivațional sau impulsul de a căuta întăritori apetitivi. Pe măsură ce ratele de obezitate au crescut în ultimele decenii (Mietus-Snyder și Lustig, 2008), supraalimentarea compulsivă și dependența de zahăr sunt afecțiuni predominante care reprezintă o amenințare majoră pentru sănătatea umană (Avena, 2007). Comportamentul de hrănire la șoarecii săturați (hrăniți complet) după activarea căii LH-VTA amintește de comportamentele alimentare observate la oamenii diagnosticați cu tulburare de supraalimentare compulsivă (sau tulburare de alimentație excesivă) (DSM-V).

S-a propus că acțiunile repetate duc la formarea de obiceiuri, care ele însele duc la căutarea compulsivă a recompensei care caracterizează dependența (Everitt și Robbins, 2005). Descoperirea noastră că neuronii LH-VTA codifică doar intrarea în port după condiționare sugerează că această cale codifică selectiv un răspuns condiționat, nu doar o acțiune motivată. Acest lucru este în concordanță cu observațiile noastre conform cărora activarea optică a acestei proiecții poate promova căutarea compulsivă a recompensei în fața unei consecințe negative (figura 5C), precum și în absența necesității (așa cum se vede la șoarecii săturați, figura 5E). Această interpretare este confirmată în continuare de descoperirea noastră că fotoinhibarea căii LH-VTA reduce selectiv căutarea compulsivă a zaharozei (figura 5D) dar nu reduce hrănirea la șoarecii cu restricții alimentare (figura 5F). Una dintre cele mai mari provocări în tratarea supraalimentării compulsive sau a tulburărilor de alimentație excesivă este riscul de a afecta comportamentele de hrănire în general. Dintr-o perspectivă translațională, este posibil să fi identificat un circuit neuronal specific ca o țintă potențială pentru dezvoltarea intervențiilor terapeutice pentru supraalimentarea compulsivă sau dependența de zahăr, fără a sacrifica comportamentele naturale de hrănire.

Arătăm că, pe lângă o componentă glutamatergică LH-VTA (Kempadoo et al., 2013), există și o componentă GABAergic semnificativă în proiecție (Leinninger și colab., 2009) și că neuronii LH sinapsează direct atât pe DA, cât și pe DA. Neuronii GABA din VTA (figura 6). Cu toate acestea, există o diferență în echilibrul aportului excitator/inhibitor asupra neuronilor VTA DA și GABA.

În timp ce am folosit procesarea imunohistochimică pentru a verifica identitatea neuronilor VTA, am măsurat, de asemenea, I_h, un curent de cationi nespecific, activat de hiperpolarizare, redresând interior (Lacey et al., 1989, Ungless și Grace, 2012). Prezența acestui curent a fost utilizată pe scară largă în studiile electrofiziologice pentru identificarea neuronilor DA, dar s-a dovedit a fi prezentă numai în subpopulații de neuroni DA, delimitate de ținta de proiecție (Lammel et al., 2011). Deși anterior a fost propus într-o revizuire de către Fields și colegii săi că „neuronii LH sinapsează pe proiecțiile VTA către PFC, dar nu pe cei care se proiectează către NAc” (Fields et al., 2007), datele noastre sugerează că această controversă trebuie redeschisă. pentru investigatii suplimentare. Chiar dacă am observat un subset de neuroni DA care au primit excitație netă de la LH și care poseda un I foarte mic_h (în concordanță cu neuronii DA care proiectează învelișul medial mPFC- sau NAc), am observat, de asemenea, un subset de neuroni DA care au primit input excitator net și au arătat un I mare._h (în concordanță cu caracteristicile neuronilor DA care se proiectează către învelișul lateral al NAc; Figura S5; Lammel et al., 2011). În schimb, neuronii VTA DA care au primit un input inhibitor net au prezentat un I foarte mic_h sau nu a avut acest curent, ceea ce este în concordanță cu noțiunea că LH trimite o intrare predominant inhibitoare asupra neuronilor VTA DA care se proiectează către mPFC sau învelișul medial al NAc. De asemenea, arătăm că intrările LH pot fi observate atât în ​​VTA medial, cât și în lateral, ceea ce sugerează că LH oferă intrări pe neuronii VTA cu diverse ținte de proiecție, deoarece se știe că ținta de proiecție VTA corespunde oarecum locației spațiale de-a lungul unei axe medial-laterale ( Lammel et al., 2008).

Rolul căii LH-VTA în promovarea recompensei a fost anterior atribuit transmiterii glutamatergice în VTA (Kempadoo și colab., 2013), deoarece promotorul CaMKIIα este adesea considerat a fi selectiv pentru neuronii de proiecție excitatorie. Cu toate acestea, datele noastre arată în mod clar că exprimarea ChR2 sub controlul promotorului CaMKIIα vizează și neuronii de proiecție GABAergici din LH (figura 6).

Comportamentul provocat de fotostimularea LH^GABA- Calea VTA a fost frenetică, greșit direcționată și dezadaptată (Filmul S4). O interpretare este că activarea LH^GABA-Calea VTA trimite un semnal către șoarece care determină recunoașterea unui întăritor apetitiv. O interpretare alternativă este că LH^GABA- Calea VTA ar putea conduce la o importanță stimulativă sau o „dorință” intensă, în concordanță cu o abordare condiționată subiacentă a semnalului, dar la un nivel non-fiziologic care produce acest comportament aberant legat de hrănire (Berridge și Robinson, 2003). În concordanță cu aceasta, este posibil ca activarea LH^GABA-Proiecția VTA produce de fapt senzații intense de poftă, sau îndemnuri de a se hrăni. Cu toate acestea, experimentele noastre arată că activarea LH^GABA-VTA nu produce o creștere a căutării compulsive de zaharoză, dar acest lucru se datorează probabil morții excesive și comportamentelor apetitive aberante concentrate pe obiectele nealimentare din camera de testare. Deși este dificil să se determine experiența șoarecelui în timpul acestei manipulări, este clar că comportamentele legate de hrănire dirijate în mod corespunzător necesită activarea coordonată atât a componentelor GABAergice, cât și a componentelor glutamatergice ale căii LH-VTA.

Manipulările optogenetice și farmacogenetice sunt instrumente puternice pentru stabilirea relațiilor cauzale, dar ele nu dezvăluie proprietățile endogene, fiziologice, ale elementelor circuitelor neuronale. Studiul nostru unifică informații despre conectivitatea sinaptică, funcția endogenă naturală și rolul cauzal al căii LH-VTA, oferind un nou nivel de perspectivă asupra modului în care informațiile sunt integrate în acest circuit. Aceste rezultate evidențiază importanța examinării rolului funcțional al neuronilor prin conectivitate, pe lângă markerii genetici. Neuronii LH-VTA au codificat selectiv acțiunea de căutare a recompensei, dar nu au codificat stimuli de mediu, în timp ce stimulii de recompensă și indicii de predicție a recompensei au fost codificați de o populație discretă de neuroni LH în aval de VTA. În plus, am identificat o proiecție specifică care este legată cauzal de comportamentul compulsiv de căutare și hrănire a zaharozei. Eterogenitatea în proiecția LH-VTA este necesară pentru a oferi un echilibru adaptiv între motivația de conducere și reglarea comportamentelor apetitive dirijate în mod corespunzător. Aceste descoperiri oferă perspective relevante pentru afecțiuni patologice, cum ar fi tulburarea de supraalimentare compulsivă, dependența de zahăr și obezitatea