Receptorii dopaminei D2 în disfuncția de recompensă precum și al consumului compulsiv la șobolanii obezi (2010)

Comentariu: Acest studiu demonstrează că atunci când unui animal i se oferă acces nelimitat, un întăritor natural puternic (hrană foarte stimulantă) poate provoca o scădere a receptorilor D2. Acest declin a fost observat la aproape toți șobolanii și a avut loc destul de rapid. Când s-a îndepărtat mâncarea „foarte gustabilă”, șobolanii au refuzat să mănânce chow normal. Șobolanii au continuat să bâjbâie (atunci când au putut), în ciuda asocierii șocurilor electrice cu consumul de mâncare „foarte plăcut”.

• Studiu complet

Nat Neurosci. 2010 Mai; 13(5): 635-641. Publicat online 2010 martie 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Abstract

Am constatat că dezvoltarea obezității a fost asociată cu apariția unui deficit progresiv înrăutățitor în răspunsurile la recompense neuronale. Modificări similare în homeostazia recompensă indusă de cocaină sau heroină sunt considerate a fi cruciale în declanșarea tranziției de la consumul de droguri ocazional la compulsive. În consecință, am detectat un comportament alimentar compulsiv în șobolani obezi, dar nu slabi, măsurați ca un consum gustativ de hrană care a fost rezistent la perturbare printr-un stimulent condițional aversiv. Receptorii dopaminei D2 (D2Rs) au fost scăzuți în cazul șobolanilor obezi, așa cum sa raportat la persoanele dependente de droguri. Mai mult decât atât, distrugerea lentiunilor mediată de D2Rs striatal a accelerat rapid dezvoltarea deficitelor de recompensă asemănătoare dependenței și apariția alimentelor compulsive caută la șobolani cu acces extins la alimente bogate în grăsimi gustoase. Aceste date demonstrează că consumul excesiv de alimente gustoase declanșează reacții neuroadaptive asemănătoare dependenței în circuitele de recompensare a creierului și conduce la dezvoltarea unei alimentații compulsive. Mecanismele hedonice comune pot sta la baza obezității și dependenței de droguri.

Introducere

Hrănirea este influențată de plăcere și recompensă, iar obținerea recompensei alimentare poate motiva puternic consumul1, 2. Cu toate acestea, mecanismele hedonice care contribuie la obezitate rămân slab înțelese. La omul hiperfagic cu deficit congenital de leptină, activitatea din striatul dorsal și ventral, care sunt componente de bază ale circuitelor de recompensare a creierului crește semnificativ ca răspuns la imaginile alimentelor3, iar terapia de substituție a leptinei atenuează atât activitatea striatală, cât și „plăcerea” auto-raportată a alimentelor3 . Acest lucru sugerează că striatul este important în aspectele hedonice ale comportamentului alimentar. Recent s-a arătat că activarea striatului ca răspuns la mâncarea foarte plăcută este tocită la persoanele obeze în comparație cu controalele slabe4. Mai mult, hipofuncția striatului dorsal și creșterea în greutate pe termen lung sunt cele mai pronunțate la indivizii cu alela TaqIA a locului genei DRD2 – ANKK1, ceea ce duce la scăderea expresiei D2R striatale și s-a dovedit că predispune indivizii la tulburări de dependență de substanțe4, 5 Aceste observații și alte observații similare au condus la propunerea că deficitele în procesarea recompenselor pot fi un factor de risc important pentru dezvoltarea obezității și că indivizii obezi pot consuma în mod compulsiv alimente gustoase pentru a compensa hiposensibilitatea recompensei6. În special, nu este clar dacă deficitele în procesarea recompenselor sunt constitutive și preced obezitatea sau dacă consumul excesiv de alimente gustoase poate determina disfuncționalitatea recompensei și, prin urmare, poate contribui la obezitatea indusă de dietă.

O caracteristică definitorie a indivizilor supraponderali și obezi constă în faptul că aceștia continuă să supraviețuiască, în ciuda consecințelor sociale și de sănătate negative cunoscute. Într-adevăr, mulți indivizi supraponderali exprimă dorința de a-și limita consumul de alimente, totuși se luptă să-și controleze aportul și consumă în mod repetat dincolo de cerințele lor energetice7, 8. Dezvoltarea comportamentului hrănirii care este insensibilă la rezultatul negativ este similară comportamentului compulsiv de asimilare a drogurilor observat la dependenții de droguri umani, care este, în mod similar, imperceptibil la consecințele negative9. Aici am investigat efectele accesului extins la o dietă bogată în grăsimi cu gust plăcut asupra sensibilității sistemelor de recompensare a creierului la șobolani. De asemenea, am examinat legătura dintre dysregulările hedonice induse de regimul alimentar și apariția de hrană compulsivă. În cele din urmă, am investigat rolul D2Rs striatal în aceste răspunsuri comportamentale asemănătoare.

Deficitele de recompensă asemănătoare dependenței la șobolanii obezi

Pentru a testa efectele accesului restricționat sau extins la o dietă plăcută cu conținut ridicat de grăsimi, am pregătit șobolani Wistar masculi (300-350 g) cu un electrod bipolar de stimulare în hipotalamusul lateral și i-am antrenat timp de 10-14 zile într-un studiu discret. procedura de recompensă a stimulării cerebrale cu prag curent (BSR) până la stabilirea pragurilor stabile de recompensă4. În procedura BSR, șobolanii răspund energic pentru a obține o auto-stimulare electrică recompensantă prin electrodul de stimulare intern, cu intensitatea minimă de stimulare care menține comportamentul de auto-stimulare numit pragul de recompensă10. Deoarece pragurile de recompensă rămân stabile și nealterate pe perioade prelungite în condiții de bază, această procedură oferă o măsură sensibilă a capacității de reacție a sistemelor de recompensare a creierului. După stabilirea pragurilor BSR stabile (definite ca variație <10% a pragurilor pe trei sesiuni consecutive), am alocat șobolanilor la trei grupuri care nu au prezentat diferențe în greutatea corporală medie sau pragurile de recompensă între grupuri. Celor trei grupuri li s-a oferit acces diferențial la o dietă „în stil cafenea”, constând din alimente gustoase, cu densitate energetică, ușor disponibile pentru consumul uman (a se vedea metodele online). Șobolanii au avut 0 h (șobolani numai chow; n = 9), 1 h (șobolani cu acces restricționat; n = 11) sau 18-23 h (șobolani cu acces extins; n = 11) acces la dietă pe zi pentru 40 de zile consecutive. Se știe că dietele de la cantină au ca rezultat obezitatea indusă de dietă la șobolani11. Toți șobolanii au avut, de asemenea, acces ad libitum la chow de laborator standard, cu praguri de recompensă, creștere în greutate și aport caloric înregistrate pe tot parcursul.

Greutatea a crescut semnificativ la șobolanii cu acces extins la alimentația pentru cafenea, comparativ cu grupurile de acces numai în comun sau cu acces restrâns (Fig. 1a). Greutatea a avut tendința de a crește și la șobolanii cu acces restricționat, comparativ cu șobolanii cu șobolani, dar acest efect nu a atins semnificația statistică. Dezvoltarea obezității la șobolanii cu acces extins a fost strâns asociată cu un deficit înrăutățitor al funcției de recompensare a creierului, reflectat în pragurile BSR progresiv crescute (figura 1b). Deoarece nu s-au observat diferențe între latențele de răspuns pentru BSR în rândul celor trei grupuri (Figura suplimentară 1), deficitele în performanța comportamentală nu pot ține cont de această observație. Au fost raportate deficite similare în funcția de recompensare a creierului la șobolani cu acces extins, dar nu restricționat, la administrarea intravenoasă de cocaină sau heroină 12, 13, 14. Astfel, accesul extins la hrană bogată în grăsimi poate provoca deficite asemănătoare dependenței în funcția de recompensă a creierului, considerată o sursă importantă de motivație care poate conduce la ouă și poate contribui la dezvoltarea obezității1, 6.

Figura 1: Creșterea în greutate și disfuncția recompensă la șobolani cu acces extins la o dietă de la cantină.

(a) Creșterea medie (± sem) în greutate la șobolanii cu acces restricționat, cu acces restricționat și cu acces extins (interacțiune de acces × zi: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai cu chow, test post hoc). (b) Modificarea procentuală medie (± sem) față de pragurile de recompensă inițiale (interacțiune de acces × timp: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc).

Când am examinat în detaliu comportamentul alimentării (Fig 2), am constatat că aportul caloric zilnic total a fost similar între șobolani cu acces la hrană și cu șobolani cu acces restrâns (Fig 2a, d). Prin contrast, aportul caloric total la șobolani cu acces extins a fost aproape de două ori mai mare decât al șobolanilor cu acces limitat și cu șobolan (Figura 2a, d). Deși șobolanii cu acces restrâns și numai șobolani au menținut aproximativ aceeași admisie calorică zilnică (fig. 2a, d), șobolanii cu acces restrâns au obținut numai ~ 33% din caloriile lor zilnice din chow (fig 2b, d), indicând că au dezvoltat un comportament de hrănire asemănător unui tip de hrănire și au consumat ~ 66% din consumul lor zilnic de calorii în timpul sesiunii de acces 1 h la cafea diet15 (Figura 2d). Șobolanii cu acces extins au obținut doar o fracțiune mică (~ 5%) din cantitatea totală de admisie calorică din chow (Figura 2b); au consumat aproape exclusiv dieta de la cantină (figura 2d). Schimbarea preferinței dietetice în grupurile cu acces limitat și cu acces extins sa reflectat și într-o creștere accentuată a admisiei de grăsime în comparație cu șobolanii cu șobolani (Fig. 2c și 2 suplimentar). În concordanță cu rapoartele anterioare16, a existat o tendință ca consumul dietei pentru cafenea să scadă în timp în șobolanii cu acces extins. Acest lucru poate reflecta dezvoltarea toleranței față de gustul produselor alimentare furnizate ca parte a dietei pentru cantină în timp. Cu toate acestea, preferința pentru dieta de la cantină comparativ cu cea standard a rămas constantă la aceste șobolani (3 suplimentar). Aceste date demonstrează că accesul extins, dar nu restricționat, la o dietă bogată în grăsimi gustoasă, induce deficite de recompensă, supraexploatare și pierderea echilibrului energetic homeostatic. În schimb, accesul restricționat la alimentele gustoase dă naștere unor tipare de consum de tip binge, dar nu întrerupe echilibrul energetic homeostatic și nici funcția de recompensare a creierului. Cu toate acestea, este posibil ca accesul restricționat la dieta de la cantină pentru mai mult de 40 zile consecutive să determine o creștere semnificativă a greutății și o întrerupere a funcției de recompensare a creierului.

Figura 2: Modele de consum la șobolani cu acces extins la o dietă la cafenea.

(a) Aportul caloric mediu zilnic (± sem) la șobolanii cu acces limitat, cu acces restricționat și cu acces extins (acces: F1,324 = 100.6, P <0.0001; timp: F18,324 = 7.8, P <0.0001; acces × interacțiune în timp: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (b) Aportul caloric mediu zilnic (± sem) de la chow (acces: F2,504 = 349.1, P <0.0001; timp: F18,504 = 5.9, P <0.0001; acces × interacțiune în timp: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (c) Aportul caloric mediu zilnic (± sem) din grăsimi (acces: F2,486 = 118.7, P <0.0001; timp: F18,486 = 8.8, P <0.0001; acces × interacțiune în timp: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (d) Compararea aportului caloric total mediu (± sem) și a caloriilor consumate exclusiv de la chow, pe întreaga perioadă de acces de 40 de zile (acces: F2,54 = 25.0, P <0.0001; sursă de calorii: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; acces × interacțiune sursă de calorii: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 comparativ cu caloriile totale din grupul numai pentru chow, ### P <0.001 comparativ cu caloriile totale din același grup de șobolani, test post hoc).

După 40 de zile, șobolanilor nu li s-a mai permis accesul la dieta plăcută, dar au continuat să aibă acces ad libitum la chow-ul de laborator standard. Am evaluat pragurile de recompensă și consumul zilnic de chow în această perioadă forțată de „abstinență”. Creșterile pragurilor de recompensă au persistat timp de cel puțin 2 săptămâni la șobolanii cu acces extins atunci când nu mai aveau acces la dieta plăcută (Fig. 3a). Acest lucru contrastează cu deficitele relativ tranzitorii (~ 48 ore) în funcția de recompensă raportate la șobolanii supuși abstinenței de la cocaina autoadministrată13. A existat, de asemenea, o scădere semnificativă a aportului caloric (Fig. 3b) și o scădere treptată a greutății corporale (Fig. 3c) la șobolanii cu acces extins și, într-o măsură mai mică, la șobolanii cu acces restricționat, în această perioadă de abstinență, în concordanță cu rapoarte anterioare11, 15. După 14 zile de abstinență, șobolanii au fost uciși și plasarea electrodului a fost determinată prin colorare cu violet crezil (Fig. 3d).

Figura 3: Disfuncție persistentă de recompensă și hipofagie în timpul abstinenței la șobolani cu acces extins la o dietă de la cantină.

(a) Modificarea procentuală medie față de pragurile de recompensă inițiale (± sem) în timpul abstinenței de la o dietă plăcută bogată în grăsimi (acces: F2,112 = 3.7, P <0.05; timp: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (b) Aportul caloric mediu (± sem) în ultima zi de acces la dieta bogată în grăsimi (momentul inițial) și în timpul celor 14 zile de abstinență când a fost disponibil doar chow standard (acces: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; timp: F6,168 = 65.6, P <0.0001; acces × interacțiune de timp: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (c) Modificarea greutății corporale medii (± sem) în comparație cu greutatea corporală în ultima zi de acces la dieta bogată în grăsimi (linia de bază) și în timpul celor 14 zile de abstinență, când a fost disponibil doar chow standard (acces: F1,126 = 37.2, P <0.0001; timp: F7,126 = 3.1, P <0.01; acces × interacțiune timp: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 în comparație cu grupul numai chow, test post hoc). (d) Reconstrucția histologică a localizării electrozilor de stimulare BSR în hipotalamusul lateral al șobolanilor cu chow-only (triunghiuri), cu acces restricționat (pătrate) și cu acces extins (cercuri) șobolani.

Striatal D2Rs la șobolanii obezi: rol în deficitele de recompense

Apoi am testat ipoteza că consumul excesiv al unei diete de cafenea plăcută ar putea reduce densitatea D2R striatală, contribuind la dezvoltarea hiposensibilității recompensei asemănătoare dependenței. O nouă cohortă de șobolani cu acces restrâns, cu acces restricționat și cu acces extins a permis accesul la dieta de la cafenea până când a existat o creștere semnificativă statistic a greutății corporale la șobolanii cu acces extins, comparativ cu grupul numai cu chow (P <0.05 ; Fig. 4a). Expresia striatală a formei legate de membrană puternic glicozilată (~ 70 kDa) a D2R a fost mai scăzută la șobolanii cu acces extins decât la șobolanii cu acces restricționat sau șobolani numai cu chow (Fig. 4b; vezi Metode online). Când am împărțit șobolanii din fiecare grup de acces în două subgrupuri pe baza unei împărțiri mediane a greutăților corporale (ușoare sau grele), am găsit o relație inversă clară între greutatea corporală și expresia D2R striatală (Fig. 4a, c). Nu am detectat scăderi semnificative statistic ale expresiei formelor citoplasmatice nematurate (~ 39 kDa) și glicozilate intermediar glicozilate ale D51R (Fig. Suplimentară 2) 4, indicând faptul că expresia D17R striatală la șobolani cu acces extins este probabil reglementate prin mecanisme post-transcripționale.

Figura 4: Creșterea în greutate este invers proporțională cu nivelurile striatale ale D2R.

(a) Șobolanii cu acces limitat, cu acces restricționat și cu acces extins au fost împărțiți în două grupe pe condiție de acces pe baza unei împărțiri mediane a greutăților corporale: ușoare (L) sau grele (H). (b) Întregul complex striatal a fost colectat de la toți șobolanii și nivelurile de D2R din fiecare grup măsurat prin western blot. Banda D2R asociată membranei a fost rezolvată la 70 kDa, iar controlul de încărcare a proteinelor este afișat mai jos (β-actină, 43 kDa). Imunoblotii de lungime completă sunt prezentați în figura suplimentară 12. (c) Cantitățile relative de D2R în striatul șobolanilor cu acces restricționat și cu acces restricționat au fost cuantificate prin densitometrie (F2,6 = 5.2, P <0.05, principal efectul accesului; * P <0.05 și ** P <0.01 comparativ cu grupul Chow-only-L).

În continuare, pentru a testa relevanța funcțională a reducerilor induse de dietă în D2R striatal la funcția de recompensare a creierului, am proiectat și validat un vector lentiviral pentru a livra un ARN cu interferență de ac de păr scurt (shRNA) pentru a bate D2R (Lenti-D2Rsh; 5 și imaginea suplimentară 5). Ratele de recompensă au început să crească la șobolanii tratați cu Lenti-D2Rsh aproape imediat după ce li sa permis accesul extins la alimentația pentru cafenea, în timp ce pragurile de recompensă au rămas neschimbate la șobolanii cu acces extins tratați cu un vector lentivic gol (Lenti-control) de acces la dieta de la cantină (14 d; Fig. 6a). Ratele de latență la răspuns au fost neschimbate în ambele grupuri de șobolani, arătând că acest efect nu este secundar deficitelor în performanța sarcinii (Figura suplimentară 6). Ratele de recompensă au fost, de asemenea, nemodificate la șobolanii tratați cu Lenti-D2Rsh sau Lenti-control care au avut acces la hrană numai în aceeași perioadă (Figura 6b).

Pragurile au rămas persistent ridicate în timpul unei suplimentare 15 d de abstinență atunci când toți șobolanii au avut acces numai la doza standard (7 suplimentar). Eliminarea striatalului D2R a crescut, prin urmare, vulnerabilitatea față de hipofuncția de recompensă indusă de dietă, dar nu a modificat activitatea de referință a sistemelor de recompensare a creierului.

Figura 5: Rezolvarea mediată de lentivirus a expresiei striatale D2R.

(a) Reprezentarea grafică a zonelor striatale în care Lenti-D2Rsh a fost supraexprimat. Cercurile verzi din emisfera striatală stângă reprezintă locațiile în care au fost vizate infuziile virale. Colorarea verde în emisfera striatală dreaptă este o colorare imunochimică reprezentativă pentru proteina fluorescentă verde (GFP) din creierul unui șobolan Lenti-D2Rsh. (b) Imunoblot reprezentativ al expresiei D2R scăzută în striatul șobolanilor Lenti-D2Rsh. Imunoblotii de lungime completă sunt prezentați în figura suplimentară 13. (c) Cantități relative de D2R în striatul șobolanilor Lenti-control și Lenti-D2Rsh, cuantificate prin densitometrie (* P <0.05 comparativ cu grupul Lenti-control, test post hoc ). (d) Infecția celulelor gliale în striat de către vectorul Lenti-D2Rsh nu a fost detectată. Colorarea verde este GFP de la virus; roșu este proteina acidă fibrilară glială marker astrocitar (GFAP); nucleele celulare sunt evidențiate prin colorarea DAPI în albastru. Săgețile albe indică o zonă localizată de glioză găsită doar la locul injectării virusului în striat și nu în țesuturile înconjurătoare în care virusul s-a difuzat. Chiar și în această zonă, niciunul dintre astrocite nu este GFP-pozitiv. Săgețile galbene din imaginea mărită evidențiază astrocitele tipice negative GFP care au fost detectate. (e) Niveluri ridicate de infecție neuronală în striat prin vectorul Lenti-D2Rsh. Colorarea verde este GFP de la virus; roșu este markerul nuclear neuronal NeuN; nucleele celulare sunt evidențiate prin colorarea DAPI în albastru. Săgețile galbene din imaginea mărită evidențiază neuronii GFP-pozitivi și NeuN-pozitivi în striat. (f) O imagine cu mărire mai mare a unui neuron infectat viral (GFP-pozitiv) în striatul șobolanilor Lenti-D2Rsh care arată caracteristicile morfologice tipice ale neuronilor spini medii.

Figura 6: Knockdownul striatalului D2R crește vulnerabilitatea pentru a recompensa disfuncția la șobolani cu acces extins la o dietă de la cantină.

(a) Modificarea procentuală medie (± sem) față de pragurile de recompensă inițiale la șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh care au avut acces extins la dieta cafenelei timp de 14 zile consecutive (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; timp: F13,156 = 2.2, P <0.05; interacțiune virus × timp: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, efect de interacțiune). (b) Modificarea procentuală medie (± sem) față de pragurile de recompensă inițiale la șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh care au avut acces numai la chow. (c) Aportul caloric mediu (± sem) al șobolanilor în timpul 14 zile de chow numai sau acces extins (acces: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Creșterea medie (± sem) în greutate în timpul 14 zile de chow numai sau acces extins (acces: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, efectul principal al accesului).

Am constatat că aportul caloric (Fig. 6c) și creșterea în greutate (Fig. 6d) au fost similare în grupurile Lenti-D2Rsh și în grupurile de control Lenti corespunzătoare în condiții de acces numai la chow sau extins (figurile suplimentare 8 și 9). Astfel, knockdown-ul striatal D2R nu a modificat nici preferința pentru dieta cantinei, nici consumul caloric total atunci când alimentele gustoase au fost disponibile în mod liber pentru consum.

Mâncarea compulsivă la șobolanii obezi: rolul pentru D2R striatal

Am testat apoi ipoteza că mâncarea compulsivă ar putea apărea la șobolani cu acces extins la dieta cafenelei și că deficitul în semnalizarea striatală D2R ar putea contribui la acest efect. O nouă cohortă de șobolani cu acces restrâns, cu acces restricționat și cu acces extins a fost permis accesul la dieta cafenelei timp de> 40 de zile până când au apărut creșteri de greutate semnificative statistic la șobolanii extinși (P <0.05 comparativ cu șobolanii numai cu chow; datele nu afișate). Toate cele trei grupuri de șobolani au primit apoi doar 30 de minute de acces pe zi la dieta cafenelei timp de 5-7 zile într-o cameră operantă până când s-a obținut aportul stabil (definit ca o variație <10% a aportului zilnic). Jumătate din șobolani în fiecare condiție de acces au fost expuși apoi la o lumină (stimul condiționat) asociată cu administrarea șocurilor la picioare (grup pedepsit), în timp ce șobolanii rămași din fiecare grup au fost expuși la lumina tac în absența șocului la picioare (grup nepedepsit) ). În ziua de testare, am examinat efectele expunerii la lumină cue singure asupra consumului de alimente plăcute (Fig. 7; vezi Metode online). Am constatat că aportul caloric mediu în timpul sesiunilor inițiale de 30 de minute a fost mai mare la șobolanii cu acces limitat și la șobolani cu acces restricționat decât la șobolanii cu acces extins (Fig. 7a, b). Acest lucru sugerează că șobolanii cu acces limitat și cu acces restricționat care se înghesuiau pe alimentele gustative în timpul sesiunilor de acces intermitente de 30 de minute, reflectat în faptul că acești șobolani au consumat ~ 40-50% din aportul lor caloric zilnic, de obicei ~ 100 kCal, în timpul acestor sesiuni (Fig. 7a, b). În schimb, șobolanii cu acces extins par a fi rezistenți la dezvoltarea acestui comportament hrănitor asemănător, poate din cauza istoricului lor de acces aproape nelimitat la mâncarea plăcută timp de> 40 de zile consecutive, au stabilit modele de mâncare relativ inflexibile de modificat. În ziua testului, nu am observat efecte semnificative statistic ale reluării ușoare a consumului de alimente la șobolanii nepedepsiți din grupurile cu chow-only, cu acces restricționat sau cu acces extins, în comparație cu aportul în perioada inițială (Fig. 7a). Prin urmare, lumina indicativă nu avea deci nicio evidență motivativă. La șobolanii pedepsiți, lumina de șoc asociată cu șocul a scăzut semnificativ consumul de alimente plăcute la șobolanii cu chow și cu acces restricționat. Cu toate acestea, lumina tacului nu a avut niciun efect asupra consumului de alimente plăcute la șobolanii cu acces extins, arătând că consumul lor a fost insensibil la indicii de mediu aversive care prezic adversități. Aportul inițial de energie la șobolanii cu acces extins a fost mai mic decât cel din celelalte grupuri. Cu toate acestea, deoarece aportul de chow în perioade de timp similare a fost mult mai mic (Fig. 7d), este puțin probabil ca acesta să reprezinte un „efect de podea” care să ne confunde rezultatele. Împreună, datele noastre susțin ideea că un comportament alimentar asemănător compulsiv poate apărea la șobolanii cu acces extins într-un mod analog cu consumul compulsiv de cocaină observat la șobolani cu antecedente de acces extins la droguri18.

Figura 7: Răspuns compulsiv pentru mâncare gustoasă.

(a) Consumul mediu (± sem) de gust gustativ la șobolani nepedepsiți în timpul sesiunilor inițiale de 30 de minute și în ziua testului când șobolanii au fost expuși la un stimul condiționat neutru care nu a fost asociat anterior cu șocul nociv al piciorului (acces: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 în comparație cu șobolanii numai pentru chow). (b) Consumul mediu (± sem) gustativ de dietă la șobolani pedepsiți în timpul sesiunilor inițiale de 30 de minute și în ziua testului în care șobolanii au fost expuși la un stimul condiționat care anterior a fost asociat cu șoc picior nociv (acces: F2,21 = 3.9 , P <0.05; tac: F1,21 = 8.6, P <0.01; acces × interacțiune tac: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 comparativ cu aportul din timpul sesiunii de bază, #P <0.05 comparativ cu doar șobolani chow). (c) Consumul mediu (± sem) gustativ de dietă în timpul sesiunilor inițiale de 30 de minute și în ziua testului la șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh care anterior aveau acces exclusiv chow sau au extins la o dietă de cafenea (repere: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 comparativ cu aportul în timpul sesiunilor inițiale, test post hoc). (d) Consumul mediu (± sem) de chow în timpul sesiunilor inițiale de 2 de minute și în ziua testului la șobolanii Lenti-control și Lenti-D1,26Rsh care anterior au avut doar chow sau au extins accesul la o dietă de cafenea (tac: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX comparativ cu aportul în timpul sesiunilor inițiale, test post hoc).

În cele din urmă, am examinat efectele stimulului condiționat asociat cu pedeapsa asupra consumului de alimente la șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh care anterior au avut acces doar la chow sau au extins accesul la dieta cafenelei (șobolani din Fig. 6). Am constatat că aportul de hrană gustativ inițial în timpul sesiunilor inițiale de 30 de minute a fost la fel de mare (~ 40 kCal) în toate cele patru grupuri (Fig. 7c). În plus, consumul total zilnic de chow (în cușca de acasă) a fost similar între toate cele patru grupuri de șobolani în timpul sesiunilor de condiționare și în ziua testului (Fig. Suplimentar 10). 14 zile de acces anterior la dieta de cafenea nu a fost, prin urmare, suficientă pentru a bloca comportamentul alimentar asemănător unei binge într-un mod similar cu cel observat la șobolanii care aveau> 40 de zile de acces extins la dieta de cafenea (Fig. 7a, b). Stimulul aversiv al luminii de semnal a întrerupt consumul de alimente plăcute la șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh care anterior aveau acces doar la chow (Fig. 7c). În mod similar, stimulul condiționat aversiv a întrerupt consumul de alimente plăcute la șobolanii Lenti-control care anterior aveau 14 zile de acces extins la dieta cafenelei. În schimb, stimulul condiționat aversiv nu a avut niciun impact asupra consumului de alimente plăcute la șobolanii Lenti-D2Rsh care anterior aveau 14 zile de acces extins la dieta cafenelei (Fig. 7c). Pragurile BSR au rămas semnificativ ridicate la acești șobolani atunci când au fost înregistrate la 48 de ore după sesiunea de testare, în timp ce pragurile au rămas stabile și nealterate în celelalte trei grupe de șobolani.

(Figura suplimentară 11). Pentru a verifica dacă rezistența la stimularea condiționată de stimulare stimulată a consumului de alimente gustoase la șobolanii cu acces extins Lenti-D2Rsh nu a fost secundar la afectarea proceselor clasice de condiționare, am testat efectele stimulentelor condiționate aversive asupra consumului de mâncare standard mai puțin gustoasă toate cele patru grupe de șobolani. Spre deosebire de consumul gustativ al alimentelor gustoase, am constatat că toate cele patru grupe de șobolani au consumat mici cantități (~ 2 kCal) în cursul sesiunilor de bază 30 min (Fig. 7d) și că consumul de hrană a fost întrerupt în toate cele patru grupuri o magnitudine similară la expunerea la stimulul condițional aversiv (figura 7d). Aceste date demonstrează că scăderea D2R-urilor striatale a accelerat semnificativ apariția consumului compulsiv de alimente gustoase, dar numai la șobolani cu un istoric de acces extins. Mai mult, deoarece alimentația compulsivă a fost detectată numai la șobolanii Lenti-D2Rsh care au avut praguri de BSR ridicate, hipofuncția de recompensă indusă de dietă poate fi un antecedent necesar pentru apariția alimentelor compulsive care caută.

Discuție

Ușor de acces la alimente bogate în grăsimi gustoase este considerat un factor important de risc pentru mediu pentru obezitatea19. Am constatat că accesul extins la o dietă foarte gustoasă în stilul cantinei a dus la supraalimentarea și creșterea în greutate cuplate cu praguri BSR crescătoare progresiv la șobolani. Acest efect asupra pragurilor BSR poate fi explicat prin scăderea treptată a capacității de reacție a circuitelor de recompensare a creierului, o interpretare conformă faptului că restricționarea alimentelor și pierderea în greutate pot crește20, în timp ce supracapacitatea acută poate scădea tranzitoriu21, răspunzând pentru BSR la șobolani. Această constatare reprezintă o extensie a activității care arată că supraproducția acută a șobolanilor printr-un tub 21 de alimentare intragastrică și disfuncția gastrică sau perfuzia cu glucagon intravenos care imită saturația postprandială22, 23, 24, scade răspunsul pentru a recompensa BSR hipotalamic lateral și crește răspunsurile asemănătoare aversiunii stimulation25. Lucrările anterioare au arătat, de asemenea, că șobolanii cu forța de hrană repetată prin tuburi intragastrice până când greutatea lor a crescut cu ~ 200 g scade în mod similar ratele de răspuns pentru BSR, un efect care persistă până când greutatea corporală a normalizat23. La fel ca în aceste descoperiri la șobolani, răspunsul la pisici pentru BSR hipotalamică laterală a fost inhibat prin hrănirea anterioară a satiunii 26, arătând că interacțiunile dintre funcția de recompensare a creierului și starea metabolică sunt conservate și, astfel, sunt susceptibile să apară și la om. Ușurința de a avea acces și de a supravietui în consecință dietelor tip bufet la om este considerat un factor important de mediu în actuala epidemie de obezitate din societățile occidentale19. Datele noastre arată că hipofuncția recompensă apare la șobolanii care supraviețuiesc în mod voluntar o dietă de cantină gustoasă, asemănătoare cu cea consumată de oameni, și că acest efect devine progresiv mai rău pe măsură ce câștigă mai multă greutate. În mod special, toți șobolanii cu creșteri ale pragului de recompensă ≥20% aveau electrozi BSR localizați în intervalul ~ 500 μm al fornixului dorsolateral. Sensibilitatea neuronilor legate de recompensă în această zonă este mărită prin restricționarea alimentelor într-o manieră sensibilă la leptina derivată din grăsime și această regiune a creierului este considerată un substrat important pentru recompensa alimentară27. Circuitele creierului care reglementează hedonicii alimentare sunt, prin urmare, inhibate de semnalele postingestice care prezic saturația, conform studiilor recente de imagistică umană care arată că disfuncția gastrică28 și peptida factorului postprandial derivat din intestinul subțire YY3-36 (PYY) 29 modulează activitatea regiunilor creierului implicate în prelucrarea recompensei. În plus, sistemele de recompensare sunt, de asemenea, inhibate de creșterea excesivă în greutate. Rapoartele recente indică faptul că leptina circulantă, un regulator cheie al echilibrului energetic, poate pătrunde în țesuturile creierului și poate inhiba activitatea circuitelor de recompensă3, 27, 30, 31.

Deficiențele de recompensă la șobolanii supraponderali pot reflecta scăderi contraadaptative ale sensibilității de bază a circuitelor de recompensă a creierului pentru a se opune supraestimularii lor de către mâncarea gustativă. O astfel de hipofuncție de recompensă indusă de dietă poate contribui la dezvoltarea obezității prin creșterea motivației de a consuma diete „obezogene” cu recompensă ridicată pentru a evita sau a atenua această stare de recompensă negativă6, 32. Acest lucru ar putea explica hipofagia pe care am observat-o la accesul extins șobolani și într-o măsură mai mică la șobolanii cu acces restricționat atunci când mâncarea gustativă a fost retrasă și numai chow-ul mai puțin gustabil era disponibil. Un astfel de scenariu este, de asemenea, în concordanță cu datele din studiile de imagistică a creierului uman în care activarea tocită a striatului ca răspuns la hrana foarte plăcută, în special la persoanele cu polimorfisme genetice despre care se crede că scade expresia D2R striatală, este asociată cu creșterea în greutate pe termen lung4. Nu a fost clar dacă o astfel de hiposensibilitate la recompensă la persoanele obeze se manifestă înainte de dezvoltarea obezității și este legată exclusiv de factori genetici („sindromul de deficiență a recompensei”) sau dacă supraalimentarea poate provoca întreruperea procesării recompensei. Datele noastre demonstrează că accesul extins la mâncăruri gustoase cu energie ridicată și ulterioare mâncăruri excesive recompensează sensibilitatea și, prin urmare, pot reprezenta un important mecanism hedonic care promovează dezvoltarea obezității. O disfuncție de recompensă similară cu cea raportată aici la șobolanii obezi este detectată și la șobolanii cu antecedente de acces extins la administrarea intravenoasă de cocaină sau heroină, dar nu la cei cu antecedente de acces restricționat12, 13, 14. Mai mult, tranziția de la S-a propus căutarea casuală de droguri compulsivă rezultând dintr-o încercare de a atenua starea persistentă de recompensă diminuată indusă de această disfuncție de recompensă indusă de droguri12, 32, 33. Astfel, datele noastre indică faptul că obezitatea și dependența de droguri pot împărtăși mecanisme hedonice subiacente.

Reglarea în jos a expresiei striatale D2R este un răspuns notabil neuroadaptiv la consumul excesiv de alimente gustoase. Într-adevăr, reduceri ale densității D2R striatale sunt observate la persoanele supraponderale4, 34 și rozătoare35, 36. În schimb, persoanele cu anorexie nervoasă au crescut D2R37 striatal, iar scăderea în greutate la persoanele obeze după intervenția chirurgicală bariatrică (bypass gastric) este asociată cu creșterea densității D2R striate28. Polimorfismul genelor numit alela TaqIA A1 are ca rezultat reducerea densității striate D2R, iar indivizii care adăpostesc această alelă sunt suprareprezentați în populațiile obeze 4. Alela TaqIA crește, de asemenea, vulnerabilitatea la dependența de alcool, opioid și stimulant psihomotor38. Reducerea densității striate D2R care apare fie prin factori genetici constitutivi, fie ca o consecință a supraestimării poate contribui, prin urmare, la mecanismele neurobiologice ale obezității. Am constatat că nivelele striatale ale izoformei 70 kDa D2R, considerate a reflecta D2R asociată membranei, au fost invers proporțional cu greutatea corporală la șobolani din grupurile de acces numai la chow, acces restrâns și acces extins (Fig. 4). Knockdownul expresiei striatale D2R, cel mai vizibil în striatumul dorsolateral (Fig. 5), a determinat creșterea pragurilor BSR aproape imediat după expunerea la dieta de la cantină. Scăderea exprimării striatale D2R a accelerat rapid apariția hipofuncției de recompensă la șobolani cu acces extins la alimente gustoase, o concluzie conformă cu datele imagistice ale creierului uman care indică faptul că deficitele în densitatea striatală D2R contribuie la recompensarea hipofuncției la persoanele obeze 4.

Trei caracteristici ale șobolanilor Lenti-D2Rsh sunt, de asemenea, demne de remarcat. În primul rând, deși reducerea striatală a D2R combinată cu accesul extins la alimentația gustoasă a dus la ridicarea pragurilor BSR, nu au existat diferențe în ceea ce privește aportul caloric sau creșterea în greutate la acești șobolani în comparație cu șobolanii de control. Acest lucru ar putea reflecta faptul că șobolanii aveau numai 14 d de acces la dieta de la cantină; perioadele mai lungi de acces ar fi putut duce la creșterea ponderii în greutate în timp, în mod similar cu creșterea susceptibilității la creșterea în greutate observată la om cu deficiențe în semnalizarea striatală D2R4. Cu toate acestea, avantajul de a limita accesul la hrana pentru cantină doar la 14 d este acela că șobolanii cu acces extins au fost singurul grup care a arătat praguri BSR ridicate și acest lucru ne-a permis să evaluăm rolul potențial al hipofuncției recompensării în dezvoltarea compulsivă mănâncă (vezi mai jos). În al doilea rând, pragurile BSR au rămas stabile și neschimbate la șobolanii care au avut acces doar la hrană. Aceasta indică faptul că expresia redusă a D2R striatală nu a fost suficientă pentru a induce hiposensibilitatea recompensării; în schimb, părea să interacționeze cu consumul exagerat de alimente gustoase pentru a accelera apariția acestei stări de sensibilitate redusă a recompensei. Alte reacții adaptive în circuitele de recompensare a creierului ar putea, prin urmare, să declanșeze hiposensibilitatea recompensării la șobolani cu acces extins la dieta de la cantină. Având în vedere acest lucru, observăm că bromocriptina D2R agonist reduce nivelurile de leptină39 în circulație și leptina inhibă hrănirea cel puțin parțial prin inhibarea regiunilor striatale care controlează răspunsurile hedonice la produsele 3, 30 și 31. Astfel, este posibil ca downregularea D2R striatal ca răspuns la creșterea greutății corporale să mărească semnalizarea leptinei și astfel să stimuleze efectele inhibitoare ale acestei adipokine asupra sistemelor de recompensare a creierului. În cele din urmă, observăm că ne-am vizat vectorii lentivirus spre striatumul dorsolateral. Aceasta a fost în primul rând din motive tehnice, deoarece plasarea laterală a canulelor pentru livrarea virusului în striatum ne-a permis de asemenea să acomodeze electrodul stimulator hipotalamic intern pentru determinarea pragului BSR. Astfel, este posibil ca direcționarea D2R-urilor pentru knockdown în alte zone ale striatumului, în special în zonele dorsomediale și ventrale (nucleul nucleului accumbens și cochilie), ar putea avea praguri BSR ridicate chiar și în absența regimului gustos.

Striatul dorsolateral a fost puternic implicat în învățarea tipului de obicei stimul-răspuns, după cum se reflectă în dezvoltarea unui comportament consumativ care este insensibil la devalorizare prin hrănirea anterioară a satierii sau prin asocierea cu stimuli nocivi40. Prin vizarea predominantă a striatului dorsolateral, am fi putut doborî populații de D2R care reglează vulnerabilitatea șobolanului la dezvoltarea unei alimentații asemănătoare compulsive. În concordanță cu rolul D2R-urilor striatale în comportamentele compulsive, alela TaqIA a locului genei DRD2 – ANKK1 uman - care are ca rezultat o densitate scăzută a D2R striatală5, bluntează activarea striatală ca răspuns la hrana gustativă4 și ridică vulnerabilitatea la obezitate4 - este, de asemenea, asociată cu deficite în învățarea evitării acțiunilor cu consecințe negative41. Pierderea controlului inhibitor asupra comportamentului care poate avea un rezultat negativ este o trăsătură caracteristică atât a obezității, cât și a dependenței de droguri, în care comportamentele consumative persistă în ciuda consecințelor sociale, de sănătate sau financiare negative. Comportamentul de administrare a cocainei la șobolani cu antecedente de consum extins de medicamente poate deveni inflexibil și rezistent la perturbări de către un stimul condiționat aversiv care prezice un rezultat negativ (șoc la picioare) 18. În mod similar, șoarecii care anterior aveau acces la o dietă plăcută cu conținut ridicat de grăsimi vor petrece mai mult timp într-un mediu aversiv (puternic luminat) pentru a obține hrana plăcută decât șoarecii care nu aveau experiență cu dieta42. Am constatat că consumul de alimente plăcute la șobolani cu acces extins la dieta de la cafenea a fost în mod similar insensibil la un stimul condiționat aversiv. În concordanță cu rolul D2R-urilor striatale în acest efect, mâncarea asemănătoare compulsivă a fost găsită la șobolanii D2R striatali care anterior aveau 14 zile acces extins la dieta cafenelei, dar nu și la grupurile de control. Din perspectiva neurocircuitului, accesul extins la hrana gustabilă ar putea declanșa plasticitatea în căile corticostriatale, făcând astfel animalele mai vulnerabile la dezvoltarea comportamentelor asemănătoare compulsivității, cu deficite în semnalizarea D2R striatală care îmbunătățește acest proces. Într-adevăr, densitatea redusă a D2R striatal la indivizii obezi este corelată cu metabolismul redus în zonele corticale prefrontale și orbitofrontale43 care exercită un control inhibitor asupra comportamentului44.

În mod special, consumul de alimente gustoase a fost detectat numai la șobolanii care au avut anterior acces la dieta de la cantină, nu la șobolanii de control care au extins accesul la hrana pentru cafeteria pentru aceeași perioadă de timp, nici la șobolanii chow-only access. Principala diferență dintre șobolanii knockdown cu acces extins anterior și celelalte grupuri a fost pragurile lor BSR persistente ridicate. Acest lucru ar putea reflecta originile neurobiologice obișnuite ale hipofuncției de recompensă și apariția unor alimente compulsive, care coincid în timp și totuși fenomene independente. Alternativ, hipofuncția de recompensă indusă de dietă ar putea servi ca un substrat pentru o armare negativă care facilitează dezvoltarea compulsivă cum ar fi eating14, 32, 33. Indiferent de mecanismele care stau la baza, constatarile noastre demonstreaza ca raspunsul compulsiv de dependenta pentru alimentatia gustoasa poate aparea la sobolanii obezi si indica faptul ca deficitele de semnalizare striatala D2R cresc vulnerabilitatea la dezvoltarea acestui comportament.

În concluzie, am constatat că suprasolicitarea sistemelor de recompensare a creierului prin consumul excesiv de alimente gustoase și dense consumă o stare profundă de hiposensibilitate la recompensă și de dezvoltare a unei alimentații compulsive. Aceste răspunsuri comportamentale maladaptive la șobolanii obezi, probabil, apar din deficitele induse de dietă în semnalizarea D2R striatală. Consumul excesiv de droguri reduce în mod similar densitatea striatală D2R, induce o stare profundă de hipofuncție a recompenselor și declanșează apariția unor comportamente compulsive cum ar fi consumul de droguri. Constatările noastre susțin, prin urmare, lucrările anterioare 4, 19, 42, 45, 46, 47, indicând faptul că obezitatea și dependența de droguri pot apărea din răspunsuri neuroadaptive similare în circuitele de recompensare a creierului.

Metode

Șobolani.

Șobolanii Wistar masculi care au cântărit 300-350 g la începutul experimentelor au fost obținuți de la Charles River. La sosire, șobolanii au fost adăpostiți individual la o temperatură constantă pe un ciclu 12-h lumină-întuneric (luminile sunt aprinse la 2200 h). Șobolanii au fost permiși accesul ad libitum la băuturi standard de laborator și apă pe durata experimentului. Toate procedurile au fost aprobate de Comitetul pentru îngrijirea și utilizarea animalelor instituționale al Scripps Florida, iar șobolanii au fost tratați în conformitate cu liniile directoare stabilite de National Institutes of Health privind principiile îngrijirii animalelor.

Proceduri chirurgicale.

Șobolanii preparați cu electrozi de stimulare BSR au fost anesteziați mai întâi prin inhalarea 1-3% izofluran în oxigen și plasați într-un cadru stereotaxic (Kopf). S-au implantat electrozi bipolari BSR (11 mm lungime) în hipotalamus lateral posterior (anteroposterior, -0.5 mm de la bregma, mediolateral, ± 1.7 mm de la linia mediană, dorsoventrală, 8.3 mm din duritatea barului incisiv a fost ajustată la 5 mm deasupra liniei interacționale ) 47. Șobolanii care au primit injecții virale au fost de asemenea pregătiți cu canule de ghidare bilaterale (23 gauge, 14 mm lungime) poziționate deasupra striatumului (anteroposterior, 2.8 mm de la bregma, mediolateral, ± 3.1 mm de la linia mediană, dorsoventral, cu stiluri 2.4-mm. Patru șuruburi craniene din oțel inoxidabil și acrilice dentare au ținut electrodul și canulele în poziție. Rana chirurgicală a fost tratată cu antibiotic local o dată la fiecare 48 h pentru 14 d după operație. Șobolanii au primit 12-5 d pentru a se recupera de la intervenție chirurgicală și au fost apoi instruiți în procedura de prag BSR.

Procedura BSR.

Șobolanii au fost instruiți să răspundă pentru stimularea BSR în conformitate cu o procedură de control a pragului de curent discret similar cu cea descrisă în altă parte10, 14. Pe scurt, nivelele actuale ale BSR au variat în serii descendente și ascendente alternante în pași 5-μA. În fiecare sesiune de testare au fost prezentate patru serii descendente / ascendente alternante. Pragul pentru fiecare serie a fost definit ca mijlocul dintre două intensități curente consecutive pentru care șobolanii au răspuns în cel puțin trei din cele cinci studii și două intensități consecutive pentru care șobolanii nu au răspuns în trei sau mai multe din cele cinci studii. Pragul general al sesiunii a fost definit ca media pragurilor pentru cele patru serii individuale. Fiecare sesiune de testare a avut o durată de aproximativ 30 min. Pragurile BSR stabile au fost definite ca variații ≤10% în praguri în timpul zilelor consecutive 5, stabilite de obicei după 10-14 d de formare. Latența răspunsului pentru fiecare sesiune de testare a fost definită ca o latență medie a răspunsului tuturor studiilor în care a avut loc un răspuns pozitiv.

Livrare și livrare virale.

ARN scurt de ac de păr a fost livrat și exprimat constitutiv folosind sistemul vectorial pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Particulele virale au fost preparate conform protocolului producătorului. Pe scurt, celulele HEK 293FT au fost transfectate cu vector care conține inserția shRNA (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCTCACACTCGAG-3 ') sau vectorul gol, plus ViraPower Packaging Mix (Invitrogen) timp de 72 h. Supernatantul a fost apoi colectat și concentrat prin ultracentrifugare (24g, rotor Beckman Coulter SW 76,755 TI., 32 min, 90 ° C) și titlul viral a fost determinat prin sortarea celulelor activate prin fluorescență conform instrucțiunilor producătorului. Virusul a fost alicotat și depozitat în cutii protejate împotriva luminii la -4 ° C până la utilizare.

Șobolanii cu praguri BSR stabile au primit injecții virale bilaterale la trei locuri în striatumul fiecărei emisfere cerebrale (2 μl pe injecție, 1 μl min-1, 1 min între injecții, un total de șase injecții pe șobolan). Șobolanilor li sa permis cel puțin recuperarea 2-3 d din injecții intrastriatale înainte de reluarea evaluării pragului BSR. Evaluarea zilnică a pragului BSR a continuat pentru 33 d după injecțiile cu virus pentru a asigura realizarea knockdown-ului maximal striatal D2R înainte de a permite accesul șobolanilor la dieta din cafenea. Nu au existat diferențe între pragurile BSR dintre șobolanii Lenti-control și Lenti-D2Rsh în timpul acestor 33 d (datele nu sunt prezentate).

Imunoblotare.

Șobolanii au fost uciși aproximativ 1 h după accesul lor regulat la cantina și creierele au fost îndepărtate rapid. Secțiunile creierului cu grosimea ~ 1-2 mm au fost preparate utilizând o matrice creierului coronal (interval 1-mm, Plastics One) pe un bloc de gheață și au fost luate pumnii de țesut striat dorsal (bregma: ~ 2.2 la -0.26 mm). Striaturile de țesut stricat au fost colectate rapid, au fost înghețate și stocate la -80 ° C până la utilizare. Probele individuale au fost dezghețate pe gheață și s-au colectat cantități egale de țesut striatal pe baza unei divizări mediane a grupurilor de acces dependente de greutate (șobolani 7-10 per bazin). Țesutul a fost resuspendat în tampon RIPA rece (glicemie RIPA) cu gheață de gheață (Thermo Scientific) conținând ortovanadat de sodiu, inhibitori de fosfatază cocktail 500 și 1 (Sigma-Aldrich), leupeptin și pepstatin înainte de omogenizare. Lizatele de țesut au fost fierte timp de 2 min în tampon de probă și încărcate pe geluri SDS cu 10% -4% sau 20% Tris-glicină (Invitrogen). Proteina a fost transferată pe membrane de nitroceluloză, blocată pentru 10 h la 1-23 ° C (25% lapte uscat fără grăsime și 5% Tween-0.2 în PBS, pH 20) și incubată în anticorp primar peste noapte la 7.4 ° C. Următorii anticorpi primari au fost diluați în soluție bloc: monoclonală de șoarece D4R (Santa Cruz, 2: 1) sau monoclonal de șoarece β-actină (Santa Cruz, 100: 1). S-a adăugat reactiv ECL chemiluminescent după incubarea cu anticorpi secundari conjugați cu peroxidază de hrean (Amersham, 200: 1). Forma D2,000DR (~ 2 kDa) 70, 17 asociată membranei mature a fost normalizată la un control al încărcării cu proteine ​​(β-actină; 49 kDa) și cuantificat prin densitometrie utilizând software NIH Image J.

Analiza imunochimică.

Șobolanii au fost anesteziați și perfrațiați transcardial cu 4% paraformaldehidă în PBS (pH 7.6). Creierele au fost îndepărtate, postfixate peste noapte și depozitate în zaharoză (soluție 30% în PBS, pH 7.4) timp de cel puțin 72 h. Secțiunile de țesut înghețat (grosimea 30 μm) au fost colectate de la un microtom și blocate (3% BSA, 5% ser de capră normală și 0.3% Triton X-100 în PBS) pentru 1 h la -23-25 ° C. Următorii anticorpi primari au fost adăugați la soluția bloc și au fost incubați peste noapte la 4 ° C: pui policlonal la GFP (Abcam, 1: 1,000); iepure monoclonal la GFAP (Millipore, 1: 1,000); mouse monoclonal la NeuN (Millipore, 1: 1,000). Secțiunile au fost incubate cu anticorpi secundari conjugați cu coloranți fluorescenți la 23-25 ° C: colorant anti-pui-488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), colorant anti-iepure-594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ) și colorant anti-șoarece-594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Secțiunile au fost montate cu suporturi de montare Vectashield care conțin DAPI (Vector Labs) și plafonate. Imaginile au fost luate cu ajutorul unui microscop de fluorescență Olympus BX61 (obiectiv × 2) sau al unui microscop confocal Olympus (obiective X × NUMX și × 10).

Procedura de alimentare.

Șobolanii au fost adăpostiți individual pe așternut de hârtie (plăcuțe alfa, Shepherd Specialty Papers) pentru a împiedica produsele alimentare să fie murdare cu materiale de așternut în vrac. Dieta pentru cafenea a constat din slănină, cârnați, cheesecake, tort de lire, glazură și ciocolată, care au fost cântărite individual înainte de a fi puse la dispoziția șobolanilor. Produsele alimentare de la cafenea au fost livrate în recipiente metalice mici. Toate produsele alimentare, inclusiv vase de laborator standard, au fost cântărite din nou la încheierea sesiunii de hrănire. Aportul caloric din diferitele macronutrienți a fost calculat utilizând informațiile nutriționale furnizate de producător.

Cue-indusă suprimarea comportamentului de hrănire.

Procedurile de alimentare au avut loc în camere operante atenuate de sunet identice ca dimensiuni cu cele utilizate în experimentele BSR. Șobolanii au fost așezați într-o cameră operantă și au avut acces la dieta de la cafenea sau chow timp de 30 de minute. Produsele alimentare au fost livrate în recipiente metalice mici. Toate produsele alimentare au fost cântărite înainte și după sesiunile de hrănire, care au fost efectuate în timpul perioadei normale de hrănire a șobolanilor. Consumul de chow a fost evaluat prin consumul de pelete de chow de 45 mg identice în compoziție cu chow-ul furnizat în cuștile de acasă ale șobolanilor. Șobolanilor li s-a permis apoi accesul de 30 de minute pe zi la dieta cafenelei până când s-a obținut aportul stabil (definit ca o variație <10% a aportului zilnic), necesitând 5-7 zile. După stabilizarea aportului de alimente gustabile în această perioadă de bază, șobolanii din fiecare condiție de acces au fost alocați la două grupuri: pedepsiți (cei care primesc șoc la nivelul piciorului) și nepedepsiți (care nu primesc șoc la picior). Șobolanii au fost apoi supuși la patru sesiuni de condiționare în zile consecutive în aceeași cameră operantă în care anterior au avut acces la mâncarea gustativă. În timpul sesiunilor de condiționare de 30 de minute, a fost activată o lumină de repere (stimul condiționat) timp de 10 minute, oprită timp de 10 minute, apoi reaprinsă timp de 10 minute. Șobolanii pedepsiți au primit șoc la picioare numai în timpul prezentării luminii tac (0.5 mA timp de 1.0 s; 10 stimulări cu intervale de ~ 1 min). Șobolanilor nepedepsiți li s-a prezentat lumina de semnalizare în același mod, dar fără administrarea șocului piciorului. În ziua testului, a doua zi după ultima sesiune de condiționare, șobolanii din grupurile pedepsiți au primit șoc intermitent la nivelul piciorului (cinci stimulări în total) asociat cu activarea luminii tac timp de 5 minute. Șobolanii nepedepsiți au fost din nou expuși la lumina tacului în absența șocului piciorului. După perioada de pedeapsă de 5 minute, tuturor șobolanilor li s-a permis accesul la mâncarea plăcută pentru o sesiune de 30 de minute cu stimulul condiționat activat intermitent (lumină de 10 minute aprinsă, lumină de 10 minute oprită, lumină de 10 minute aprinsă).

Analize statistice.

Pragurile de bază pentru recompense au fost definite ca valoarea medie a pragului pentru 5 d înainte de accesul la dieta pentru cafenea pentru fiecare subiect. Ratele de recompensă au fost exprimate ca variație procentuală față de valoarea pragului de referință. Datele privind procentul valorilor pragului de bază pentru recompensă, creșterea în greutate, consumul caloric și consumul caloric din grăsimi au fost analizate prin analiza varianței cu două factori, măsurători repetate, cu acces (doar chow, acces restrâns sau acces extins) (de exemplu, în cazul unei diete standard sau al unei cantine), a virusului (Lenti-control sau Lenti-D2Rsh) și a tacului (asociat sau neparticipat cu pedeapsa) ca factori între subiecți și timp ca factor în subiecți. După caz, efectele principale în analizele de variație au fost analizate în continuare prin testele Bonferroni post hoc. Toate analizele statistice au fost efectuate utilizând software-ul GraphPad Prism.

Referinte

Referinte

Corespondența cu:

· Paul J Kenny ([e-mail protejat])