PLoS Unul. 2014 Jul 29; 9 (7): e102524. doi: 10.1371 / journal.pone.0102524. eCollecție 2014.
Abstract
Expunerea cocainei cronice atât la persoanele dependente de om, cât și în modelele de dependență ale rozătoarelor reduce activitatea cortexului prefrontal, care, ulterior, dysreglează procesarea recompensării și funcția executivă de ordin superior. Efectul net al acestui compromis al comportamentului este vulnerabilitatea sporită la recădere. Anterior, am arătat că creșteri induse de cocaină în expresia factorului neurotrofic derivat din creier (BDNF) în cortexul prefrontal medial (PFC) este un mecanism neuroadaptiv care bluntă eficacitatea consolidării cocainei. Deoarece se știe că BDNF afectează supraviețuirea neuronală și plasticitatea sinaptică, am testat ipoteza că abstinența de la autoadministrarea cocainei ar duce la modificări ale morfologiei neuronale și ale densității sinaptice în PFC. Folosind o tehnică nouă, tomografie matriceală și colorare Golgi, au fost analizate modificările morfologice la PFC de șobolan după zilele 14 de autoadministrare a cocainei și zile de 7 de abstinență forțată. Rezultatele noastre indică faptul că ramificația dendritică globală și densitatea sinaptică totală sunt reduse semnificativ la PFC de șobolan. Dimpotrivă, densitatea dorsurilor subțiri dendritice este semnificativ crescută pe neuronii piramidali ai stratului V din PFC. Aceste constatări indică faptul că modificările structurale dinamice apar în timpul abstinenței de cocaină care poate contribui la hipoactivitatea observată a PFC la indivizii dependenți de cocaină.
Introducere
Se propune ca modificări ale plasticității structurale în cadrul circuitelor de recompensă să fie mecanisme cheie care contribuie la capacitatea puternică a cocainei de a menține comportamentul de căutare a drogurilor [1]). Studiile anterioare au arătat o creștere a arborizării dendritice și a densității coloanei vertebrale în nucleul accumbens (NAc) [2]-[4], zona tegmentală ventrală [5], și cortexul prefrontal (PFC) [6] după expunerea la cocaină. În timp ce majoritatea studiilor s-au concentrat asupra modificărilor structurale asociate cu activitatea disfuncțională a NAc, au fost examinate considerabil mai puține studii ale modificărilor în PFC. Mai multe linii de dovezi demonstrează disfuncționalitatea PFC după expunerea cocaină cronică la ambii dependenți [7], [8] și în modelele de dependență de rozătoare [9], [10]. Prin urmare, caracterizarea schimbărilor structurale care apar în PFC este relevantă pentru înțelegerea evenimentelor moleculare care stau la baza dependenței.
PFC reglează controlul impulsurilor și luarea deciziilor și astfel joacă un rol important în capacitatea unui individ de a controla comportamentul, în special în dependența de droguri [8], [11]. De exemplu, la indivizii dependenți de cocaină, scăderea activării cortexului prefrontal este asociată cu retragerea de droguri și a întreruperii răspunsurile executive de ordin superior [7], [8], care pot spori vulnerabilitatea la recădere. La rozătoare, creșterea activității neuronale în PFC este asociată cu aportul de cocaină [9], [10], comportament compulsiv de căutări de droguri [12], iar restabilirea cocainei după retragere [13]-[15]. În plus, bistabilitatea membranei este eliminată în PFC după administrarea cocainei cronice [16]. În cele din urmă, activitatea metabolică indusă de medicamente în PFC este bluntată la șobolani cărora li sa administrat o injecție provocată în timpul retragerii de la autoadministrarea cocainei [9], [17]. Împreună, aceste studii indică faptul că cocaina cronică induce schimbări profunde în ceea ce privește funcționalitatea PFC care pot fi asociate cu o creștere a numărului de sinapsă inhibitoare și / sau o reducere a sinapselor excitaționale în PFC. Cu toate acestea, modificările morfologice care apar în PFC în urma utilizării cronice de droguri nu au fost elucidate.
În studiul de față am încercat să examinăm dacă abstinența de la cocaină duce la modificări structurale în PFC. Modificările morfologice au fost examinate utilizând o metodă tradițională, colorarea Golgi, precum și o tehnică nouă, tomografie matriceală. Tomografia cu array este o metodă unică care combină secționarea ultrasonică a țesuturilor cu imunofluorescență și reconstrucția imaginii tridimensionale pentru a permite o cuantificare exactă a densității sinapselor totale și subtipului [18], [19]. Folosind aceste metode, rezultatele noastre au indicat plasticitate substanțială la PFC de șobolan ca răspuns la abstinența din cocaină.
Materiale și metode
Animale și locuințe
Șobolani Sprague-Dawley masculi (Rattus norvegicus) cu o greutate cuprinsă între 250 și 300 g au fost obținuți de la Taconic Laboratories (Germantown, NY). Animalele erau adăpostite individual cu hrană și apă disponibile ad libitum în cușca lor de acasă. Protocoalele experimentale au fost în concordanță cu liniile directoare emise de Institutele Naționale de Sănătate ale SUA și au fost aprobate de Școala de Medicină Perelman de la Universitatea din Pennsylvania și Comitetul instituțional de îngrijire și utilizare a animalelor de la Universitatea din Pennsylvania.
Intervenție Chirurgicală
Înainte de operație, șobolanii au fost anesteziați cu 80 mg / kg ketamină și 12 mg / kg xilazină (ip, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). A fost introdus un cateter siliar intern (diametrul interior 0.33 mm, diametrul exterior 0.64 mm) în vena jugulară dreaptă și suturat în poziție. Cateterul a fost apoi trecut subcutanat peste lama umerilor și a fost direcționat către o platformă de backmount (CamCath, Cambridge, UK) care a fost suturată sub piele direct deasupra scapulelor. Cateterii au fost evacuați zilnic cu 0.3 ml din antibioticul Timentin (ticarcillin disodic / clavulanat de potasiu, 0.93 mg / ml, Henry Schein, Melville, NY) dizolvat în soluție salină heparinizată (10 U / ml). Cateterii au fost sigilați cu obturații din plastic atunci când nu sunt utilizați.
Cocaina se autoadministrează
Șobolanilor i s-au permis zile de recuperare 7 de la intervenția chirurgicală înainte ca administrarea cocainei să înceapă. Șobolanii au fost repartizați aleatoriu într-unul din cele două grupuri: animale de cocaină care se administrează singură și controale saline înfipte. Fiecare șobolan instruit să răspundă pentru perfuzii contingente de cocaină a fost asociat cu un subiect joked care a primit același număr și model temporal de infuzii ca și el administrat de sobolanul cocaină experimental asociat. Apăsarea manetei pentru șobolanii saline nu a avut consecințe programate.
Inițial, șobolanii experimentali de cocaină au fost plasați în camerele de operatori modulare (Med Associates, St. Albans, VT) și lăsate presă pentru infuzii intravenoase de cocaină (0.25 mg cocaină / 59 μl salină, infuzie peste 5 s) raportul 1 (FR1) al armării. Odată ce un șobolan experimental de cocaină a realizat cel puțin infuzii de cocaină 20 într-o singură sesiune operator în cadrul programului FR1, cerința de răspuns a fost schimbată într-un program de armare FR5. Pentru a răspunde la ambele scheme de rapoarte fixe, numărul maxim de infuzii de cocaină a fost limitat la 30 pe sesiune de administrare zilnică și o perioadă de timp de așteptare a 20 a urmat fiecare infuzie de cocaină, timp în care răspunsurile pârghiei active au fost tabelate, dar nu au avut consecințe programate . Sesiunile zilnice 2 h operator (7 zile / săptămână) au fost efectuate pentru un total de 14 zile. Răspunsurile făcute cu privire la maneta inactivă, care nu au avut consecințe programate, au fost înregistrate și în timpul sesiunilor de formare FR1 și FR5.
După 14th zilnic operatorii de ședințe, șobolanii cu control salina experimentală cocaină și însoțită de salină au fost returnați în cuștile lor de origine unde au suferit zile 7 de abstinență forțată de droguri. Pe 7th zi de abstinență de cocaină, creierele au fost îndepărtate și PFC a fost disecat pe gheață. Au fost alese șapte zile de abstinență de cocaină pentru a face comparații directe cu studiul nostru publicat anterior despre examinarea modificărilor induse de cocaină în expresia PFC BDNF [20].
Perfuzie
Șobolanii au fost anesteziați (100 mg / kg, ip pentobarbital de sodiu) și perfuzate cu paraformaldehidă 4% gheață în 0.1 M PB, pH 7.4 (PFA). O emisferă din fiecare creier a fost folosită pentru colorarea lui golgi, iar cealaltă emisferă pentru tomografie matricolă. Emisferele de matrice au fost postfixate în 4% PFA cu 2.5% zaharoză pentru ore 2, iar emisferele Golgi au fost fixate pentru 48 h în 4% PFA.
Armaturi tomografice
Experimentele de tomografie array au fost realizate așa cum s-a descris anterior [19], [21]. Pe scurt, țesutul fixat PFA a fost încorporat în secțiunile rășină și coronale (70 nm) la nivelul mPFC au fost tăiate și colectate ca o panglică. Panglele au fost hidratate în glicină 50 mM în Tris și blocate în soluție de blocare (0.05% Tween / 0.1% albumină serică bovină în tampon Tris (50 mM Tris / 150 mM NaCI, pH 7.6). Chemicon), PSD65 (semnalizare celulară) sau synaptophysin (Abcam), în soluția de blocare peste noapte la 95 ° C. Ribbonii au fost spălați cu tampon Tris și colorați cu anticorpi secundari la 4![[raport]](http://www.ncbi.nlm.nih.gov/corehtml/pmc/pmcents/x2236.gif){kind=small}
50 în soluție de blocare (făină de capră anti-mouse Alexa-făină 488 și capră anti-iepure cy3 sau măgar anti-iepure cy5). Panglicile au fost contra-colorate cu DAPI pentru a facilita găsirea acelorași site-uri pe fiecare secțiune. Imaginile de scanare a imaginilor au fost colectate utilizând un microscop Zeiss AxioImager Z2 de epifluorescență. Imaginile de pe același site pe fiecare secțiune serială 20-30 pe panglică au fost achiziționate la 63x cu programe automate specializate pentru tomografie matrice.
Armatologie Tomografie Analiză
Imaginile seriale de la fiecare panglică au fost deschise secvențial, transformate într-un teanc și aliniate cu pluginurile MultiStackReg și StackReg (de curtoazia lui B. Busse de la Universitatea Stanford și [21], [22]. Cutiile de culegere (19.5 μmx19.5 μm) au fost utilizate pentru a selecta regiuni de interes (ROI) în neuropil pentru cuantificare. Selecțiile trebuiau să excludă corpurile celulare neuronale sau alte trăsături obscurante. Pentru analiza automată a imaginilor, culturile de interes (sau ROI) pentru synaptophysin, decarboxilaza acidului glutamic-65 (GAD65) și PSD95 au fost automat pragulate, respectiv cu algoritmi automatici în ImageJ. Culturile au fost codificate și analiza a fost executată orb la condiție. Un program automat de detectare pe bază de prag pentru cuantificarea numărului de puncte punctate identificate ca sinapse pozitive a fost utilizat așa cum a fost descris anterior [23]. Densitățile terminalelor presinaptice, terminalele postsynaptice excitatorii și procentul de sinapse GAD-pozitive (inhibitoare) au fost calculate pornind de la o medie a siturilor 75 pentru fiecare animal colectat din două blocuri de țesut diferite de la PFC (n
=5 tratat cu clorină, animale tratate cu ser fiziologic 5) pentru un total de punți postsynaptice 29,154 și puncte punctuale 53,565 de la punctele de prelevare 818 din toate animalele tratate cu ser fiziologic 5 și punctele 29,662 postsynaptic și 17,034 presinaptic din punctele de prelevare 588 din toate animalele tratate cu 5 cocaină. S-au calculat valorile mediane pentru densitatea sinapsei și procentul de sinapsă inhibitoare per animal și s-au efectuat teste t folosind medii de animale pentru a testa dacă există o diferență între mijloacele grupului.
Metoda Rapid-Golgi
Secțiunea unică Golgi a fost efectuată așa cum s-a descris anterior [24], [25]. Pe scurt, mPFC dintr-o emisferă a fiecărui animal a fost tăiat în secțiuni coronale 100 μm și post-fixat în tetraoxid de osmiu 1% urmat de trei spălări în 0.1 M PB, pH 7.4. Secțiunile s-au incubat peste noapte în dicromat de potasiu 3.5%, s-au spălat pe scurt și s-au infiltrat cu nitrat de argint 1.5% prin metoda sandwich [25]. Secțiunile au fost montate pe diapozitive acoperite cu gelatină cu 20% zaharoză și deshidratate printr-o serie de concentrații de alcool, urmate de de-grăsimi în xilen și acoperire prin razuire.
Golgi Analiză
Goldele Golgi au fost codificate și analizate orb la condiție și toate analizate de același experimentator. Imaginile și trasările neuronale și imaginile reprezentative ale coloanei dendritice au fost colectate utilizând un microscop vertical BX51 Olympus cu o etapă motorizată integrată (Prior Scientific, Rockland, MA) cu un obiectiv 20 × 0.7 NA. Pentru analiza ramificațiilor dendritice, neuronii 7 au fost selectați pentru analiză pe animal. Am măsurat lungimea și complexitatea neuritului folosind macrocomenzile NeuronJ și Advanced Sholl Analysis, respectiv. Numărul de intersecții (puncte de ramificație) în cercurile concentrice la radii între 5-250 μm (inclusiv dendrite bazale și apicale) au fost măsurate și comparate între grupuri. Pentru analiza densității coloanei, s-au analizat segmente 4-5 cu lungimea de cel puțin 20 μm din dendrite bazale de ordinul trei, pe neuron de la neuronii 5-7 pe animal folosind un microscop de epifluorescență Zeiss AxioImager Z2 cu un obiectiv de imersie 63x în ulei. Morfologia coloanei vertebrale a fost clasificată așa cum este descris anterior [26]. Densitatea liniei coloanei vertebrale pentru fiecare segment dendritic și morfologia coloanei vertebrale (subțire, stubby, ciupercă, în formă de ceașcă) fiecărui coloanei vertebrale au fost comparate între grupuri. Software-ul open source de la National Institutes of Health (ImageJ) a fost utilizat pentru analiza datelor cu privire la tomografia cu array și a matricei array.
REZULTATE
Abstinența de la cocaină reduce densitatea totală a sinapsei
Tomografia cu array a fost utilizată pentru a măsura modificările în ambele sinapse excitatorii și inhibitoare, pentru a determina modificările morfologice specifice care apar în PFC ca răspuns la abstinența de la autoadministrarea cocainei. Tomografia cu array este o metodă cu o performanță ridicată care permite cuantificarea exactă a sinapselor totale, inhibitoare și excitative în structuri care sunt prea mici pentru a fi identificate sau localizate în mod corespunzător prin metode tradiționale de microscopie confocală [19]. Deoarece atât sinapsele inhibitorii cât și cele excitatorii sunt componente esențiale ale circuitelor de recompensă a medicamentelor [13], [27], [28] am folosit această metodologie nouă pentru a evalua modificările morfologice ale PFC în timpul abstinenței de la cocaină. Secțiuni de PFC de șaptezeci de mii de la o emisferă creier de șobolani experimentați cu 5 și cu șobolani experimentați cu 5 au fost colorați cu anticorpi pentru PSD95, un marker de excitație postsynaptică, synaptophysin, marker presinaptic și GAD65, care au marcat neuroni inhibitori și sinapse. Densitățile sinapse și procentul sinapselor inhibitoare au fost determinate în stratul cortical V (Figura 1A și 1B). Rezultatele noastre arată că în timpul abstinenței de la cocaină a existat o scădere semnificativă a densității sinaptofizinei (Figura 1C), care măsoară toate terminalele presinaptice [t (7)=2, p <0.05]. Nu a existat o scădere semnificativă a densității de sinapsă excitativă [t (8)=0.48, p=0.32] măsurată prin numărarea PSD95 puncta (Figura 1D). Interesant, a existat o tendință nesemnificativă față de o creștere a procentului de sinapse inhibitorii GAD65-pozitiv [t (8)=-1.39, p=0.9] (Figura 2E).
Abstinența de la cocaină reduce ramificația dendritică, în timp ce crește în mod tranzitoriu densitatea coloanei vertebrale în PFC
Metoda Golgi a fost utilizată pentru a examina modificările în ramificația neuronală și densitatea coloanei dendritice pentru a confirma modificările ultrastructurale observate în densitatea sinapsei (Figura 1). Am efectuat impregnarea rapidă cu Golgi pe o subgrupă de neuroni din PFC din celelalte emisfere ale acelorași animale care au fost utilizate pentru studiile de tomografie array. Au fost evaluate ramificația dendritică, numărul coloanei vertebrale dendritice și morfologia coloanei vertebrale. Doi neuroni piramidali reprezentativi de la PFC ai unui control saline în formă de joker și un șobolan expus cocainei sunt arătați în Figura 2A. Parcela Sholl a măsurat numărul de intersecții (puncte de ramificație) în cercurile concentrice la radii între 5-250 μm. Rezultatele noastre demonstrează că, după ce 7 zile de abstinență forțată de la auto-administrarea de cocaină a existat o reducere semnificativă a complexității dendritice (Figura 2B). Măsuri repetate în două direcții Analiza ANOVA a datelor privind complotul sculptat a evidențiat efecte importante semnificative ale tratamentului [F(1,738)=30.59, p <0.0001] și raza [F(245, 738)=289.6, p <0.0001] (Figura 2B), confirmând o pierdere a dendritelor care sunt de acord cu pierderea sinapselor măsurate în studii de array (Figura 1C). Analiza dendritelor basilare secundare și a treia a relevat o creștere semnificativă a coloanei dendritice după 7 zile de abstinență de cocaină [t (6)=−3.12, p <0.05] (Figura 2D). Mai exact, abstinența de la expunerea la cocaină a crescut numărul subtipului coloanei vertebrale, fără a avea niciun efect semnificativ asupra altor subtipuri de coloanei vertebrale (Figura 2E), după cum sa arătat prin măsurări repetate în două sensuri ANOVA cu efecte principale ale tratamentului [F(1,30)=11.9, p=0.0017], subtip tip coloanei vertebrale [F(4,30)=57.7, p <0.0001] și un tratament semnificativ x interacțiunea subtipului coloanei vertebrale [F(1, 4, 30)=8.8, p <0.0001].
Discuție
În studiul de față demonstrăm că există modificări structurale și sinaptice pronunțate în stratul V al PFC după zilele 7 de abstinență forțată de la autoadministrarea cocainei. Mai precis, există o scădere semnificativă a ramificării dendritice a neuronilor piramidali și o pierdere generală a densității sinapse măsurată prin scăderea densității boutonilor presinaptici globali etichetați cu synaptophysin. În ciuda pierderii densității presinaptice, dendritele bazale ale neuronilor piramidali ai stratului V au suferit o creștere a densității dendritice a coloanei vertebrale, în special a coloanei subțiri din plastic. Deoarece nu am detectat schimbări semnificative în densitatea PSD95, se poate specula că scăderea terminalelor presinaptice, dar creșterea densității coloanei vertebrale poate fi datorată unei creșteri a numărului de butelii multi-sinaptice. În plus, este de remarcat, de asemenea, că am observat o tendință spre creșterea sinapselor inhibitorii în PFC. Din moment ce spinurile subțiri sunt implicate în plasticitate [29], creșterea acestor spini ar putea reprezenta o plasticitate compensatorie pentru menținerea intrărilor sinaptice asupra acestor neuroni denervați care au pierdut ramurile dendritice.
Studiile anterioare au demonstrat că cocaina crește arborizarea dendritică și densitatea coloanei vertebrale în NAc [2]-[4]. Recent, Dumitriu și colab., 2012 [30] a demonstrat că cocaina modifică în mod dinamic coloanele proximale din nucleul și cochilia NAc. Mai precis, în cochilie, retragerea din cocaină a mărit tibia subțire, în timp ce scăderea densității capului coloanei vertebrale în capota NAc [30]. Spre deosebire de studiile NAc, există doar câteva studii care au examinat efectele cocainei asupra morfologiei neuronale în PFC [6], [31]. Datele noastre sunt conforme cu un studiu recent care demonstrează că cocaina induce o creștere a densității coloanei vertebrale în PFC [31]. În mod special, șoarecii care au avut o creștere mai mare a spinii persistenți și stabili, adică a coloanei vertebrale care au prezentat 3 zile după retragere, pe dendritele apicale au prezentat scoruri de preferință mai mari pentru cocaină și hiperactivitate indusă de cocaină [31]. Un studiu anterior efectuat pe neuronii II-III ai stratului PFC al șobolanilor a raportat valori de aproximativ 3 spini per μm de dendrit atât pe dendrite apice, cât și pe bazale, un nivel surprinzător de dens de spini care a fost modificabil prin stres [32]. Valorile noastre la șobolanii de control al coloanei 2 / 10 μm ale segmentelor dendritice sunt mai mici, ceea ce se poate datora diferitelor populații neuronale analizate (dendrite bazale de tip V) sau diferenței în tehnica imagistică. În studiul de față am folosit metoda cu o singură secțiune rapidă Golgi, în timp ce injecțiile iontoforetice ale colorantului galben Lucifer combinate cu imagistică confocală au fost utilizate de Radley și colegii săi [32] pentru a vizualiza morfologia neuronală și dendritică. În plus, concluziile noastre evidențiază, de asemenea, importanța duratei abstinenței de la autoadministrarea cocainei care duce la modificări structurale ale creierului. Un raport publicat anterior a demonstrat o creștere a arborizării dendritice după retragerea de pe cocaină pe termen lung (24-25 zile) la șobolani femele [6], în contrast cu scăderea observată după zilele 7 de abstinență forțată la șobolani masculi. În ciuda acestor diferențe metodologice și a diferențelor în ceea ce privește datele ramificate, în ambele studii s-a observat creșterea numărului de spini, ceea ce a confirmat reorganizarea pe scară largă a circuitului în timpul abstinenței de cocaină. Studiile viitoare vor elucida durata acestor evenimente pentru a determina dacă aceste schimbări structurale sunt tranzitorii sau de lungă durată.
Constatările noastre indică faptul că abstinența forțată de la autoadministrarea cocainei determină modificări structurale dinamice și determină reorganizarea sinaptică în PFC. Aceste rezultate pot explica hipoactivitatea din PFC care apare ca urmare a expunerii repetate la cocaină [8], [33]. În plus, concluziile noastre susțin studii anterioare care demonstrează dezactivarea PFC [7], [8]și creșterea GABA extracelulară în mediul PFC în timpul retragerii cocainei [34]. Astfel, mecanismele care reflectă hipoactivitatea PFC după expunerea cocaină cronică [8], [10] poate include (1) o creștere a reducerii GABAergic, (2) în reducerea glutamatergică și / sau (3) a intrării sinaptice dopaminergice la PFC. Studiul prezent demonstrează că abstinența de la cocaină reduce în mod semnificativ densitatea generală a sinapselor, așa cum este indicată de o reducere a numărului de puncte sinaptice pozitive sinaptofizice. Aceste date sugerează că există o reducere a reacției post-sinaptice la PFC, posibil mediată de scăderea cantității de glutamat sau de dopamină. Într-adevăr, există studii care indică faptul că cocaina induce reducerea tonusului glutamatergic [35], [36]. Cu toate acestea, folosind metoda Golgi, am observat o creștere a numărului de spini dendritici subțiri pe dendritele bazale ale neuronilor piramidali, ceea ce sugerează o creștere a intrării excitatorii în PFC la neuriții rămași. Aceste date aparent contradictorii pot reflecta o pierdere generală a sinapselor asociate pierderii mari de dendrite pe care o observăm cu un răspuns compensator, posibil mediată de creșterea BDNF, după cum am arătat în concluziile noastre anterioare [20], pentru a mări densitatea coloanei dendritice asupra neuriturilor rămase.
În mod colectiv, concluziile noastre indică reorganizarea dinamică a PFC în timpul abstinenței de cocaină. Mai precis, există o reducere semnificativă a conectivității sinaptice, pierderea ramificării dendritice și o creștere a numărului de spini subțiri la PFC de șobolan după zilele 7 de abstinență de droguri forțate de la autoadministrarea cocainei. Aceste rezultate pot furniza baza structurală pentru hipoactivitatea observată observată în PFC a consumatorilor cronici de cocaină și poate explica pierderea controlului cognitiv care apare în timpul dependenței de cocaină.
recunoasteri
Autorii ar dori să-i mulțumească lui Gavin Sangrey pentru asistența sa în pregătirea capsulelor încorporate.
Declarație de finanțare
Această lucrare a fost susținută de subvențiile NIDA DA22339 și DA033641 (RCP & GSV) și DA18678 (RCP). HDS a fost susținut de un premiu individual K01 (DA030445). Finanțatorii nu au avut niciun rol în proiectarea studiului, colectarea și analiza datelor, decizia de publicare sau pregătirea manuscrisului.
Referinte
;
