Cdk5 ෆොස්ෆොරයිල්ට්ස් ඩොප්ඒමින් ඩීඑන්එන්එම්ක්ස් රෙස්ටොරොර් සහ පහළටක සිග්නලිං (2)

අදහස්: Cdk5 මගින් ඩොපමයින් D2 ප්‍රතිග්‍රාහක නියාමනය අඩු කිරීමට හේතු වන බව පෙනේ. පුදුම සහගත ලෙස, පරිවර්තන සාධකය ඩෙල්ටාෆොස්බ් සීඩීඑක්ස්එන්එම්එක්ස් නිෂ්පාදනයට පොළඹවයි.

ජෝන් ජේ, පාක් යූ, කිම් ඩී.කේ., ලී එස්, ක්වාක් යූ සහ අල්. (2013) PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

වියුක්ත

ඩොපමයින් D2 ප්‍රතිග්‍රාහකය (DRD2) යනු මනෝභාවය, විපාකය සහ චිත්තවේගයන් වැනි ඩොපමයින් ආශ්‍රිත මොළයේ ක්‍රියාකාරිත්වයට මැදිහත් වන ප්‍රධාන ප්‍රතිග්‍රාහකයකි. සයික්ලින් මත යැපෙන කයිනාස් 5 (Cdk5) යනු මොළයේ විපාක පරිපථයට සම්බන්ධ කර ඇති ප්‍රෝලින්-යොමු කරන ලද සෙරීන් / ත්‍රෙටොනීන් කයිනස් ය. මෙම අධ්‍යයනයේ දී, DRD321 (D321i2) හි තුන්වන අන්තර් සෛලීය පුඩුවේ ඇති සෙරීන් 2 අපද්‍රව්‍ය (S3) යනු Cdk5 හි නව නියාමන අඩවියක් බව අපි අනාවරණය කළෙමු. D5i321 හි S2 හි Cdk3 මත රඳා පවතින පොස්පරීකරණය නිරීක්ෂණය කරන ලදී කෘතිම දී සහ සෛල සංස්කෘතික පද්ධති.

S321 හි ෆොස්ෆොරිලීකරණය DRD2 හි ඇග්නිවාදී උත්තේජිත මතුපිට ප්රකාශනය දුර්වල වන අතර ඩී. ඩී. ඩී. එපමණක් නොව, ඩීඑන්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි අඩු කරන ලද සංඝටක ක්රියාකාරිත්වය නිසා p2 knockout කළල සිට ප්රාථමික න්යුරෝනීය සංස්කෘතීන් තුළ ආන්තරික cAMP මාර්ගයට බලපෑවේය. මෙම ප්රතිඵල මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ ඩීඩීසින් සංඥා කිරීම සඳහා නව නියාමන යාන්ත්රණයක් සපයන අතර S5 මගින් මැදිහත් වූ ෆොස්ෆොරිලීකරණයක් DRD321 ක්රියාකාරීත්වයට බාධා කරයි.

ඉලක්කම්

උපුටනය: ජෝන් ජේ, පාක් යූ, කිම් ඩී.කේ., ලී එස්, ක්වාක් යූ සහ අල්. (2013) Cdk5 ෆොස්ෆොරිලයිට් ඩොප්ඒමයින් ඩීඑන්එන්එම්ක්ස් රෙසේටරය සහ පහළට නල සංඥා නිකුත් කරයි. PLoS ONE 2 (8): e12. doi: 84482 / journal.pone.10.1371

කර්තෘ: ඇමරිකා එක්සත් ජනපදයේ උතුරු ඩැකෝටා විශ්ව විද්යාලයේ ජේම්ස් පෝටර්

ලැබුණු: මැයි 20, 2013; පිළිගත්තා: නොවැම්බර් 14, 2013; Published: දෙසැම්බර් 31, 2013

කතුහිමිකම: © 2013 Jeong et al. මෙය කොන්දේසි යටතේ බෙදා හැර ඇති විවෘත ප්රවේශ ලිපි වේ Creative Commons ආරෝපණය බලපත්රයමුල් ග්රන්ථය හා මූලාශ්රය බැරවූ විට ඕනෑම මාධ්යයකින් සීමා කිරීම, බෙදා හැරීම හා ප්රතිනිෂ්පාදනයට ඉඩ ලබා දේ.

අරමුදල්: ෙකොරියානු රජය (MSIP) මගින් ෙමම වැඩ සඳහා ආධාර ලබා ෙදන ලදි (NRF-2012R1A2A2A01012923 සහ NRF-2012R1A4A1028200) සහ ෙකොරියාවේ NRF විසින් පාලනය කරන ලද අන්තර්ජාතික සහෙයෝගීතා වැඩසටහන යටෙත් සහාය ලබාෙදන අතර ෙකොරියා ෙමෝසින් පර්ෙය්ෂණ ආයතනය (KBRI) MSIP හි මූලික පර්යේෂණ වැඩසටහන (2012-2). කේපීඑන් 1 සහ XISXX සහ ෂික්ෂෝපියාව සහ අවපාත පිලිබඳ පර්යේෂණ සඳහා 2033117 ජාතික සන්ධානය (NARSAD) තරුණ විමර්ශක සම්මාන. අධ්යයනය සැලසුම්, දත්ත එක්රැස් කිරීම සහ විශ්ලේෂණය, ප්රකාශයට පත් කිරීමට හෝ අත්පිටපත් සකස් කිරීමේ දී අරමුදල්කරුවන්ට කිසිදු කාර්ය භාරයක් නොතිබුණි.

තරඟකාරී අවශ්යතා: කතුවරුන් ප්රකාශ කර ඇත්තේ තරඟකාරී අවශ්යතා කිසිවක් නොමැති බවයි.

හැදින්වීම

ඩොපැමිණ සංඥා කිරීම මෝටර් සම්බන්ධීකරණය, මනෝ පාලනය සහ විපාක යාන්ත්රණය ඇතුළු විවිධ මොළ කි්රයාකාරීත්වයන්ට සම්බන්ධ වේ [1]. පෘෂ්ඨවංශිකයන්ගේ ෆිෂර් පවසයි සංඥා ප්රධාන සංඝටකයක් striatal මධ්ය spiny නියුරෝන (MSNs) තෝරා ගනු ෆිෂර් පවසයි ප්රතිග්රාහක උප කුලකයක් ප්රකාශ සහ උදරීය tegmental ප්රදේශයේ (VTA) සිට ප්රධාන වශයෙන් dopaminergic ආදාන ලබා ඇති විසින් යොදන අතර substantia nigra (SN) [2]. ඩොපැමයින් ග්රාහකයින් G-ප්රෝටීන-බැඳුනු ප්රතිග්රාහක (GPCR) වන අතර ඒවා transmembrane වසම් හතකින් සමන්විත වන අතර ඒවා දෙකකින් යුක්ත වන අතර, D1-like සහ D2-like receptors, dopamine සංඥාකරණයේ ප්රතිවිරුද්ධ ක්රියාවන් මැදිහත් [1]. උදාහරණයක් ලෙස ඩොපේන් ඩීඑන්එන්එම්එක්ස්-වැනි ප්රතිග්රාහක (D1, D1) මගින් ඇඩෙන්ලීල් සයික්ලස් මගින් Gαs cAMP අන්තර් සෛලීය මට්ටම ඉහළ නංවන නමුත් ඩොම්පේන් D2 වැනි ප්රතිග්රාහක (D2, D3, D4) ඇඩෙන්ලීල් සයික්ලේසා මගින් Gαi cAMP අන්තර් සෛලීය මට්ටම අඩු කිරීම [1], [3].

ඩොපීනයින් ප්රතිග්රාහකයන් අතර D2 receptor (DRD2) මානසික රෝග සහ විවිධ මත්ද්රව්ය වලට ඇබ්බැහි වීම වැනි ප්රධාන මානසික ආබාධවල ආබාධ [4]බොහෝ ප්රතික්රියාකාරක ඖෂධ වර්ග අවම වශයෙන් අර්ධ වශයෙන් ඩීඩීඑන්එන්එන්ක්ස් ඉලක්ක කර ගනී. සත්ව මාදිලියේ අනිසි ඖෂධවල ඖෂධවල හැසිරීමේ ප්රතිවිපාක සමඟ DRD2 ක්රියාකාරිත්වය හොඳින් සම්බන්ධ බව ද දන්නා කරුණකි [5]. ප්රතිජීවක ඖෂධ සහ මනෝචිකරණ ස්ථායීතාවයේ කාර්යක්ෂමතාව ද ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්ක්ස් හෝ සෛල මතුපිට ප්රකාශනයෙහි PKA, ERK සහ GSK2 මගින් මැදිහත් වන අතර, [1], [4], [6]. මොළයේ DRD2 සඳහා මෙම තීරනාත්මක භූමිකාවන් තිබියදීත්, DRD2 ගුණාංගවලට විවිධත්වය හා සංකීර්ණත්වය ලබා දෙන සවිස්තරාත්මක නියාමන යාන්ත්රනයන් සම්පූර්ණයෙන්ම තේරුම් ගෙන නොමැත.

ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස් ක්රියාකාරිත්වය මැනවින් සවි කිරීම සඳහා විවිධ පශ්චාත් පරිවර්තන වෙනස්කම් සිදු කරන බවට සාක්ෂි පේළි කිරීමක් පෙන්නුම් කරයි. ඩීඩීඩීඑන්එන්එන්ක්ස් හි පුළුල් ග්ලූෙකෝෂීකරණයන්හි මුල් ඡායාරූපය-ලේබල් ලේබල් කිරීමේ අධ්යයන වලදී අනාවරණය විය [7]සහ ඩිඩීෆයිඩ් බන්ධන සෑදීම ද්රාව්ය බන්ධන සඳහා වැදගත් වෙනස්කම් ලෙස හඳුනාගෙන ඇත [8]. තව දුරටත්, DRD2 හි ෆොස්ෆොරිලීකරණ ස්ථාන මුලදී හඳුනා ගන්නා ලදී කෘතිම දී විකිරණශීලී සමස්ථානික සමග පරීක්ෂණය, විවිධ කැනීම් වලින් මැදිහත් වන විවිධ නියාමන මාර්ග සඳහා මාර්ග ලබා දීම [9]. ඇත්ත වශයෙන්ම, ප්රෝටීන කිනසේ සී (PKC) මගින් ඩ්රැක්සිනුස්-මැදිහත් කරන ලද අභ්යන්තර තීරබියම් කැල්සියම් මැඩලීම හා ඩී. ඩී. ඩී. [10]. GPCR kinase 2 (GRK2) මගින් පොස්පරයිලීකරණය මගින් DRD2 හි ව්යාධිජනක සැකැස්මක් [11].

Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) යනු අත්යවශ්ය ක්රියාකාරීත්වයේ මොළවල නිශ්චිත ප්රකාශනය නිසා මනාප ක්රියාකාරිත්වය ඇති ප්රෝලයල-සෘණ / ත්රිකෝණ කයිනාස්, p35 සහ p39 [12]. Cdk5 නියුරෝන සංක්රමණය සහ අක්ෂන් මගපෙන්වීම ඇතුළු විවිධාකාර නියුෙටෝන කියාකාරකම්වලට සම්බන්ධ වන අතර Cdk5 සහ p35 null මීයන් ආවරණ තැන්පත් කිරීෙම් දෝෂ [13]. මෑතකදී, Cdk1 මගින් WAVE5 හා උෂ්ණත්වයේ ඇති ෆොස්ෆොරයිලීකරණය මගින් ඩෙන්ඩ්රැටික් කොඳු ඇටෝනි ප්රජනනය පාලනය කරයි. [14]. තව දුරටත්, Cdk5 මගින් NMDA ප්රතිග්රාහක, NR2B හා NR2A-මැදිහත් වූ NMDA ප්රවාහ වල මතුපිට ප්රකාශ මට්ටම් පාලනය කරයි. [15], [16]. Cdk5 සහ dopamine පද්ධතිය අතර ඇතිවූ කිට්ටු සබඳතාවන්ගෙන් බහුතර සාක්ෂි ඉදිරිපත් කරන බව සැලකිය යුතු කරුණකි. Cdk5 ටොසසීන් හයිඩ්රොක්සිලේසා (TH) ටොස්ෙරෝසීන් හයිඩ්රොක්සිලේස් (phosphorylates), එහි ස්ථායීතාව පාලනය කිරීම සහ එමගින් ඩොපීනර්ජීය ගෘහස්ථතාව පවත්වා ගැනීම [17]. postsynaptic නියුරෝන දී, ෆිෂර් හා චක්රීය-AMP නියාමනය phosphoprotein-75kD (DARPP-32) යන T32 අවෙශේෂ Cdk5 විසින් phosphorylated විට, එය PKA ක්රියාකාරකම් තහංචි හා ඒ නිසා ෆිෂර් පවසයි DRD1-මැදිහත් PKA සංඥා හතුරු හැකි [18]. කොකේන්, ඩොපීනයින් ප්රතිග්රාහක ආන්තරික හෙපටයිටිස්, කෝඩෝනය, මීයන්, mRNA සහ ප්රෝටීන් මට්ටම් වල Cdk5 මධ්යකාලීන නියුට්රෝන වල වැඩි වීමක් ලෙස පාලනය කරයි. [19]. සාමූහික වශයෙන්, Cdk5 මත්ද්රව්ය-අනුයාත උපාගමී අනුගතවීම් වලට සම්බන්ධ වී තිබේ. මෙම අධ්යයනයේ දී, DRD2 සහ Cdk5 වල ක්රියාකාරී අන්තර් ක්රියාකාරීත්වයක් පෙන්නුම් කරන අතර ඩොපැමිනි සංඥාකරණයේ දී Cdk5 වල භූමිකාව තවදුරටත් ව්යාප්ත වේ.

ද්රව්ය සහ ක්රම

ප්රතිජීවක

DRD321 (D321i2) තෙවන අන්තර් සෛලීය චක්රය වන ෆොස්ෆෝ-සෙරීන් 2 (pS3) අඩංගු peptides වලට එරෙහිව හාවා සාදයි. Phospho-peptide, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), affinity purification සඳහා peptide-සංයුජිත තීරුව සෑදීම සඳහා භාවිතා කරන ලදි (20401, PIERCE). නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව අනුප්රාප්තික පිරිසිදුකිරීමේ පද්ධතිය මගින් ප්රති-pS321 ප්රතිදේහ ආලේප කරන ලදී. Purified ෆොස්ෆෝ-ප්රතිදේහ 0.1% SODIUM azide සහ 0.1% ජෙලටින් සමඟ PBS තුල ගබඩා කර ඇත. ප්රති-මූසිකය-Cdk5 විරෝධී ප්රතිදේහ (sc-249) හා ප්රති-හාවා විරෝධී p35 ප්රතිදේහ (sc-820) Cdk5 / p35 බස්නාහිර blotting හා immunocytochemistry සඳහා භාවිතා කරන ලදී. ප්රති-මුසික ප්රතිශක්තික ප්රතිශක්තිකරණ GFP ප්රතිදේහ (sc-9996) ප්රතිශක්තිකරණ සහ ඩ්රයිඩීඑන්එන්එන්එක්ස්-ජීඑෆ්පී බටහිර පෙහෙලි සඳහා භාවිතා කරන ලදී. හෑරූ ප්රති-FLAG ප්රතිදේහ (sc-2), හාවිෂ්ට ප්රති-HA ප්රතිදේහ (sc-807), ප්රති-මූසික ප්රතිරෝධිත GST ප්රතිදේහ (sc-805) සහ ප්රති-මුසික ප්රතිදේහ GAPDH ප්රතිදේහ (sc- 138) සන්ටා කෲස් ජෛව තාක්ෂණයෙන් මිලදී ගන්නා ලදී.

සතුන්

P35 knockout මූසිකය යනු ජපානයේ RIKEN Brain Science Institute හි වෛද්ය කට්සුෂිකෝ මිකෝෂිබාගෙන් ලද කරුණාවකි. ප්රාථමික නියුරෝන සංස්කෘතිය සඳහා භාවිතා වේ. genotyping සඳහා පාථමිකය කට්ටල 5'- GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5'-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC හා 5'- TCCATCT GCACGAGACTAGT විය පෙර විස්තර කරන ලද ආකාරයට [20]. ICR මූසිකයන් සහ ස්ප්රෙග් ඩව්ලි මීයන් මොළේ ලිසේට් සැකසීම සඳහා භාවිතා කරන ලදී. විද්යාත්මක හා තාක්ෂණික සත්ව සංරක්ෂණ හා භාවිතා කිරීමේ කමිටුවේ පොහාන්ග් විශ්වවිද්යාලයෙන් සියලුම සත්ව වැඩ පිළිවෙල අනුමත කරන ලදී.

ප්ලැස්මිඩ් ඉදි කිරීම්

එය pFLAG-CMV-2 plasmid දෛශික දී EGFP-N1 plasmid vector සහ DRD2 (දිගු isoform DRD212 වලට ආවේනික වන 373 අමතර ඇමයිනෝ අම්ලය අපද්රව්ය ඇතුළු 29-2 ඇමයිනෝ අම්ලය අපද්රව්ය) අතර තුන්වැනි අන්තර් සෛලීය පුඩුවක් මානව DRD2 දිගු isoform භාවිතා කරන ලදී. මානව Cdk5 pCMV-HA ප්ලාස්මිඩ් දෛශිකයකද ඇතුළත් කරන ලද අතර pxNUMX pcDNA 35 ප්ලාස්මිඩ් දෛශිකය තුලට ඇතුළත් කරන ලදී. මානව Cdk3.1 වූ cytomegalovirus (CMV) immunocytochemistry සඳහා ද්විත්ව ප්රකාශනය ඉදිකිරීමක් (Cdk5 / p35) බවට පත් කිරීම සඳහා pcDNA 3.1 දෛශික මානව p5 සමග අනුග්රාහකයෙකු, ධාරකෙය් internalization පිරිවරක්, [යටින් වූ35S] -GTPγS බන්ධන විශ්ලේෂණය, රේඩියෝලෝගන්ඩ් බන්ධන විශ්ලේෂණය සහ cAMP එන්සයිම ප්රතිශක්තිය.

Vitro හි චීනාසා පරීක්ෂණය

IP-සබැඳි කෘතිම දී කිනෙසේස් පරීක්ෂණය පහත පරිදි ෙව්. එක් සම්පූර්ණ මූසික මොලයක් 3 mL erythrocytes lysis buffer (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) ලුණු . ලිස්ටේන් 20 min සඳහා අයිස් මත රත් කර ඇති අතර ඒවා සීනක් හා 30 හි කේන්ද්රගත කර ඇත. g 10 සඳහා min. ක්රියාකාරී Cdk35 / p5 සංකීර්ණ ලබා ගැනීම සඳහා supernatants ප්රති වෛරස් ප්රති-p35 ප්රතිදේහ සමඟ immunoprepidated. Cdk5 / p35 සංකීර්ණ සහ පවිත්ර කරන ලද GST Fusion ප්රෝටීන් ඇඩෙනසින් 5'-ට්රයිපෝෂප්ට් සමඟ මිශ්ර වූ අතර, [γ-32P] (NEG-502H, PerkinElmer) සහ කිනාස් බෆරයේ දිරාපත් වූ අතර (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl2, 0.2 mM DTT) කාමර උෂ්ණත්වයේ 1 h සඳහා [18], [21]. පිරිසිදු Cdk5 / p25 සංකීර්ණය (14-516, මිල්ලිපෝර්) ද භාවිතා විය කෘතිම දී ඉහත විස්තර කර ඇති පරිදි චීනාස් පරීක්ෂණය. 2 × සාම්පල බහාලුම් බුකාරය ප්රතික්රියා මිශ්රණයට එකතු කර 100 ° C මත තම්බා එයි. එම සාම්පල පසුව SDS-PAGE වලට යටත් කරන ලද අතර, වියලූ ජෙල් ප්රමාණය ඕටෙරාඩෝග්රැෆි මගින් ඇගයීමට ලක් කරන ලදී.

ද්රවික වර්ණාලේපය (LC) - මාස් වර්ණාවලීක්ෂය (MS) / MS විශ්ලේෂණය

මෙම ප්රතිජීවක GST-D2i3 ප්රෝටීන් විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ LC-MS / MS මගින් IP-සම්බන්ධිත කෘතිම දී කිනෙසේස් පරීක්ෂණය. X-TANDEM (ඩී-එන් 01-2008 අනුවාදය) භාවිතා කරමින් LC-MS / MS දත්තවල peptide හඳුනා ගැනීම සිදු කරන ලදී. සෑම RAW දත්ත ගොනුව ප්රථම වරට Trans-proteomic නල මාර්ගයේ (mkXML) බවට පරිවර්තනය කරන ලදී (TPP, version 4.3). පසුව පරිවර්තනය කරන mzXMLs දී MS / MS පර්යාවලෝකනය මෙම UniProt මූසිකය ප්රෝටීන් අනුක්රමය දත්ත සමුදාය (නිදහස් 2010_07) X !! එකා පසුපස එකා භාවිතා GST-D2i3 අනුක්රමය ඇතුළු එරෙහිව සෙවීමට ලක් කරන ලදී. ඉවහල් වූයේ 3 Da පූර්වජර් අයන සහ 2 Da සඳහා කැබලිවල අයන සඳහා. තිප්ස්සන් සඳහා එන්සයිම නිශ්චිතතාව භාවිතා කරන ලදී. Cysteine ​​(57.021 Da), ඔක්සිකරණ ඔක්සිකරණ ඔක්සිකරණය (15.995 Da), ඇස්පාරේන් (0.987 Da) හි හයිඩ්රයිල්සනය සහ සෙරීන් (79.966 Da) යන ෆෝස්ෙෂෝලියනය කිරීම සඳහා විචල්ය විකරණය විකල්පයන් භාවිතා කරන ලදී.

ප්රතිශක්තිකරණය

ELB ලයිස බෆරයේ සෛල ලසේට් මත ප්රතික්රියාවක් සිදු කරන ලදී. GFP ප්රතිදේහ Lysates සඳහා එකතු කරන ලද අතර xNUMX ච් හි 3 ºC සඳහා දිරාපත් වී ඇත. ප්රෝටීන-A ඇග්රරෝස් භාවිතයෙන් Immunocomplexes පවිත්ර කර ඇත. 4 ° C හි 30 විනාඩි සඳහා SDS නියැදි බෆ්රියර් සමඟ දුම්බීම සඳහා SDS-PAGE සහ Western blots වලට යටත් විය.

GST කඩා වැටීම

Purified GST සහ GST-D10i2 හි 3 μg, 1.5 ° C හි 4 h සඳහා මීයන් මොළේ ලයිසේට් සමඟ පොතු තබා ඇත. 30 μL ග්ලූටතයෝන් (GSH) -පහසු සේපාරෝස් 4B බෝඩර් (17-0756-01, GE හෙල්ත්කෙයාර්) ලිිසිස් බෆරයේ සමතුලනය කරන ලද අතර අතිරේක 1 h සඳහා යොදන ලදී. 2,000 x හි කේන්ද්රාපසාරනය මගින් බීඩස් එකතු කරන ලදිg සහ ලීසා බෆර් 4 ගුණයකින් සේදිය යුතුය [22], [23]. Cdk5 සහ ප්රති-p35 ප්රතිදේහ භාවිතා කරමින් බස්නාහිරින් බිංදු මගින් විශ්කම්භය නියැදි විශ්ලේෂණය කෙරිණි.

බහිෂ්කාරක

coverslips මත ප්රබුද්ධ Transfected HEK 293 සෛල හා striatal නියුරෝන පොස්පේට් buffered සේලයින් (PBS) සමග එක් වරක් සෝදා සීතල 4% paraformaldehyde / 30 විනාඩි සඳහා PBS කථනය විසින් නියම කරන ලදී. ප්රාථමික ප්රතිදේහ බ්ලොක්සින් විසඳුමේ (2% අශ්ව සේදය හා 1% PBS හි Triton X-100) තනුක කර ඇත. Alexafluor-647-සංයුග්මක මූසිකය විරෝධී ප්රතිදේහ (A20990, Invitrogen) සහ Alexafluor-568-සංයුග්මක-හාවා විරෝධී ප්රතිදේහ (A11011, Invitrogen) ද්විතීයික ප්රතිදේහ ලෙස භාවිතා කරන ලදී. න්යෂ්ටිය පැල්ලම් සඳහා Hoechst භාවිතා කරන ලදී. රූප මානක අන්වීක්ෂය (ඔලිම්පස්, FluoView-1000) මගින් ලබා ගන්නා ලදී.

ප්රතිචක්රමික අභ්යන්තරකරණය විශ්ලේෂණය

24 h පසුව transaxection පසු, සෛල 1 μM quinpirole (Q102, සිග්මා) 30 min සඳහා සහ 90 min සඳහා 37 ° C හිදී ප්රතිකාර කරන ලදී. එක් එක් ප්රතික්රියාව සඳහා 2 mL සීතල PBS වල නැවත සවි කරන ලද අතර 200 μL සමස්ථානික භාවිතා කරන ලදී. පහත සඳහන් සාන්ද්රණයන්හි 3 h සඳහා කාමර උෂ්ණත්වයේ දී ඖෂධ ප්රතිකාර සිදු කරන ලදී. 3 nM [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer), 3 μM sulpiride (895, TOCRIS), 10 μM haloperidol (H1512, Sigma). හයිඩ්රෝෆොබික් [3H] -spiperone පූර්ණ ප්රකාශිත ග්රන්ථි ලේබල් කිරීම සඳහා භාවිතා කරන ලද අතර හයිපොෆිලික් සල්පිරීඩය භාවිතා කරන ලද පටල සහිත බන්ධන ප්රතිස්ථාපන [3H] -spiperone සංඥා. සම්පූර්ණ ප්රකාශිත ප්රතිශක්තිකරණ අගයයන්ගෙන් අභ්යන්තර බන්ධන ප්රතිශෝධක අගයන් අඩු කිරීමෙන් membrane-associated receptor signals ගණනය කර ඇත. සෛල GF / B (මිලිපෝර්) ෆිල්ටරයක් ​​මත ෆිල්ටර හා 3 ගුණයකින් සේදීමේ බෆර් (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) සෝදා ගත්තේය. ශීතකරණයක් වියළී ගිය අතර ඉතිරි වූ විකිරණශීලතාව ද්රව වර්ණනාපක කවුළුවකින් මනින ලදී [24].

සෛල පටල සකස් කිරීම

transfection පසු 100 මි.මී. සංස්කෘතිය-කෑම Confluent සෛල අයිස්-සීතල PBS සෝදා 1 මිලිලීටර් HME බෆරය (25 mm HEPES (pH අගය 7.5) අස්වැන්න, 2 mm MgCl ලදී2, 1 mM EDTA). 500 min සඳහා 15 × g සමග සමීකරණය කරන ලද ලයිසයිට් කේන්ද්රය කේන්ද්රගත කර ඇති අතර උෂ්ණත්වයන් පසුව 36,000 x හි 30 × g සමඟ ප්රතිස්ථාපනය විය. HME buffer හි නැවත භාවිතයට ගන්නා ලද පෙති යළි භාවිතා කරන ලදී.

[35S] -GTPγS බන්ධන පරීක්ෂණය

සෛල පටල භාග 1 μM quinpirole (Q102, Sigma) එම නිශ්චය බෆරය (25 mm HEPES (pH අගය 7.5) හි, 1.5 mm MgCl සමග පෙර incubated ලදී2100 mM NaCl, 1 mM EDTA සහ 0.01 mM දළ) 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) 3 μL හි 30 nM හි අවසාන සාන්ද්රණයට එකතු කරන ලද අතර 90 මිනිත්තුව සඳහා තවදුරටත් නිස්සාරණය කරන ලදී. 170 μL තාරකා-HCl (pH අගය 10) 8.0 mM NaCl, 100 mM MgCl2සහ 0.1 mM GTP) ප්රතික්රියාව නතර කිරීම සඳහා එකතු කරන ලදී. Membranes GF / B ෆිල්ටරයක (Millipore) මත ෆිල්ටරනය කරන ලද අතර 3 ගුණයකින් සේදීමේ බෆර් (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) සෝදා ගෙන ඇත. පෙරහන් වියලූ අතර විකිරණශීලතාවය මිනුමි අංකයෙන් මනිනු ලැබේ [25], [26].

විකිරණ මගින් බන්ධන පරීක්ෂණය

0.01 nM සමඟ රත් කළ සෛල පටල සායම් කරන ලදී [3H] -spiperone (NET-565, PerkinElmer) සහ පරික්ෂක බෆරයේ 102 විනාඩි සඳහා quinpirole (Q30, Sigma) සාන්ද්රණය වැඩි වීම (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membranes GF / B ෆිල්ටරයක (Millipore) මත ෆිල්ටරනය කරන ලද අතර 3 ගුණයකින් සේදීමේ බෆර් (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl) සෝදා ගෙන ඇත. GF / C ෆිල්ටර් හරහා වේගවත් පෙරහන මගින් ප්රතික්රියාව අවසන් විය. ද්රවශීල විකිරණශීලතාවය ද්රව වර්ණනක කවුන්ටරයකින් මැනිය [27]-[29].

cAMP එන්සයිමේ Immunoassay

293 සෛල 10 μM රෝලිප්රම් (R6520, සිග්මා) සඳහා 1 සෛල යොදා ගන්නා ලද අතර 0.1 μM forskolin (F6886, සිග්මා) සමඟ ප්රතිකාර සහ XINXX min සඳහා ක්වින්පිරෝලේ (Q102, සිග්මා) සාන්ද්රණය වැඩි විය. ප්රාථමික සංස්කෘත ස්ටීටරල් න්යුරෝන 30 h සඳහා 10 μM රෝලිපම් සමඟ ප්රතිකාර කළ අතර 1 μM dopamine සඳහා 1 h [22]. සෛල ලසේට් 0.1 M HCl සමඟ සාදන ලද අතර නිෂ්පාදකයාගේ උපදෙස් අනුව cAMP එන්සයිම ප්රතිශක්තිකරණ (Sapphire Bioscience) මගින් cAMP මට්ටම් අනාවරණය කර ඇත.

ප්රාථමික සංස්කෘතික ස්ටීටියල් නියුරෝන

ස්ට්රැටල් ප්රදේශය මූසික කලලරූ මොළයේ සිට හුදකලා විය (E15). 11095% Trippsin (T0.25-4549, Sigma) සහ 100% DNase I 0.1 ° C හි 6 හි අඩංගු අවම අවශේෂ මාධ්ය (MEM) (37, Invitrogen) තුළ විස්ථාපිත පටක විඝටනය විය. සෛලවල ආලේපන මාධ්යයේ නැවත ඇසිරීම (MEM 0.01 M HEPES (pH 7.4) සහ 10% (vol / vol) අශ්ව සේන්ම (16050-122, GIBCO) සමඟ ප්රතිස්ථාපනය විය. 7 දවස් සඳහා නියුරෝන වගා කරන ලදී කෘතිම දී (DIV 7) B27 අතිරේකය (17504-044, Invitrogen) සමඟ MEM වල ඇති cAMP එන්සයිම ප්රතිශක්තිකරණ ප්රතිශක්තියට යොමු වීමට පෙර.

ප්රතිපල

Cdk5 ඩර්ඩීඑන්එන්එක්ස් හි තුන්වන අභ්යන්තර ඇලූමලුවේ 321 ෆොස්ෆොරිලේට් කෘතිම දී

නව Cdk5 උපස්ථර හඳුනා ගැනීම සඳහා, (S / T) PX (K / H / R) භාවිතා කරමින් ක්රමානුකූලව සිදුකරන ලද Cdk5 හඳුනාගැනීමේ අනුමැතීන් අනුපිළිවෙල ලෙස [30] අපේක්ෂක උපස්ථරයක් ලෙස DRD2 හදුනාගෙන ඇත. සෙරීන් 321 ද ඇතුලු සම්මුති අනුක්රමය, ඩ්රයිඩීඑන්එන්එන්එක්ස් (D2i2) තුන්වන අභ්යන්තර ලූපයේ පිහිටා ඇත. [3], [10], [11]. අනුක්රමණය ඩෙබීඑන්එන්එක්ස් හි පරිණත ලෙස පරිණාමයෙන් සංරක්ෂණය කර ඇති අතර ඉතිරි කොටසෙහි ක්රියාකාරී වැදගත්කම ඇඟවුම් කරයි (රූපය 1A).

සිඟිති රුව

රූපය 1. Cdk5 සෙරීන් 321 ෆොස්ෆොරිලයිට් ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි තෙවැනි අභ්යන්තර බන්ධන නිපදවන ලදී.

(A) විවිධ ශාක වලින් (DRD2) සංරක්ෂණය කරන ලද ප්රදේශ පෙන්නුම් කරන ඇමයිනෝ අම්ල අනුක්රමය. Cdk5 ෆොස්ෆොරිලීකරණයේ විභවතාවන් තරු ලකුණකින් දැක්වේ. (B) IP-සබැඳි කෘතිම දී GIN-D2i3 සහ GST-D2i3 mutant ප්රෝටීන සමඟ කිනාස් පරීක්ෂාව. Kinase ප්රතික්රියා සඳහා ප්රති-p5 ප්රතිශක්තිකරණය මගින් Cdk35 / p35 සංකීර්ණ මවුස් මොළයේ සාරය මගින් පොහොසත් කරන ලදී. පොස්ෆොරෝලියනය කරන ලද ප්රෝටීනවල ඕටරියෝඩෝග්රොෆ්ට් එක ම ජෙල් කෙමස්සි නිල් පැහැයෙන් වර්ණගැන්වීම සමඟ පෙන්වා ඇත. Grow-D2i3 වලට අනුරූප විකිරණශීලී සංඥාවක් ඇඟවුම් කරන අතර විවෘත ඊතලය p35 වලින් විකිරණශීලී සංඥා. (C) D2i3 වල ෆොස්ෆොරයිලයිඩ් පෙප්ටයිඩ් අංශුවේ MS / MS වර්ණාවලිය. මෙම න්යායික කොටස් කැබලි ආකෘතිය පහත දැක්වේ. සියලුම කැඩී ඇති අයන අතර, y- සහ b-අයන අනාවරනය කරනු ලබන්නේ වර්ණාවලිය තුලය. ඔව්හු6 සහ y7 සීනීන් 321 වල ෆොස්ෆොරිලීකරණය දැඩිලෙස දක්වයි. (D) එන්නත් වේ GST-D5i25 සහ GST-D2i3 mutant ප්රෝටීන් භාවිතා කරන පිරිසිදු Cdk2 / GST-p3 සංකීර්ණය සමඟ කිීනේස් පරීක්ෂනය. පොස්පෝෂිතීකෘත ප්රෝටීන කාටියර්ස් නිල් පැහැයෙන් වර්ණගැන්වීම සමග කෞතුකාගාරයක ප්රදර්ශනය කෙරිණි. ඇන්ඩ්රොඩිඩ් පෙන්වන විකිරණශීලී සංඥා GST-D2i3 හා විවෘත ඊතල සහිත GST-p25 වලින් විකිරණශීලී සංඥා.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

DxNUMXi5 ෆොස්ෆරයිලට් කිරීමට Cdk2 හි ධාරිතාව තක්සේරු කිරීම සඳහා, IP-සම්බන්ධ කළෙමු කෘතිම දී සෛල ලෙස ආම්ලික මොළේ ලයිසෙට් මගින් p5 ප්රතිශක්තිකරණ (pNNX) නිශ්චිත සංඝටක GST-D35i35 (ඇමයිනෝ අම්ල ප්රතිස්ථාපන 2-3) ප්රෝටීන ලෙස සක්රීය ක්රියාකාරී Cdk212 / p373 සංකීර්ණයක් භාවිතා කරයි. පිරිසිදු GST-D2i3 සහ GST-D2i3 S297A ප්රෝටීනවල ෆොස්ෆොරිලීකරණ සංඥා නිරීක්ෂණය කළද, නමුත් GST-D2i3 S321A භාවිතයෙන් සංඥාව සැලකිය යුතු ලෙස අඩු විය.රූපය 1B). GST-D321i2 හි සෙරීන් 3 වල ෆොස්ෆොරිලීකරණය පිළිබඳ තවදුරටත් තහවුරු කිරීම සඳහා අපි IP-සම්බන්ධිත සාම්පල LC-MS / MS විශ්ලේෂණය කළා කෘතිම දී LTQ XL ස්කන්ධ වර්ණාවලිමානය භාවිතා කරමින් කිනාස් පරීක්ෂණ. අඛණ්ඩව, ෆොස්ෆෝ-සෙරීන් 321 පෙප්ටයිඩ වල ස්කන්ධයට අනුරූප වන පොස්පෝ-පෙප්ටයිස් (රූපය 1C). LC-MS / MS විශ්ලේෂණය තුල දත්ත-රඳා පවතින අත්පත් කර ගැනීම නියැදිවල බහුල ප්රෝටීන හඳුනා ගැනීමට හැකිවේ [31]මෙම දත්තයන් මගින් D321i5 කලාපයේ Cdk2 හි ආම්ලික 3 අවශේෂ ප්රධානතම ෆොස්ෆොරිලීකරණ අඩවිය ලෙස සැලකේ. Cdk321 විසින් GST-D2i3 හි සෙරීන් 5 හි සෘජු ෆොස්ෆොරිලීකරණය සනාථ කිරීමට ඔප්පු කිරීම සඳහා, කෘතිම දී purified recombinant GST-D5i25 ප්රෝටීන් සමඟ පිරිසිදු Cdk2 / GST-p3 සංයෝගය භාවිතයෙන් කයිනාස් පරීක්ෂණ සිදු කරන ලදී. GST-D2i3 S2A හි (GST-D3i321) හි වැදගත් සංඝටක සංඥාවක් අපි හඳුනා ගත්තේය (රූපය 1D). එකට ගත් විට, මෙම ප්රතිඵල පෙන්නුම් කරන්නේ D2i3 S321 ප්රතිශතය Cdk5-මැදිහත්කාර පොස්ෆෝරිලිකරණය සඳහා මනාප ඉලක්කයකි.

Cdk5 සෛල තුළ ඩර්ඩීඑන්එන්එක්ස් හි සෛල වල ඩී.

සෙරීන් 321 හි ෆොස්ෆොරිලීකරණය හඳුනා ගැනීම සඳහා, ෆොස්ෆෝ-සෙරීන් 321 (pS321) සඳහා නිශ්චිත ප්රතිශතයක් නිපදවා ඇත. IP-සබැඳි වලින් නියැදි කෘතිම දී kinase පරීක්ෂණයෙන් ප්රති-pS321 ප්රතිදේහ භාවිතා කරමින් Western blot මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. බ්ලොට්ස් GST-D2i3 මත යැපෙන චාලක ප්රතික්රියාවෙහි වෙනස් කලාපයක් පෙන්නුම් කරන ලදී (රූපය 2A). සෛල XnumX හි ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි සෛල 321 හි සෛල වල සෛල වල සෛල X-DXX-GFP සහ DRD2 S5A-GFP ප්රකාශයට පත් කරන ලද HEK 293 සෛල වල ප්රතික්රියා GFP ප්රතික්රියා කරන ලදී. HA-Cdk2 සහ p2 යන ඒවා සමඟ විශ්ලේෂණය කරන ලදී. ප්රති-pS321 ප්රතිදේහ. ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස් හි අධික ලෙස ග්ලූකෝසිලිකරණය හේතුවෙන් ද්රාව්ය GFP ප්රතිදේහ මගින් සුවිශේෂී ස්ඵටික තරංග ආයාමයන් දක්නට ලැබේ. DRD5-GFP හි දක්නට ලැබෙන අතර, ප්රති-pS35 ප්රතිදේහ එම සමාන DRD321 සංඥා Cdk2 / p2 සම ප්රකාශනය සමඟ පමණක් (රූපය 2B) [7]. Cdk321 මඟින් සෙරීන් 5 වල ෆොස්ෆොරිලීකරණය, D2i3 (FLAG-D2i3) හා D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) විකෘති ස්වරූපය නිපදවා ඇත. FLAG-D2i3 හා FLAG-D2i3 S321A හෝ HA-Cdk5 සමඟ හෝ ප්රකාශිත හෝ HEK 35 සෛල තුල p293 සමඟ ප්රකාශයට පත් කරන ලදී SDS-ජෙල් චලන චලන පරීක්ෂණය මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. FLAG-D5i2 සඳහා සැළකිය යුතු Cdk3-යැපීම් චලිත සංක්රාන්තියක් නිරීක්ෂණය කරන ලදී, නමුත් FLAG-D2i3 S321A (රූපය 2C). අප විසින් ද්රාව්ය උත්තේජකයක් ලෙස Ser2 හි DRD321 හි ෆොස්ෆොරිලීකරණ මට්ටම තක්සේරු කරන ලදී. ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස්-ජීඑෆ්පී සහ සීඩීඑක්එන්එන්එක්ස් / පීඑන්එන්එක්ස් සංකීර්ණය ප්රකාශයට පත් කරන ලද HEK 293 සෛල ක්නිපිරිරල් මගින් උත්තේජනය කරන ලද අතර, සෛල ලිසේට් ප්රතික්රියා කරන ලද GFP ප්රතික්රියාවලදී ජී-පීඑෆ්පී සහ ප්රති-pS2 ප්රතිදේහ භාවිතා කිරීමෙන් බටහිර විශ්මයට පත් විය. සර්ක්එන්එන්එක්ස් එක්ස්පීඩීස් හි ධ්වනිත පොස්පරයිලීකරණය වූ SerxNUMX හි Cdk5-මැදිහත්වී ෆොස්ෆොරිලීකරණය ඇග්රනිස්ටන උත්ප්රේරනය මගින් බලපෑමට ලක් නොවූ අතර GRK- සහ PKC-මැදිහත්වූ ෆොස්ෆොරයිලන්ට් වලින් වෙනස් විය (රූපය 2D) [32], [33]. මෙම ප්රතිඵලවලින් එකක ප්රතිඵලයක් ලෙස Cdk5 සෛල පරිසරයේ DRD321 සෙරීන් 2 ප්රතිශතය ෆොස්ෆොරයිලට් කළ හැකිය.

සිඟිති රුව

රූපය 2. Cdk5 සෛල 321 මගින් සෛල තුළ ඇති ඩර්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි තුන්වන අභ්යන්තර ඝෝෂාව තුළ ෆොස්ෆොරිලයිට් කරයි.

Cdk5-මැදිහත්කාරක සෙරීන් 321 වල මැදිහත්වී ෆොස්ෆොරයිලීකරණය විශ්ලේෂණය කරන ලද්දේ pS321 ප්රතිදේහ භාවිතා කිරීමෙනි. (A) IP-සබැඳි වලින් නියැදි කෘතිම දී GST-D2i3 ප්රෝටීන යොදා ගනිමින් කිනාස් පරීක්ෂණයෙන් පෙන්නුම් කරන ලද ප්රතිදේහ සමග බටහිර බීටිටි (WB) මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. Grow-D2i3s යන ඇෙරෝඩෙඩ්ස් පෙන්වයි. (B) DRD2-GFP සහ DRD2 S321A-GFP HEK 5 සෛල තුළ HA-Cdk35 සහ p293 හෝ නැතිව ප්රකාශයට පත් කෙරිණි. GFP ප්රතිදේහ සහ ප්රති-pS321 ප්රතිදේහ භාවිතා කරමින් බටහිර ජීප්පාදයෙන් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. ඩ්රයිව් ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් සංඥා මගින් පෙන්නුම් කරන අතර විවෘත ඊතලය ගර්භාෂ ප්රතිශක්තිකරණ ප්රතිශක්ති ඌනතා වලින් ලැබෙන සංවේදී සංඥා. '% ආදානය' යනු IP ප්රතික්රියාව සඳහා මුළු ලයිසේට් ප්රමාණය% ක් වේ. දුර්වල අනන්ය සෛල Cdk2 සංඥා ස්ටේස් වලින් දැක්වේ. (C) ජෙල් චලනය මාරු කිරීමේ පරීක්ෂණය. HEK 5 සෛල ලෙස නම් කරන ලද බටහිර සෛල මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. (D) Transfected HEK 293 සෛල quinpirole සමඟ ප්රතිකාර කරන ලද අතර GFP ප්රතිජීවක ඖෂධ (anti-GFP imunoprecipitates) විශ්ලේෂණය කරන ලදී. GFP සහ ප්රති-pS293 ප්රතිදේහ සමඟ බටහිර වෙඩිතැබීම මගින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. විවෘත ඊතලය මඟින් GFP ප්රතිශක්තිකරන ප්රතික්රියාවෙන් විශේෂ සංඥා නිකුත් කරනු ලැබේ.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 සංකීර්ණය හා DRD2 භෞතිකව සම්බන්ධ වේ

Cdk5 / p35 සංකීර්ණය හා DRD2 අතර ඇති විභව්ය භෞතික අන්තර්ක්රියා විමසා බැලීම සඳහා බොහෝ Cdk5 උපස්ථරයන් Cdk5 / p35 සංකීර්ණය සමඟ භෞතිකව සම්බන්ධ කර ඇති බව දන්නා නිසා [23], [34], [35]. පළමුවෙන්ම, GST pull-down පරීක්ෂණය සිදු කරන ලදී. Purified recombinant GST-D2i3 ප්රෝටීන් මොළයේ ලයිසේට් සමඟ සමතුලනය කරන ලද අතර, බටහිර ස්ඵටිකය සඳහා ජී.එස්.පී. පෙන්වා ඇති පරිදි රූපය 3A, එන්ඩෝග්රැෆික් Cdk5 සහ p35 හඳුනාගෙන ඇති අතර, ඩ්රයිඩීඑන්එක්ස් සහ සීඩීඑක්එන්එන්එක්ස් / පීඑන්එන්ක්ස් සංකීර්ණ අතර භෞතික අන්තර් ක්රියාකාරීත්වයක් පෙන්නුම් කරයි.රූපය 3A). එපමණක් නොව, ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස්-ජීඑෆ්පී සහ සීඩීඑක්එන්එන්එක්ස් / පීඑන්එන්එම්එක්ස් (HEK 5 සෛල ලිසේට්ස්) වලින් HF-Cdk35 සහ p293 හී-ජීඑෆ්පී ප්රතිශක්තිකරණ වලදී හමු වී ඇත (රූපය 3B). මීට අමතරව, අපි ප්රතිශක්ති විද්යාත්මක විශ්ලේෂණයන් සිදු කරන ලද අතර, DRD2-GFP, HA-Cdk5 සහ p35 විසින් HEK 293 සෛල වල පටලවල වැදගත් සංකෝචනකරණ සංඥා පෙන්වයි.රූපය 3C, ඉහළ තල). අපි ඩර්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් සහ සීඩීඑකේඑන්එක්ස් / පීඑන්එන්එක්ස් එක්ස්චලේෂන් න්යුරෝනීය සන්දර්භය තුළ අධ්යයනය කළා. අඛන්ඩව DRD2-GFP දෛනිකව Cdk5 සහ p35 සමග සැලකිය යුතු සම-දේශියකරණයක් පෙන්නුම් කරන අතර DRD2 හා Cdk5 / p35 අතර ක්රියාකාරී සම්බන්ධතා තවදුරටත් සහාය වන අතර,රූපය 3C, පහළ පුවරු). මෙම ප්රතිඵල මගින් පෙන්නුම් කරන්නේ DRD2 සහ Cdk5 / p35 සංකීර්ණ ලෙස සකස් කළ හැකි වන අතර DRD2 Cdk5 හි භෞතික විද්යාත්මක උපස්ථායකයක් වන බව අනුමත කරයි.

සිඟිති රුව

රූපය 3. Cdk5 / p35 සංකීර්ණ සංයෝගයක් DRD2 සමඟ සංයුක්ත කළ හැක.

(A) පොටෑති මොළයේ නිස්සාරණය සහිත purified recombinant GST-D2i3 ප්රෝටීන් භාවිතා කරමින් GST pull-down පරීක්ෂණය. GST පල්ලා බැස යන අවදානමට බටහිර විශ්ලේෂණයට ලක් විය. 'බීඩ්' GST ප්රෝටීන් නොමැතිව ඇදගෙන යාමේ අවදානමක් පෙන්වයි. (B) DRD2 සහ Cdk5 / p35 සංකීර්ණ ආඝ්රාණය කිරීම. එන්.ජී.එෆ් .පී. පරිණාමිත සෛලවලින් ලයසට්ස් වලින් බස්නාහිර පුල්ලි විශ්ලේෂණයට යටත් විය. ඩ්රයිව් ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් සංඥා මගින් පෙන්නුම් කරන අතර විවෘත ඊතලය ගර්භාෂ ප්රතිශක්තිකරණ ප්රතිශක්ති ඌනතා වලින් ලැබෙන සංවේදී සංඥා. ආදාන සඳහා අවහිර කරන ලද බ්ලූටෝට් ද දකුණේ ද දක්නට ලැබේ. (C) DRD2 හා Cdk2 / p5 වල පතිශක්ති ෙල්ඛන විශ්ෙල්ෂණය. ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස්-ජීඑෆ්පී සහ Cdk35 / p293 ප්රකාශයට පත් කරන ලද HEK 2 සෛල Cdk5 සහ ප්රති-p35 ප්රතිදේහ (ඉහළ පුවරු) ආසාදනය කරන ලදී. DRD5-GFP හෘද ස්ට්රයිකි න්යුරෝන තුළ තනිව ප්රකාශයට පත් කරන ලද අතර Cdk35 සහ ප්රති-p2 ප්රතිදේහ (පහළ පුවරු) ආසාදනය විය. න්යෂ්ටිය පැල්ලම් සඳහා Hoechst භාවිතා කරන ලදී. පරිමාණ තීරුව 5 μm වේ. සියලුම රූප ලබා ගන්නා ලද්දේ පැමිනෙන අන්වීක්ෂය (Olympus, FluoView-35) මගින්ය.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-මැදිහත් වූ DRD2 හි පොස්පරයිලීකරණය ප්රතිග්රාහක ක්රියාකාරිත්වය

ෆොස්ෆොරිලීකරණය G-ප්රෝටීන් ස්පන්දනය, ප්රතිග්රාහක අභ්යන්තරකරණය, අන්තර් මූල ලක්ෂණ සහ මොඩියුලේටරය ආශ්රිත ප්රෝටීන සමඟ සහයෝගීතාවය GPRO හි විභව්ය ගුණාංගයන් මොඩියුලේටනය කරයි. [9], [11], [24]. ඒසංඥා සම්ප්රේෂණය පිළිබඳ තීරණාත්මක නියාමන ක්රියාවලියක් යනු ගෝනිවාදීන් විසින් අනුමත කරන ලද ප්රතිග්රාහක අභ්යන්තරකරණයකි. අපි ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් අභ්යන්තරීකරණයේ Cdk5-මැදිහත් කරන ලද මොඩියුලය විමසා බැලුවා. HEK 2 සෛල ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස්-ජීඑෆ්පී සහ DRD293 S2A-ජීඑෆ්පී සමග Cdk2 / p321 හෝ නොමැතිව 5 μM quinpirole සමඟ පොදුවේ පොදුවේ උත්තේජිත ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එස් අභ්යන්තරකරණය (රූපය 4A). [3H] -spiperone සංඥා DRD2-GFP ප්රකාශක සෛල 30 min quinpirole ප්රතිකාරයේ සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කරන ලද අතර 90 ආර්. සිත්ගන්නා සුළු, [3H] -spiperone සංඥා DRD2-GFP සහ Cdk5 / p35 ප්රකාශ කිරීමේ සෛල 30 min quinpirole ප්රතිකාර වලදී අඩු කරන ලදී 90 min (රූපය 4A, දෙවන කොටස). අනිත් අතට, [3H] -spiperone සංඥා DRX2 S321A-GFP ප්රකාශනය කරන ලද සෛල 30 min වලදී අඩු කරන ලද අතර Cdk90 / p5 සමඟ සම ප්රකාශනය නොතකා 35 min හි recovered. පූර්ව අධ්යයනයන් මගින් පෙන්නුම් කෙරුනේ දිගු කලක් තිස්සේ ඇග්නිවාදී උත්තේජකයක් මගින් අභ්යන්තරීකෘත DRD2 නැවත ප්ලාස්මමය පටල නැවත ප්රතිස්ථාපනය කරන බවයි [11]. ටීනිවසේදී ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස් හි මැදිහත් වූ ෆොස්ෆොරයිලීකරණය Cdk5 මගින් ප්රතික්රියාකාරක ක්රියාවලියට සම්බන්ධ වන බව පෙනී යයි.

සිඟිති රුව

රූපය 4. Cdk5-මැදිහත්කාරක ෆොස්ෆොරයිලීකරණය DRD2 මතුපිට ප්රකාශනය හා පහළට සංඥා කිරීම අඩු කරයි.

(A) DRD2 මතුපිට ප්රකාශනය මැනීම [3H] -spiperone බන්ධන පරීක්ෂණය. HEK293 සෛල මාරු කරන ලද කාලයට අනුව 1 μM quinpirole මගින් උත්තේජනය කරන ලද අතර අස්වැන්න නෙලීමෙන් අනතුරුව 3 nM [3එච්] - පැය 3 ක් සඳහා ස්පයිපෙරෝන් ප්‍රතිකාරය. විකිරණශීලතාවය මනින ලද අතර මතුපිට සං als ා ගණනය කරන ලදී. දෝෂ තීරු මධ්යන්යය නියෝජනය කරයි ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; ඩනෙට් පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය සමඟ එක්-මාර්ගයක් ANOVA: පාලක තීරුවට එදිරිව සියලු තීරු සංසන්දනය කරන්න). (බී) [35S] -GTPγS බන්ධන පරීක්ෂණය. සෛල පටල වලින් සාදා ඇති පරිදි සෛල ලෙස පරිවර්තනය කරන ලදී. ඵම්එම්්රේන් සම්මිශණ 1 μM quinpirole සමඟ පොතු කරන ලද අතර පසුව 3 nM [35S] -GTPγමිනිත්තු 90 ක් සඳහා එස්. දෝෂ තීරු මධ්යන්ය නියෝජනය කරයි ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; බොන්ෆෙරෝනි පශ්චාත් කාලීන පරීක්ෂණය සමඟ එක්-මාර්ග ANOVA: සියලු තීරු යුගල සංසන්දනය කරන්න). (ඇ) ක්වින්පිරෝල්-තරඟකාරී [3H] -spiperone බන්ධන පරීක්ෂණය. සංක්රමණික සෛල වලින් පටල මිශ්රණ 0.01 nM සමඟ පොතු කරන ලද අතර [3එච්] -ස්පයිපෙරෝන් සහ මිනිත්තු 30 ක් සඳහා ක්වින්පිරෝල් සාන්ද්‍රණය වැඩි කිරීම. රේඛීය නොවන ප්‍රතිගාමීත්වය ග්‍රැෆැඩ් විසින් ලබා ගන්නා ලදි. දෝෂ තීරු මධ්‍යන්‍ය ± SE (n = 3) දක්වයි. ()) සම්ප්‍රේෂණය කරන ලද HEK 293 සෛලවල cAMP එන්සයිම ප්‍රතිශක්තීකරණ. සම්ප්‍රේෂණය කළ සෛල 10 for සඳහා 1 µM රෝලිප්‍රම් සමඟ පූර්ව ප්‍රතිකාර කරන ලද අතර පසුව 0.1 forM ෆෝස්කොලින් සමඟ සම-ප්‍රතිකාර කර මිනිත්තු 30 ක් සඳහා ක්වින්පිරෝල් සාන්ද්‍රණය වැඩි කරන ලදී. රේඛීය නොවන ප්‍රතිගාමීත්වය ග්‍රැෆැඩ් විසින් ලබා ගන්නා ලදි. දෝෂ තීරු මධ්යන්ය නියෝජනය කරයි ± SE (n = 4; ** p <0.01; ද්වි-වලිගය tපරීක්ෂණය). (E) වල් වර්ගයෙන් හා පීඑන්එන්එම්එක්ස් පිළිකා කලලයන් (DIV 35) මගින් නිෂ්පාදනය කරන ලද 7 μM රෝලිපම් 10 h සඳහා ප්රතිකාර කරන ලදී. 1 μM dopamine 1 h සඳහා අනුගමනය කරන ලදී. දෝෂ තීරයන් මධ්යන්යය ± SE (n = 1; **p<0.01; ද්වි-වලිගය tපරීක්ෂණය).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

ඇඩොනික්-උත්තේජිත G ප්රෝටීනයක් සම්බන්ධව ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් (Cdk2) මැදිහත්වූ ෆොස්ෆොරයිලීකරණයට සම්බන්ධ වූ විභව වෙනස්වීමක් අපි තවදුරටත් ඇගයීමට ලක් කළෙමු [35S] -GTPγS බන්ධන පරීක්ෂණය [25], [26]. සීඩීඑන්එක්ස්එම්එක්ස්-ජීඑෆ්පී සහ ඩර්ඩීඑන්එන්එක්ස් S2A-GFP සමඟ Cdk2 / p321 හෝ නොමැතිව ප්රකාශ කරන ලද්දේ HEK 5 සෛල තුළය. එම්එම්ප්රෑස් 35 μM quinpirole සමඟ උත්තේජනය කරන ලද අතර උත්තේජනය කරන ලදී [35S] -GTPγS සංස්ථාගත කිරීම. DRD2-GFP සහ Cdk5 / p35 ශෛල පටක ප්රකාශණය සැලකිය යුතු ලෙස අඩු වී ඇති බව [35S] -GTPγS සෛල පටල වලට සාපේක්ෂව S බන්ධනය (රූපය 4B). මෙම ප්රතිඵල මගින් පෙන්නුම් කරන පරිදි Cdk5-මැදිහත්කාරක පොස්පරයිලකරණය ඩ්රයිඩීඑන්එන්එක්ස් හි ඇග්නිවාදී-උත්තේජිත G ප්රෝටීන් බන්ධනය නියාමනය කරනු ලබයි.

ඊට අමතරව, quinpirole-තරඟකාරී [3H] -spiperone බන්ධන පරීක්ෂා සිදු කරන ලදී. Cdk2-මැදිහත්වූ ෆොස්ෆොරයිලයිට් මගින් DRD5 හි ඇග්නි විශේෂඥතාවයේ විභව්ය වෙනසක් විමසා බැලීම සඳහා සිදු කරන ලදී. තරඟකාරී බැඳීම [3H] -ප්රයිපර්නොනෝ (transmitioned from membrane preparation) දක්වා වූ ක්වින්පිරෝලේ වැඩි වන සාන්ද්රණයන් සඳහා ප්රතිකාර කරන ලදී. Quinpirole සහ තරඟකාරි බැඳීම [3H] -spiperone DRD2-GFP සහ DRD2 S321A-GFP සමාන ආකාරයේi අගයන් (DRD9.789-GFP සඳහා -2 සඳහා වන DRD9.691 S2A-GFP සඳහා -321), ඩීජීඩීඑන්එක්ස් වලට ලයිජන්ඩ් අනුපාතය ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස්හි (Cdk2-මැදිහත්කාර පොස්පරයිලනය) සැලකිය යුතු බලපෑමක් නොදරයිරූපය 4C).

Cdk5-මැදිහත්කාරක පොස්ෆොරිලීලේට් පහළ-DRD2-cAMP සංඥා මාර්ගය

මීලඟට, Cdk2 විසින් DRD5 වෙනස් කිරීම පහළට සංඥා මාර්ග වෙතට බලපෑ හැකිදැයි අපි විමසා බලමු. අපි cAMP එන්සයිම ප්රතිශක්තිකරණ immunoassay භාවිතා කරමින් DRD2-GFP සහ DRD2 S2A-GF ප්රකාශ කරන සෛල තුළ ඇඩෙන්සිල්ල් සයික්ලේසා විසින් නිෂ්පාදනය කරන ලද සාස්ලොවීන්-උත්තේජිත cAMP නිෂේධනය කරන ලදී. ඩර්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස්-ප්රකාශිත සෛල එක් එක් කාණ්ඩයට සාපේක්ෂව cAMP මට්ටම අඩු වී ඇත. Cdk321 / p2 හි සම-ප්රකාශනය අතිශයින්ම සැලකිය යුතු ලෙස සැලකිය යුතු ලෙස අඩු කිරීම සඳහා cAMP සැකැස්ම (රූපය 4D, වම් පුවරුව). අනෙක් අතට, DRD2 S321A-GFP සෛල ප්රකාශනයෙහි, cAMP සැකසුම් Cdk5 / p35 ප්රකාශනය නොතකා quinpirole ප්රතිකාර වලට ප්රතිචාර වශයෙන් ඵලදායී ලෙස තුරුවීරූපය 4D, දකුණු පුවරුව). මෙම ප්රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කෙරෙන්නේ Cdk5-මැදිහත් වූ ෆොස්ෆොරිලීකරණය ඩීඩීඑන්එන්එන්එන්එක්ස් හි පහළම ප්රවාහක සංඥා මාර්ගයේ DRD2 වල ආක්රමණශීලී ක්රියාකාරිත්වය අඩු කරන බවයි. වඩාත් භෞතිකව අදාළ වන සැකසුමේ සංසිද්ධිය තවදුරටත් තහවුරු කර ගැනීම සඳහා, p2 හි අත්යාවශ්ය Cdk35 සක්රියකාරකයේ අඩුපාඩු වන නියුට්රෝ ඩිම්බ්රූස් වලින් ප්රාථමික සංස්කෘත නියුරෝන භාවිතා කර ඇත. ප්රාථමික සංස්කෘත ස්ටීටරල් න්යුරෝන 5 μM dopamine සමඟ ප්රතිකාර කළ අතර cAMP එන්සයිම ප්රතිශක්තිකරණය මඟින් විශ්ලේෂණය කරන ලදී. P1 knockout මීයන්ගෙන් ඇති නියුරෝන නියුක්ලියෝන මගින් ඩම්පමින් සමග උත්තේජනය කරන ලද ඩීඑම්ඒ වර්ගයට සාපේක්ෂව cAMP මට්ටම අඩු විය.රූපය 4E). ටීඅම්ලය එකට එකතු වී, ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි මැදිහත් වූ ෆොස්ෆොරයිලීකරණයක් ඩීඩීඑන්එන්එන්එක්ස් විසින් ක්රියාත්මක කරන ලද සීඑම්.පී. ආක්රමණයේ සංවේදී ස්වරයේ අඩුවීමක් බව අපි නිගමනය කළෙමු.

සාකච්ඡා

Cdk2 හි නව උපස්ථරයක් ලෙස DRD5 හදුනාගෙන ඇත. ඩීඑන්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි පෘෂ්ඨ ප්රකාශනය පාලනය කිරීම සඳහා ෆොස්ෆොරයිලීකරණය පහත දැක්වේ.i-සංස්කරණය හා පහළට යන cAMP මාර්ගය. ඩීඑන්ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් හි දිගු හා කෙටි ආකෘති වල ෆොස්ෆොරිලීකරණ ප්රතික්රියාව S321 පවතින බැවින්, මෙම අධ්යයනයේ දී යෝජනා කරන ලද යාන්ත්රණය DRD2 මඟින් සන්නිවේදනය කරන ලද සංඥාකරණයේ සාමාන්ය ක්රමයකි..

මධ්යකාලීන නිවුනික් නියුරෝන තුල ප්රධාන ඩොපැමයින් ප්රතිපිළීති උපකරණයක් ලෙස සලකනු ලැබුවේ පමණක් නොව, පාරිසරික උත්තේජනයට ප්රතිචාර දැක්වීමේදී එහි ඇති වෙනස්කම් වලට ඇති හැකියාව වෙනස් විය හැකිය. ඩිග්ඩීඑන්එන්එක්ස් හි ඇග්නිස්ටික්-ඉන්ඩිපෙන්ඩන්ට් ඩීසෙන්ටේෂණය හා ප්රතිකෝෂනය පුළුල් ලෙස අධ්යයනය කර ඇත [11], [24]. විශේෂයෙන්ම අධ්යයනයන් ගණනාවක් පෙන්නුම් කර ඇත්තේ කොන්ඩයානා synapse වල ඩොපැමයින් බාහිර සෛල මට්ටම ඉහල නැගීම, කොකේන් සහ ආර්ෆේටයින් වැනි නිදන්ගත මනෝවිශ්ලේෂක නිරාවරණයක් වන අතර, DRD2 හි ගතික වෙනස්කම් වලට අනුකූල වේ. [36]. ඇත්ත වශයෙන්ම, නිදන්ගත කොකේන් භාවිතා කරන්නන් හට ඩ්රැක්සිනුස් මට්ටම අඩු කර ඇති අතර, න්යෂ්ටියේ ඇක්බුන්සන් (NAcc) හි ඇති ඩ්රයිඩීඑන්එක්ස් ධාරිතාවය, මීයන් සහ ප්රාථමිකයන්ගේ මත්ද්රව්ය ගැනීමේ සහ ශක්තිමත් කිරීමේ හැසිරීම් සමඟ ඍණාත්මක සම්බන්ධතාවයක් පෙන්නුම් කරයි. [37]-[39]. මෙම සොයා ගැනීම්වලින් පෙන්නුම් කරන්නේ, DRD2 ක්රියාකාරිත්වය නිදන්ගත ඖෂධ නිරාවරණය ඇතුළු විවිධ උත්තේජකවලට ප්රතිචාර දැක්වීමේදී අනුවර්තනීය හෝ වන්දි නියාමනයට බෙහෙවින් අන්තරාදායක බවය. අපගේ ප්රතිඵලවලින් පෙන්නුම් කරන්නේ, DRD321 හි තෙවැනි අභ්යන්තර බන්ධන වල සෙක්න් අම්ලය, Cdk2 මඟින් පොස්පරයිලකරණය කළ හැකි වන අතර, සීඑම්එම් පාරේ ආක්රමණික බලපෑමේ DRD5 වල අඩු වීමක් ඇති බව පෙන්වයි. මෙම අන්තර්ක්රියාකාරිත්වය DRD5 පෘෂ්ඨීය තත්වයේ ගතික ස්වභාවය සමඟ සම්බන්ධ කළ හැකි dopamineceptive නියුරෝන වල Cdk2 සමඟ සම්බන්ධ නව නියාමන යාන්ත්රණයක් යෝජනා කරයි.

Cdk5 යනු න්යුරෝන පරිසරයේ අනුවර්තනය වීමේ වෙනස්කම් මැදිහත් වීමෙහිලා ප්රධාන අංගයකි. නිදසුනක් වශයෙන්, සීමාසහිත පරිපථයේ න්යුරෝන වල ඩෙන්ඩ්රැටික් කඤ්චේයයේ ව්යුහාත්මක හා ක්රියාකාරී වෙනස්කම් නැවත නැවතත් මනෝවිශ්ලේෂන් නිරාවරණය වීමක ප්රතිවිපාකයකි [40]. මෙම වෙනස්කම් සිදු වන්නේ cAMP ප්රතික්රියා මූලද්රව්යය-බන්ධන ප්රෝටීන් (CREB) සහ ΔFosB ආදී සාධකවලට අනුකූල වන අතර, නිදන්ගත කොකේන් පරිපාලනයට ප්රතිචාර දැක්වීම තුලින්, [41], [42]. වැදගත් වන්නේ Cdk5 ΔFosB හි ඉලක්කයකි [19], PSD-95, p21-සක්රිය කළ kinase (PAK), β-කැටිනින් සහ ස්පිනොෆිලින් වැනි ඩෙඩ්රැටික් ස්පිනෝ ගතිකතාවයට සම්බන්ධ විවේචනාත්මක සංරචක Cdk5 උපස්ථර [43]-[46]. Cdk5 ක්රියාකාරකම් ජානමය හෝ ඖෂධීය හැසිරීම් අනුකූලව කොන්ඩයින්ට ඩෙන්ඩ්රැටික් කොඳු ඇට පෙළවල වෙනස් කිරීම් සහ චර්යාත්මක ප්රතිචාරයන් ඇති කිරීම, මෙඩොලිම්බික් ඩොපේන් පරිපථවල අණුක සහ රූපක වෙනස්වීම් සඳහා Cdk5 සඳහා තීරනාත්මක භූමිකාවන් ඇඟවුම් කරයි. [47], [48]. DRD2 හි Cdk5 හි නව ඉලක්කයක් බව පෙන්වන අපගේ ප්රතිඵල Cdk5 හි නව ඉලක්කයක් වන අතර පසුව පහත දැක්වෙන නිසා නිදන්ගත ඖෂධ නිරාවරණයන්ට ප්රතිචාර වශයෙන් ඩොපැමයින් පද්ධතියේ අනුකම්පිත වෙනස්කම් පිළිබඳ අමතර අවබෝධයක් ලබා දෙයි. Cdk2 මගින් මැදිහත් වූ ඉහළ-නියාමනය මඟින් DRD2 වල ෆොස්ෆොරයිලීකරණය . එපමණක් නොව DRAMXNUMX ද සම්භාවිතාවය ක්රියාවලි ගණනාවකට අයත් වේ. CAMP සහ MAP කිීනේස් මාර්ග සහ නාලිකා සංසරණ [42], [49]. මේ අනුව, මෙම අධ්යයනයේ සොයාගැනීම් Cdk2 විසින් ඩ්රයිඩීඑන්එන්එක්ස් විසින් සෘජු නියාමනය කිරීම පමණක් නොව, ඩොපීනින් පද්ධතියේ අනුවර්තනය කරන ප්රතිචාර පිළිබඳ නිදහසේ ඖෂධ නිරාවරණය කිරීමට ද නව ආලෝකයක් සපයනු ඇත.

කර්තෘ දායකත්වය

අත්හදා බැලීම් හා නිර්මාණය කිරීම: JJ YUP DH SKP. අත්හදා බැලීම්: JJ YUP DKK YK. දත්ත විශ්ලේෂණය කළේ: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. දායක ප්රතික්රියාවක් / ද්රව්ය / විශ්ලේෂණ මෙවලම්: YHS. පත්රිකාව ලියූ: JJ SKP.

ආශ්රිත

  1. 1. Missale C, Nash SR, රොබින්සන් SW, ජැබර් එම්, කාන්න් එම්ජී (1998) ඩොපෑම්යින් ප්රතිග්රාහක: ව්යුහයට ක්රියා කිරීම. භෞතීය ප්රති-78: 189-225.
  2. 2. බුද්ධිමත් ආර්එස් (2002) මොළය වින්දනය සඳහා වූ පරිපථ: අනවශ්ය දීමනා ලබා ගැනීම. නියෝන් 36: 229-240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. ලිපිය බලන්න
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. ලිපිය බලන්න
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. ලිපිය බලන්න
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. ලිපිය බලන්න
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. ලිපිය බලන්න
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. ලිපිය බලන්න
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. ලිපිය බලන්න
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. ලිපිය බලන්න
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. ලිපිය බලන්න
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. ලිපිය බලන්න
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. ලිපිය බලන්න
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. ලිපිය බලන්න
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. ලිපිය බලන්න
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. ලිපිය බලන්න
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. ලිපිය බලන්න
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. ලිපිය බලන්න
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. ලිපිය බලන්න
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. ලිපිය බලන්න
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. ලිපිය බලන්න
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. ලිපිය බලන්න
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. ලිපිය බලන්න
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. ලිපිය බලන්න
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. ලිපිය බලන්න
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. ලිපිය බලන්න
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. ලිපිය බලන්න
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. ලිපිය බලන්න
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. ලිපිය බලන්න
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. ලිපිය බලන්න
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. ලිපිය බලන්න
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. ලිපිය බලන්න
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. ලිපිය බලන්න
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. ලිපිය බලන්න
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. ලිපිය බලන්න
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. ලිපිය බලන්න
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. ලිපිය බලන්න
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. ලිපිය බලන්න
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. ලිපිය බලන්න
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. ලිපිය බලන්න
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. ලිපිය බලන්න
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. ලිපිය බලන්න
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. ලිපිය බලන්න
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. ලිපිය බලන්න
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. ලිපිය බලන්න
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. ලිපිය බලන්න
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. ලිපිය බලන්න
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. ලිපිය බලන්න
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. ලිපිය බලන්න
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, Trantham-Davidson H (2004) ඩොප්ඒමයින් ප්රතිග්රාහක සංඥා. J නැවත සංඥා සංඥා Res 24: 165-205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. අමාර් එස්, ෂල්ටිල් ජී, මාන් එල්, ශමීර් ඒ, ඩීන් බී, සහ අල්. (2008) භයානක පශ්චාත් ඩොම්පමයින් ඩීඑන්එන්එම්එස්එක්ස් සංවේදී සංඝටක සංඝටක විභාජනය කිරීමේ හැකියාව. Int J Neuropsychopharmacol 2: 11-197. doi: 205 / s10.1017
  146. 5. කේයින් එස්.බී., නෙගස් එස්එස්, මෙලෝ එන්.කේ., පැටෙල් එස්, බ්රිස්ටොව් එල්, ඇල්. (2002) ඩොක්ඩින් ඩීඑන්එන්එම්එම්එම්එක්ස්-කොකේන් ස්වයං පරිපාලනය තුළ ඩීඑන්එන්එම්එස්එක්ස් ග්රාහකයින් සහ අධ්යයන ඩී. එන්. J Neurosci 2: 2-2.
  147. 6. ලී එස්, ජොන්ග් ජේ, පාක් යූ, ක්වාක් ය, ලී SA, සහ අල්. (2012) වෝල්ටෝටේට් පර-4 ප්රෝටීන් ප්රකාශනය සමඟ සම්බන්ධ වීමෙන් ඩොපැමයින් සංඥා කිරීම මගින් වෙනස් වේ. PLoS එකක් 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. ෆිෂ්බර්න් සීඑස්, එලිසා Z, Fuchs S (1995) ඩීඑන්එන්එන්එක්ස් ඩොපෑම්යින් ග්රන්ථයේ දීර්ඝ හා කෙටි ආකෘති සඳහා Differential glycosylation සහ intracellular ජාවාරම සඳහා. J Biol Chem 2: 270-29819. doi: 29824 / jbc.10.1074
  149. 8. Reader TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) විශේෂිත [3H] ප්රතික්රියාකාරක ඩොක්ලයිසයිඩ් ඩොක්ඇමීඑස් ඩීඑන්එම්එම්එස් සඳහා වන බන්ධන: ඩිස්සල්ෆයිඩ් සහ සල්ෆයිඩ්රිල් කාණ්ඩයේ කාර්යභාරය. Neurochem Res 2: 17-749. doi: 759 / bf10.1007
  150. 9. Ng GY, ඕ ඩොව්ඩ් බීඑෆ්, කැරන් එම්, ඩෙනිස් එම්, බ්රාන්න් ජීඑම් සහ අල්. (1994) Sf2 සෛල තුළ මානව D9L ඩොපීනින් ප්රතිෙපෝෂක ෙපොස්ෙටෝෙලොලිකරණය සහ palmitoylation. ජේ නුරෝකොම් 63: 1589-1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) ඇක්ටින්-බන්ධන ප්රෝටීන් (ABP-2) මගින් dopamine D (280) ප්රතිශෝධක සංඥා කිරීම. මෝල් ෆාමසොල් 57: 446-452.
  152. 11. චෝ ඩී, ෂෙන්ග් එම්, මින් සී, මා එල්, කුරෝස එච් සහ අල්. (2010) ඩොපැමයින් ඩී (2) ප්රතිග්රාහක (Agonist-induced endocytosis and receptor phosphorylation mediate resensitization). මෝල එන්ටොක්රිනෝල් 24: 574-586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. සීඅයිඑච්එච්, ඩෙල්ලල් I, ශෝචනීය VS ජර්, චේ ටී, හාර්ලොව් ඊ (1994) p35 යනු සෛලීන් මත රඳා පවතින කිනාස් 5 ස්නායු විශේෂිත නියාමක උප නයිසියේ. නේචර් 371: 419-423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. ඩවාන් ආර්, සීඅයි එල්එච් (2001) සීඩීසීඑන්එන්එක්ස් එක් දශකයක්. Nat Rev Mol Mol Biol 5: 2-749. doi: 759 / 10.1038
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Cyclin-dependent kinase 5 Dendritic කොඳු ඇට පෙළ සංවර්ධනය තුළ Actin සයිටොස්ලෙටොන් වලට බාහිර ලක්ෂණ දක්වයි. සෙල් Adh Migr 1: 110-112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Cdk5 සක්රිය කිරීම NMPA ප්රතිග්රාහක සෘජු ෆොස්ෆොරිසිලින් මගින් හයිපොකැම්පල් CA1 සෛල හට ගනී. නට් නියුරෝසි 6: 1039-1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. ෂැං එස්, එඩෙල්මන් එල්, ලියු ජේ, ක්රැන්ඩ්ල් අයිඑම්, මොබොරිටෝ එම්ඒ (2008) Cdk5 නයිසීන් 1472 NR2B හි ප්රදාහය සහ NMDA ප්රතිග්රාහක මතුපිට ප්රකාශනය පාලනය කරයි. J Neurosci 28: 415-424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Cyclin-dependent kinase 5 ටයිරිසීන් හයිඩ්රොක්සිලේසයේ සෙරීන් 31 පොස්පරයිලකරණය කර එහි ස්ථායීතාව පාලනය කරයි. J Biol Chem 279: 54487-54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. බිබ් ජේ, ස්නියර් ජීඑල්, ​​නිශි ඒ, යාන් Z, මායිරර් එල් සහ අල්. (1999) Cdk32 විසින් DARPP-5 මගින් ඩොඑස්පීඑස් 402 වල ෆ්ස්ෆොරයිලීකරණය නියුරෝන තුල ඩොපේන් සංඥා කිරීම කරයි. නේචර් 669: 671-XNUMX.
  160. 19. බිබ් ජේ, චෙන් ජේ, ටේලර් ජේ.ආර්, ස්венනින්සන් පී, නිශි ඒ, සහ අල්. (2001) කොකේන් වලට නිදන්ගත නිරාවරණයන් වල බලපෑම සංස්කරණය නියුරෝනෝල් ප්රෝටීන් Cdk5 විසින් පාලනය කරනු ලැබේ. නේචර් 410: 376-380.
  161. 20. ඕෂිමා ටී, ඔගාවා එම්, වීර්නානා, හිරාසාව එම්, ලන්නෙන්කර් ජී සහ අල්. (2001) සින්ක්ලින්-රඳා පවතින කයිනැස් 5 / p35 සහ Reelin / Dab1 වල සින්සර්ජික් දායකත්වය වර්ධනය වන මවුස මොසියේ උන්ගේ නියුරෝන ස්ථානගත කිරීම සඳහා. ප්රොක්ට් ඇට්ල් ඇකඩ් එස්සී ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය 98: 2764-2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Cyclin-dependent kinase 5 න්යුරෝන තුල ඇති පොසිනප්ටී ඝනත්ව ප්රෝටීන් PS-95 වල N-පර්යන්තයේ වසම නහරනය කරයි. J Neurosci 24: 865-876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. පාර්ක් එස්.කේ., නූයන් එන්. ඩී., ෆිෂර් ඒ, ලූක් මයා, ඇෆාර් එල් බී සහ අල්. (2005) Par-4 වලට dopamine සංඥාකරණය හා අවපීඩනය සම්බන්ධ කරයි. සෛල 122: 275-287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. නියේහමර් එම්, ස්මිත් ඩී එස්, අයාල ආර්, පීං ජේ, කොයි ජී සහ අල්. (2000) NUDEL යනු LIS5 හා සෛලවල ප්රෝටීන ඩයිනින් සමග සම්බන්ධ වන නව Cdk1 උපස්ථරයකි. නියෝන් 28: 697-711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. කිම් කේඑම්, වැලෙන්සැනෝ කේ.ජේ., රොබින්සන් එස්.ආර්, යාඕ ඩබ් ඩබ්, බරක් එල්එස්එල්, සහ අල්. (2001) G ප්රෝටීන්-සම්බන්ධිත ප්රතිග්රාහක කිනාස් සහ බීටා-අත්අඩංගුවට ගැනීම මගින් dopamine D2 සහ D3 ග්රන්ථිවල වෙනස නියාමනය කිරීම. J Biol Chem 276: 37409-37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) A1 ඇඩෙනොසීන් සහ ඩ්රේම්එන්එක්ස් ඩොපැමයින් ප්රතික්රියාකාරක සාරාම්න් සහ ඩේමෙටිතිත්වකරණය කරන ලද සරාරයින් (NF2) යන විසංයෝජනය. මෝල් ෆාමසොල් 037: 53-808.
  167. 26. බෝෆිල්-කාඩෝනා ඊ, කුඩලැසීක් ඕ, යාන් Q, ඇහෝන් එච්, ෆීස්ස්මමුට් එම් සහ අල්. (2000) D2-dopamine receptor වලට හැමිඩොඩිලින් බන්ධනය කිරීම G ප්රෝටීන් ක්රියාකාරී ස්විච්චය අත්හිටුවීම මගින් සංඥා සංඥා අඩු කරයි. J Biol Chem 275: 32672-32680. doi: 10.1074 / jbc.m002780200
  168. 27. List SJ, Seeman P (1981) මීයන් මොළ ප්රදේශ වලට ස්පයිටෙරෝන් බන්ධන වල dopamine සහ serotonin receptor සංරචක පිළිබඳ නිරාකරණය. ප්රොක්ට් ඇට්ල් ඇකඩ් එස්සී ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය 3: 78-2620. doi: 2624 / pnas.10.1073
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) D2 (දිගු) ඩෙපේයින් ප්රතිග්රාහක (Agonist) ක්රියාවලිය: ලයිජන් බන්ධනය සහ ක්රියාකාරී විශ්ලේෂණය. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. ඩොපැමයින් ඩොපැමයින් ඩොපැමයින් ඩොපැමයින් ඩොම්පේමින් ඩීඑන්එම්එම්එම්එස් ග්රාහකවල අධි අනුප්රාසනීය ස්ථානවලින් අවශෝෂණය කර ඇත. නමුත් [2003H] රොලොප්ල්රයිඩ් හෝ [3H] ස්පයිපෙටොනය නොවේ සමස්ථානික මාධ්යය: මානව පොස්ර්රෝනය විමෝචන ඡේදනමරය සඳහා බලපෑම්. සිනැප්ස් 2: 3-3. doi: 49 / syn.209
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: කෙටි අනුක්රමික ආවරණ භාවිතා කරමින් සෛල සංඥා අන්තර්ක්රියා වල ප්රෝටෝම් පුළුල් අනාවැකි. න්යෂ්ටික අම්ල භෂ්ම 31: 3635-3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, යේට්ස් JR 3rd (2004) වෙඩි බෙහෙත් හි නිරපේක්ෂ ප්රෝටීන් බහුලතාවය අහඹු නියැදීම හා ඇස්තමේන්තු කිරීම සඳහා ආදර්ශයක්. රස පරීක්ෂක රසායනික 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. ඉටෝ කේ, හගා ටී, ලමේ ජේ, සදී W (1999) ඩොපැමයින් ඩීඑන්එන්එම්එක්ස් ග්රාහකයින්ගේ අනුපිලිවෙල ලිංගාශ්රිතව සංඝටිත ග්රාහක සංඝටක 2 හෝ 2 යන සංයුතිය මත රඳා පවතී. Eur J Biochem 5: 260-112. doi: 119 / j.10.1046-1432.x
  174. 33. Namkung Y, Sibley DR (2004) ප්රෝටීන් kinase C D2 ඩොපීනයින් ප්රතිෙපෝෂක ෙපොස්ෙෂෝලියිලීකරණය, ෙදෝෂෙභෝජනය කිරීම සහ ජාවාරම මැදිහත් කරයි. J Biol Chem 279: 49533-49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. වොන්ග් ඒඑස්, ලී එච්එච්, චුං ඒවයි, යුන්ග් පී කේ, චන්ග් එස්.කේ. සහ අල්. (2011) Cdk5-එන්ඩොෆිලින් B1 මගින් මැදිහත් වූ ෆොස්ෆොරයිලීකරණයට පාකින්සන් රෝගයේ ආවේනික ස්වයංජීවනය සඳහා අවශ්ය වේ. Nat Cell Biol 13: 568-579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, මැක්ලෆීන් ඩී.එම්., බ්රවුන්ලීස් ජේ, ඇකර්ලි එස්, ඇල්. (2001) p35 / cdk5 බන්ධනය සහ බීටා-කැටෙනින් ෆොස්ෆරයිලනය වන අතර බීටා-කැටිනින් / ප්රෙසීනිලින්-1 අන්තර්ක්රියා කටයුතු පාලනය කරයි. ඊර්එන් ජේ නුර්සොසි 13: 241-247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. කුහර් එම් ජේ, රිට්ස් එම්, බෝව් ජේවී (1991) කොකේන්වල විස්ථාපන ලක්ෂණ පිළිබඳ ඩොපැමයින් උපකල්පනය. ප්රවණතා ස්නායු ශුන්ය 14: 299-302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, ෆව්ලර් ජේඑස්, වුල්ෆ් ඒපී, ස්කීර් ඩී, ෂියූ සී, සහ අල්. (1990) පශ්චාත් රුසියානු ඩොපීනයින් ප්රතිග්රාහක මත නිදන්ගත කොකේන් උල්ලංඝනය කිරීමේ බලපෑම්. Am J Psychiatry 147: 719-724.
  179. 38. ඩාලි ජේ ඩබ්, ෆයිර් ටීඩී, බ්රිචාර්ඩ් එල්, රොබින්සන් එස්එස්, තියෝබෝල්ඩ් ඩී සහ අල්. (2007) Nucleus accumbens ඩීඑන්එන්එම්එක්ස් / 2 ග්රාහකයන්ට අනුකම්පා විරහිත භාවය සහ කොකේන් ආවරණ පුරෝකථනය කරයි. විද්යා 3: 315-1267. doi: 1270 / science.10.1126
  180. 39. නඩර් එම් එම්, මෝර්ගන් ඩී, ගගේ ඩී HD, නඩීර් එස්එච්, කැලූන් එන්එල්, ඇල්. (2006) ඩෙයාමිඩ ඩීඑන්එන්එම්එක්ස් ග්රාහකයින්ගේ ඩී.කේ. නට් නියුරෝසි 2: 9-1050. doi: 1056 / nn10.1038
  181. 40. රොබින්සන් ටී, කොල්බ් බී (1997) ඇම්පේටයින් සමඟ කලින් ඇති අත්දැකීම් මගින් න්යෂ්ටියේ ඇම්බිබන් හා පුරප්රෆල් කෝටෙක්ස් න්යුරෝනවල අඛණ්ඩ ව්යුහාත්මක වෙනස්කම්. J Neurosci 17: 8491-8497.
  182. 41. රොබින්සන් ටී, කොල්බ් බී (1999) ඇම්පේටයින් හෝ කොකේන් සමඟ නැවත නැවත ප්රතිකාර කිරීමෙන් පසු න්යෂ්ටියේ ඇම්බ්රිබන් සහ පුරප්රුද්රා බාහිකයේ ඩෙන්ඩ්රයිට් හා ඩෙන්ඩ්රැටික් කඤ්චේනවල වෙනස් කිරීම්. ඊර්එන් ජේ නුර්සොසි 11: 1598-1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) CREB සහ ඩෙල්ටා ෆොස්බී විසින් ජාන ප්රකාශනය සහ කොකේන් විපාකය නියාමනය කිරීම. නට් නියුරෝසි 6: 1208-1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. ෆෙන්ග් ජේ, යාන් Z, ෆෙරේරා ඒ, ටොමිසාවා කේ, ලයිව් ජේ ඒ සහ අල්. (2000) ස්පිනොෆිලින් ඩෙන්ඩ්රැටික් කඤ්චුකවල පිහිටීම සහ ක්රියාකාරීත්වය පාලනය කරයි. ප්රොක්ට් ඇට්ල් ඇකඩ් එස්සී ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය 97: 9287-9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. පන්චේන් ඕ, මර්ෆී TH (2001) පශ්චාත් සනීපාරක්ෂක ඝනත්වය 95 ක්ලස්ටර්ස් සහ ස්ෙටිකීකෘත න්යුරෝන පූර්ව වර්ධනය අවධි වල ස්ථායී ඔක්සිජන් පූර්වජයන් සමඟ ඇසුරු කිරීම. J Neurosci 21: 9325-9333.
  186. 45. මූරා එස්, මොසර් ඊ, ස්මාන් එම්එම් (2002) ඩොපෝලකරනය, බෙනා-කැටිනින් න්යුරෝනීය කඤ්චුක ලෙසට මෙහෙයවනු ලබයි. නියෝන් 35: 91-105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. හේහාසි එන් එල්, චෝයි සි, රාවෝ බීඑස්, ජුන්ග්හි, ලී. එච්. (2004) චලිත sinaptic morphology හා forebrain-විශේෂිත ආධිපත්යය-ඍණ PAK transgenic මීයන් තුළ අස්ථායී මතක සංයුක්තය වෙනස් කරන ලදි. නියෝන් 42: 773-787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. බෙනායිඩ්ස් ඩීආර්, ක්වීන් ජේ, ෂොන්ග් පී, හවාස්ලි ඒඑච්, ඩීලෝන් රීඩර් සහ අල්. (2007) Cdk5 කොකේන් විපාක, අභිප්රේරණය සහ ස්තරතෘති නියුෙපන් විකාර ආවර්තය ෙමොකයිලයි. J Neurosci 27: 12967-12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. මේයර් ඩී.ඒ., රිචර් ඊ, බෙන්කොච් එස්.ඒ., හයෂී කේ, කන්සී ජේ. (2008) Cdk5 වල ලිංගික දුර්ගන්ධණය කිරීම කොකේන් වලට, මෝටර් රථ ඉගෙනීම හා ඩෙන්ඩ්රැටික් රූපවාහිනිය මගින් ආවරණ ප්රතික්රියා කරයි. ප්රොක්ට් ඇට්ල් ඇකඩ් එස්සී ඇමරිකා එක්සත් ජනපදය 105: 18561-18566. doi: 10.1073 / pnas.0806078105
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) නව සම්බන්ධතා සෑදීම: න්යෂ්ටික ප්ලාස්ටික් වල ERK / MAP කිනාස් සංඥා වල භූමිකාව. නියෝන් 23: 11-14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3