ප්රොක්ට් Natl Acad Sci එක්සත් ජනපද ඒ. 2005 පෙබරවාරි 1; 102(5): 1737-1742.
වියුක්ත
අපයෝජන drug ෂධයක් වන කොකේන්, ඇක්සෝන් පර්යන්තවල ඩොපමයින් නැවත ලබා ගැනීම අවහිර කිරීමෙන් ස්ට්‍රයිටේටම් හි උපාගමික ඩොපමයින් මට්ටම ඉහළ නංවයි. පශ්චාත්-නියුරෝන වල උපස්ථර වල පොස්පරීකරණයට සම්බන්ධ ප්‍රෝටීන වන සයික්ලින් මත යැපෙන කයිනාස් 5 (Cdk5) සහ එහි සක්‍රියකාරක p35, කොකේන් වලට නිරාවරණය වීමෙන් පසුව නියාමනය කර ඇති බව සොයාගෙන ඇත. ස්ට්‍රයිටල් ඩොපමයින් සං aling ාකරණය මත සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සහ පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රේරණයේ බලපෑම තවදුරටත් පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි සීඩීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් හෝ පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් නියුරෝන වල අධික ලෙස පීඩනයට ලක් වූ ස්වාධීන පාරජම්බුල මූසික රේඛා දෙකක් ජනනය කළෙමු. PxNUMX හි ප්‍රති result ලයක් ලෙස Cdk5 ක්රියාකාරිත්වය වැඩි වූ නමුත් Cdk35 අධික ලෙස පීඩනය යෙදීම කොකේන්-මැදිහත් වූ ඩොපමයින් සං sign ා ලබා ගැනීමට හේතු වන බව අපි මෙහි වාර්තා කරමු. Thr-5 හි 35 kDa (DARPP-5) අණුක ස්කන්ධය වන ඩොපමයින් හා සීඒඑම්පී-නියාමනය කරන ලද ෆොස්ෆොප්‍රෝටීන් වල සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස්-මධ්‍යස්ථ පොස්පරීකරණය වැඩි වීමත් සමඟ ත්‍රි-එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි ඩාර්පීපී-එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි පොස්පරීකරණය අඩු විය. Thr-35 හි බාහිර සෛල සං signal ා-නියාමනය කරන ලද කයිනාස් කයිනාස් 5 හි Cdk5- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණය සමඟ බාහිර සෛල සං signal ා-නියාමනය කරන ලද kinase 32 / 32 සක්‍රිය වීම අඩු විය. මෙම බලපෑම් මගින් CAMP ප්‍රතිචාර මූලද්‍රව්‍ය බන්ධන ප්‍රෝටීන වල කොකේන් ප්‍රේරිත පොස්පරීකරණය හා ස්ට්‍රයිටේටම් හි සී-ෆොස් අඩු ප්‍රේරණයක් ලබා ගැනීමට දායක විය. මෙම ප්‍රති results ල මගින් Cdk75 ක්‍රියාකාරකම් කොකේන් වලට නිරාවරණය වීමෙන් පසුව වෙනස් කරන ලද ජාන ප්‍රකාශනයකට සම්බන්ධ වන අතර එම නිසා කොකේන් වලට ඇබ්බැහි වීමට යටින් පවතින නියුරෝන ක්‍රියාකාරිත්වයේ දිගුකාලීන වෙනස්කම් වලට බලපෑම් කරයි.
කොකේන්, ස්ට්‍රයිටේටම් හි සයිනොප්ටික් ඩොපමයින් මට්ටම ඉහළ නංවන අතර ඩොපමයින් ඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රතිග්‍රාහකයේ සිට න්‍යෂ්ටිය දක්වා ආරම්භක සං signal ාව ප්‍රචාරණය කරන අන්තර් සෛලීය මාර්ග සක්‍රීය කිරීමෙන් ඩොපමිනොසෙප්ටිව් නියුරෝන වල ජාන ප්‍රකාශනය වෙනස් කරයි (1). කොකේන් වලට නිදන්ගතව නිරාවරණය වීම පිටපත් කිරීමේ සාධක කිහිපයක් නියාමනය කරයි, එහි ප්‍රති ing ලයක් ලෙස කොකේන් ඇබ්බැහි වීමේ නියුරෝන අනුවර්තනයන්ට යටත් වේ යැයි සිතන ජාන ප්‍රකාශනයේ දීර්-කාලීන වෙනස්කම් සිදු වේ.2). OsFosB, එවැනි පිටපත් කිරීමේ සාධකයක් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත (3), කොකේන් සඳහා සතුන්ගේ චර්යාත්මක ප්‍රතිචාර දැක්වීම වැඩි කරන බව පෙන්වා දී ඇත (4, 5). එබැවින්, osFosB ප්‍රේරණය මගින් නියාමනය කරනු ලබන ඉලක්කගත ජාන හඳුනා ගැනීම කොකේන් වලට ඇබ්බැහි වීමට යටින් පවතින අණුක යාන්ත්‍රණය පිළිබඳ වැඩි අවබෝධයක් ලබා ගැනීමට අපේක්ෂා කරයි. මෑතකදී, කොකේන් සමඟ සතුන්ට නිදන්ගත ප්රතිකාර කිරීම සයික්ලින් මත යැපෙන කයිනාස් 5 (Cdk5) සහ එහි සක්‍රියකාරක p35 ස්ට්‍රයිටේටම් හි ප්‍රකාශනය නියාමනය කිරීම සඳහා ΔFosB (6, 7).
Cdk5 යනු සෙරීන් / ත්‍රෙටොනීන් කයිනස් හි සීඩීකේ පවුලේ සාමාජිකයෙකි. සෛල චක්‍ර ප්‍රගතියේ ප්රධාන නියාමකයින් වන අනෙකුත් සීඩීඑක්ස් මෙන් නොව, සීඩීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් ප්රධාන වශයෙන් පශ්චාත්-නියුරෝන වල උපස්ථර වල පොස්පරීකරණය සඳහා සම්බන්ධ වේ. (8). Cdk5 ක්‍රියාකාරිත්වයේ නියුරෝන නිශ්චිතතාව සාක්ෂාත් කරගනු ලබන්නේ එහි ක්‍රියාකාරීන් වන p35 හෝ p39 සමඟ සම්බන්ධ වීමෙනි, ඒවා ප්රධාන වශයෙන් පශ්චාත්-නියුරෝන වල ප්‍රකාශ වේ (8). මොළයේ වර්ධනය සඳහා Cdk5 හි අත්‍යවශ්‍ය කාර්යභාරයට අමතරව (9, 10), මමපශ්චාත් ප්‍රසව මොළයේ ඩොපමිනර්ජික් සම්ප්‍රේෂණයට ද ටී සම්බන්ධ කර ඇත (11, 12). Cdk5 ක්‍රියාකාරීත්වය නිෂේධනය කිරීමෙන් ස්ට්‍රයිටේටම් හි ඩොපමයින් මුදා හැරීම වැඩි වන අතර, ඩොපමයින් මුදා හැරීමේ negative ණ නියාමකයෙකු ලෙස සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් හි පූර්ව ක්‍රියාකාරීත්වය පෙන්නුම් කරයි. (11). තව දුරටත්, සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් විසින් පොස්පරීකරණය කිරීමෙන් ඩොපමයින් හා සීඒඑම්පී-නියාමනය කරන ලද ෆොස්ෆොප්‍රෝටීන්, අණුක ස්කන්ධය 5 kDa (DARPP-32) Thr-32 හි පෝස්ට්නැප්ටික් ඩොපමයින් සං sign ාකරණයේ කාර්යක්ෂමතාව මොඩියුලේට් කරයි. (12).
මෙම නිරීක්ෂණවලින් පෙනී යන්නේ Cdk5 සහ p35 යනු කොකේන් වලට නිදන්ගතව නිරාවරණය වීමෙන් පසුව ඩොපමයින් සං sign ා දීර් activ කාලයක් තිස්සේ ක්‍රියාත්මක කිරීමේ පහළ නියාමකයින් වන අතර එම නිසා කොකේන් වලට ඇබ්බැහි වීමයි. ස්ට්‍රයිටල් ඩොපමයින් සං sign ාකරණයේ සීඩීඑක්එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි කාර්යභාරය තවදුරටත් ආමන්ත්‍රණය කිරීම සඳහා, අපි පාරජම්බුල මූසික රේඛා දෙකක් ජනනය කළෙමු. එමඟින් සීඩීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් හෝ පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස්, නියුරෝන වල විශේෂයෙන් පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ අධික ලෙස පීඩනයට ලක් කරන ලදී. අපගේ සොයාගැනීම් වලට අනුව, සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය ඉහළ නියාමනය කර ඇත්තේ පීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් ප්‍රෝටීන මට්ටම් සමඟ මිස සීඩීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් ප්‍රෝටීන් නොවේ, එයින් ඇඟවෙන්නේ සීඩීඑක්එන්එන්එම්එක්ස් ක්‍රියාකාරකම් සඳහා අනුපාත සීමා කරන බවයි. අපි මෙහි සපයන්නෙමු ඉතින් P5 අධි පීඩනයේ ප්‍රති C ලයක් ලෙස Cdk35 ක්රියාකාරිත්වය වැඩි වූ බවට සාක්ෂි, PKA සහ බාහිර සෛල සං signal ා-නියාමනය කළ කයිනාස් (ERK) කඳුරැල්ල නිෂේධනය කිරීම මගින් න්‍යෂ්ටියට කොකේන්-මැදිහත් වූ ඩොපමයින් සං sign ා ලබා ගැනීමට හේතු වේ.
ද්රව්ය සහ ක්රම
ප්‍රතිදේහ. Cdk5 (C-8) සහ p35 (C-19) සඳහා වූ පොලිකාලෝනීය ප්‍රතිදේහ සැන්ටා ක ru ස් ජෛව තාක්ෂණයෙන් මිලදී ගන්නා ලදී. ERK kinase (MEK) 1 / 2, ERK1 / 2, සහ cAMP- ප්‍රතිචාර මූලද්‍රව්‍ය බන්ධන ප්‍රෝටීන් (CREB) සඳහා පොස්පරීකරණය මත රඳා පවතින සහ රඳා පවතින ප්‍රතිදේහ සෛල සං Sign ා තාක්ෂණයෙන් (බෙවර්ලි, MA) ලබා ගන්නා ලදී. ෆොස්ෆෝ- Thr-34 DARPP 32 සඳහා ප්‍රතිදේහ (13), phospho-Thr-75 DARPP-32 (12), මුළු DARPP-32 (12), සහ සී-ෆොස් (14) විස්තර කර ඇති පරිදි භාවිතා කරන ලදී. ඇක්ටින් සඳහා ප්‍රතිදේහයක් සිග්මා වෙතින් මිලදී ගන්නා ලදී.
පර්යේෂණාත්මක සතුන්. අපි මීට පෙර p35 ජානය මූසිකය ක්ලෝන කළා Cdk5r1, එය p35 ප්‍රෝටීන් සංකේතවත් කරන අතර එහි ජානමය ව්‍යුහය සංලක්ෂිත කරයි (15). P35 (Tgp35) හි නියුරෝන අධික ලෙස පීඩනය සමඟ පාරජම්බුල මූසිකය ජනනය කිරීම සඳහා, 6-kb පරිසරRI-පරිසර1.2-kb ප්‍රවර්ධක කලාපය අඩංගු RI කැබැල්ල pGEM9Z (-) ප්ලාස්මිඩ් එකකට අනුයුක්ත කර ඇති අතර SV45 වෙතින් ලබාගත් 40-bp ටැගය ඇතුළත් කර ඇත. කේපීඑන්මම පොලි (ඒ+) සං signal ාව (රූපය. 1A). ටැගයෙහි a වේගයසතුන්ගේ ප්‍රවේණිගත කිරීම සඳහා මම වෙබ් අඩවිය. 6-kb කැබැල්ල ප්ලාස්මිඩ් වලින් ඉවත් කර පිරිසිදු කර ඇති අතර ඉන් පසුව පාරජම්බුල මීයන් උත්පාදනය කිරීම සඳහා පාරජම්බුලයට න්‍යෂ්ටික එන්නත් කරනු ලැබේ. 1.2-kb p35 ප්‍රවර්ධකයේ නියාමන පාලනය යටතේ සංක්‍රාන්තියේ ප්රකාශන පැතිකඩ පරීක්ෂා කිරීම. ඉතින්, ද්වි-පාරම්පරික මූසිකයක් (Tgp35; p35 - / -) තව දුරටත් උත්පාදනය කරන ලද්දේ පියවර දෙකක අභිජනන උපාය මාර්ගයක් භාවිතා කරමින් Tgp35 මූසිකය අන්තරාසර්ග p35- ශුන්‍ය පසුබිමක ප්‍රතිනිර්මාණය කිරීමෙනි. මෙම අධ්‍යයනයේදී භාවිතා කරන ලද අනෙකුත් මූසික ආකෘති අතර p35 +/–, p35 - / -, Cdk5 +/–, සහ Cdk5 (TgCdk5) හි නියුරෝන අධික ලෙස පීඩනය සහිත පාරජම්බුල මූසිකය (9, 16, 17). මෙම මීයන්ගේ ප්‍රවේණි වර්ග තීරණය කරනු ලැබුවේ වලිග බයොප්සි වලින් හුදකලා වූ ජානමය ඩීඑන්ඒ පිළිබඳ දක්ෂිණ බ්ලොට් විශ්ලේෂණය හෝ පීසීආර් ය. මීයන් 12-h light / 12-h අඳුරු චක්‍රයක් යටතේ තබා ඇත. රසායනාගාර හා පර්යේෂණාත්මක සතුන් රැකබලා ගැනීම හා භාවිතය පිළිබඳ ජාතික සෞඛ්‍ය ආයතන මාර්ගෝපදේශයන්ට අනුකූලව සියලු සත්කාර ලබා දී ඇත.
දක්ෂිණ බ්ලොට් විශ්ලේෂණය. වලිග බයොප්සි වලින් ලබාගත් ජානමය ඩීඑන්ඒ සමඟ ජීර්ණය කරන ලදී පරිසරRI සහ වේගයමම, 0.9% ඇගරෝස් ජෙල් මත විද්‍යුත් විච්ඡේදනය කර නයිලෝන් පටලයකට මාරු කළෙමි. පටලය අහඹු ලෙස ප්‍රාථමිකව දෙමුහුන් කරන ලදී 32එක් රැයකින් 42 at C දී පී ලේබල් කරන ලද පරීක්ෂණය. P485 පිළිමළුන් පිටුදැකීමේ (p35 - / -) සහ Tgp35 මීයන් ජාන සැකසීම සඳහා වූ 35-bp පරීක්ෂණය පහත සඳහන් ප්‍රාථමිකයන් භාවිතා කරමින් PCR විසින් ජනනය කරන ලදි: 5′-ACATCCTGCTGCCACGGTGAC-3 X සහ 5T-CCACTGTAAAA. 3 මිනිත්තුව සඳහා 2 × C දී දෙමුහුන් පටලය 0.1 × SSC / 42% SDS වලින්ද, 10 මිනිත්තුව සඳහා 0.1 at C හි 0.1 at C දීද, 65 min C දී දෙවරක් සෝදා, එක්ස් කිරණ පටලයට නිරාවරණය විය.
Treatment ෂධ ප්රතිකාර. කොකේන් (සිග්මා) විෂබීජහරණය කළ සේලයින් වල ද්‍රාවණය විය. 15 මාස වලදී සතුන් කොකේන් (3 mg / kg) හෝ ඊට සමාන සේලයින් ප්‍රමාණයක් එන්නත් කරන ලද අතර එන්නත් කිරීමෙන් පසු විවිධ කාලවලදී (15, 30, 60, සහ 120 min) කසාය මගින් මරා දමන ලදී. අයිස් සිසිල් පීබීඑස් තුළ මොළය වේගයෙන් ඉවත් කර සිසිල් කරන ලදී. පසුව වර්ජනය විසුරුවා හරින ලද අතර උතුරු හෝ බටහිර බ්ලොට් විශ්ලේෂණයට භාජනය විය. ප්‍රතිශක්තීකරණ රසායනික විශ්ලේෂණය සඳහා, එන්නත් කිරීමෙන් පසු 2 h මීයන්ගෙන් ස්ට්‍රයිටල් අංශ ලබා ගන්නා ලදී.
උතුරු බ්ලොට් විශ්ලේෂණය. TRIzol reagent (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA) සමඟ ස්ට්‍රයිටා වෙතින් සම්පූර්ණ RNA ලබා ගත් අතර විස්තර කර ඇති පරිදි උතුරු බ්ලොට් විශ්ලේෂණයට භාජනය විය (18). C-fos mRNA හඳුනා ගැනීම සඳහා, විස්තර කර ඇති පරිදි පරීක්ෂණයක් ලෙස මූසිකයේ c-fos cDNA හි 189-bp කැබැල්ලක් භාවිතා කරන ලදී (19). නිශ්චිත කලාපයේ දෘශ්‍ය ity නත්වය මැනීම මගින් සී-ෆොස් එම්ආර්එන්ඒ මට්ටම ගණනය කරනු ලැබුවේ නිහා රූප මෘදුකාංගයක් වන 1.62 අනුවාදය සමඟ රූප විශ්ලේෂණ පද්ධතියක් භාවිතා කිරීමෙනි.
බටහිර බ්ලොට් විශ්ලේෂණය. ස්ට්‍රයිටල් පටක 1% SDS වලින් sonicated සහ 10 min සඳහා තම්බා ඇත. සෑම සාම්පලයකම ප්‍රෝටීන් සාන්ද්‍රණය තීරණය කරනු ලැබුවේ BCA ප්‍රෝටීන් තක්සේරුව (පියර්ස්) විසිනි. නයිට්‍රොසෙලුලෝස් පටලයකට මාරු කිරීමට පෙර සමාන ප්‍රෝටීන ප්‍රමාණයක් SDS / PAGE මගින් වෙන් කරන ලදී. 1% හීන කිරි සහ 5% 0.05 අඩංගු 20 × PBS හි පටල අවහිර කර ඇති අතර ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහ සමඟ එක රැයකින් 4 at C දී පුරවා ඇත. පෙරොක්සිඩේස්-සංයෝජිත මවුස් හෝ හාවා IgG (සිග්මා) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි තක්සේරු කිරීම 60 මිනිත්තුව සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී සිදු කරන ලදී. වැඩි දියුණු කරන ලද රසායන ද්රව්ය (පියර්ස්) විසින් සං signal ාවක් අනාවරණය කරන ලද අතර, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි පටි වල දෘශ්‍ය ities නත්වය ප්‍රමාණනය කරන ලදී.
Cdk5 Kinase Assay. ස්ට්‍රයිටල් ලයිසෙට් සකස් කරන ලද්දේ 50 mM Tris · HCl, pH 7.4 / 50 mM NaCl / 5 mM EDTA / 1% Triton X-100 / 1mMDTT / 1 mM phenylmethyls / මිලි ලියුපෙප්ටින් / පොස්පේටේස් නිෂේධක (පොස්පේටේස් නිෂේධක මිශ්‍රණය I සහ II, සිග්මා). ලයිසෙට් ප්‍රති-සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් (සී-එක්ස්එන්එම්එක්ස්) හෝ ප්‍රති-පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් (සී-එක්ස්එන්එම්එක්ස්) ප්‍රතිදේහ සමඟ ප්‍රතිශක්තිකරණයට ලක් කරන ලදී. Cdk1 ප්‍රතිශක්ති ප්‍රතිරෝධක සකස් කරන ලද්දේ ලයිසෙට් හි 1 μl (ප්‍රෝටීන වල 5 tog ට අනුරූපව) සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රතිදේහ (8 μg) සමඟ එක රැයකින් 35 at C දී පුර්ව ලියාපදිංචි කිරීමෙනි. ඉන්පසු 19 μl ප්‍රෝටීන් A-agarose පබළු 5 h සඳහා 300 h සඳහා ලයිසිස් බෆරයේ% මුඩුක්කු; සැන්ටා ක ru ස් ජෛව තාක්ෂණය). P300 immunoprecipitates සැකසීම සඳහා, ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි ලයිසෙට් හි 5 μl (ප්‍රෝටීන වල 3 mg ට අනුරූපව) p4 ප්‍රතිදේහ (25 μg) සමඟ පුර්ව ලියාපදිංචි කර ඇත. ප්‍රතිශක්තීකරණ ප්‍රතිරෝධක දෙවරක් ලයිසිස් බෆරයෙන් සහ දෙවරක් 50 mM Tris · HCl, pH 3 / 4 mM MgCl වලින් සමන්විත කයිනාස් බෆරයකින් සෝදා ඇත.2/ 1 mM EDTA / 1 mM EGTA / 1 mM DTT, කයිනාස් බෆරයේ 60 inl හි නැවත එකතු කර ඇත. කයිනාස් ක්රියාකාරිත්වය මනිනු ලැබුවේ හිස්ටෝන් H1 උපස්ථරයක් ලෙස භාවිතා කිරීමෙනි (18).
හෘද රෝගය. ඇවර්ටින් (250 mg / kg, Fluka) එන්නත් කිරීම මගින් මීයන් නිර්වින්දනය කරන ලද අතර 0.1 M සෝඩියම් පොස්පේට් බෆරය, pH 7.4 සමඟ අන්තරාසර්ගව සුවඳ විලවුන් කරන ලද අතර, පසුව ස්ට්රෙක් ටිෂූ ෆික්සේටිව් (ස්ට්‍රෙක්ක් රසායනාගාර, ලා විස්ටා, එන්ඊ), හරස් සම්බන්ධක නොවන ස්ථායීකාරකයක් විය. 37 at C දී එක රැයකින් විසුරුවා හරින ලද මොළය තවදුරටත් සවි කර ඇත. ඉන්පසුව, මොළය පැරෆින් තුළට කාවැදී, 5-thick න කිරීටක කොටස් වලට කපා, ඩයමිනොබෙන්සයිඩින් සමඟ උපස්ථරයක් ලෙස අවිඩින්-බයෝටින්-පෙරොක්සයිඩ් සංකීර්ණ තාක්ෂණය (දෛශික රසායනාගාර) භාවිතා කරමින් ප්‍රතිශක්ති ist න රසායන විද්‍යාවට භාජනය කරන ලදී. 4 at C දී එක රැයකින් සී-ෆොස් වලට එරෙහිව කොටස් පිරිසිදු කරන ලද පොලිකාලෝනීය ප්‍රතිදේහයක් සමඟ මෙම කොටස් පුරවා ඇත. ප්‍රාථමික ප්‍රතිදේහය මඟ හැරීම මගින් පැල්ලම් කිරීමේ නිශ්චිතතාව තක්සේරු කරන ලදී.
ප්රතිපල
P35 හි නියුරෝන අධික ලෙස පීඩනය සමඟ පාරජම්බුල මීයන් උත්පාදනය කිරීම. P35 හි වැඩි නියුරෝන ප්‍රකාශනය සාක්ෂාත් කර ගැනීම සඳහා භාවිතා කරන සංක්‍රාන්තිය සමන්විත වූයේ ක්ලෝන කරන ලද මූසිකයේ 6-kb කැබැල්ලයි. 35-kb ප්‍රවර්ධකය අඩංගු p1.2 ජානය සහ p35 හි සම්පූර්ණ කේතීකරණ අනුක්‍රමය (රූපය. 1 A). මීයන්ගේ ප්‍රවේණි වර්ග තීරණය කරනු ලැබුවේ දක්ෂිණ බ්ලොට් විශ්ලේෂණය මගින් p35 - / - සහ Tgp35 මීයන් වල් ආකාරයේ මීයන්ගෙන් වෙන්කර හඳුනා ගැනීම සඳහා නිර්මාණය කරන ලද පරීක්ෂණයක් භාවිතා කිරීමෙනි.රූපය. 1 A සහ B). 1.2-kb p35 ප්‍රවර්ධකයාගේ පාලනය යටතේ ඇති පාරදෘශ්‍ය ප්‍රකාශනය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, අපි ද්විත්ව පාරජම්බුල මීයන් (Tgp35; p35 - / -) උත්පාදනය කළෙමු, එහිදී p35 ප්‍රකාශනය මෙහෙයවනු ලැබුවේ සංක්‍රාන්තියෙන් පමණි. Tgp35 හි p35 ප්‍රකාශනය; p35 - / - මීයන් නිරීක්ෂණය කරන ලද්දේ මොළයේ පමණි (රූපය. 1C), එහිදී අවකාශීය ප්රකාශන රටාව වල් ආකාරයේ මීයන්ට සමාන විය (රූපය. 1D). P35 හි lack නතාවය මස්තිෂ්ක බාහිකයේ සහ මීයන්ගේ හිපොකැම්පස් හි අසාමාන්‍ය ස්ථර ව්‍යුහයක් ඇති බව පෙන්වා දී ඇත (10). කෙසේ වෙතත්, Tgp35; p35 - / - මීයන් p35 - / - මොළයේ ෆීනෝටයිප් (රූපය. 1E). මෙම දත්ත වලින් පෙන්නුම් කළේ 1.2-kb p35 ප්‍රවර්ධකය විසින් අන්තරාසර්ග p35 ජානයෙන් p35 වලට සමාන ප්රකාශන පැතිකඩක් සමඟ සංක්‍රාන්ති ප්‍රකාශනය පාලනය කරන බවයි.
PxNUMX ප්‍රෝටීන් මට්ටම Cdk35 ක්‍රියාකාරකම් ඉහළ නියාමනය කිරීම සඳහා අනුපාත සීමා කිරීමකි. P35 - / -, p5 +/–, වල්-වර්ගය, Tgp35, Cdk35 +/–, සහ TgCdk35 මීයන්ගෙන් වයස අවුරුදු X දී ප්‍රෝටීන ප්‍රකාශනය මත p5 සහ Cdk5 කේතීකරණයේ ජාන-මාත්‍රා බලපෑම් අපි පරීක්ෂා කළෙමු. P3 සහ Cdk35 ප්‍රෝටීන මට්ටම් පිළිවෙලින් ජාන මාත්‍රාව සමඟ හොඳින් සම්බන්ධ වේ (රූපය. 2 A සහ B). Tgp35 මීයන් වල් ආකාරයේ මීයන් හා සසඳන විට p1.6 ප්‍රෝටීන් මට්ටමේ ≈35 ගුණයකින් වැඩි වූ අතර සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රෝටීන් මට්ටම් විවිධ මට්ටම්වල p5 ප්‍රෝටීන වලට බලපාන්නේ නැත. TgCdk35 මීයන් වල් ආකාරයේ මීයන් හා සසඳන විට Cdk5 ප්‍රෝටීන් මට්ටමේ ≈1.9 ගුණයකින් වැඩි වූ අතර pxNUMX ප්‍රෝටීන් මට්ටම් විවිධ මට්ටමේ Cdk5 ප්‍රෝටීන වලට බලපාන්නේ නැත. Cdk35 ක්‍රියාකාරිත්වයට විවිධ p5 ප්‍රෝටීන වල බලපෑම පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, Cdk35 ප්‍රති-සීඩීඑස් වලින් ප්‍රතිශක්තිකරණයට ලක් නොවූ අතර Cdk5 ප්‍රති-ප්‍රතිදේහ සමඟ කයිනාස් ක්රියාකාරිත්වය මනින ලදී. ඒ හා සමානව, සීඩීකේඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රෝටීන වල විවිධ ප්‍රමාණයන් කයිනාස් ක්‍රියාකාරිත්වයට බලපාන ආකාරය පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රති-පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ප්‍රතිදේහ සහිත ස්ට්‍රයිටල් නිස්සාරණයෙන් ප්‍රතිශක්තිකරණයට ලක් නොවූ අතර කයිනාස් ක්රියාකාරිත්වය මනින ලදී. Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් p5 ප්‍රෝටීන මට්ටම සමඟ හොඳින් සම්බන්ධ වී ඇති නමුත් Cdk5 ප්‍රෝටීන මට්ටම සමඟ නොවේ (රූපය. 2 C සහ D). මෙම ප්‍රති results ලවලින් පෙනී ගියේ pxNUMX ප්‍රෝටීන් ප්‍රමාණය Cdk35 ක්‍රියාකාරකම් සඳහා අනුපාත සීමා කරන සාධකයක් බවයි. එබැවින් අපි ස්ට්‍රැටිටල් ඩොපමයින් සං aling ාකරණය මත සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීමෙන් ඇතිවන බලපෑම සොයා බැලීමට ටීපීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් මීයන් භාවිතා කළෙමු.
Thr-32 හි DARPP-34 හි කොකේන්-ප්‍රේරිත පොස්පරීකරණය Tgp35 මීයන් තුළ දක්නට ලැබේ. DARPP-32 හි ක්‍රියාකාරීත්වය බහු අඩවි වල ඇති පොස්පරීකරණය තත්වය මත රඳා පවතී (20). Thr-32 හි PKA ෆොස්ෆරයිලට් DARPP-34 වන අතර, Cdk5 ෆොස්ෆරයිලෙට් DARPP-32 Thr-75 හි. මේ අනුව, අපි වල්-වර්ගය සහ Tgp32 මීයන්ගෙන් ලබාගත් නිස්සාරණ වල DARPP-35 හි පොස්පරීකරණය තත්වය පරීක්ෂා කළෙමු. Tgp75 මීයන් තුළ ෆොස්ෆෝ- Thr-32 DARPP-35 මට්ටම ඉහළ මට්ටමක පැවතුනි (රූපය. 3A; 1.6 wild 0.2 වල් ආකාරයේ මීයන්ගේ වටිනාකමට වඩා ගුණයක්). අපි ඊළඟට තක්සේරු කළේ ස්ට්‍රයිටල් ඩොපමයින් සං aling ාකරණය මත සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීමේ බලපෑමයි. Thr-5 හි DARPP-35 හි පොස්පරීකරණය කිරීමේ තත්ත්වය විශ්ලේෂණය කිරීමෙන් අපි Tgp32 මීයන් තුළ කොකේන් ප්‍රේරිත PKA සක්‍රීය කිරීම පරීක්ෂා කළෙමු. කොකේන් එන්නත් කිරීමෙන් පසු 34 මිනිත්තුවේදී වල් ආකාරයේ මීයන් තුළ පොස්ෆෝ- Thr-34 DARPP-32 මට්ටම වැඩි කරන ලදි (රූපය. 3B; 1.8 ± 0.2- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණ කරන්න). කෙසේ වෙතත්, DARPP-34 හි Thr-32 ෆොස්ෆරයිලේෂණයට කොකේන් වල බලපෑම Tgp35 මීයන් (1.2 ± 0.3- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණයක්) තුළ දක්නට ලැබුණි. මෙම ප්‍රති results ලවලින් පෙනී ගියේ සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්‍රියාකාරිත්වයේ වැඩි වීමක් කොකේන් මගින් ඇති කරන ලද පීකේඒ සක්‍රීය කිරීම බොහෝ විට Thr-5 හි DARPP-32 ෆොස්ෆරයිලේෂන් හරහා ලබා ගත හැකි බවයි (6, 12). Presynaptic Cdk5 ක්‍රියාකාරිත්වයේ වැඩි වීමක් ඩොපමයින් මුදා හැරීම අඩුවීමට හේතු වන අතර මෙය කොකේන් වල බලපෑම අඩු කිරීමට දායක වේ. කොකේන් එක් එන්නතක් p35 සහ Cdk5 ප්‍රෝටීන මට්ටමට මෙන්ම කයිනාස් ක්‍රියාකාරිත්වයට (බලපාන්නේ නැත).රූපය. 3 C සහ D). මෙය කොකේන් සඳහා නිදන්ගත නිරාවරණයක් p35 සහ Cdk5 හි ප්‍රකාශනය නියාමනය කිරීම සඳහා පෙන්වා දී ඇති පෙර අධ්‍යයනයකට වඩා වෙනස් ය.6).
Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් ඉහළ නියාමනය කිරීම ERK1 / 2 හි කොකේන් ප්‍රේරිත ක්‍රියාකාරීත්වය කෙරෙහි අවධානය යොමු කරයි. මෑත සාක්ෂි වලින් පෙනී යන්නේ ස්ට්‍රයැටම් හි ඩොපමයින් ප්‍රතිග්‍රාහක සක්‍රිය කිරීම ඊආර්කේ මාර්ගය ඇතුළුව අනෙකුත් සං sign ා කඳුරැල්ල ද සක්‍රීය කරන බවයි (21, 22), එය කොකේන් සඳහා චර්යාත්මක ප්‍රතිචාරයේ වැදගත් කාර්යභාරයක් ඉටු කරයි (23). එබැවින් Cdk5 ක්‍රියාකාරීත්වය කොකේන් මගින් ප්‍රේරණය වන ERK මාර්ගය සක්‍රීය කිරීමට බලපාන්නේ දැයි අපි විමසා බැලුවෙමු. වල් ආකාරයේ මීයන්ගෙන් ලබාගත් ස්ට්‍රයිටිකල් නිස්සාරණවල කොකේන් එන්නත් කිරීමෙන් පසුව ERK මාර්ගය සක්‍රීය කිරීම නිරීක්ෂණය කරන ලදී. මෙයින් පැහැදිලි වන්නේ Ser-1 සහ Ser-2 (217 ± 221- බාසල් මට්ටමට වඩා) සහ ERK1.5 හි MEK0.2 / 1 හි පොස්පරීකරණය වැඩි වීමෙනි. / 2 Thr-202 සහ Tyr-204 (ERK2 phosphorylation: 1.5 ± 0.2- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණයකින්) ()රූපය. 4 A සහ B). කෙසේ වෙතත්, කොකේන් මගින් ඇති කරන ලද MEK1 / 2 (බාසල් මට්ටමට වඩා 1.2 ± 0.2 ගුණයකින්) සහ ERK1 / 2 (ERK2 ෆොස්ෆරයිලේෂන්: 1.2 ± 0.2- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණයකින්) Tgp35 මීයන් (අ).රූපය. 4 A සහ B). එපමණක් නොව, Tgp1 මීයන් (2 ± 35 වල් ආකාරයේ මීයන්ගේ වටිනාකමට වඩා ගුණයකින් අඩු) හි පොස්ෆෝ-ඊආර්එක්එක්ස්එන්එම්එක්ස් / එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි බාසල් මට්ටම් අඩු වූ අතර මෙම ප්‍රවණතාව සංඛ්‍යානමය වශයෙන් වැදගත් නොවීය. Thr-0.8 හි MEK0.2 හි Cdk5 මත යැපෙන පොස්පරීකරණය මෙම අවසාන ප්‍රති result ලයට හේතු විය හැකි අතර එහි ප්‍රති cat ලයක් ලෙස උත්ප්‍රේරක ක්රියාකාරිත්වය අඩු වේ (24). මෙම හැකියාව තක්සේරු කිරීම සඳහා, අපි Thr-1 හි MEK286 හි පොස්පරීකරණය කිරීමේ තත්ත්වය පරීක්ෂා කළ අතර Tgp286 මීයන්ගෙන් ලබාගත් නිස්සාරණ නිස්සාරණවල ඉහළ පොස්ෆෝ- Thr-1 MEK35 ඇති බව සොයා ගත්තෙමු.රූපය. 4C; 1.3 wild 0.1 වල් ආකාරයේ මීයන්ගේ වටිනාකමට වඩා ගුණයක්). තව දුරටත්, Thr-1 හි MEK286 හි පොස්පරීකරණය කිරීමේ තත්ත්වය කොකේන් එන්නත් කිරීමකින් වෙනස් නොවූ අතර, ප්‍රතිකාරයෙන් Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් බලපා නොමැති බව සොයා ගැනීමට අනුකූල විය (CdkXNUMX).රූපය. 3D).
න්‍යෂ්ටියට ඩොපමයින් සං aling ා කිරීම ප්‍රචාරණය කිරීම සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීම මගින් අවධානයට ලක් වේ. PKA සහ ERK සම්බන්ධ කොකේන් ප්‍රේරිත බහු සං sign ා කඳුරැල්ල සාර්-එක්ස්එන්එම්එක්ස් හි පොස්පරීකරණය හරහා න්‍යෂ්ටියේ CREB නම් සංක්‍රාන්ති සාධකය සක්‍රීය කිරීමට හේතු වේ.22, 25). PKA සහ ERK සක්‍රීය කිරීමේ කඳුරැල්ල මත Cdk5- මැදිහත් වූ නිෂේධනීය බලපෑම් න්‍යෂ්ටියේ CREB පොස්පරීකරණය සමඟ අභිසාරී විය හැකිද යන්න සොයා බැලීමට, අපි වල්-වර්ගය සහ Tgp133 මීයන්ගෙන් ලබාගත් නිස්සාරණ වලදී Ser-35 හි CREB හි පොස්පරීකරණය තත්වය පරීක්ෂා කළෙමු. Tgp35 මීයන් තුළ ෆොස්ෆෝ-ක්‍රෙබ්හි බාසල් මට්ටම අඩු විය (වල් ආකාරයේ මීයන්ගේ වටිනාකමෙන් 0.7 ± 0.1 ගුණයකින්) (රූපය. 5). කොකේන් එන්නත් කිරීමට ප්‍රතිචාර වශයෙන්, වල් ආකාරයේ මීයන්ගේ (1.5 ± 0.1- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණයකින්) ෆොස්ෆෝ-ක්‍රෙබ් මට්ටම ඉහළ නංවන ලදි, නමුත් කොකේන් සඳහා මෙම ප්‍රතිචාරය Tgp35 මීයන් (1.2 ± 0.1- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණ කරන්න) (රූපය. 5).
Ser-133 හි CREB හි පොස්පරීකරණය මගින් සී-ෆොස් ජානය ද ඇතුළුව ඇතැම් ජානවල ප්‍රවර්ධක කලාපයේ CAMP ප්‍රතිචාර මූලද්‍රව්‍යයක් හරහා එහි පිටපත් කිරීමේ ක්‍රියාකාරකම් වැඩි කරයි (26). එබැවින් අපි කොකේන් එන්නත් කිරීමෙන් පසු වල්-වර්ගය සහ Tgp35 මීයන් වල සී-ෆොස් ප්‍රේරණය පරීක්ෂා කළෙමු. වල් ආකාරයේ මීයන් තුළ, සී-ෆොස් එම්ආර්එන්ඒ මට්ටම උපරිම අගයක් දක්වා ඉහළ ගියේය (1.8 ± 0.2- බාසල් මට්ටමට වඩා ගුණය) කොකේන් එන්නත් කිරීමෙන් පසු 30 මිනිත්තුව, පසුව එන්නත් කිරීමෙන් පසු 120 මිනිත්තුව වන විට බාසල් මට්ටමට නැවත පැමිණියේය (රූපය. 6 A සහ B). කෙසේ වෙතත්, එන්නත් කිරීමෙන් පසු 30 මිනිත්තු වන තෙක් වල් ආකාරයේ මීයන්ට වඩා සී-ෆොස් එම්ආර්එන්ඒ මට්ටම Tgp35 මීයන් තුළ ≈30% අඩු විය (රූපය. 6 A සහ B). Tgp35 මීයන් තුළ සී-ෆොස් අඩු ප්‍රේරණය ප්‍රතිශක්තීකරණ රසායන විද්යාව මගින් තවදුරටත් සනාථ කරන ලදී (රූපය. 6 C-F). කොකේන් පරිපාලනය සී-ෆොස් ප්‍රතිශක්ති ac ලදායීතාව ඉහළ නැංවීය. කෙසේ වෙතත්, සී-ෆොස්-ප්‍රතිශක්තීකරණ සෛල ගණන කොකේන් මගින් ඇති කරන ලද වැඩිවීම Tgp35 මීයන්ගේ ස්ට්‍රයැටියම් තුළ කැපී පෙනේ.රූපය. 6G). මෙම ප්‍රති results ල සියල්ලම පෙන්නුම් කළේ කොකේන්-මධ්‍යස්ථව න්‍යෂ්ටියට ස්ට්‍රයිටල් ඩොපමයින් සං sign ා කිරීම Tgp35 මීයන් තුළ නිෂේධනය කර ඇති අතර එය Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් වැඩි වීමේ ප්‍රති result ලයක් විය හැකි බවයි.
සාකච්ඡා
Cdk5 සහ එහි සක්‍රියකාරක p35 ඉලක්කගත ජාන ලෙස හඳුනාගෙන ඇති අතර ඒවා නිදන්ගතව කොකේන් වලට නිරාවරණය වීමෙන් නියාමනය කරනු ලැබේ. (6). Cdk5 ඉහළ නියාමනයට වඩා p35 ඉහළ නියාමනයේ ප්‍රති C ලයක් ලෙස Cdk5 ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීම, ස්ට්‍රයිටල් නියුරෝන වල කොකේන්-මැදිහත් ඩොපමයින් සං sign ා ලබා ගැනීමට හේතු වන බවට අපි මෙහි සාක්ෂි වාර්තා කරමු. ස්ට්‍රයිටල් ඩොපමයින් සං sign ාකරණය මත සීඩීඑක්එක්ස්එන්එම්එක්ස් හෝ පීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් හි ඉහළ නියාමනය කළ ප්‍රකාශනයේ ප්‍රතිවිපාක පරීක්ෂා කිරීම සඳහා, පාරම්පරික මූසික රේඛා දෙකක්, ටීජීසීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් සහ ටීජීපීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් මීයන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් p35 ප්‍රෝටීන මට්ටමකට සමානුපාතිකව නියාමනය කර ඇති නමුත් Cdk5 ප්‍රෝටීන මට්ටම ඉහළ යාමෙන් එය බලපෑමට ලක් නොවීය. Cdk35 immunoprecipitates භාවිතා කරමින් ක්රියාකාරිත්වය මනින විට TgCdk5 මූසික මොළයේ Cdk35 ක්‍රියාකාරීත්වය වල් ආකාරයේ මූසික මොළයට වඩා අඩු බව අපගේ පෙර වාර්තාවෙන් පෙන්නුම් කර ඇත.17), p5 මට්ටම වැඩි නොකළහොත් Cdk5 අධික ලෙස පීඩනය යෙදීමෙන් මොනෝමරික් Cdk35 මට්ටම ඉහළ යනු ඇතැයි යෝජනා කරයි. මෙම ප්‍රති results ලවලින් පෙනී ගියේ p35 ප්‍රෝටීන මට්ටම Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් සඳහා අනුපාත සීමා කරන සාධකයක් බවයි.
Tgp35 මීයන්, කොකේන් උග්‍ර ලෙස එන්නත් කිරීමෙන් පසුව ස්ට්‍රයිටේටම් හි CREB ෆොස්ෆරයිලේෂන් සහ සී-ෆොස් යන දෙවර්ගයේම අඩු ප්‍රේරණයක් ප්‍රදර්ශනය කළ අතර, සීඩීකේඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීමෙන් කොකේන් සඳහා වර්ධනීය ප්‍රතිචාරය වළක්වන බව යෝජනා කරයි. Tgp5 මීයන් තුළ කොකේන්-මැදිහත් ඩොපමයින් සං sign ා ලබා ගැනීම සීඩීඑක්ස්එන්එම්එම්එක්ස් මැදිහත් වීමෙන් ඩාර්පීපී-එක්ස්එන්එම්එක්ස්, පීකේඒ සහ ඊආර්කේ සම්බන්ධ බහු සං sign ා කඳුරැල්ල නිෂේධනය කිරීම තුළින් ලබා ගත හැකිය. කොකේන් පරිපාලනය වල් ආකාරයේ මීයන් තුළ Thr-35 හි DARPP-5 හි PKA ෆොස්ෆරයිලේෂණය වැඩි කළ අතර මෙම ප්‍රතිචාරය Tgp32 මීයන් තුළ දක්නට ලැබුණි. Thr-32 හි DARPP-34 හි PKA ෆොස්ෆරයිලේෂණය CREB හි Ser-35 හි ඩෙෆොස්ෆරයිලේෂණයට වගකිව යුතු එන්සයිමය වන ප්‍රෝටීන් පොස්පේටස් 32 (PP34) වල ක්රියාකාරිත්වය වළක්වන බව පෙන්වා දී ඇත.27). මේ අනුව, Tgp1 මීයන් තුළ ඇති DARPP-32 / PP1 මාර්ගය හරහා PP35 ක්‍රියාකාරකම් ප්‍රතිවිරෝධී නොවේ.
කොකේන් ප්‍රේරිත ERK1 / 2 සක්‍රිය කිරීම Tgp35 මීයන් තුළද දක්නට ලැබුණි. Cdk5 විසින් ERK1 / 2 හි කොකේන් ප්‍රේරණය සක්‍රීය කිරීම වළක්වා ගත හැකි පැහැදිලි යාන්ත්‍රණ කිහිපයක් තිබේ. පළමුවෙන්ම, Thr-5 හි DARPP-32 හි Cdk75 මත යැපෙන පොස්පරීකරණය PKA නිෂේධනය කළ හැකි අතර එය ERK1 / 2 සක්‍රිය කිරීම සඳහා අවශ්‍ය වන ඕනෑම PKA- මැදිහත් වූ MEK1 / 2 සක්‍රීය කිරීම පසුව නිෂේධනය කරයි. මෑත අධ්‍යයනයකින් හෙළි වී ඇත්තේ ThK-32 හි DARPP-34 හි පොස්පරීකරණය අවශ්‍ය වන්නේ කොකේන්-මැදිහත් වී ERK1 / 2 සක්‍රීය කිරීම සඳහා MEK සක්‍රීය කිරීම වක්‍රව නියාමනය කිරීම හා ටයිරොසීන් වන ස්ට්‍රයිටිකල්-පොහොසත් පොස්පේටේස් නියාමනය කිරීම සම්බන්ධ වන මාර්ග කිහිපයකින් බවයි. ERK1 / 2 මත කෙලින්ම ක්‍රියා කරන පොස්පේටේස් (28). Ser-1 සහ Ser-2 හි MEK217 / 221 හි කොකේන් ප්‍රේරිත පොස්පරීකරණය Tgp35 මීයන් තුළ අහෝසි කර ඇති බව සොයා ගැනීමෙන් මෙම හැකියාව සඳහා සහාය යෝජනා කෙරේ. Thr-5 හි MEK1 හි Cdk286 මත යැපෙන ෆොස්ෆරයිලේෂණය හරහා තවත් මාර්ගයක් ඇති අතර එමඟින් එහි උත්ප්‍රේරක ක්රියාකාරිත්වය අඩුවීමට හේතු වන අතර ERK1 / 2 ක්‍රියාකාරකම් වලක්වනු ඇත (24).
සතුන් තුළ නිදන්ගත කොකේන් ප්‍රතිකාරයේ චර්යාත්මක බලපෑම් ඇති කළ හැකි බව ස්ට්‍රයිටේටම් හි සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය නිෂේධනය කර ඇත (6). Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් ඉහළ නියාමනය කිරීම නැවත නැවතත් කොකේන් පරිපාලනයේ බලපෑම් වලට ප්‍රතිරෝධය දැක්වීම සඳහා ස්නායුක අනුවර්තනය වීමට දායක විය හැකිය යන උපකල්පනයට අනුකූල වේ. (6), DARPP-5 සහ MEK32 හි Cdk1- මැදිහත් වූ පොස්පරීකරණය, කොකේන් මගින් ප්‍රේරණය වන ERK1 / 2 සක්‍රීය කිරීම සඳහා දායක වී ඇති අතර, එහි ප්‍රති C ලයක් ලෙස CREB පොස්පරීකරණය හා සී-ෆොස් ස්ට්‍රයිටේටම් අඩු වේ. P5 ඉහළ නියාමනයේ ප්‍රති C ලයක් ලෙස Cdk35 ක්රියාකාරිත්වය වැඩි කිරීම, කොකේන් වලට නිරාවරණය වීමෙන් පසුව ස්ට්‍රයිටේටම් හි ජාන ප්‍රකාශනය වෙනස් කළ හැකිය යන අදහසට අපගේ සොයාගැනීම් සහාය වේ. CREB සහ c-fos වැනි පිටපත් කිරීමේ සාධකවල ක්‍රියාකාරකම්වල වෙනස්කම් මගින් මෙය සිදුවිය හැකිය. මේ අනුව, Cdk5 සක්‍රියකාරක p35, Cdk5 ක්‍රියාකාරකම් කෙරෙහි එහි අනුපාත සීමා කිරීමේ බලපෑම් හේතුවෙන්, කොකේන් ඇබ්බැහිවීමට යටින් පවතින නියුරෝන ක්‍රියාකාරිත්වයේ දිගුකාලීන වෙනස්කම් වලට දායක විය හැකිය..
අනුමත කර
අපි ස්තූතිවන්ත වෙමු. අත් පිටපත විවේචනාත්මකව කියවීම සඳහා මේරි ජෝ ඩැන්ටන්, පිලිප් ග්‍රාන්ට් සහ ශෂි කේෂවපානි. මෙම කාර්යයට ජාතික සෞඛ්‍ය ආයතන ප්‍රදාන Z01DE00664-05 (ABK වෙත), එක්සත් ජනපද මහජන සෞඛ්‍ය සේවා ප්‍රදාන DA10044 සහ සයිමන්ස් පදනම, පීටර් ජේ. ෂාප් පදනම සහ පිකෝවර් පදනම (PG වෙත) ආධාර ලබා දී ඇත.
සටහන්
සංක්ෂිප්ත: Cdk5, සයික්ලින් මත යැපෙන kinase 5; ඊආර්කේ, බාහිර සෛල සං signal ා-නියාමනය කරන ලද කයිනාස්; DARPP-32, ඩොපමයින් සහ cAMP- නියාමනය කරන ලද පොස්පොප්‍රෝටීන්, අණුක ස්කන්ධය 32 kDa; PKA, cAMP- යැපෙන kinase; MEK, ERK kinase; CREB, cAMP- ප්‍රතිචාර මූලද්‍රව්‍ය බන්ධන ප්‍රෝටීන්.
ආශ්රිත
;