Pediatrie primară. 2018; 9: 81.
Publicat online 2018 Mar 12. doi: 10.3389 / fpsyt.2018.00081
PMCID: PMC5858605
PMID: 29593587
Minho Lee,1,† Hyeyoung Cho,2,3,† Seung Hyun Jung,2,4 Seon-Hee Yim,2 Sung-Min Cho,2,3 Ji-Won Chun,5 Soo-Hyun Paik,5 Parcul Yae Eun,6,7 Dong Huey Cheon,7,8 Ji Eun Lee,7 Jung-Seok Choi,9 Dai-Jin Kim,5,* și Yeun-Jun Chung1,2,3,*
Abstract
Context
Utilizarea dependenței de Internet și jocurile online este o posibilă tulburare psihiatrică numită tulburare de jocuri pe Internet (IGD). Profilurile de expresie ale microRNA (miRNA) modificate au fost raportate în sângele și țesutul cerebral la pacienții cu anumite tulburări psihiatrice și sugerate ca biomarkeri. Cu toate acestea, nu au existat rapoarte despre profilele miRNA de sânge în IGD.
Metode
Pentru a descoperi miRNAs asociate IGD, am analizat profilele de expresie miRNA ale probelor 51 (controalele 25 IGD și 26) folosind TaqMan Density Low Array de miRNA. Pentru validare, am efectuat PCR cu transcripție inversă cantitativă cu probe independente 36 (controale 20 IGD și 16).
REZULTATE
Prin descoperirea și validarea independentă, am identificat trei miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-652-3p) care au fost semnificativ reglate în grupul IGD. Persoanele cu toate cele trei modificări ale miRNA au avut un risc mult mai mare de IGD decât cele fără alterare (Rata de șanse (22, 95% CI 2.29-211.11)), iar OR au crescut doză în funcție de numărul de miRNA-uri modificate. Genele țintă prognozate ale celor trei miRNAs au fost asociate cu căile neuronale. Am explorat expresia proteică a celor trei gene țintă din aval prin metoda Western blot și am confirmat că expresia GABRB2 și DPYSL2 a fost semnificativ mai mare în grupul IGD.
Concluzie
Am observat că expresiile hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p și hsa-miR-652-3p au fost reduse la pacienții IGD. Rezultatele noastre vor ajuta la înțelegerea fiziopatologiei IGD.
Introducere
Utilizarea dependenței de jocuri pe internet și pe Internet nu este doar un fenomen social în țările cu o infrastructură extinsă de acces la Internet, ci o potențială tulburare psihiatrică denumită tulburare de jocuri pe Internet (IGD) (1-3). Conform rapoartelor epidemiologice, ratele de prevalență ale IGD la adolescenți variază în funcție de țări, de la 0.8 la 26.7% (4). În mod special, studiile au arătat rate de prevalență peste 10% la adolescenții din multe țări asiatice, cum ar fi Coreea de Sud, China, Taiwan, Hong Kong și Singapore (4). IGD este asociat cu afectarea cunoașterii, a relațiilor psiho-sociale și a vieții de zi cu zi; de exemplu, scăderea performanțelor academice sau ocupaționale (4-7). IGD este inclusă acum în secțiunea III (Condiții pentru studii ulterioare) a celei de-a cincea revizii a Manualului de diagnostic și statistic al tulburărilor mintale (DSM-V) (8). Cu toate acestea, în ciuda importanței sale clinico-sociale, se cunoaște puține despre mecanismul genetic molecular din spatele IGD.
Studii recente pe scară largă privind gemeni au sugerat un fundal genetic pentru IGD (9, 10). Vink și colab. a investigat diferențele individuale în utilizarea compulsivă a Internetului cu gemeni XENUMX monozigotici și dizygoți adolescenți în Registrul Twin al Țărilor de Jos și a raportat că 5,247% dintre diferențe au fost explicate prin factori genetici9). Li și colab. observate perechi de 825 de gemeni chinezi adolescenți și au raportat că factorii genetici au explicat 58-66% dintre diferențe (10). În consecință, polimorfismele genelor implicate în neurotransmiterea, cunoașterea și atenția, cum ar fi gena D2 a receptorului dopaminic (DRD2), gena catecolamină-O-metiltransferază (COMT), gena transporter de serotonină (5HTTLPR) și gena alfa 4 a receptorului colinergic nicotinic (CHRNA4) au fost raportate ca fiind semnificativ asociate cu dependența de internet (11-13). Recent, Kim și colab. variante de screening de mai mult de 100 candidati gene legate de productie, actiune si metabolismul de neurotransmitatori prin analiza secventiere urmatoarea generatie si a raportat ca rs2229910 de NTRK3 gena este asociată cu IGD (14).
În plus față de factorii genetici, este de asemenea bine cunoscut că fenotipurile neuro-comportamentale sunt controlate epigenetic prin ARN-uri care nu codifică, inclusiv micro ARN (miRNAs) (15, 16). miRNAs sunt mici molecule de ARN monocatenare necodificatoare (aproximativ lungime de nucleotide 20-23) care reglează negativ expresia genelor care codifică proteine prin degradarea ARNm și joacă un rol critic în procesul fiziopatologic al diferitelor boli17). Linile de dovezi au demonstrat că miARN-urile sunt abundente în sistemul nervos central (CNS) uman și acționează pentru a regla nivelul de expresie al genelor țintă, care sunt implicate în dezvoltarea și maturarea sistemului SNC (15). Într-adevăr, studii recente au arătat că profilurile expresiei miRNA sunt modificate în țesutul cerebral al pacienților cu tulburări psihiatrice, sugerând că profilurile lor de expresie ar putea fi biomarkeri pentru tulburări psihiatrice (15, 16, 18). De exemplu, prin analiza postmortem, Lopez et al. a raportat că expresia miR-1202, care reglează expresia genei metabotropice a receptorului glutamat-4 și prezice răspunsul la antidepresiv, a fost reglată în țesuturile cortexului prefrontal ale pacienților cu tulburări majore de depresie19). În ceea ce privește screening-ul biomarkerilor, această abordare are o limitare clară deoarece efectuarea unei biopsii a țesutului CNS pentru screening este imposibilă. Deoarece miRNAs pot fi detectate în sânge (plasmă sau ser), miARN-urile circulante au un avantaj clar ca biomarkeri neinvazivi în tulburările neuropsihiatrice. Cu toate acestea, până în prezent, nu au existat studii privind circulația profilurilor miRNA în IGD. O mai bună înțelegere a profilurilor de expresie miRNA circulante ar putea contribui la clarificarea mecanismului dezvoltării IGD și la facilitarea traducerii clinice.
În acest studiu, ne-am propus să identificăm markerii miRNA asociați IGD prin observarea miRNA-urilor plasmatice exprimate diferențial între grupurile de IGD și de control și am explorat implicațiile lor biologice.
Materiale și metode
Subiecte de studiu
Am studiat adolescentii 3,166 (cu varsta de 12-18 ani) folosind scorurile DSM-V IGD. Dintre acestea, 251 (bărbați 168 și femele 83) au fost diagnosticați ca IGD în conformitate cu criteriile DSM-V (8). Un număr total de persoane 91 (controale 49 IGD și 42) au furnizat consimțământul în cunoștință de cauză pentru acest studiu. Dintre acestea, patru persoane au fost excluse în funcție de criteriile de excludere. În cele din urmă, indivizii 87 (subiecți 45 IGD și indivizi sănătoși de control 42) au fost înscriși în acest studiu. Dintre aceștia, participanții 51 (pacienți cu 25 IGD și controalele 26) au fost recrutați ca descoperire setată de la 2014 la 2016. Ceilalți participanți la 36 (pacienți cu 20 IGD și controale 16) au fost recrutați ca set de validare independent de la 2016. Toți participanții au fost indivizi coreeni, înscriși la Spitalul Seul St. Mary's (Seul, Coreea de Sud) și la Universitatea Națională din Seul, Boramae Hospital (Seul, Coreea de Sud). Toți participanții au fost supuși unui interviu structurat de către un psihiatru, bazat pe Programul coreean Kiddie pentru tulburări afective și schizofrenie (K-SADS-PL) (20). Toți participanții au completat subtesturile Block Design and Vocabulary din Scala de informații coreeană-Wechsler pentru copii, ediția 4th (K-WISC-IV) (21). Impulsivitatea a fost evaluată prin scara de impulsivitate Barratt (BIS) (22). Sistemele de inhibare a comportamentului (BInS) și scale de activare a comportamentului (BAS) au fost măsurate pentru a evalua dimensiunea de personalitate (23). Criteriile de excludere au inclus tulburări medicale majore (de exemplu, diabet zaharat), tulburări neurologice (de exemplu, tulburări convulsive, leziuni ale capului), tulburări psihice (de exemplu, tulburare depresivă majoră, tulburări de anxietate) , tutun, canabis, alcool). Caracteristicile generale ale subiecților studiului sunt rezumate în Tabelul Table1.1. Acest studiu a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțional al Colegiului Medical al Universității Catolice din Coreea (MC16SISI0120). Toți participanții și părinții lor au dat consimțământul în scris.
Tabelul 1
Caracteristicile generale ale subiecților studiului.
| Descoperire | Validare | Combinat | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Mod de control | IGD | P-valoare | Mod de control | IGD | P-valoare | Mod de control | IGD | P-valoare | |
| N | 26 | 25 | 16 | 20 | 42 | 45 | |||
| Vârsta (ani) | |||||||||
| Median (min-max) | 13 (12 - 17) | 13 (12 - 15) | 0.759 | 15 (13 - 18) | 14.5 (12 - 18) | 0.628 | 14 (12 - 18) | 14 (12 - 18) | 0.509 |
| Săptămânal ore de jocuri pe Internet (h) | |||||||||
| Median (min-max) | 5.25 (2 - 17) | 18 (6 - 46) | 1.27E-6a | 5.5 (2 - 23) | 8 (1 - 112) | 0.374 | 5.5 (2 - 23) | 14 (1 - 112) | 1.63E-5a |
| Venitul lunar al gospodăriei (milioane KRW) | |||||||||
| Median (min-max) | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.588 | 4 (4 - 4) | 2 (2 - 2) | 1.000 | 5 (1 - 9) | 3 (1 - 9) | 0.460 |
| Educație (ani) | |||||||||
| Median (min-max) | 8 (7 - 9) | 8 (7 - 9) | 0.584 | 12 (12 - 12) | 6 (6 - 13) | 0.305 | 8 (7 - 12) | 8 (6 - 13) | 0.269 |
| K-WISC: proiectarea blocurilor | |||||||||
| Median (min-max) | 10.5 (4 - 17) | 10 (4 - 16) | 0.544 | 10 (3 - 16) | 12.5 (4 - 15) | 0.125 | 10 (3 - 17) | 11 (4 - 16) | 0.598 |
| K-WISC: vocabular | |||||||||
| Median (min-max) | 9 (5 - 17) | 7 (5 - 13) | 0.174 | 9.5 (8 - 15) | 11.5 (5 - 15) | 0.595 | 9 (5 - 17) | 9 (5 - 15) | 0.527 |
| KS | |||||||||
| Median (min-max) | 24 (17 - 36) | 37 (22 - 51) | 3.81E-6a | 29 (17 - 34) | 59 (22 - 108) | 1.2E-5a | 25 (17 - 36) | 40 (22 - 108) | 2.05E-10a |
| BIS | |||||||||
| Median (min-max) | 63 (35 - 75) | 67.5 (45 - 81) | 0.080 | 61 (45 - 79) | 63 (32 - 82) | 0.835 | 62 (35 - 79) | 65 (32 - 82) | 0.240 |
| BAS | |||||||||
| Median (min-max) | 31 (15 - 40) | 31 (13 - 51) | 0.558 | 36.5 (22 - 48) | 34 (27 - 52) | 1.000 | 32 (15 - 48) | 34 (13 - 52) | 0.637 |
| BINS | |||||||||
| Median (min-max) | 18 (10 - 26) | 17.5 (13 - 27) | 0.642 | 18.5 (12 - 25) | 20 (13 - 21) | 0.138 | 18 (10 - 26) | 19 (13 - 27) | 0.302 |
IGD, pacienți cu tulburări de joc pe internet; KS, Scala coreeană de dependență de Internet coreeană; BIS, scara de impulsivitate Barratt; BAS, Sistem de activare comportamentală; BInS, sistem de inhibare a comportamentului; KRW, coreeană câștigată.
aP <0.05 (test Mann – Whitney – Wilcoxon).
Experimentele TaqMan cu densitate mică a miRNA Array (TLDA)
S-a colectat sânge periferic de la fiecare participant și transferat la laborator în cadrul 4 h pentru a minimiza liza celulelor sanguine. Specimenul a fost centrifugat la 3,000 rpm pentru 10 min la temperatura camerei. Apoi, supernatantul (stratul plasmatic) a fost colectat fără a afecta celulele sanguine. MIRNA-urile circulante au fost extrase folosind kitul de purificare TaqMan miRNA ABC (Human Panel A; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Pe scurt, 50 μL de probă de plasmă și 100 μL de tampon ABC au fost amestecate. După hibridizarea cu perle magnetice anti-miARN specifice țintă, miRNA-urile circulante limitate au fost eluate din granule cu 100 uL de tampon de eluare. În faza de descoperire, miRNA 381 au fost examinate din probele 51 din plasmă (25 IGDs și 26 control) utilizând TaqMan miRNA ABC Purification Kit (Human Panel A, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, SUA) conform instrucțiunilor producătorului. Reacțiile de transcripție reversă Megaplex și reacțiile de pre-amplificare au fost realizate pentru a crește cantitatea de cADN pentru analiza expresiei miRNA folosind MegaplexPreAmp Primer Human Pool A și Mix Master Mix (Thermo Fisher Scientific). Panoul TLDA A v2.0 (Thermo Fisher Scientific) a fost condus pe sistemul PCR ViiA7 în timp real (Thermo Fisher Scientific) pentru a evalua exprimarea miRNAs. Datele brute au fost procesate folosind ExpressionSuite Software v1.0.4 (Thermo Fisher Scientific) pentru a determina valorile Ct pentru fiecare miARN.
Analiza datelor pentru TLDA
Am măsurat mai întâi ciclurile de prag (valoarea Ct) ale fiecărui miARN. miARN-urile cu o valoare Ct> 35 au fost considerate ca nedetectabile și excluse din analiza ulterioară. Toate valorile Ct au fost normalizate la valoarea Ct a miR-374b (valoarea ΔCt), unul dintre miARN-urile cele mai stabil exprimate care circulă în plasma umană (24). A fost calculat un raport de schimbare fold log2 (valoarea ΔΔCt) a expresiei folosind valorile medii ale probelor de control ca calibrator din pachetul HTqPCR din Bioconductor (25). Cantitatea relativă (RQ) a fiecărei ținte miRNA a fost definită ca 2-ΔΔCt. Pentru testarea ipotetică a diferenței de exprimare între două grupuri am aplicat analiza variabilelor surogat (SVA) pentru a capta eterogenități cum ar fi efectele lotului în experimente utilizând sto în bioconductor (26). miRNAs cu a P-valoarea <0.05 a fost considerată a fi semnificativ diferită între două grupuri.
Gene Analiza de îmbogățire a setului
Pentru analiza de îmbogățire a seturilor de gene, am folosit ToppFun în ToppGene Suite (27) pentru a deduce Ontologia genetică îmbogățită semnificativ (GO) (28) termeni, cale, și termeni de boală. Ca input pentru această abordare, am folosit 1,230 genele țintă prognozate ale miRNAs candidate. Analiza canalului a fost utilizată pentru a găsi căi semnificative ale genelor țintă prevăzute conform cu KEGG, BioCarta, Reactome, GeneMAPP și MSigDB în căile ToppGene. Semnificația termenilor de îmbogățire funcțională a fost determinată pe baza ajustării Bonferroni P-valoare.
Metoda de validare și replicare PCR cu transcripție cantitativă inversă (qRT-PCR)
Pentru a valida miRNA-urile 10 exprimate diferențial în stadiul de descoperire, s-a efectuat qRT-PCR utilizând analiza TaRMan MicroRNA (miR-15b-5p, #000390; miR-26b-5p, #000407; miR-29b-3p, 000413; miR-125b-5p; #000449; miR-200c-3p; #002300; miR-337-5p; #002156; miR-411-5p; -001610p, #423 și miR-5-002340p, #483) și sistemul ViiA5 (Life Technologies) în conformitate cu protocolul producătorului. Zece nanograme de ARN total s-au transformat în ADNc de prim strand cu primeri specifici miRNA utilizând kitul de transcriere Reverse Transcription TaqMan MicroRNA (#002338, Life Technologies), urmată de PCR în timp real cu probele TaqMan. RQ a fiecărei miRNA a fost definită ca 652-ΔCt, unde ΔCt este diferența în ciclurile de prag pentru proba în cauză, normalizată față de miARN endogen (miR-374b-5p, #001319). Toate reacțiile PCR s-au efectuat în triplicat, iar valorile lor Ct au fost medii. Am calculat un raport log2 ori-schimb (ΔΔCt) al fiecărei miRNA în același mod ca și în analiza bazată pe matrice. A fost efectuat un test non-parametric Mann-Whitney-Wilcoxon pentru a testa diferențele în nivelurile de expresie ale miRNAs în două grupuri cu un prag P-valoarea lui 0.05.
Analiza Western Blot
Fiecare probă serică a fost descoperită mai întâi de proteinele de vârf 14 de înaltă abundență (albumină, imunoglobulină G, imunoglobulină A, serotransferrin, haptoglobin, antitripsină alfa-1, fibrinogen, macroglobulină alfa-2, glicoproteină acută alfa-1, imunoglobulină M, apolipoproteină AI , apolipoproteina A-II, completarea C3 și transtretină) utilizând coloana MARS-14 (4.6 × 50 mm, Agilent Technology, Santa Clara, CA, SUA) înainte de analiza Western blot. Fracțiunea nelegată obținută din coloana MARS-14 a fost concentrată utilizând un filtru centrifugal Amicon Ultracel-3 (3 kDa cutoff) și apoi concentrația de proteină a fost determinată folosind metoda acidului bicinchonicic. Aceleași cantități (de la 10 la 30 μg) probelor de control și IGD au fost separate pe un gel preformat 4-20% Mini-PROTEAN TGX (Bio-Rad, CA, SUA) și transferate într-o membrană difluoridă de poliviniliden. Apoi, membrana a fost blocată în TBS-T (190 mM NaCI, 25 mM Tris-HCI, pH 7.5 și 0.05% Tween 20) cu 5% lapte uscat fără grăsimi la temperatura camerei pentru 30 min. Membranele au fost apoi incubate cu anticorpi primari împotriva DPYSL2 (1: 500, Novus Biologicals, Littleton, CO, SUA), GABRB2 (1: 1000, Abcam, Cambridge, MA, SUA) și CNR1 (1: 100, Santa Cruz Biotechnology , Inc, Santa Cruz, CA, SUA), DUSP4 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA, USA) și PI15 (1: 500, MybioSource, San Diego, CA) % lapte uscat fără grăsimi la 5 ° C peste noapte și apoi cu anticorpi secundari corespunzători, fie anti-șoarece bovină (4: 1, Santa Cruz Biotechnology), fie capră anti-iepure (1,000: 1, Cell Signaling, Beverly, MA ) conjugat cu peroxidază de hrean la temperatura camerei pentru 1,000 h. Detectarea semnalului a fost efectuată utilizând chemiluminescența cu reactiv ECL (GE healthcare, Piscataway, NJ, SUA). Am cuantificat rezultatele obținute prin metoda western blot folosind software-ul de analiză TotalLab 1D (Dynamic non-linear, Newcastle upon Tyne, UK). Apoi, valoarea raportului densitometric a fost calculată prin împărțirea valorii densitometrice a fiecărei probe așa cum este descrisă în altă parte (29). Ca un control al normalizării, pentru fiecare experiment s-a utilizat o probă serică colectată din probe 46 IGD și probe de control. Semnificația statistică a fost determinată utilizând un test non-parametric Mann-Whitney-Wilcoxon cu un prag P-valoarea lui 0.05.
REZULTATE
Caracteristicile obiectului de studiu
Caracteristicile demografice și clinice ale subiecților studiului sunt prezentate în Tabelul Table1.1. Atunci când am comparat grupurile IGD și grupurile de control în conformitate cu Scala coreeană Pronouncement Internet Addiction (K-Scale) așa cum este descris în altă parte (20, 30), grupul IGD a prezentat o valoare K-Scale mediană semnificativ mai mare decât grupul de control (37 vs. 24, P = 3.81 × 10-6) (Masa (Table1) .1). Durata medie săptămânală petrecută pe jocurile de noroc pe Internet în grupul IGD a fost semnificativ mai mare decât cea a controalelor (18 vs. 5.25 h, P = 1.27 × 10-6). Deși nu a existat o diferență semnificativă între două grupuri în ceea ce privește vârsta, venitul lunar al gospodăriei, durata de învățământ, proiectarea blocurilor și rezultatele subtestului de vocabular al K-WISC, BIS, BInS și BAS.
Diferențial exprimate miRNAs între IGD și controale
Pentru a descoperi miRNAs asociate cu IGD, am adoptat o abordare în două etape (descoperire și validare independentă). Designul studiului și strategia globală sunt ilustrate în Figura S1 din Materialul Suplimentar. În faza de descoperire, am analizat profilele de expresie miRNA ale probelor 51 (25 IGDs și 26 controalele) utilizând matricea miRNA conținând miRNA 384. Nivelurile de exprimare ale miRNA 10 s-au dovedit a fi semnificativ diferite între grupurile de control IGD și de control (Tabelul (Table2) .2). Nivelurile de exprimare relativă a acestor miRNA 10 sunt prezentate în Figura Figure1.1. Dintre acestea, două (hsa-miR-423-5p și hsa-miR-483-5p) au fost reglate și opt (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-26b-5p, hsa-miR-29-3p, hsa-miR-125c-5p, hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-337-5p și hsa-miR-411-5p).
Tabelul 2
Diferențial exprimate microRNAs (miRNAs) și modificări ori.
| Mirna | Descoperire | Validare | Combinat | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| P-valoare | Renunțați la schimbare | P-valoare | Renunțați la schimbare | P-valoare | Renunțați la schimbare | |
| HSA-miR-15b-5p | 0.033 | 0.829 | 0.694 | 1.119 | 0.381 | 0.947 |
| HSA-miR-26b-5pa | 0.008 | 0.871 | 0.049 | 0.841 | 0.013 | 0.857 |
| HSA-miR-29b-3p | 0.005 | 0.400 | 0.560 | 1.187 | 0.089 | 0.647 |
| HSA-miR-125b-5p | 0.021 | 0.582 | 0.290 | 0.950 | 0.069 | 0.723 |
| HSA-miR-200c-3pa | 0.011 | 0.336 | 0.003 | 0.542 | 2.93 × 10-5 | 0.415 |
| HSA-miR-337c-5p | 0.009 | 0.385 | 0.582 | 0.872 | 0.020 | 0.553 |
| HSA-miR-411-5p | 0.004 | 0.322 | 0.336 | 1.282 | 0.158 | 0.595 |
| HSA-miR-423-5p | 0.026 | 1.387 | 0.189 | 0.955 | 0.518 | 1.175 |
| HSA-miR-483-5p | 0.018 | 1.861 | 0.765 | 1.413 | 0.211 | 1.647 |
| HSA-miR-652-3pa | 0.019 | 0.715 | 0.049 | 0.877 | 0.011 | 0.782 |
amiRNAs semnificativ modificate în seturi de descoperire și de validare într-o manieră consecventă.
Validarea qRT-PCR a miRNA-urilor candidate
Pentru a valida miRNA-urile candidate 10, am efectuat qRT-PCR cu un set de validare independent (20 IGDs și 16) (tabelul S1 în Materialul Suplimentar). Trei dintre aceste miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p și hsa-miR-652-3p) au fost semnificativ reduse în grupul IGD din setul de validare (Table2) .2). Alte trei miRNA (hsa-miR-337c-5p, hsa-miR-125b și hsa-miR-423-5p) au fost, de asemenea, scăzute în grupul IGD, dar nu semnificativ. Celelalte patru miRNA (hsa-miR-15b-5p, hsa-miR-29b-3p, hsa-miR-411-5p și hsa-miR-423-5p) au fost exprimate opus în setul de validare. Când am combinat seturile de descoperire și validare (un total de subiecți 45 IGD și controale 42), cele trei miRNA valide au fost în mod semnificativ semnificative (tabelul (Table2) .2). Informații detaliate, locații cromozomiale, secvențe mature și nivele de expresie în SNC ale acestor trei miRNAs sunt disponibile în tabelul S2 din Materialul Suplimentar.
Efectul sinergic al modificării simultane a celor trei miRNA asupra riscului IGD
Pentru a evalua efectul combinat al celor trei miRNAs, am observat ratele de șanse (ORs) ale celor patru subgrupuri (cu modificări 0, 1, 2 sau 3 miRNA). modificarea miRNA a fost definită de valoarea RQ descrisă în secțiunea "Materiale și metode. "Deoarece toți cei trei markeri miRNA au fost reglați în grupul IGD, un miRNA a cărui valoare RQ a fost sub unul a fost defectată ca fiind una modificată. Informații detaliate privind valoarea RQ a fiecărui subiect de studiu pentru cele trei miRNAs sunt disponibile în tabelul S3 din Materialul suplimentar. Pentru fiecare subgrup, cotele au fost calculate ca raportul numărului de controale cu cel al IGD-urilor, apoi fiecare OR a fost calculat prin împărțirea cotei pentru fiecare subgrupă cu cotele de subgrup fără modificări ale miRNA. Persoanele cu trei modificări miRNA au prezentat un risc de 22 ori mai mare decât cele fără alterare miRNA (sau 22, 95% CI 2.29-211.11). OR au prezentat o tendință crescătoare cu numărul de miRNA modificați de la 0 la 3 (r2 = 0.996) (Figura (Figure22).
GO și analiza căii genei țintă a miRNA-urilor candidate
Pentru a obține o perspectivă asupra funcțiilor celor trei markeri miRNA semnificativ reglați în grupul IGD, genele lor țintă au fost prezise folosind baza de date miRWalk 2.031). Un total de gene 1,230 au fost prezise constant ca ținte în aval de patru algoritmi (miRWalk, miRanda, RNA22 și Targetscan) utilizând baza de date miRWalk (32-34) (Tabelul S4 din materialul suplimentar). Analiza de îmbogățire a setărilor genetice folosind ToppFun în ToppGene Suite a arătat că genele țintă ale acestor miRNAs au fost asociate semnificativ cu căile de dezvoltare neuronală, cum ar fi "ghidarea Axon" și GO, cum ar fi "neurogenesis" (Tabelul S5 în Materialul Suplimentar).
Exprimarea genelor țintă preconizate
Dintre genele țintă în aval ale celor trei miRNAs, 140 au fost prezise simultan pentru două sau mai multe miRNAs (Tabelul S4 în Materialul Suplimentar). Pentru a explora dacă nivelurile de exprimare a proteinei din genele țintă din aval sunt diferite între grupurile IGD și martor, am selectat genele 2 (DUSP4 și PI15), care sunt prezise ca ținte în aval ale tuturor miRNA-urilor 3 și ale genelor 3 suplimentare (GABRB2, DPYSL2, și CNR1) față de cele prezise pentru miRNA 2 și au efectuat analiza western blot cu probele de plasmă din 28 IGDs și 28 controale disponibile pentru experiment. Am comparat expresiile celor cinci ținte între IGD și grupurile de control prin măsurarea intensității și a suprafeței benzii așa cum este descris în altă parte (29). Dintre acestea, nivelurile de expresie ale DPYSL2 (28 IGDs și 28 controls, P = 0.0037) și GABBR2 (27 IGD-uri și 28 de controale, P = 0.0052) au fost semnificativ mai mari în grupul IGD (Figura (Figure3) .3). Cu toate acestea, nu am putut observa expresii diferențiale ale lui CNR1 (P = 0.0853), DUSP4 (P = 0.5443) și PI15 (P = 0.6346).
Discuție
Sa raportat că miRNAs sunt implicați în dezvoltarea neuronală (35, 36) și expresia diferențială a miRNA-urilor cerebrale sunt observate în bolile psihiatrice cum ar fi schizofrenia (37). Prin urmare, este plauzibil ca profilele miRNA circulante să fie biomarkeri utili pentru IGD. MIRN-urile circulante au fost sugerate ca biomarkeri pentru diverse afecțiuni neuropsihiatrice (38-40); cu toate acestea, mecanismele moleculare din spatele dezvoltării IGD sunt încă în mare parte necunoscute, în ciuda importanței clinice și sociale. În mod specific, nu au existat studii privind miARN-urile asociate IGD. Scopul acestui studiu a fost dublu. În primul rând, am încercat să descoperim miRNA plasmatice asociate cu IGD. În al doilea rând, am evaluat implicarea biologică a candidaților miRNA prin explorarea expresiei proteinei și GO a genelor țintă din aval. Prin screening-ul larg al profilurilor expresiei miRNA și validarea în aval a candidaților, am descoperit că expresia a trei miRNAs (hsa-miR-200c-3p, hsa-miR-26b-5p și hsa-miR-652-3p) semnificativ mai scăzută la pacienții cu diabet zaharat decât cele de control. Deși modelele de expresie ale altor șapte candidați miRNA nu au fost replicate în validare, ele pot fi false negative datorită mărimii mici a eșantionului în acest studiu. Din cunoștințele noastre, acesta este primul raport referitor la posibilitatea ca profilurile de expresie miRNA din sânge să poată fi biomarkere utile pentru IGD. Combinarea celor trei markeri miRNA ar putea servi ca un instrument minim invaziv pentru identificarea precoce a persoanelor cu risc de IGD.
MiRNA-urile identificate în acest studiu au fost raportate ca fiind implicate în diferite tulburări neuropsihiatrice. Expresia hsa-miR-200c în sânge a fost raportată ca fiind scăzută în mai multe tulburări psihiatrice, cum ar fi schizofrenia (41) și episoadele depresive majore (42). miR-200c a fost raportat a fi mai puternic exprimat în fracții sinaptice decât în creierul total (43) și, de asemenea, să fie asociată cu moartea celulelor neuronale (44). Pe baza acestor rapoarte anterioare, miR-200c este implicat în neurodezvoltare și poate fi asociat cu tulburări neuropsihiatrice dacă expresia sa este perturbată. Mai multe studii au sugerat asocierea dintre miR-652 și riscul tulburărilor neuropsihiatrice. Similar cu abordarea noastră, pentru identificarea biomarkerilor de sânge pentru schizofrenie, Lai et al. a efectuat analiza TLDA cu pacienți cu schizofrenie și controale normale și a constatat că șapte miRNA, inclusiv hsa-miR-652, au fost exprimate diferențiat la pacienții cu schizofrenie (45). În studiul ulterior, au proiectat un model de predicție folosind datele de exprimare miRNA și au distins cu succes schizofrenia de la controlul normal (46). Expresia alterată a hsa-miR-652 a fost observată și la alcoolici (47). Hsa-miR-26b sa dovedit a fi activat în timpul diferențierii celulelor neuronale (48). Perkins și colab. a raportat că hsa-miR-26b a fost redus în cortexul prefrontal al pacienților cu schizofrenie (49).
Deși nu există nici o dovadă directă pentru a susține relația dintre expresia perturbata a acestor miRNAs și fiziopatologia IGD, putem deduce că dereglarea acestor miRNAs poate fi asociată cu fiziopatologia IGD bazate pe diverse rapoarte anterioare asupra genelor din aval am prezis . Unele dintre genele din aval ale celor trei miRNA, cum ar fi GABRB2, CNR1, NRXN1, și DPYSL2 sunt raportate ca fiind asociate cu tulburări neuropsihiatrice. Acidul gama-aminobutiric (GABA) este un neurotransmițător inhibitor major în SNC. Dysregularea receptorului GABA este implicată în tulburări neuropsihiatrice incluzând dependența, anxietatea și depresia (50), care sunt, de asemenea, principalele caracteristici ale IGD (8). Polimorfismele genetice ale genelor receptorilor GABA sunt raportate ca fiind asociate cu dependența de alcool și schizofrenie (51, 52). DIAXX (DYSYSL2) este un membru al familiei de proteine mediator de răspuns la collapsină, care joacă un rol în asamblarea microtubulilor, semnalarea sinaptică și reglarea creșterii axonale. În consecință, această moleculă a fost sugerată ca un biomarker pentru tulburările psihiatrice (53, 54). Polimorfismul în DPYSL2 gena a fost, de asemenea, raportată ca fiind asociată cu tulburarea de consum de alcool (55). Rapoartele anterioare si datele noastre sugereaza ca in exces a GABRB2 și DPYSL2, țintele din aval ale miRNAs downregulated, are implicații pentru patogeneza tulburărilor neuropsihiatrice, inclusiv IGD. tip al receptorilor canabinoizi 1 (CNR1) este un heteroreceptor presinaptic care modulează eliberarea neurotransmițătorului și tulburări în cannabinoid de semnalizare sunt asociate cu diferite tulburări neuropsihiatrice (56). Polimorfismul genetic al CNR1 gena este cunoscută ca fiind asociată cu dependența de substanțe la caucazieni (57). La un model de șobolan, activarea hipocampului ventral CNR1 perturbă comportamentul și cunoașterea socială normală (58). Alterarea genetică a familiei NRXN este cunoscută ca fiind implicată în diferite tulburări neuropsihiatrice, incluzând dependența (59).
Pentru a examina implicarea biologică a celor trei candidați miRNA într-un mod mai direct, am explorat expresia proteică a genelor țintă în aval. Datorită disponibilității limitate a probelor de plasmă, din candidații frecvenți 140 (prezenți ca în aval de 2 sau mai multe miRNAs), am examinat țintele 5 (GABRB2, DPYSL2, CNR1, DUSP4 și PI15) prin Western blot și am confirmat că expresia GABRB2 și DPYSL2 a fost semnificativ mai mare în grupul IGD. Rapoartele anterioare si datele noastre sugereaza ca in exces a GABRB2 și DPYSL2, țintele din aval ale miRNAs downregulated, pot avea implicații pentru patogeneza tulburărilor neuropsihiatrice, inclusiv IGD. Rezultatele analizelor GO și ale căilor de dezvoltare a căilor de dezvoltare neuronală susțin, de asemenea, implicarea neurobiologică a markerilor miRNA. O altă constatare interesantă a fost efectul sinergetic al modificării simultane a miRNAs. Persoanele cu reglarea în jos a tuturor miRNA-urilor 3 au prezentat 22 ori un risc mai mare decât cei care nu au avut o reglare a nivelului de regresie, iar ORS au crescut într-o manieră dependentă de doză. Deși IC pentru aceste trei modificări a fost larg datorită dimensiunii limitate a eșantionului, corelația clară pozitivă (r2 = 0.996) susține efectul sinergic al celor trei miARN.
Deși am descoperit markerii miRNA asociați cu IGD și indivizii cu toate cele trei modificări ale miRNA au avut un risc 22 ori mai mare decât cei fără alterarea miRNA, există mai multe limitări în acest studiu. În primul rând, mărimea mică a eșantionului a crescut probabilitatea de lipsă a altor markeri semnificativi miRNA. În al doilea rând, deoarece datele noastre nu au fost suficiente pentru a clarifica dacă profilurile miRNA din plasmă sunt fie cauză, fie efect, nu putem confirma rolurile biologice ale acestor markeri neinvazivi într-un cadru clinic. Mai mult, profilarea miRNA și analiza genelor în aval utilizând țesutul creierului uman din banca țesutului cerebral poate da un răspuns mai direct. Analiza țesuturilor cerebrale cu un model de animale cu tulburări de joc, de asemenea, ar fi de ajutor. În al treilea rând, datorită disponibilității limitate a probelor de plasmă, am examinat numai cinci molecule candidate candidate în aval. Explorarea mai multor ținte în aval cu un set mai mare de eșantioane va fi utilă pentru a înțelege în continuare mecanismul molecular al IGD.
Pe scurt, prin screening-ul genomului la nivel de profile de expresie Mirna si validare independenta, am descoperit trei miRNAs IGD asociate (HSA-miR-200c-3p, HSA-miR-26b-5p și HSA-miR-652-3p). Multe dintre genele lor din aval sunt raportate ca fiind implicate în diferite tulburări neuropsihiatrice, iar validarea experimentală a expresiei alterate a acestor gene în aval susține implicarea miRNAs identificate în acest studiu. Am constatat că indivizii cu downregulation ale tuturor celor trei miARN prezintă un risc ridicat de IGD. Împreună cu factorii de risc clinici sau de mediu cunoscuți și criteriile diagnostice, concluziile noastre pot facilita intervenția timpurie pentru a ajuta persoanele care prezintă un risc mai mare de IGD.
Declarație de etică
Acest studiu a fost aprobat de Consiliul de revizuire instituțional al Colegiului Medical al Universității Catolice din Coreea (MC16SISI0120). Toți participanții și părinții lor au dat consimțământul în scris.
Contribuțiile autorului
ML și HC au contribuit în mod egal la această lucrare. ML, D-JK și Y-JC au proiectat studiul. SJ, S-MC, YP, DC și JL au efectuat experimente și generarea de date. J-WC, S-HP, J-SC și D-JK au colectat probe de sânge și informații clinice. ML, HC, S-HY și Y-JC au analizat datele. ML, HC, S-HY și Y-JC au descris manuscrisul. Y-JC a supravegheat proiectul.
Declarația privind conflictul de interese
Autorii declară că cercetarea a fost efectuată în absența oricăror relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretate ca un potențial conflict de interese.
Note de subsol
Finanțarea. Această lucrare a fost susținută de un grant din cadrul Programului de cercetare al creierului, prin intermediul Fundației Naționale de Cercetare din Coreea (NRF), finanțat de Ministerul Științei și TIC și Planificarea Viitorului (NRF-2015M3C7A1064778).
Material suplimentar
Materialul suplimentar pentru acest articol poate fi găsit online la http://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpsyt.2018.00081/full#supplementary-material.
Referinte
;