Inhibarea neuronală tranzitorie dezvăluie rolurile opuse ale căilor indirecte și directe în sensibilizare (2011)

Nat Neurosci. 2011 ianuarie; 14 (1): 22-24.

Publicat online 2010 decembrie 5. doi:  10.1038 / nn.2703

PMCID: PMC3058296
NIHMSID: NIHMS245934
Versiunea editată finală a acestui articol este disponibilă la Nat Neurosci
Vezi alte articole din PMC că citează articolul publicat.

Abstract

Striatul dorsal joacă un rol important în dezvoltarea dependenței de droguri; cu toate acestea, o înțelegere precisă a rolurilor striatopallidal (indirect) și striatonigral (cale directă) neuronii în reglarea comportamentelor rămâne eluziv.

Folosind o abordare nouă care se bazează pe expresia mediată de virusul unui GPCR proiectat (hM4D), am demonstrat că activarea hM4D cu clozapină-N-oxid (CNO) a redus potențial excitabilitatea neuronilor striatali. Când hM4Receptorii D s-au exprimat selectiv fie în neuroni pe cale directă sau indirectă la șobolani, CNO nu a schimbat răspunsurile locomotorii acute la amfetamină, dar și plasticitatea comportamentală modificată asociată cu tratamentul repetat cu medicamentele. Specific, întreruperea tranzitorie a activității neuronale striatopalidice a facilitat sensibilizarea comportamentală, în timp ce scăderea excitabilității neuronilor striatonigrali a afectat persistența acesteia. Aceste constatări sugerează că efectele acute ale medicamentelor pot fi analizate din adaptările comportamentale asociate cu expunerea repetată la medicament și evidențiază utilitatea acestei abordări pentru deconstruirea contribuțiilor căii neuronale la comportamente precum sensibilizarea.

În ciuda consecințelor negative copleșitoare ale dependenței de droguri, utilizarea psihostimulantului și abuzul rămân prevalente. Progresia de la expunerea inițială la administrare la utilizarea regulată și, în cele din urmă, comportamentul compulsiv, obișnuit și pierderea controlului inhibitor implică o serie de adaptări moleculare în neurocircuite discrete1,2,3. Striatul a fost identificat ca un loc-cheie pentru multe dintre adaptările comportamentale și neurobiologice considerate a forma procesele de bază care mediază dependența1,2,3. Majoritatea neuronilor din striatum (~ 95%) sunt neuroni de proiecție spinală mediană GABAergic (MSNs) tpălări diferă în expresia neuropeptidelor lor și formează două căi eferente majore4.

  • MSN-urile striatopalidice conțin enkefalină (ENK) și formează calea indirectă
  • în timp ce MSN striatonigral conțin dynorfin (DYN) și substanța P și formează calea directă.

Multe modele conceptuale fac ipoteza că aceste populații de MSN se opun reciproc mecanic și funcțional5,6. Cu toate acestea, există puține dovezi empirice care să susțină rolul lor diferențial în controlul comportamentului, deoarece aceste populații de celule sunt amestecate fizic și nu pot fi distinse din punct de vedere morfologic, făcând manipularea selectivă din punct de vedere tehnic evazivă.

Pentru a examina rolul acestor populații de celule striate în dezvoltarea comportamentelor care apar după expunerea repetată la medicamente de abuz, am combinat două strategii noi: vectori virali care utilizează promotorii genei ENK sau DYN pentru a viza expresia transgenei la neuronii striatopalidici sau striatonigrali , respectiv, un GPCR construit (Gi / o- muscarinice umane combinate M4 DREADD; Designer Receptor exclusiv activat de un designer de droguri; hM4D)7 care este activat de un alt ligand farmacologic inert, clozapina-N-oxid8,9 (CNO; Fig. 1a, h). După expresia în neuronii de cultură, administrarea de CNO stimulează Gi / o- hM cuplat4D, activând astfel canalele de canal 3 (Kir3) de rectificare interioară, având ca rezultat hiperpolarizarea membranei și tăcerea neuronală tranzitorie9.

Figura 1  

Atenuarea tranzitorie și orientată a semnalizării celulelor striate. (a, h) Amplicon hărți de pENK-hm4D/pENK-GFP (a) și pDYN-hm4D/pDYN-GFP (h) care vizează vectori. (b, i) Microscopia confocală a arătat că pENK-hm4D receptorii au fost selectiv exprimate în striatopalid ...

Pentru a testa specificitatea fenotipului celular al vectorilor virali, am folosit microscopia cu imunofluorescență cu dublă etichetă după infuzia de virusuri striat dorsale (Imagine suplimentară 1) care exprimă hM marcat cu hemaglutinină4D sub controlul promotorului ENK (pENK-hm4D) sau promotorul DYN (pDYN-hm4D). Am constatat că pENK-hm4D expresia a fost în principal în MSN cu conținut de ENK (90% din celulele hemaglutininice au fost ENK +, 85 din 94; 6% din celulele hemaglutininice au fost substanțe P +, 4 din celulele 70; Fig. 1b) întrucât pDYN-hm4D expresia a fost în principal în MSN cu conținut de substanță P (95% din celulele hemaglutininice au fost substanțe P +, 109 din celulele 115; 5% din celulele hemaglutininice au fost ENK +, 5 din celulele 97; Fig. 1i). Rezultate similare s-au obținut în urma perfuzării de virusuri specifice promotor care exprimă proteina fluorescentă verde (pENK-GFP și pDYN-GFP; SupplementaryFigs. 2a și 3a).

Având în vedere că MSN striatopallidal se proiectează în primul rând la globus pallidus extern (GPe) și la MSN striatonigral, se proiectează în principal la substanța nigra pars reticulata (SNpr), am folosit injecții ale markerului retrograd Fluoro-Gold în aceste regiuni ale creierului urmate de imunohistochimie fluorescentă dublă pentru a confirma că pENK și pDYN virusii au produs o infecție specifică căii. Am observat că pENK-GFP celulele co-localizate cu expresia fluoro-aurar striatal după infuzii în GPe, dar nu SNpr (Figura complementară 2b) întrucât pDYN-GFP celulele co-localizate cu expresia fluoro-aurar striatal după infuzii în SNpr, dar nu și GPe (Figura complementară 3b). Exprimarea vectorilor virali nu a modificat numărul de neuroni ENK + sau substanță P + în regiunea infecției virale, sugerând că utilizarea acestor promotori pentru transferul genelor mediate viral nu interferează cu nivelele neuropeptidice endogene. Toate aceste rezultate demonstrează că pENK și pDYN vectorii virali exprimă genele în populațiile de celule striatale segregate corespunzător.

Deși hM4D, s-a demonstrat că tehnicile bazate pe receptori pot modula activitatea altor tipuri neuronale9, capacitatea lor de a afecta neuronii striatali nu a fost examinată. Prin urmare, am infectat neuronii spirali medii striatali cu hM4D sub controlul unui promotor al virusului herpes simplex (HSV), a preparat felii coronale de striat dorsal două zile mai târziu și a examinat modul în care hM4D-exprima neuronii striatali spini medii răspund la CNO. Am observat că aplicarea locală a CNO (10 μM) a indus o hiperpolarizare a potențialului membranei (~ 7 mV, potențialul membranei de bază a fost ajustat la -80 mV; Fig. 1c) și a redus rezistența la intrare a neuronilor după aplicarea CNO (Fig. 1d, de exemplu), sugerând că conductanța de potasiu (adică, curentul mediat de Kir3) este activat de CNO în hM4D neuronilor care exprimă receptorul. Mai mult, perfuzia CNO a redus substanțial numărul de potențiale de acțiune evocate în hM4D-exprimând neuroni, dar nu și în celulele martor, inhibând astfel în mod eficient producția funcțională a neuronilor infectați cu virus Exprimarea hM4Receptorii D nu au modificat rezistența la intrare (P = 0.84) sau arderea potențialului de acțiune (P = 0.64). (Figura 1f, g). Luate împreună, aceste date sugerează că, similar neuronilor hipocampali9, hM4Metoda bazată pe D / CNO poate scădea efectiv excitabilitatea neuronilor striatali ai șobolanilor.

Ca dovadă suplimentară a conceptului, am testat dacă hM4D ar bloca neurotransmisia într-un circuit bine stabilit unde activitatea neuronală este evocată previzibil de către stimuli relevanți în comportament. În consecință, am infectat neuronii din zona tegmentală ventrală (VTA) cu hM4D sub controlul unui promotor HSV, care exprimă puternic în neuroni ai dopaminei10, și a utilizat voltammetria ciclică de scanare rapidă pentru a măsura modificările eliberării dopaminei în nucleul accumbens după livrarea neașteptată a unei recompense alimentare11. Administrarea CNO a atenuat semnificativ eliberarea de dopamină provocată de peletele alimentare în nucleul accumbens comparativ cu vehiculul (Imagine suplimentară 4). În cele din urmă, am testat dacă scăderea activității anumitor tipuri de celule neuronale în striatum in vivo ar putea modifica capacitatea amfetaminei de a stimula exprimarea Fos. Psihostimulanții, cum ar fi amfetamina, sunt activatori puternici ai c-FOS în striatum12 și va crește c-FOS în ambii neuroni striatonigrali și striatopalidici în condițiile experimentale13. Pe lângă utilizarea sa ca marker al activității neuronale, inducerea psiștimulantă a c-FOS se presupune că joacă un rol important în inițierea și menținerea adaptărilor neurale asociate sensibilizării psihomotorii1,14. Am constatat că activarea mediată de CNO a pENK-hm4D a redus semnificativ numărul total de celule c-Fos induse de amfetamină în striat (Figura 1k și Figura suplimentară 5a). Această reducere a apărut în ambii neuroni hemaglutinin-pozitivi (adică cei care exprimă hM4D) și neuronii hemaglutinin-negativi (adică cei care nu exprimă hM4Receptori D; Fig. 1l), sugerând un efect neuronal de discurs transversal între hM4D-exprimând neuroni și neuroni neinfectați. S-au observat reduceri semnificative ale numărului total de celule c-Fos evocate prin amfetamină și în numărul de celule c-Fos pozitive la hemaglutinină atunci când hM4Receptorii D s-au activat în neuroni de cale directă (Fig. 1n, o și Figura complementară 5b). Foarte important, aceste efecte nu sunt pur și simplu cauzate de expresia virală a unui receptor nou, deoarece expresia fie a pENK-hm4D sau pDYN-hm4D receptorii în absența tratamentului cu CNO nu a avut niciun efect asupra numărului de celule Fos evocate de amfetamină (Figurile suplimentare. 6 și 7). Astfel, aceste constatări demonstrează că activarea mediată de CNO a hM4D pot duce de asemenea la scăderi ale activității neuronale prin reducerea eliberării neurotransmițătorilor și prin atenuarea semnalizării intracelulare.

Expunerea repetată la medicamente dependente poate duce la o creștere progresivă și persistentă a capacității de reacție comportamentală, deseori denumită sensibilizare comportamentală. Este important faptul că sensibilizarea implică unele dintre aceleași circuite neuronale implicate în dezvoltarea dependenței de droguri umane3. Aici folosim instrumentele noastre noi pentru a investiga efectul amortizării specifice a circuitului neuronilor striatali asupra dezvoltării sensibilizării amfetaminei. Am presupus că neuronii direcți și indirecți ai căii au roluri opuse în care neuronii striatonigraționali promovează sensibilizarea și neuronii striatopalidici suprimă sensibilizarea, în concordanță cu rolurile propuse conceptual în activarea comportamentală și respectiv inhibarea5,6. În consecință, am testat dacă excitabilitatea neuronală a neuronilor striatopalidici, în scădere biochimică, ar induce sensibilizarea la un regim de dozare a amfetaminei care ar produce un prag de sensibilizare și dacă scăderea excitabilității neuronale a neuronilor striatonigrali ar împiedica sensibilizarea într-un protocol care produce în mod normal o sensibilizare robustă.

Pentru primul studiu, am folosit un regim de tratament care induce un prag de sensibilizare locomotorie în controalele GFP (patru expuneri la medicamente). După o perioadă de așteptare, a fost administrată o doză moderată de amfetamină provocată (2 mg / kg) în absența atenuării induse de CNO a activității neuronale pentru a determina dacă sensibilizarea a fost persistentă. Activarea mediată de CNO a pENK-hm4D receptorilor în timpul tratamentului cu amfetamină nu a modificat răspunsul locomotor acut la amfetamină (Fig. 2a). Cu toate acestea, disfuncția mediată de CNO a activității neuronale în neuronii cu căi indirecte a facilitat dezvoltarea unei sensibilizări semnificativ mai robuste comparativ cu controlul GFP (Fig. 2b). Această creștere a sensibilizării sa menținut asupra provocării amfetaminei, care a fost efectuată o săptămână mai târziu în absența tratamentului cu CNO (Fig. 2c, d). Aceste efecte pot fi atribuite unei reduceri dependente de CNO a activității neuronilor striatopalidici de hM4D deoarece hM4Exprimarea receptorului D fără tratamentul cu CNO nu produce sensibilizare locomotorie la acest regim de dozare ușoară a amfetaminei (Imagine suplimentară 6).

Figura 2  

Reducerea tranzitorie a excitabilității neuronilor striatopalidali sau striatonigrali a avut efecte opuse asupra sensibilizării amfetaminei. (a, e) Răspunsuri locomotorii acute la amfetamină după activarea indusă de CNO a pENK-hm4D (a) și pDYN-hm4D (e) receptori. ...

Pentru a determina dacă neuronii striatonigrali pot regla reactivitatea medicamentului într-o manieră opusă, am testat în continuare efectul excitabilității biochimice a neuronilor striatonigrali în striatum dorsomedial în timpul unui regim de tratament al amfetaminei care produce o sensibilizare robustă în controalele GFP (șase expuneri la medicament ) precum și în timpul unei doze scăzute de provocare de amfetamină (0.5 mg / kg) în absența perturbării mediate de receptor a activității neuronale. Ca și în cazul amortizării căii indirecte, scăderea mediată de CNO a excitabilității neuronilor direcți direcți în timpul tratamentului cu amfetamină nu a modificat răspunsul locomotor acut la amfetamină (Fig. 2e). Deși dezvoltarea sensibilizării a apărut similar cu controlul GFP după activarea indusă de CNO a pDYN-hm4D receptorilor în timpul fazei de tratament (Fig. 2f), sensibilizarea nu a persistat în pDYN-hm4D dar a fost încă menținută în mod robust în controalele GFP (Fig. 2g, h). Aceste efecte pot fi, de asemenea, atribuite unei scăderi dependente de CNO a activității neuronilor striatonigrali de hM4D deoarece hM4Exprimarea receptorului D în absența tratamentului cu CNO nu a blocat dezvoltarea sensibilizării locomotorii, deoarece s-a observat o sensibilizare în timpul fazei de tratament și pe provocarea medicamentului (Imagine suplimentară 7). Aceste date sugerează că neuronii striatonigrali pot fi deosebit de importanți pentru reglementarea adaptărilor comportamentale pe termen lung care sunt o consecință a consumului repetat de droguri.

În concluzie, aceste date oferă prima dovadă a rolului critic și opus al neuronilor striatopalidici și striatonigrali în reglarea plasticității comportamentului dependent de experiența medicamentului. În plus, lipsa efectului inhibării neuronale asupra răspunsului locomotor acut la amfetamină oferă dovezi suplimentare că mecanismele care reglează răspunsurile acute la medicamente sunt diferite de cele care modulează adaptările de durată care apar cu expunerea repetată la medicament. În cele din urmă, asocierea vectorilor virali specifici fenotipic cu receptori proiectanți capabili să modifice activitatea neuronală fără a distruge permanent funcția celulară oferă o abordare nouă și puternică pentru deconstrucția bazei moleculare a dependenței.

Material suplimentar

recunoasteri

Această lucrare a fost susținută de granturile NIH K99 DA024762 (SMF), T32 GM07266 și T32 GM07108 (DE), T32 AA009455 și F32 DA026273 (MJW), R21 DA021793 (PEMP), R01 DA023206 (YD), U19MH82441 și NIMH-PDSP ) si R21 DA021273 (JFN), o recompensa de realizare pentru colegii de stiinta (DE) si un premiu NARSAD Distinguished Investigator (BLR)

Note de subsol

Concluzie privind interesele concurente

Autorii declară că nu au interese financiare concurente.

Referinte

1. Berke JD, Hyman SE. Neuron. 2000; 25: 515-532. [PubMed]
2. Neslter EJ. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 119-128. [PubMed]
3. Robinson TE, Berridge KC. Dependenta. 2001; 96: 103-114. [PubMed]
4. Smith Y, Bevan MD, Shink E, Bolam JP. Neuroscience. 1998; 86: 353-387. [PubMed]
5. Shen W, Flajolet M, Greengard P, Surmeier DJ. Ştiinţă. 2008; 321: 848-851. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
6. Durieux PF, și colab. Nat Neurosci. 2009; 12: 393-395. [PubMed]
7. Conklin BR, și colab. Nat Metode. 2008; 5: 673-678. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
8. Alexander GM, și colab. Neuron. 2009; 63: 27-39. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
9. Armbruster BN, Li X, Pausch MJ, Herlitze S, Roth BL. Proc Natl Acad Sci SUA. 2007; 104: 5163-5168. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
10. Choi KH, și colab. Ann NY Acad Sci. 2003; 1003: 372-374. [PubMed]
11. Clark JJ, și colab. Nat Metode. 2010; 7: 126-129. [Articol gratuit PMC] [PubMed]
12. Harlan RE, Garcia MM. Mol Neurobiol. 1998; 16: 221-267. [PubMed]
13. Badiani A, MM Oates, Ziua HE, Watson SJ, Akil H, Robinson TE. Behav Brain Res. 1999; 103: 203-209. [PubMed]
14. Hyman SE, Malenka RC. Nat Rev Neurosci. 2001; 2: 695-703. [PubMed]