Front Endocrinol (Lausanne). 2017; 8: 216.
Publicat online 2017 Aug 29. doi: 10.3389 / fendo.2017.00216
PMCID: PMC5581815
Julie Paradis,1 Pierre Boureau,1 Thomas Moyon,1 Sophie Nicklaus,2 Patricia Parnet,1,*† și Vincent Paillé1,*†
Abstract
Consumul matern perinatal de alimente bogate în energie crește riscul de obezitate la copii. Acest lucru este asociat cu un consum excesiv de alimente gustoase care sunt consumate pentru proprietatea sa hedonică. Mecanismul de bază care leagă dieta maternă perinatală și preferința descendenților pentru grăsime este încă puțin înțeles. În acest studiu, ne propunem să studiem influența alimentației materne cu conținut ridicat de grăsimi/zahăr [dieta occidentală (WD)] în timpul gestației și alăptării asupra căilor de recompensă care controlează hrănirea puilor de șobolan de la naștere până la maturitatea sexuală. Am efectuat o urmărire longitudinală a descendenților WD și Control la trei perioade critice de timp (copilărie, adolescență și vârsta adultă) și ne-am concentrat pe investigarea influenței expunerii perinatale la o dietă plăcută asupra (i) preferinței grăsimilor, (ii) a profilului expresiei genelor. și (iii) modificări neuroanatomice/arhitecturale ale rețelelor dopaminergice mezolimbice. Am arătat că hrănirea WD limitată la perioada perinatală are o influență clară de lungă durată asupra organizării circuitelor homeostatice și hedonice ale creierului, dar nu și asupra preferinței de grăsime. Am demonstrat o evoluție specifică perioadei a preferinței pentru grăsime pe care am corelat-o cu semnăturile moleculare specifice ale creierului. La descendenții de la femele hrănite cu WD, am observat în timpul copilăriei existența preferinței de grăsime asociată cu o expresie mai mare a genei cheie implicate în sistemele dopaminei (DA); la adolescență, o preferință bogată în grăsimi pentru ambele grupuri, redusă progresiv în timpul testului de 3 zile pentru grupul WD și asociată cu o expresie redusă a genei cheie implicate în sistemele DA pentru grupul WD care ar putea sugera un mecanism compensator pentru a le proteja de la expunerea suplimentară la grăsimi; și, în sfârșit, la vârsta adultă, o preferință pentru grăsime care a fost identică cu șobolanii de control, dar asociată cu modificarea profundă a genelor cheie implicate în rețeaua de acid γ-aminobutiric, receptorii serotoninei și remodelarea hipotalamusului dependentă de acid polisialic-NCAM. În total, aceste date arată că WD maternă, limitată la perioada perinatală, nu are un impact susținut asupra homeostaziei energetice și preferinței grăsimilor mai târziu în viață, chiar dacă a avut loc o remodelare puternică a căii homeostatice hipotalamice și a recompensei implicate în comportamentul alimentar. Ar fi necesare experimente funcționale suplimentare pentru a înțelege relevanța remodelării acestor circuite.
Introducere
Mediul și evenimentele timpurii ale vieții sunt acum bine recunoscute că contribuie la sănătate și predispoziție la boli mai târziu în viață (1-3). Conceptul de amprentare metabolică a fost propus pentru a descrie modul în care schimbările din mediul nutrițional și hormonal în timpul perioadei perinatale pot predispune descendenții la obezitate și patologiile asociate acesteia mai târziu. O problemă semnificativă a modului nostru de viață occidental este supranutriția ca urmare a consumului de alimente bogate în energie. Într-adevăr, persoanele care sunt expuse la aportul matern al acestui tip de alimente prezintă un risc mai mare de a dezvolta obezitate și sindrom metabolic (4, 5). Multe studii au arătat că dieta maternă bogată în grăsimi (HFD) prin gestație și alăptare are un efect pe termen lung asupra metabolismului puilor (6-8). Pe lângă căile implicate în reglarea metabolică, sistemele de recompensă ale creierului joacă, de asemenea, un rol important în comportamentul de hrănire (9, 10). Neurotransmisia dopaminei mezolimbice (DA), studiată intensiv în contextul recompensei și dependenței, este modificată în obezitatea indusă de dietă la ambii oameni (11-13) și animale (14-16). Proiecțiile DA se dezvoltă, în mare parte, postnatal (17), și, prin urmare, dezvoltarea lor poate fi afectată de dieta timpurie. În ultimii câțiva ani, experimentele pe rozătoare au evidențiat că aportul matern de HFD îmbunătățește hrănirea hedonică a descendenților (18, 19). Chiar dacă această observație a implicat unele modificări în funcția sistemului DA (20-22), sunt disponibile date limitate privind ontogeneza și remodelarea căilor de recompensă în timpul vieții timpurii (21). În plus, nu este documentat dacă și cum partea de semnalizare non-DA a sistemului de recompensă, cum ar fi sistemul GABA (acidul y-aminobutiric), ar putea fi afectată de stresul nutrițional perinatal. Într-adevăr, neuronii GABA par să joace un rol cheie în recompensă și aversiune. Zona tegmentală ventrală (VTA) Neuronii GABA primesc un model similar de intrare din diferite zone ale creierului (23), iar studiile comportamentale bazate pe optogenetic evidențiază rolul major al VTA GABA în aversiunea la locul condiționat (24) și în recompensarea comportamentului consumator (25). Nucleus accumbens (NAc) este constituit în principal din proiecția neuronilor spinoși medii GABAergici și acționează ca o interfață limbico-motorie integrând semnalele care decurg din sistemul limbic și transformându-le în acțiune. de ieșire către pallidum ventral (VP) și alți efectori motorii (26). Și, în sfârșit, hipotalamusul care este constituit din numeroase conexiuni GABA în LH (27) și nucleul arcuat, integrează semnale de foame și sațietate (10).
Acest studiu urmărește identificarea influenței aportului maternal western (WD) la puii de șobolan de la naștere până la maturitatea sexuală (i) asupra preferinței de grăsime (ii) asupra profilului de expresie genică a sistemului DA, a sistemului GABAergic și a plasticității hipotalamusului. și (iii) asupra modificărilor neuroanatomice/arhitecturale ale rețelelor dopaminergice mezolimbice pentru aceeași perioadă. Prin urmare, am evaluat, într-un studiu longitudinal (de la înțărcare, P25, până la maturitatea sexuală, P45 și vârsta adultă, P95), efectul WD materne asupra creșterii greutății corporale și dezvoltării țesutului adipos al descendenților ținuți sub mâncare regulată după înțărcare. Concomitent, am efectuat un test de preferință a grăsimilor, urmat de o analiză transcriptomică dedicată și analiza componentelor principale (PCA) ulterioară a unei selecții de markeri pentru aportul alimentar, alegerea și sistemele de reglementare a motivației. Rezultatele noastre au îmbogățit semnificativ rezultatele recente, concentrându-se pe programarea nutrițională a sistemului DA.
Materiale și metode
Declarație de etică
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale comitetului local pentru bunăstarea animalelor, UE (directiva 2010/63/UE), Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, Franța) și Departamentul veterinar francez (A44276). Protocolul experimental a fost aprobat de comitetul de etică instituțional și înregistrat sub referința APAFIS 8666. S-au luat toate măsurile de precauție pentru a minimiza stresul și numărul de animale utilizate în fiecare serie de experimente.
Animale și diete
Animalele au fost menținute într-un ciclu lumină/întuneric de 12 ore/12 ore la 22 ± 2°C cu hrană și apă ad libitum. Treizeci și două de femele de șobolan Sprague-Dawley (greutate corporală: 240-290 g) în ziua 1 de gestație (G1) au fost achiziționate direct de la Janvier (Le Genest Saint Isle, Franța). Au fost cazați individual și hrăniți fie cu o dietă de control (CD) (5% grăsime de vită și 0% zaharoză) pentru 16 dintre ele, fie cu WD (21% grăsime de vită și 30% zaharoză) pentru 16 dintre ele în timpul perioadelor de gestație și lactație. (Vezi tabelul Table1: 1: compoziția dietei în procente de kcal de la ABdiet Woerden, Țările de Jos). La naștere, dimensiunea puiului a fost ajustată la opt pui pe așternut, cu un raport de 1:1 mascul la femelă. Am păstrat 12 din 16 femele cu un așternut compus din 4 masculi și 4 femele pentru fiecare grupă. La înțărcare (P21), puii născuți din femele CD și WD au fost ținuți în mâncare standard până la sfârșitul experimentului (Figurile (Figurile 1A,B).1A,B). Greutatea corporală a puilor a fost înregistrată la naștere și ulterior în fiecare zi la ora 10:00 până la P21 (înțărcare). După înțărcare și până la sfârșitul experimentului, șobolanii au fost cântăriți la fiecare 3 zile. Prezentăm date numai despre descendenții masculi. Femelele de șobolan au fost utilizate pentru un alt studiu (Figura (Figure11).
Comportament (test de alegere în două sticle)
Au fost studiate trei perioade critice de dezvoltare (P21 până la P25: juvenile, P41 până la P45: adolescență și P91 până la P95: adult tânăr). 24 de pui masculi (n = 12 per grup) au fost selectați aleatoriu și plasați într-o cușcă individuală pentru a efectua un test gratuit cu două sticle (Figuri (Figurile 1A,B)1A,B) (28-30). Acest test a fost folosit pentru a studia în mod specific atractivitatea față de gustul de grăsime prin disocierea acestuia de gustul dulce și pe cât posibil de efectul metabolic al aportului de calorii. Într-adevăr, consumul de soluție de ulei de porumb 1% este asociat doar cu un aport de 0.09 kcal/ml. După o zi de obișnuire cu prezența a două sticle, testul a fost efectuat timp de 2 zile la P25 și peste 4 zile la P41 și P91 (Figura (Figure1A) .1A). În detalii, la înțărcare (P21), 24 de pui au fost adăpostiți individual timp de 2 zile (Figura (Figura 1A): 1A): ziua 1, faza de obișnuire, ziua 2, șobolanilor li s-a oferit o alegere liberă de două sticle între o emulsie de ulei de porumb 1% în gumă xantan 0.3% (Sigma Aldrich, St. Quentin Fallavier, Franța) și soluție de gumă xantan ( 0.3%). La P41 și P91, s-au folosit 24 de pui și s-au propus două sticle libere pentru trei zile consecutive. Consumul de soluție de gumă xantană și soluție de gust (ulei de porumb 1%) a fost înregistrat zilnic la ora 11:00 timp de 3 zile (P45 și P95). Poziția celor două sticle a fost inversată zilnic pentru a preveni părtinirea preferinței de poziție. Scorul de preferință pentru grăsimi a fost calculat ca raportul dintre volumul „soluției de grăsime” consumat și volumul total consumat în 24 de ore. Toți șobolanii au fost menținuți sub dietă standard de mâncare pe tot parcursul testului comportamental.
Recoltarea țesuturilor și prelevarea de probe de sânge
A doua zi după ultima zi a testului cu două sticle, jumătate dintre șobolani (n = 6 per grup) au fost eutanasiați rapid între orele 09:00 și 12:00 de către CO2 inhalare. Sângele a fost colectat în tuburi cu EDTA (Laboratoires Léo SA, St Quentin en Yvelines, Franța) și centrifugat la 2,500 g timp de 15 minute la 4°C. Plasma a fost congelată la -20°C. Organele și depozitul individual de grăsime retroperitoneal au fost disecate și ponderate. Creierul a fost îndepărtat rapid și plasat într-o matrice cerebrală (WPI, Sarasota, FL, șobolan SUA 300-600 g). Mai întâi a fost disecat hipotalamusul [după coordonatele atlasului lui Paxinos: −1.0 până la −4.5 mm de la Bregma (31)] apoi, pentru fiecare șobolan, s-au obținut două felii coronale de 2 mm grosime la nivelul NAc și încă una la nivelul VTA. Probele de NAc din dreapta și stânga și VTA din dreapta și din stânga (patru probe în total per animal) au fost obținute rapid folosind două perforatoare de biopsie diferite (Laboratoarele Stiefel, Nanterre, Franța) (diametru de 4 mm pentru NAc și 3 mm). pentru mezencefalul ventral). Probele au fost congelate în azot lichid și depozitate la -80 ° C pentru determinarea ulterioară a expresiei genelor prin matrice de densitate scăzută TaqMan (TLDA).
Ceilalți șobolani (n = 6 per grup) au fost anesteziați profund cu pentobarbital (150 mg/kg ip) și perfuzați cu o perfuzie salină fiziologică transcardială urmată de paraformaldehidă 4% rece ca gheață în tampon fosfat (PB), pH 7.4. Creierele au fost îndepărtate rapid, scufundate în același fixativ timp de 1 oră la 4 ° C și în cele din urmă depozitate în zaharoză PB 25% timp de 24-48 ore. Creierele au fost apoi congelate în izopentan la -60 ° C și în cele din urmă depozitate la -80 ° C până la utilizare. NAc, hipotalamus și VTA au fost tăiate în secțiuni coronale seriale de 20 um cu un criostat (Microm, Microtech, Francheville, Franța). Au fost efectuate două sau trei serii de 10 lame de sticlă care conțin 4-6 secțiuni pentru fiecare zonă a creierului. Pentru fiecare lamă de sticlă, secțiunile în serie sunt distanțate la 200 µm (Figura (Figure66).
Analize biochimice de plasmă
Plasma EDTA colectată pe șobolani P25, P45 și P95 a fost utilizată pentru a măsura glucoza plasmatică, NEFA (acizi grași neesterificati), insulina și leptina. Glucoza și NEFA au fost măsurate folosind reacții enzimatice colorimetrice cu truse specifice (kituri glucoză și NEFA PAP 150, BioMérieux, Marcy-l'Etoile, Franța). Hormonii au fost testați cu truse ELISA specifice, urmând instrucțiunile producătorului pentru insulină și leptină (kit ELISA pentru insulină de șobolan/șoarece, kit ELISA pentru leptină de șobolan, Linco Research, St. Charles, MO, SUA).
imunohistochimie
Lamele de sticlă care conțineau secțiuni seriale de VTA și NAc au fost mai întâi blocate timp de 3-4 ore și apoi incubate peste noapte la 4°C cu un amestec de următorii anticorpi: anti-NeuN de șoarece (1:500; IgM; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, SUA) și iepure anti-TH (1:1,000; Millipore Bioscience Research Reagents, Merk, SUA). După incubarea cu anticorpi primari și spălarea ulterioară cu PB, secțiunile au fost incubate într-un amestec de anticorpi secundari: IgM anti-șoarece de măgar conjugat Alexa 488 și IgG anti-iepure de măgar conjugat Alexa 568 (1:500; Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham) , MA, SUA) timp de 2 ore. Secțiunile au fost montate în superfrost plus lame de aur (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA), uscate la aer și acoperite cu reactiv antidecolorare ProLong™ Gold (Invitrogen, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, SUA).
Numărul de neuroni TH în VTA
Pentru fiecare șobolan, celulele TH-pozitive au fost numărate așa cum s-a descris anterior (32) la trei niveluri rostrocaudale diferite ale VTA: la nivelul ieșirii celui de-al treilea nerv (distanța față de Bregma: −5.3 mm), 200 µm rostral și 200 µm caudal la acest nivel (Figurile (Figurile 6A).6A). Pentru partea stângă și dreapta, a fost obținută o imagine digitalizată care cuprinde întregul VTA de la tractul terminal accesoriu medial până la marginea laterală a mezencefalului, folosind o mărire ×40 a unui scanner digital de diapozitive NanoZoomer-XR. C12000 (Hamamatsu, Japonia). A fost trasată o linie în jurul perimetrului VTA pentru fiecare secțiune. Granițele au fost alese examinând forma celulelor și făcând referire la atlasul Paxinos și Watson. Un neuron dopaminergic a fost definit ca un corp celular imunoreactiv NeuN(+)/TH(+) cu nucleu clar vizibil. Folosind software-ul NIH Image J (plugin de contor de celule), celulele NeuN(+)/TH(+) au fost numărate de două persoane diferite fără cunoștințe despre grupurile de animale. Erorile de numărare a celulelor divizate au fost corectate folosind formula Abercrombie (32), Unde N = n[t/(t + d)] (N = numărul total de celule; n = numărul de celule numărate; t = grosimea secțiunii; și d = diametrul celulei), iar acest factor de corecție a fost 0.65. Datele sunt exprimate ca medie [NeuN(+)/TH(+) în VTA stânga și dreapta] ± SEM.
Densitatea fibrei TH în NAc
Conținutul de proteină TH în terminalele nervoase dopaminergice ale NAc a fost estimat prin analiza anatomică densitometrică a secțiunilor imunomarcate cu TH. Densitatea fibrelor TH a fost cuantificată la trei niveluri arbitrare de-a lungul axei rostrocaudale a NAc (Bregma 2.20, 1.70 și 1.20 mm) (Figura (Figure6B) .6B). Pe scurt, imagine digitalizată cuprinzând întregul striat și NAc obținută folosind o mărire ×40 a unui scanner digital de diapozitive NanoZoomer-XR C12000 (Hamamatsu, Japonia) au fost obținute. Pentru un anumit NAc, a fost trasată o linie în jurul întregului nucleu pentru a defini zona de măsurare a densității optice (OD) (Figura (Figure6B) .6B). Valoarea obținută a fost normalizată cu valoarea OD măsurată dintr-o zonă circulară desenată pe corpul calos (o regiune necolorată pentru imunochimia TH) din aceeași secțiune folosind software-ul NIH Image J. Datele sunt exprimate ca o medie a raportului DO (valoarea DO în valoarea NAc/OD în corpul calos al celor trei secțiuni) ± SEM.
Expresia genică de către TLDA și TaqMan
ARN-ul a fost izolat din NAc congelat rapid, probe îmbogățite cu VTA și hipotalamus, utilizând trusa NucleoSpin ARN/proteine (Macherey-Nagel, Hoerdt, Franța). ARN-ul total a fost supus digestiei cu DNază urmând instrucțiunile producătorului, cantitatea a fost estimată prin absorbanța UV de 260/280 nm, iar calitatea a fost evaluată folosind sistemul de bioanalizator Agilent 2100, apoi a fost calculat numărul de integritate a ARN (RIN). Probele cu un RIN sub 8 au fost aruncate. Un microgram de ARN total a fost transcris invers în ADNc utilizând trusa RT de înaltă capacitate (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA) într-un volum total de 10 ui.
După cum sa descris anterior (33), TLDA este un card micro-fluidic cu 384 de godeuri pe care pot fi efectuate 384 de PCR-uri simultane în timp real (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Am folosit un TLDA special conceput pentru a acoperi diferite familii de gene relevante pentru plasticitate și reglarea aportului alimentar. Fiecare card personalizat a fost configurat ca linii de încărcare cu 2 × 4 eșantioane care conțin 2 × 48 camere de reacție (referință: 96a). Un set de 92 de gene (Tabel S1 în Material suplimentar) și au fost studiate patru gene menajere (18S, Gapdh, Polr2a și Ppia). PCR în timp real a fost efectuată utilizând reactivi Life Technologies TaqMan și rulată pe sistemul de detectare a secvenței ABI Prism 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA). Datele brute de fluorescență au fost colectate prin PCR folosind software-ul SDS 2.3 (Applied Biosystems, Foster City, CA, SUA), care a generat în continuare cicluri de prag Ct cu determinarea automată atât a liniei de bază, cât și a pragului. După filtrarea utilizând aplicația cloud ThermoFisher (ThermoFisher, SUA) pentru a discrimina rulările PCR aberante, testele per probă au fost n = 6 (n = 5 pentru grupul WD la P25). Datele au fost apoi analizate cu aplicația ThermoFisher Cloud (ThermoFisher, SUA) pentru cuantificare relativă. Cuantificarea relativă a expresiei genelor (RQ) s-a bazat pe metoda comparativă Ct folosind ecuația RQ = 2-ΔΔCt, unde ΔΔCt pentru o țintă de genă a fost propria sa variație Ct scăzută dintr-o probă de calibrare și normalizată cu un control endogen. Mai exact, am determinat cea mai stabilă genă de menaj folosind algoritmul geNorm (ThermoFisher Cloud App RQ, ThermoFisher, SUA). Printre cele patru gene de menaj, Gapdh a fost definit ca control endogen pentru NAc și hipotalamus și Ppia pentru VTA și acest lucru a fost valabil pentru toate probele din cele trei perioade de timp analizate. Reprezentarea grafică a expresiei genelor a fost proiectată manual pentru a atribui o culoare pentru o creștere de 10% a expresiei genelor în raport cu grupul CD. Variația semnificativă, folosind testul Wilcoxon cu rang semnat neparametric, a fost notă cu un asterisc.
Analiza statistică
Rezultatele sunt exprimate ca medie ± SEM în tabele și figuri. Testul neparametric Mann-Whitney a fost utilizat pentru analiza greutății corporale la diferite momente, preferințele de grăsime și raportul OD obținut din imunohistochimie.
Pentru a evalua semnificația preferințelor de grăsime de 3 zile, am efectuat o analiză statistică pe coloană pentru fiecare zi. Pentru fiecare grup, consumul de soluție de grăsime și soluție de control a fost testat utilizând testul Wilcoxon neparametric cu rang semnat. Am comparat valoarea medie a preferinței cu valoarea ipotetică de 50% (linia roșie punctată). Variația semnificativă a fost observată cu un asterisc roșu. Am folosit același test pentru analiza valorii qPCR RQ; am comparat valoarea medie RQ cu valoarea ipotetică de 1. Variația semnificativă a fost observată cu un asterisc (Figura (Figure44).
Pentru analiza probei de plasmă, am efectuat un test neparametric Mann și Whitney. Numărul de celule TH-pozitive a fost analizat cu ANOVA bidirecțională și p valoarea a fost calculată. Din cauza multiplicității testelor implementate, un Bonferroni post hoc corectarea a fost aplicată numai după acest test. Analiza statistică a fost efectuată folosind software-ul Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, SUA).
Un PCA nesupravegheat a fost efectuat pentru prima dată pe 130 de parametri (TLDA, comportament și date de plasmă) la momente diferite pentru fiecare perforație de biopsie cerebrală (VTA, NAc și hipotalamus) pentru a vizualiza structura generală a setului de date (adică trei PCA globale). pe punct de timp). PCA poate fi definită ca proiecția ortogonală a datelor pe un spațiu liniar de dimensiuni inferioare, astfel încât varianța datelor proiectate să fie maximizată în subspațiu. Mai întâi am filtrat genele care nu sunt exprimate sau puțin exprimate (Figura (Figure5) .5). Valorile pentru descendenții de la diazele hrănite cu CD și de la femelele hrănite cu WD au apărut în culori diferite în diagramele PCA individuale pentru a vizualiza dacă aceste două grupuri experimentale sunt bine separate de componentele PCA nesupravegheate. Această analiză separă grupurile de gene care sunt exprimate diferențial între cele două grupuri de descendenți. Ulterior, au fost efectuate PCA concentrate pe diferite grupări de markeri ARNm: plasticitate (adeziune celulară, citoschelet, factor neurotrofic, sinaptogeneză și reglare a transcripției), cale DA, cale GABAergică, modulatori epigenetici (histone deacetilază și histon acetil transferaza). Aceste PCA concentrate permit vizualizarea simultană a corelației dintre dietele materne și unii markeri și corelații între genele specifice familiei. O scară calitativă a fost utilizată pentru analiza PCA și PCA focalizată: +++: separare foarte bună; ++: separare bună cu un șobolan pe partea greșită a separării PCA; +: separare destul de bună cu doi șobolani (unul din fiecare grup) pe partea greșită, −: nicio separare clară.
REZULTATE
Greutatea corporală și creșterea
Aportul mamei de WD în timpul gestației (de la G1 la G21) nu a afectat greutatea corporală a puilor la naștere (Figura (Figure2) 2) (CD: 6.55 ± 0.07 g vs WD: 6.54 ± 0.05 g p = 0.9232) (Figuri (Figurile 2A,B).2A,B). Creșterea în greutate corporală de la naștere până la înțărcare a fost cu 21% mai mare la puii născuți din femele WD decât descendenții din femele CD cu o greutate corporală semnificativ mai mare la înțărcare la puii născuți din femele WD (36.19 ± 0.90 g vs 47.32 ± 1.48 g p <0.001) (Figura (Figure2C) .2C). De la înțărcare până la sfârșitul experimentului (P95), șobolanii au fost hrăniți cu o dietă standard, iar greutatea corporală a rămas mai mare pentru descendenții de la femele WD decât de la puii de femele CD. În detalii: în timpul adolescenței (P39) (Figuri (Figurile 2A,D),2A, D), CD: 176.8 ± 3.3 g vs WD: 192.2 ± 3.3 g p = 0.0016 și la P93 (adult tânăr) (Figuri (Figurile 2A,E)2A,E) CD: 478 ± 9.9 g vs WD: 508.6 ± 10.3 g p = 0.0452.
Hormoni și markeri metabolici la diferite perioade de timp
Concentrațiile plasmatice de leptină, insulină, glucoză și NEFA au fost măsurate la P25, P45 și P95. La toate vârstele, nivelurile de glucoză în plasmă, NEFA și leptina ale descendenților WD nu au fost diferite din punct de vedere statistic de descendenții CD (Tabel (Table2,2, n = 6 per grup). Am observat o creștere semnificativă a depunerilor de grăsime (raportul masei de grăsime retroperitoneală) la descendenții de la femele hrănite cu WD numai la P25 (p = 0.0327, testul Mann și Whitney).
Impactul WD perinatal asupra preferinței de grăsime de la înțărcare la vârsta adultă
Pentru a explora impactul WD asupra preferinței de grăsime, am folosit o paradigmă de alegere a două sticle în trei momente diferite în timpul creșterii. Acest test a fost folosit pentru a studia în mod specific preferința pentru gustul de grăsime, evitând pe cât posibil efectul metabolic al ingerării acesteia. Am arătat că diferențele în aportul de calorii „în plus” din biberon (la P25, P45 și P95) nu sunt semnificative statistic. între grupuri (Figurile S1A–C în material suplimentar). În plus, diferența de consum de soluție de ulei de porumb 1% are ca rezultat o creștere a caloriilor cu 1% pentru șobolanii WD la P25 (WD: 4.9% față de CD: 3.9% din caloriile ingerate) și 0.5% pentru șobolanii CD la P45 (WD: 2% față de CD: 2.5% din caloriile ingerate) (Figuri S1D–F în material suplimentar). La P25, puii de la femele CD nu au preferință pentru grăsime (44.87 ± 9.8%, p = 0.339); pe de altă parte, șobolanii WD prezintă o preferință pentru grăsime (75.12 ± 8.04%, p = 0.039 după testul Wilcoxon cu rang semnat, asterisc roșu). Mai mult, există o diferență statistică între cele două grupuri cu p = 0.0347 (testul Mann și Whitney, etichetă hash neagră) (Figura (Figure33A).
La P45 și P95, cele două grupuri au o preferință semnificativă pentru grăsime, adică semnificativ diferită de valoarea teoretică de 50% (la P45, CD: 80.68 ± 2.2% p = 0.0005 și WD: 78.07 ± 3.25% p = 0.0005; la P95, CD: 74.84 ± 8.4% p = 0.0425 și WD: 69.42 ± 8.9% p = 0.109 după testul Wilcoxon cu rang semnat, asterisc roșu) (Figura (Figure3A) .3A). Valorile pentru cele două grupuri au fost nediferențiate după o zi de prezentare a gustului (la P45 p = 0.7857 și la P95 p = 0.9171 Testul Mann–Whitney) (Figura (Figure33A).
Pentru a ști cum șobolanii își reglează consumul de grăsime în timp, am repetat prezentarea grăsimilor timp de trei zile consecutiv la P45 și P95 (Figurile (Figurile 3B,C).3B,C). Interesant, la P45, numai masculii din barajele WD și-au pierdut progresiv preferința pentru soluția de grăsime (Figura (Figure3B) 3B) (a treia zi: 53.12 ± 8.36% p = 0.851 după testul Wilcoxon de rang semnat). Totuși, la P95 (vârsta adultă) toate animalele au preferat grăsimea fără evoluție în timpul testului de 3 zile (Figura (Figure33C).
Pe scurt, în acest model, am observat, în stadiu incipient (copilărie), o preferință pentru grăsime la șobolanii hrăniți de femele WD cu un dezinteres progresiv în timp în timpul adolescenței. Nu am observat nicio diferență între cele două grupuri de șobolani la vârsta adultă.
Semnătura moleculară a plasticității creierului și remodelarea circuitelor GABA în hipotalamus și căile de recompensă
Pentru a determina dacă aportul matern de WD în timpul gestației și alăptării are un impact asupra hipotalamusului și căilor de recompensă ale urmașilor, am măsurat expresia relativă a mai multor factori cheie ai plasticității creierului, modelării creierului și markerilor circuitelor neuronale implicate în aportul alimentar și epigenetic. regulatorii. Am folosit TLDA pentru a analiza abundența lor în diferite zone ale creierului (de exemplu, hipotalamus, VTA și NAc) (Tabel S1 în Material suplimentar) la cele trei perioade de timp. Screening-ul a fost efectuat după testele de alegere a două sticle la P25, P45 și P95 (Figura (Figure1) 1) pe șase masculi născuți din baraje hrănite cu WD și șase masculi născuți din baraje hrănite cu CD.
La P25 în hipotalamus, cinci gene din treisprezece categorii diferite au afișat un nivel semnificativ mai scăzut de expresie a ARNm, în principal în markerii de plasticitate și markerii GABA, variind între -20% (Gfap) și -40% (Gabra5) la puii de la femele hrănite cu WD în comparație cu șobolanii de la Diguri alimentate cu CD. În biopsiile căii recompensei (VTA și NAc), două gene au afișat un nivel statistic mai mare de expresie a ARNm (D2R și Gabra1), adică semnalizarea DA și receptorii GABA și o genă o expresie mai scăzută (Hcrtr2) (adică receptorul orexinei 2) în NAc , în timp ce patru gene au afișat un nivel de expresie a ARNm semnificativ mai mare (Map2, Gabara1, Hcrtr1 și Hcrtr2) (adică markeri de plasticitate, receptori GABA și receptori serotoninergici) în VTA (Figura (Figure44).
La P45 în hipotalamus, cinci gene din treisprezece categorii diferite au afișat un nivel mai scăzut de expresie a ARNm, variind între -20% (Fos) și -50% (FosB) la puii de la femele hrăniți cu WD, comparativ cu șobolanii de la femele hrăniți cu CD. La P45 în biopsiile căii de recompensă, patru gene au afișat un nivel mai mare de expresie a ARNm (Gfap, Dat, Cck2r și Kat5) și două gene o expresie mai scăzută (Fos și FosB) în NAc, în timp ce trei gene au afișat un nivel mai scăzut de expresie a ARNm (Arc, FosB și Th) și o genă la un nivel superior (Gabrg2) în VTA.
La P95 în hipotalamus, 20 de gene din treisprezece categorii diferite au afișat un nivel mai mare de expresie a ARNm, variind între +20 și +40% (Syt4 până la Gjd2) și 3 gene au afișat o expresie mai scăzută a ARNm (FosB, D1r și Gabarb1) la puii de la WD. baraje hrănite în comparație cu șobolanii din baraje hrănite cu CD. La P95 în biopsiile căii de recompensă, 12 gene au afișat un nivel mai mare de expresie a ARNm, variind între +20 și +40% (Syn1 la Hcrt1) și 1 genă o expresie mai scăzută (Th) în NAc, 6 gene au afișat un nivel mai mare de expresie a ARNm (Ncam1) , Gja1, Gjd2, Gabra5, Htr1a și Htr1b) și 6 gene au afișat un nivel mai scăzut de expresie a ARNm (Cntf, Igf1, Fos, Socs3, Gabrb2 și Hdac3) în VTA.
Apoi am efectuat trei PCA nesupravegheate corespunzătoare celor trei biopsii ale creierului utilizând toți parametrii cuantificați (adică, doza de plasmă, datele comportamentale și variațiile expresiei ARNm). O separare clară a celor două grupuri a fost obținută numai la P95 pentru NAc și VTA (Tabel (Table33).
În conformitate cu cercul de corelare PCA și datele TLDA (reprezentând majoritatea variabilelor incluse în acest PCA), am definit familiile de gene care ar putea fi responsabile de segregare și am efectuat un PCA focalizat (Figurile (Figurile 5A,B,5A,B, de exemplu). PCA concentrat a arătat că la P25 markerii DA din NAc și markerii de plasticitate din hipotalamus ar putea separa cele două grupuri de descendenți (Tabelul (Table33 pentru rezumat). Atunci nu a fost obținută o astfel de discriminare la P45. Totuși, aceeași analiză la P95 a arătat că diferiții markeri ai sistemului GABA în NAc și hipotalamus, plus markerii de plasticitate (în hipotalamus, NAc și VTA) și regulatorii epigenetici (numai în NAc) contribuie la separarea celor două grupuri de animale ( Figura (Figure5; 5; Masa Table33).
Această analiză dezvăluie influența de lungă durată a dietei perinatale asupra markerilor GABAergici, precum și a plasticității și a markerilor epigenetici atât în calea homeostatică, cât și în cea de recompensă implicată în comportamentul de hrănire.
Imunohistochimia celulelor TH Analiza transcripției confirmate
Deoarece am observat o oarecare variație a ARNm TH în NAc și VTA la diferitele perioade de dezvoltare, ne-am propus să corelăm aceste rezultate cu imunocolorarea TH. Numărul de celule pozitive TH/NeuN a fost analizat în VTA unde sunt localizați corpurile celulare dopaminergice și OD a imunomarcarii TH a fost cuantificată în terminațiile nervoase situate în NAc. Celulele TH (+) au fost mai puțin abundente în VTA ale WD în comparație cu șobolanii CD doar la P45 (Figurile (Figurile 6A,C,E;6AS; Figura S2A în material suplimentar). Nu a existat o interacțiune semnificativă între nivelul secțiunii și cuantificarea TH/NeuN la cele trei perioade (P25 p = 0.9991, P45 p = 0.9026 și P95 p = 0.9170). Doar la P45, s-a obținut o diferență statistică între cele două grupuri de descendenți (p = 0.0002) (Figura (Figura 6E).6E). În plus, nu am observat nicio diferență în OD a imunocolorării TH în NAc la P25 și P45 între cele două grupuri (valori ale raportului OD la P25: 1.314 ± 0.022 în CD vs 1.351 ± 0.026 în WD, p = 0.2681; Valorile raportului OD la P45: 1.589 ± 0.033 în CD vs 1.651 ± 0.027 în WD, p = 0.1542). Cu toate acestea, o scădere semnificativă a OD a terminațiilor nervoase TH a fost găsită în NAc din grupul WD la P95 (valorile raportului OD la p95: 1.752 ± 0.041 în CD vs 1.550 ± 0.046 în WD, p = 0.0037) (Figuri (Figurile 6B,D,F;6B,D,F; Figura S2B în material suplimentar).
Discuție
În acest studiu, am emis ipoteza că supranutriția perinatală maternă va influența programul de dezvoltare a căilor de recompensă implicate în homeostazia energetică, alegerea alimentelor și aportul alimentar al urmașilor. Am examinat pe larg impactul aportului matern de WD de la naștere până la înțărcare asupra căilor GABA, serotoninei și DA ale unor zone specifice ale creierului (VTA, NAc și hipotalamus) la urmași, de la copilărie până la vârsta adultă. Rezultatele noastre sugerează că utilizarea unei diete, bogate în grăsimi și dulciuri, strict limitată la perioada perinatală are un impact asupra preferinței timpurii de grăsime (copilărie) la descendenți corelat cu modificarea profilului de expresie a genelor și modificări neuroanatomice/arhitecturale ale mezolimbicului. rețele dopaminergice. Cu toate acestea, atunci când urmașii au fost ținuți sub dietă alimentară, am observat la șobolanii adolescenți hrăniți cu WD o pierdere progresivă a atractivității față de grăsime, care a fost corelată cu o expresie redusă a genelor sistemului DA și o ușoară reducere a neuronilor TH-pozitivi în VTA. . Mai târziu în viață, preferința grăsimilor nu a fost diferită între grupuri, deși o plasticitate importantă a rețelelor GABAergice și a rețelei de homeostazie energetică a hipotalamusului a fost identificată la șobolanii de la femele hrănite cu WD (Figura (Figure77).
Primul impact al aportului perinatal-WD pe care l-am observat în acest studiu este o greutate corporală crescută a puilor la înțărcare, dar nicio diferență la naștere. Într-adevăr, animalele din grupul WD câștigă cu 21% mai mult în greutate decât CD la sfârșitul perioadei de supt. Studiile anterioare au furnizat rezultate contradictorii în ceea ce privește modificarea greutății la naștere pentru descendenții de la femele hrănite cu WD: o greutate corporală mai mare (19, 34), o greutate corporală mai mică (18, 21, 35) sau nicio diferență (6, 22). Datele noastre sunt în conformitate cu o analiză recentă de metaregresie (36) efectuat pe 171 de publicații experimentale care au concluzionat că expunerea mamei la HFD nu a afectat greutatea puilor la naștere, ci a indus o greutate corporală crescută la sfârșitul perioadei de lactație. Greutatea corporală mai mare a descendenților WD reflectă probabil o schimbare în compoziția laptelui și/sau producția de lapte, care a fost ilustrată în publicațiile anterioare (37, 38). În conformitate cu greutatea corporală mai mare, raportul de grăsime retroperitoneală al descendenților WD a fost semnificativ mai mare decât cel al descendenților CD la sfârșitul perioadei de alăptare (P25, Tabel Tabelul 2), 2), care este, de asemenea, în concordanță cu studiile anterioare (18, 21). Cu toate acestea, adipozitatea mai mare nu a persistat la P45 și P95, iar alți parametri metabolici precum insulina, NEFA și plasma de glucoză nu au fost diferiți între grupuri. Rezultatele noastre au demonstrat că, fără o obezitate maternă clară în timpul gestației și alăptării, dieta în sine nu este suficientă pentru a induce efecte metabolice de durată la descendenți (22, 39, 40).
S-a raportat că aportul perinatal de HFD se corelează pozitiv cu preferința descendenților pentru alimente gustoase (41). În studiul nostru, am efectuat un studiu longitudinal care vizează testarea preferinței de grăsime pe urmașii care sunt înțărcați cu mâncare obișnuită.
Impactul WD perinatal asupra copilăriei (după înțărcare)
Puii de rozătoare mănâncă hrană solidă la 19-20 de zile după naștere (42) când căile lor de recompensă cerebrală nu sunt încă mature (17). Prin urmare, a fost foarte interesant să studiem preferința lor foarte timpurie pentru grăsime și să corelezi această preferință timpurie cu analiza transcrierilor creierului. Imediat după înțărcare, am observat o preferință pentru grăsime la descendenții WD, care nu a fost evidențiată la șobolanii CD. Acest lucru este în concordanță cu alte rapoarte care arată o legătură între malnutriția perinatală și preferința alimentelor gustoase și o preferință scăzută pentru grăsimi la vârsta fragedă pentru șobolanii de control (43).
APC global nu a permis discriminarea grupului de pui în ceea ce privește dieta mamei la acea vârstă. Cu toate acestea, atunci când a fost efectuat un PCA țintit, limitat la markeri DA, am obținut o bună segregare a grupurilor. Într-adevăr, există o creștere marcată a expresiei ARNm a receptorului D2 în NAc la puii WD. Această supraexpresie postsinaptică a D2 în NAc ar putea fi parțial implicată într-o motivație mai mare pentru grăsime (44). Puține alte transcrieri sunt modificate la puii WD comparativ cu puii CD, cum ar fi o creștere a subunității alfa 1 GABAA în NAc și VTA și o scădere a subunității alfa 5 GABAA din hipotalamus care sugerează o reorganizare a receptorilor GABAA din aceste nuclee.
Impactul WD perinatal asupra adolescenței
La P45, am observat o preferință similară cu conținut ridicat de grăsimi pentru ambele grupuri în prima zi de prezentare, dar, interesant, șobolanii WD și-au pierdut progresiv interesul pentru grăsime după prezentări repetate. Adolescența este o perioadă critică de reorganizare neurocomportamentală necesară procesării cognitive de-a lungul vieții (45), iar diverse studii au arătat o vulnerabilitate marcată la efectul cognitiv dăunător al unei diete cu grăsimi (46-48). Acest rezultat este în aparentă contradicție cu lucrările anterioare ale grupului lui Muhlhausler (21, 35) în care șobolanii tineri (6 săptămâni) au manifestat o preferință clară pentru mâncarea nedorită. Cu toate acestea, în publicațiile lor, paradigma experimentală a fost diferită, deoarece șobolanii au avut acces gratuit atât la mâncare standard, cât și la junk food, de la înțărcare până la sacrificiu (6 săptămâni).
Concomitent, am măsurat o creștere a ARNm Dat în NAc și o scădere a ARNm Th în VTA, care a fost confirmată de imunohistochimia care a arătat un număr redus de celule TH (+) în VTA la șobolanii WD. După o activitate transcriptomică crescută pentru sistemul DA la înțărcare, activitatea redusă la P45 poate explica interesul scăzut pentru hrana gustoasă observată la șobolanii noștri WD. De asemenea, trebuie remarcat faptul că scăderea sistematică a expresiei ARNm Fos și FosB în diferitele nuclee pe care le-am analizat ar putea fi un semn al unei activități cerebrale reduse după expunerea mamei la WD.
Șobolanii adolescenți WD au arătat un dezinteres mai rapid pentru grăsime, care este opus comportamentului lor anterior. Folosirea unei diete „normale” în copilărie pare să îi „protejeze” față de o preferință exagerată pentru grăsimi la adolescență. Dimpotrivă, atunci când șobolanii au acces liber la junk food după înțărcare, ca în Ref. (21, 35), ei demonstrează la adolescență o preferință puternică pentru grăsimi. Acest rezultat sugerează că dieta de 3 săptămâni după înțărcare ar fi putut reprograma circuitele și ar fi putut face descendenții adolescenți mai puțin sensibili la o provocare acută de grăsime.
Impactul WD perinatal asupra adulților
Șobolanii adulți nu au mai afișat diferențe de preferință pentru grăsime, chiar și după prezentarea repetată a grăsimii, așa cum este deja descris (22, 35). Concomitent, am observat o scădere a ARNm Th și a proteinei în NAc și o tendință pentru o expresie redusă a ARNm Dat în VTA. Naef și coleg (20) au raportat deja o activitate scăzută a sistemului DA la șobolanii adulți hrăniți în perioada perinatală cu un HFD, cu un răspuns DA tocit la amfetamină măsurat cu microdializă și o motivație crescută pentru recompensarea grăsimilor (vezi tabelul care a rezumat datele qPCR recente pe acest model, Masa S2 în Material suplimentar). O limitare a cuantificării TH (ARNm și imunohistochimie) în NAc vine din faptul că celulele NAc ar putea exprima, de asemenea, ARNm Th și proteina și apoi ar putea influența cuantificarea fibrelor DA (49, 50). Cu toate acestea, utilizarea imunocolorării TH în NAc a dezvăluit în principal terminalele axonale dense care provin de la neuronii DA din creierul mijlociu (VTA și SNc). De obicei, neuronii care exprimă TH din striat și NAc ar putea fi deslușiți numai la animalele cu leziuni puternice de DA (51) și, prin urmare, ar putea fi greu de detectat în imuno-secțiunile noastre. În acest studiu, am observat, de asemenea, o creștere puternică a receptorului opioid mu în NAc atunci când alte grupuri, cu modele diferite, au arătat o scădere a expresiei în striatul ventral al șobolanului expus timpuriu la HFD (în timpul alăptării și gestației) (19, 21) sau nicio modificare (35). Aceste modificări, măsurate doar la nivel de ARNm, ar putea reflecta o ușoară hipoactivitate a circuitelor DA asociată cu o sensibilitate mai mare la opioide (52) care probabil nu sunt suficiente pentru a avea un impact asupra testului comportamental pe care l-am efectuat. Aceste ipoteze trebuie confirmate folosind abordări funcționale. Într-o lucrare recentă, cu un model similar, Romani-Perez și colab., nu au reușit să observe o creștere semnificativă a motivației în cutiile de condiționare operante pentru descendenții HFD, dar au observat o latență mai scurtă pentru a atinge o cutie de obiective într-o paradigmă de testare a pistei (22). În ciuda absenței preferinței de lungă durată a grăsimilor în condițiile noastre experimentale, am constatat că aportul matern de WD perinatal are un efect de lungă durată asupra altor circuite cerebrale mediate în principal de remodelarea GABA în NAc și hipotalamus. NAc este considerată o „santinelă senzorială” pentru comportamentul consumator (52). Studii recente au arătat că aportul de alimente a fost suprimat prin inhibarea neuronilor LH care eliberează GABA (53). O'Connor şi colab. a arătat că neuronii NAc D1R (neuroni de proiectare GABAergic) inhibă selectiv neuronii LH VGAT pentru a opri aportul de alimente (54). Aceste experimente dezvăluie un circuit GABA (NAc/Hipotalamus) care poate fi responsabil pentru controlul răspunsului comportamental. Acest sistem striat-hipotalamic ventral completează un alt circuit care implică nucleul patului, stria terminalis, care eliberează GABA, proiectează neuronul VGAT către glutamatul care eliberează neuronii Vglut LH și inhibarea directă a LH vglut2 determină hrănirea.55). O altă componentă importantă a circuitului de reglare a apetitului care implică învelișul NAc este o proiecție inhibitoare care eliberează GABA către VP (56). Aceste date evidențiază rolul crucial al semnalizării GABA în interacțiunea dintre hipotalamus și NAc pentru a promova hrănirea. În studiul nostru, nu am fost capabili să discriminăm populația de neuroni implicați în remodelarea GABA și modul în care aceste modificări ar putea modifica rețelele. Cu toate acestea, rolul central al circuitelor GABA merită mai mult interes. În special, ar fi foarte interesant să se efectueze experimente funcționale suplimentare ale acestor circuite GABA folosind abordări electrofiziologice (57). Am observat, de asemenea, o suprareglare globală a transcriptului ARNm pentru receptorii 5HT1a și 5HT1b în cele trei nuclee studiate. Majoritatea fibrelor de serotonină proiectate provin din nucleul rafe dorsal (DRN) și nucleul rafe median (MRN). Date recente de la in vivo înregistrările și studiile imagistice au arătat un rol pozitiv al 5HT în recompensă (58). Fibrele 5HT din DRN sunt implicate în controlul impulsivității (59). Creșterea 5HT1a în VTA și NAc ar putea fi un mecanism compensator care ar putea controla impulsivitatea. În hipotalamus, studiile farmacologice sugerează că subtipurile de receptori 5HT1a pot suprima comportamentul de hrănire indus de stimularea serotoninei (60, 61). Creșterea receptorilor 5HT1a și b din hipotalamus ar putea potența acțiunea de suprimare a hrănirii a serotoninei și, prin urmare, ar putea constitui un mecanism compensator. Aceste ipoteze trebuie verificate prin efectuarea de experimente funcționale adecvate.
Aceste modificări ale rețelelor sunt asociate cu modificări ale markerilor de plasticitate ca ARNm Ncam. În hipotalamusul șobolanilor adulți, am observat o creștere a transcrierilor Ncam1 și St8sia4 care sugerează și o creștere a semnalizării acidului polisialic (PSA). PSA este un glican de suprafață celulară care modulează interacțiunile celulă la celulă. Polisialilarea proteinelor de adeziune celulară este implicată în diferite procese dependente de plasticitatea sinaptică din sistemul nervos central și s-a raportat că este necesară pentru plasticitatea sinaptică adaptativă a circuitelor de alimentare în timpul balanței energetice pozitive acute.33, 62). În plus, alți regulatori ai interacțiunii celulare și sinaptogenezei ar putea fi implicați în această plasticitate hipotalamică.
În concluzie (Figura (Figure7), 7), aportul de WD maternă are o influență de lungă durată asupra organizării circuitelor homeostatice și hedonice care reglează comportamentul alimentar la descendenți. Prin analiza a trei perioade critice de timp, am reușit să arătăm o evoluție clară a preferinței grăsimilor corelate cu semnăturile moleculare specifice ale creierului. În timpul copilăriei, preferința pentru grăsime ar putea fi corelată cu o activitate mai mare a sistemului DA. Adolescența, caracterizată printr-o inversare a preferinței de grăsime, a fost asociată cu o expresie mai scăzută a markerilor sistemului DA, sugerând un mecanism compensator. Un punct foarte interesant de semnalat este că, în acest model, o dietă echilibrată după înțărcare ar putea proteja șobolanii adolescenți de obiceiurile de hrănire dăunătoare prin reducerea dorinței lor de grăsime. Deși la vârsta adultă cele două grupuri au o preferință mare similară pentru grăsime, șobolanii de la femelele hrăniți cu WD au arătat o remodelare profundă a circuitelor GABA. Care sunt consecințele acestei plasticități de durată? Un consum exagerat de dietă obezogenă în timpul adolescenței va reactiva acest sistem de recompensă tocit? Astfel de întrebări ar putea fi relevante în monitorizarea nutrițională a nou-născuților și a copiilor crescuți în țările occidentalizate.
Declarație de etică
Toate experimentele au fost efectuate în conformitate cu liniile directoare ale comitetului local pentru bunăstarea animalelor, UE (directiva 2010/63/UE), Institut National de la Recherche Agronomique (Paris, Franța) și Departamentul veterinar francez (A44276). Protocolul experimental a fost aprobat de comitetul de etică instituțional și înregistrat sub referința APAFIS 8666. S-au luat toate măsurile de precauție pentru a minimiza stresul și numărul de animale utilizate în fiecare serie de experimente.
Contribuțiile autorului
JP și PB au efectuat experimente și au participat la discuții și scriere. TM a efectuat PCA și a participat la discuții și scriere. SN a contribuit la proiectarea experimentului și a participat la discuții. PP a contribuit la proiectarea experimentului, a participat la discuții și a scris manuscrisul. VP a proiectat și efectuat experimentele, a analizat datele și a scris manuscrisul.
Declarația privind conflictul de interese
Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.
recunoasteri
Autorii ar dori să mulțumească lui Guillaume Poupeau și Blandine Castellano pentru îngrijirea animalelor pe tot parcursul studiului, Anthony Pagniez pentru ajutorul său în extracția ARNm și TLDA, Isabelle Grit pentru ajutorul în analiza probelor de plasmă și Alexandre Benani și Marie-Chantal Canivenc pentru discuția lor utilă și designul TLDA.
Note de subsol
Finanțarea. Această cercetare a fost susținută de grantul pentru regiune des pays de la Loire PARIMAD (VP), grantul pentru fundația LCL (VP și PP), fundația SanteDige (VP) și INRA Metaprogram DIDIT (SN, VP, PP).
Material suplimentar
Materialul suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online la http://journal.frontiersin.org/article/10.3389/fendo.2017.00216/full#supplementary-material.
Figura S1
Aportul total de energie din sticla care conține ulei de porumb. (A) Aportul de calorii din sticla de ulei de porumb timp de 24 de ore la P25 la puii din femelele hrăniți cu dietă occidentală (WD) și puii din femelele hrăniți cu dieta de control (CD). (B) Aportul de calorii din sticla de ulei de porumb timp de 24 de ore la P45 (a treia zi de testare a sticlei). (C) Aportul de calorii din sticla de ulei de porumb timp de 24 de ore la P95 (a treia zi de testare a sticlei). Pentru panouri (A–C), datele sunt exprimate ca medie ± SEM, fără diferențe statistice (p > 0.05) a fost observat, în urma testului neparametric Mann și Whitney, la toate vârstele. (D) Procentul de aport de calorii din sticla de ulei de porumb în comparație cu aportul total de calorii (sticlă de ulei de porumb + dieta standard pentru mâncare) timp de 24 de ore la P25 la puii WD și puii CD. (E) Procentul de calorii aportului din sticla de ulei de porumb în comparație cu aportul total de calorii (sticlă de ulei de porumb + dietă standard pentru mâncare) timp de 24 de ore la P45 (a treia zi de test pentru biberon) la puii WD și puii CD. (F) Procentul de calorii aportului din sticla cu ulei de porumb se compară cu aportul total de calorii (sticlă de ulei de porumb + dietă standard pentru mâncare) timp de 24 de ore la P95 (a treia zi de test pentru biberon) la puii WD și puii CD. Pentru panouri (D,E), datele sunt exprimate în procente din consumul total de calorii fără diferențe statistice (p > 0.05) a fost observat, în urma chi-pătratului cu corecția lui Yates, la toate vârstele.
Figura S2
Fotomicrografii reprezentative ale imunocolorării TH în nucleul accumbens (NAc) și zona tegmentală ventrală (VTA) la trei momente de timp diferite. (A) Fotomicrografia imunocolorării TH/NeuN la nivelul VTA, -5.30 mm de la Bregma. Etichetarea roșie este pentru NeuN și cea verde pentru TH. Săgeata albă arată ieșirea celui de-al treilea nerv. (B) Fotomicrografia imunocolorării TH la nivelul NAc, +1.70 mm de la Bregma. Etichetarea verde este pentru TH. Săgeata albă arată comisura anterioară.
Tabelul S1
Lista de gene cu matrice de densitate joasă TaqMan cu codurile inventariate ale tehnologiilor de viață corespunzătoare.
Tabelul S2
Rezumatul datelor publicate privind expresia transcriptelor căii dopaminei. Caracterele roșii corespund perioadei copilăriei, cele albastre adolescenței, iar cele negre adulților. =: corespunde unei expresii de transcriere similară între grupuri, +: corespunde unei expresii de transcriere mai mare la puii din dietă bogată în calorii [mâncare nedorită, dietă occidentală (WD) sau dietă bogată în grăsimi (HFD)] femele hrănite și -: corespunde unei expresii de transcriere mai scăzută la puii de la femele hrăniți cu dietă bogată în calorii (mâncare nedorită, WD sau HFD).
Referinte
;
