Neuroscience. 2010. augusta 11; 169(1): 182-194. Publikované online 2010 May 7. doi: 10.1016 / j.neuroscience.2010.04.056
Friedbert Weiss,Loren H. Parsons,Gery Schulteis,Petri Hyytiä,Marge T. Lorang,Floyd E. BloomaGeorge F. Koob
+ Autorské príslušnosti
abstraktné
Bazálny predný mozog dopamín (DA) a 5-HT neurotransmisia sa podieľajú na sprostredkovaní akútnych zosilňujúcich účinkov etanolu. Teórie neuroadaptácie predpovedajú, že kompenzačné zmeny v neurochemických systémoch, ktoré sú akútne aktivované alkoholom, môžu byť základom príznakov abstinencie po chronickom podaní. Na testovanie tejto hypotézy sa uvoľňovanie DA a 5-HT sledovalo mikrodialýzou v nucleus accumbens závislých samcov potkanov Wistar na konci 3 - 5 týždňového režimu s obsahom etanolu (8.7% hmotn./obj.) Počas 8 hodín. odobratia a počas obnovenej dostupnosti etanolu, ktorá zahŕňa (1) možnosť operatívneho podávania etanolu (10% hmotn./obj.) po dobu 60 minút, po ktorom nasleduje (2) neobmedzený prístup k diétnej zmesi etanolu. Výsledky boli porovnané s kontrolnými skupinami, ktoré boli kŕmené tekutou stravou bez obsahu etanolu a boli trénované na samostatné podávanie buď etanolu alebo vody. U nezávislých potkanov operačné podávanie etanolu zvýšilo uvoľňovanie DA aj 5-HT v NAC. Odstúpenie od chronickej etanolovej diéty viedlo k postupnému potlačeniu uvoľňovania týchto vysielačov počas 8 hodinovej ochrannej doby. Samočinné podávanie etanolu obnovilo a udržalo uvoľňovanie DA na úrovniach pred odobratím, ale nepodarilo sa mu úplne obnoviť eflux 5-HT. Hladiny 5-HT sa však rýchlo zotavili do 1 hodiny od opätovného vystavenia pôsobeniu etanolovej tekutej stravy. Tieto objavy naznačujú, že deficity v uvoľňovaní monoamínov vumbumbalu môžu prispievať k negatívnym afektívnym dôsledkom odňatia etanolu, a tým motivovať správanie závislých od etanolu.
Zneužívanie alkoholu a závislosť od ich lekárskych a sociálnych patológií patria medzi najväčšie problémy so zneužívaním návykových látok v USA a vo svete (Nelson a Stussman, 1994;Greenfield a Weisner, 1995; Rice a Harris, 1995). Alkohol má anxiolytické a euphorigénne účinky a predpokladá sa, že tieto vlastnosti prispievajú k akútnemu posilňovaciemu účinku alkoholu, ktorý môže viesť k ďalšiemu používaniu a nakoniec k vážnemu zneužívaniu a závislosti u citlivých jedincov. V posledných rokoch sa dosiahol významný pokrok v oblasti identifikácie neurotransmiterových a receptorových systémov, ktoré sa podieľajú na sprostredkovaní akútnych zosilňujúcich účinkov etanolu (pozri prehľad Gianoulakis, 1989; Hoffman a kol., 1990; Samson, 1992; Sellers a kol., 1992; Froehlich a Li, 1993; Hunt, 1993; Grant, 1994; Tabakoff a Hoffman, 1996; Mihic a Harris, 1995).
Medzi početnými neurotransmiterovými systémami, ktoré sa podieľajú na farmakologických účinkoch alkoholu, dopamínu (DA) a 5-HT sa venovala osobitná pozornosť z dôvodu ich predpokladanej úlohy v motivačných účinkoch etanolu (Cloninger, 1987; McBride a spol., 1991;Engel a kol., 1992; Samson, 1992; Sellers a kol., 1992). V prípade DA, presvedčivé elektrofyziologické (Gessa a spol., 1985; Brodie a kol., 1990), neurochemické (Imperato a DiChiara, 1986; Wozniak a kol., 1991; Yoshimoto a kol., 1991; Engel a kol., 1992) a správania (Imperato a DiChiara, 1986; Waller a kol., 1986) dôkazy naznačujú, že behaviorálne relevantné dávky etanolu aktivujú mezolimbickú DA odmenu. Priamy dôkaz o úlohe DA pri odmeňovaní etanolu pochádza zo zistení, že operatívne samostatne podávaný etanol stimuluje uvoľňovanie DA v NAC (Weiss a kol., 1993), že potkany si sami podajú etanol priamo do oblasti ventrálneho tegmentálneho bunkového tela meso-accumbens DA odmeňovacej dráhy (Gatto a kol., 1994) a že operatívna reakcia na etanol je modifikovaná farmakologickými činidlami, ktoré interagujú s DA neurotransmisiou (McBride a spol., 1990;Samson a kol., 1991; Hodge a kol., 1993; Rassnick a kol., 1993). Napokon, preferencia alkoholu v genetických modeloch alkoholizmu súvisí so zníženým obsahom DA v NAC (Murphy a kol., 1982; Murphy a kol., 1987; Gongwer a kol., 1989), ako aj zvýšená citlivosť na účinky DA zvyšujúce uvoľňovanie a lokomotorický aktivačný účinok etanolu (Waller a kol., 1986; Cloninger, 1987; Fadda a kol., 1989; Engel a kol., 1992; Weiss a kol., 1993).
Existujú dostatočné dôkazy o účasti 5-HT v etanole zameranom správaní. Etanol v závislosti od dávky zvyšuje uvoľňovanie 5-HT v NAC (Yoshimoto a kol., 1992), zatiaľ čo farmakologická liečba, ktorá zvyšuje synaptickú dostupnosť 5-HT, alebo priama aktivácia prenosu 5-HT receptorovými agonistami, potláča dobrovoľný príjem etanolu u zvierat (pozri prehľad Sellers a kol., 1992; LeMarquand a kol., 1994) a môže znížiť spotrebu alkoholu u ľudí (\ tNaranjo a kol., 1984, 1987, 1989, 1990; Gorelick, 1989; Monti a Alterwain, 1991). Serotonergnú úlohu pri zneužívaní etanolu podporujú aj zistenia výrazných nedostatkov v obsahu predného mozgu 5-HT, zníženej inervácie 5-HT alebo upregulácii receptorov 5-HT1A v geneticky vybraných, líniách preferujúcich alkohol (Murphy a kol., 1982, 1987;Yoshimoto a kol., 1985; Yoshimoto a Komura, 1987; Gongwer a kol., 1989; McBride a spol., 1990, 1994). Subjektívne účinky etanolu závisia aspoň čiastočne na neurotransmisii 5-HT, pretože agonisty receptora 5-HT1A nahrádzajú (Značky a Schechter, 1988; Grant a Colombo, 1993; Krystal a kol., 1994), zatiaľ čo antagonisti 5-HT3 blokujú diskriminačné stimulačné vlastnosti etanolu (Grant a Barrett, 1991).
Doteraz sa veľká väčšina štúdií na neurofarmakologickom základe posilňovania etanolu udržiavala na nezávislých zvieratách. Pochopenie mechanizmov zachovávajúcich zneužívanie etanolu si však vyžaduje aj pochopenie biologického základu posilňovania etanolu v závislých subjektoch. Bolo navrhnuté, že rozvoj závislosti zahŕňa adaptácie na bunkovej alebo molekulárnej úrovni, ktoré sú proti farmakologickým účinkom látok zneužívania a tým vedú k vzniku abstinenčných príznakov, ktoré by mohli motivovať k pokračujúcej konzumácii lieku (Koob a Bloom, 1988). Vzhľadom na predchádzajúce dôkazy, že etanol stimuluje uvoľňovanie DA aj 5-HT v NAC (Imperato a DiChiara, 1986; Wozniak a kol., 1991; Yoshimoto a kol., 1992; Weiss a kol., 1993), táto hypotéza by predpovedala nedostatok pri uvoľňovaní týchto neurotransmiterov počas odoberania etanolu. Predĺženie tejto hypotézy by tiež predpovedalo reverziu neurochemických defektov vyvolaných abstinenciou po obnovenej expozícii etanolu. Na testovanie tejto hypotézy skúmali tieto experimenty účinky chronickej expozície etanolu a odobratia etanolu na uvoľňovanie DA a 5-HT v NAC s použitím intracerebrálnej mikrodialýzy, ako aj úlohu uvoľňovania akumulovaného monoamínu v posilňovaní udržiavanom etanolom v závislom prostredí. krysy.
MATERIÁLY A METÓDY
Predmety
Použili sa samce potkanov Wistar (Charles River) s hmotnosťou 400-600 gm v čase testovania. Potkany boli chované v skupinách po dvoch alebo troch vo viváriu kontrolovanom vlhkosťou a teplotou (22 ° C) na cykle 12 / 12 hr svetlo / tma (na 05: 00, mimo 17: 00) s prístupom k potrave ad libitum. voda. Všetky procedúry boli vykonávané v prísnom súlade s National Institutes of Health Guide pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat.
Prístroje na testovanie správania
Školenie s etanolom a mikrodialýza sa uskutočňovali v štandardných operačných komorách (Coulbourn Instruments, Allentown, PA) modifikovaných, ako je opísané vyššie (Weiss a kol., 1993) umožniť súčasnú prezentáciu dvoch rôznych kvapalných zosilňovačov a umiestniť komponenty systému na premenu na mikrodialýzu. Krátko, prevádzkové komory boli vybavené dvoma zaťahovacími páčkami. Výsledkom odpovedí na príslušné operandum bolo predloženie buď 0.1 ml roztoku etanolu alebo vody do jednej z dvoch nádob (objemová kapacita 0.15 ml) umiestnených 4 cm nad podlahou mriežky a medzi pákami v strede prednej dosky operatívnej komory. Pracovné komory boli umiestnené v laboratórnej miestnosti na procedúry pripojenej k viváriu a boli uzavreté v zvukovo zoslabených, vetraných kabínach (Coulbourn Instruments, Allentown, PA). Dodávanie tekutín a zaznamenávanie správania sa riadili mikropočítačom.
Školenie o etanolovej samospráve
Potkany boli vyškolené na to, aby si sami podávali etanol alebo vodu po dvojpákovej operácii s voľnou voľbou pomocou modifikovanej (Weiss a Koob, 1991) postup úniku sladkého roztoku (\ tSamson, 1986). Potkany sa najskôr umiestnili do 22-hodinového harmonogramu deprivácie vody (obmedzeného na dva po sebe nasledujúce dni) a trénovali sa v denných 30-minútových sedeniach, aby odpovedali na ktorúkoľvek z dvoch pák pre 0.2% (hmotn./obj.) Roztok sacharínu podľa harmonogramu kontinuálneho posilňovania. Po úspešnom získaní odpovede operantov bola voda opäť sprístupnená ad libitum v domácej klietke. Nasledujúcich 6 dní viedlo reagovanie pomocou jedinej dostupnej páky k dodaniu 0.1 ml roztoku etanolu (5%) / sacharínu (0.2%). Zvieratá sa potom trénovali podľa súbežného rozvrhu, v ktorom každé stlačenie jednou pákou viedlo k dodaniu roztoku etanolu / sacharínu, zatiaľ čo odpovede druhej páky vyústili do prezentácie vody v rovnakom objeme (0.1 ml). Počas nasledujúceho tréningu boli koncentrácie etanolu postupne zvyšované na 10% (hmotn./obj.), Zatiaľ čo koncentrácia sacharínu bola pomaly znižovaná, po čom nasledovalo úplné vylúčenie sladidla z pitného roztoku. Po dokončení tejto fázy blednutia sladkého roztoku, ktorá trvala 19 dní, pokračovalo samoobslužné sedenie ďalších 16–21 dní, kým neboli pozorované stabilné hladiny príjmu etanolu (10% hm./obj.). Celý výcvik a testovanie podľa vlastného výberu sa uskutočňovalo bez obmedzení týkajúcich sa stravovania alebo tekutín.
Na kontrolu účinkov jednoduchej expozície operanta na uvoľňovanie neurotransmiterov sa pripravili aj potkany, ktoré neboli na etanol zvyknuté v testovacom prostredí. Na zaistenie operatívnej histórie porovnateľnej s históriou potkanov, ktoré si samy sami podávajú etanol, sa týmto kontrolným zvieratám najskôr nasadil 22-hodinový rozvrh obmedzovania tekutín (obmedzený na dva po sebe nasledujúce dni), ale boli vyškolení na stlačenie iba pre vodu. Po získaní odpovede operenta bola voda znovu sprístupnená ad libitum v domácej klietke, ale potkany naďalej dostávali každý deň 30 minút prístup k vode v komorách pre samopodávanie. V súlade s predchádzajúcimi výsledkami (Weiss a kol., 1993), tieto zvieratá prestali reagovať na vodu pri značných rýchlostiach bez ďalšej deprivácie, čím poskytli vhodnú „nemotivovanú“ kontrolnú skupinu.
Stereotaxická chirurgia
Len čo sa dosiahli stabilné hladiny samopodania etanolu, potkanom sa stereotaxicky implantovali na prebudenú mikrodialýzu chronicky zavedenou vodiacou kanylou z nehrdzavejúcej ocele zameranou na NAC v anestézii halotánom (1.0 - 1.5%). Vodiace kanyly (C313CS, Plastics One, Roanoke, VA) sa jednostranne znížili na 2.0 mm nad dorzálnu hranicu miesta dialýzy a zaistili sa pomocou lebiek z nehrdzavejúcej ocele a zubným cementom. S odkazom na bregmu boli súradnice predné +1.3, stredné ± 1.6 a ventrálne -4.2 podľa atlasu (Paxinos a Watson, 1986). Pomocou mikrodialyzačných sond s 2.0 mm aktívnymi membránovými hrotmi (vyčnievajúcich za vodiacu kanylu) sa miesta dialýzy nachádzali medzi ventrálnymi súradnicami -6.2 a -8.2.
Indukcia závislosti od etanolu: tekutá strava
Počnúc 4 d po chirurgickom zákroku sa zotavenie z reakcie na etanol overilo obnovením denných 30 minútových etanolových samoobslužných sedení. Keď sa znova pozorovali stabilné hladiny príjmu, u potkanov sa urobila závislosť od etanolu pomocou metódy tekutej stravy (Lochry a Riley, 1980). Podrobnosti o postupe kvapalnej stravy prispôsobenom v tomto laboratóriu boli uvedené predtým (Rassnick a kol., 1992). Stručne povedané, etanolová diéta bola pripravená čerstvá denne (9: 00 na 10: 00 AM) doplnením čokoládovej príchute Sustacal, nutrične kompletnej kvapalnej potravy (Mead Johnson, Inc.) s etanolom (95% w / v), vitamínom minerálna zmes (ICN Nutritional Biochemicals) a voda na vytvorenie kvapalnej diéty s obsahom etanolu (8.7% w / v), ktorá poskytuje približne 35% kalórií pochádzajúcich z etanolu (Lochry a Riley, 1980). Tento postup typicky vytvoril koncentrácie etanolu v krvi (BAC) v rozmedzí od 80 do 180 mg% v podobnej predchádzajúcej práci v našom laboratóriu (Merlo Pich a kol., 1995; Schulteis a kol., 1996). Kontrolným potkanom sa podávala diikarikátová zmes neobsahujúca etanol obsahujúca sacharózu. Na udržanie kalorického príjmu a telesnej hmotnosti u potkanov udržiavaných na kontrolnej strave, ktorá je rovnaká ako u potkanov vystavených etanolu, sa použil postup párového kŕmenia, pri ktorom zvieratá dostávajúce etanolovú diétu dostali neobmedzený prístup, zatiaľ čo kontrolná strava bola podávaná v obmedzených množstvách každý deň ( Podrobnosti nájdete v časti Schulteis a kol., 1996).
Intrakraniálna mikrodialýza
Perfúzny systém. Doteraz opísaný perfúzny systém (Weiss a kol., 1993) modifikované tak, aby vyhovovali metódamParsons and Justice (1992) bol použitý. Stručne, vstupné a výstupné hadičky na dialýzu pozostávali z taveného oxidu kremičitého (40 μm id) a boli chránené vo vnútri pružného pružného krytu konektora kanyly (C313CS, Plastics One, Roanoke, VA). Vstupná hadička na dialýzu bola vedená z perfúzneho čerpadla do mikrodialyzačnej sondy dvojkanálovým otočným čidlom kvapaliny (Instech, Plymouth Meeting, PA), umiestneným nad stredom klietky pomocou vyvažovacej páky. Prívodná hadica bola pripojená pomocou otočného čapíka k 1 ml Hamiltonovej striekačke obsahujúcej ako perfúzne médium umelý CSF (aCSF). Perfúzne médium bolo dodávané bezdušovou injekčnou pumpou (CMA / 100; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN). Dialyzát sa manuálne zbieral do 250 ul mikrofrakčných liekoviek. Vzorky sa okamžite zmrazili na suchom ľade a až do testu sa skladovali pri -70 ° C.
Materiály a všeobecné postupy. Intracerebrálne vodiace kanyly a koncentrické mikrodialyzačné sondy (vonkajší priemer: 300 μm; materiál membrány, regenerovaná celulóza; dĺžka, 2 mm) boli skonštruované podľa popisu v Parsons and Justice (1992). Sondy sa premývali aCSF rýchlosťou 0.2 ul / min a pomaly sa zavádzali v krátkej plytkej anestézii halotánom (<5 min) 16 hodín pred začiatkom testovania a odberu dialyzátu. [Päť zvierat bolo testovaných s komerčne dostupnými mikrodialyzačnými sondami (CMA / 10; Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN) perfundované prietokovou rýchlosťou 0.5 μl / min.] Na zvyknutie si na laboratórne postupy pri mikrodialýze boli potkany naviazané na zvieratá neaktívny perfúzny systém (bez vloženia mikrodialyzačných sond) do domácej klietky asi 2 týždne pred testovaním.
Perfúzne médium. ACSF pozostávajúci zo 149 mm NaCl, 2.8 mm KCI, 1.2 mm CaCl2, 1.2 mm MgCl2 a 5.4 mm dbola použitá glukóza (pH 7.2–7.4). Kyselina askorbová sa pridala ako antioxidant v koncentrácii (0.25 m.)m) podobné ako v striatálnom extracelulárnom priestore.
Experimentálny návrh a postupy
Účinky chronickej etanolovej expozície (DEPENDENT), abstinenčného stavu a následného vlastného podávania na extracelulárne hladiny DA a 5-HT (merané konvenčnou mikrodialýzou) sa porovnávali s dvomi kontrolnými stavmi, ktoré sa skladali z potkanov (1) „etanol-aklimatizovaných“ potkanov. s rovnakou anamnézou školenia o etanolovom podávaní, ale nie sú závislé od etanolu (NONDEPENDENT), a (2) potkanov, ktorí neboli vystavení etanolu, vyškolení len na podávanie vody (ETHANOL-NAIVE). Aby sa zabezpečilo podobné rozdelenie príjmu etanolu v dvoch experimentálnych skupinách vystavených etanolu, iba potkany so stabilnou rýchlosťou príjmu etanolu (± 10% počas troch po sebe nasledujúcich dní na konci tréningu s podávaním samého seba) najmenej 0.5 gm / kg / 30 min. relácie boli zahrnuté do experimentu. Potkany, ktoré splnili toto kritérium výberu, boli potom čo najviac porovnané na základe ich východiskového príjmu etanolu pred ich zaradením do NENDEPENDENT a DEPENDENT podmienok. Tri skupiny potkanov sa udržiavali na etanole (DEPENDENT) alebo kontrolných tekutých stravách (NONDEPENDENT a ETHANOL-NAIVE) ako jediný zdroj výživy a tekutín. Trvanie expozície tekutej strave bolo 3–5 týždňov (priemerný ± SEM počet dní: 26.95 ± 2.19) pre ZÁVISLÉ a NEZÁVISLÉ potkany a 2–3 týždne (16.84 ± 1.65 d) v skupine ETHANOL-NAIVE. Počas tejto doby sa neuskutočnili žiadne operačné sedenia a potkany zostali uzavreté v domácich klietkach. Monitorovanie extracelulárnych koncentrácií DA a 5-HT v NAC mikrodialýzou sa začalo v domácich klietkach potkanov počas posledných 2 hodín vystavenia tekutej diéte s obsahom etanolu (alebo zodpovedajúcej časovej periódy u nezávislých a bez etanolu potkanov) a pokračovalo počas ďalších etáp stiahnutia a samopodávania. Odobratie etanolu sa potom vyzrážalo substitúciou kontrolnej tekutej stravy diétou obsahujúcou etanol (40 ml) počas 8 hodín. Aby sa čo najviac vyrovnalo množstvo kontrolnej diéty spotrebovanej tromi liečebnými skupinami v deň testovania, potkanom NONDEPENDENT a ETHANOL-NAIVE sa podalo obmedzené množstvo diéty, aby sa paralelne znížili množstvá diéty konzumované potkanmi DEPENDENT. Konkrétne medzi časom zavedenia mikrodialyzačných sond (v noci pred experimentom) a začiatkom fázy „vysadenia“ dostali potkany NEDEPENDENT a ETHANOL-NAIVE 70 ml kontrolnej stravy, čo zodpovedá priemernému množstvu konzumovanej etanolovej stravy. ZÁVISLÝMI potkanmi. Na začiatku abstinenčnej fázy dostali skupiny ETHANOL-NAIVE a NEZÁVISLÉ ďalšie 40 ml kontrolnej stravy, čo zodpovedá množstvu danému DEPENDENT potkanom. Všetky potkany konzumovali väčšinu kontrolnej diéty do konca fázy vysadenia a medzi skupinami neboli zrejmé rozdiely v množstve konzumovanej stravy. Po 4–6 hodinách stiahnutia boli potkany premiestnené vo svojich domovských klietkach z vivária do laboratórnej miestnosti obsahujúcej stanice pre samopodanie, kde zostali vo svojich domovských klietkach až 8 hodín po etanole. Hunter a kol., 1974; Rassnick a kol., 1992; Schulteis a kol., 1996). V tomto okamihu boli zvieratá umiestnené do komôr pre operátorov a bola im poskytnutá možnosť na 10 minút samostatne podať 60% (hmotn./obj.) Etanolu (ZÁVISLÉ a NEZÁVISLÉ) alebo vody (ETHANOL-NAÍVNE). Tridsať minút po skončení samosprávy sa potkany vrátili do svojich domácich klietok, kde dostali neobmedzený prístup k príslušnej strave. Testy sa uskutočňovali v rovnakom čase (6:00 - 10:00) u všetkých potkanov. V priebehu celého experimentu sa dialyzát zbieral v 20-minútových intervaloch s výnimkou operatívneho samopodania etanolu, keď sa odber vzoriek uskutočňoval v 10-minútových intervaloch.
HPLC monoamínové testy
Koncentrácie DA a 5-HT dialyzátu sa stanovili súčasne v každej vzorke pomocou mikrobórovej HPLC na reverznej fáze. Dialyzát sa injektoval na 5 μm ODS-2 kolónu (0.5 x 100 mm; balené v dome) pomocou vysokotlakého ventilu VALCO vybaveného vnútornou slučkou s objemom 1.0 ul. Mobilná fáza pozostávala z kyseliny citrónovej (0.02%) m) / fosforečnan sodný (monobázický, 0.04.) m) pufor obsahujúci 0.82 mm Kyselina 1-dekánsulfónová ako činidlo na párovanie iónov, 4.9 minm trietylamín, 0.2 mm Na2EDTA a 19% metanolu (zdanlivé pH 5.4). Mobilná fáza bola prečerpávaná kolónou pomocou HPLC injekčnej pumpy ISCO (model 500) HPLC rýchlosťou 16 ul / min. Analyty sa detegovali elektrochemicky pomocou amperometrického regulátora EG&G Princeton Applied Research [(PARC) model 400], pracovnej elektródy zo skleného uhlíka (PARC, model MP 1304) a referenčnej elektródy Ag / AgCl (BAS, model RE1). Použitý potenciál bol 700 mV (proti Ag / AgCl). Detekčné limity definované pomerom signál: šum> 2 boli 0.5 nm pre DA aj 5-HT.
Stanovenie alkoholu v krvi
BAC sa merali raz u každého potkana 3 – 4 d po postexperimentálnej reexpozícii etanolovej diéte. BAC boli stanovenépo dokončenie experimentov iba z dôvodu možnosti zavedenia artefaktov na uvoľňovanie neurotransmiterov postupmi odberu krvi počas testovania na mikrodialýze. Vzorka 0.1 ml krvi sa získala metódou krvácania z chvosta medzi 12:00 a 2:00. Krv sa odobrala do zatavených liekoviek Eppendorf obsahujúcich 4 μl heparínu (1000 3200 USp jednotiek / ml) ako antikoagulantu a centrifugovala pri XNUMX ot./min. . Sérum bolo extrahované kyselinou trichlóroctovou a analyzované na obsah etanolu pomocou spektrofotometrickej metódy enzýmu NAD-NADH (Sigma, St. Louis, MO).
histológia
Miesta na mikrodialýzu sa po ukončení experimentov histologicky skúmali. Mozgy boli odstránené po usmrtení 5% halotánom a uložené v 10% formaldehyde. Umiestnenie sondy v NAC sa následne overilo z 50 μm zmrazených rezov sfarbených kresylovou fialovou farbou. Vo všetkých vyšetrovaných prípadoch bolo najmenej 80% aktívnej časti dialyzačnej membrány lokalizovaných v anatomických hraniciach NAC (obr. 1).
Anatomické umiestnenie mikrodialyzačných sond.Vertikálne značky predstavujú „aktívne“ oblasti dialýzových membrán. Všetky umiestnenia sondy boli distribuované medzi 1.20 a 2.20 mm vpredu a 0.80–1.80 mm bočne od bregmy.
Analýza dát
Rozdiely v koncentráciách neurotransmiterov dialyzátu medzi skupinami DEPENDENT, NDDENDENDENT a ETHANOL-NAIVE sa analyzovali zmiešanými faktoriálovými analýzami (skupiny × intervaly vzorkovania) ANOVA použitím samostatných analýz pre DA a 5-HT. Frakcie dialyzátu zhromaždené počas fázy operatívneho samopodávania sa analyzovali na rozdiely v koncentráciách monoamínu v porovnaní s poslednými tromi vzorkami ochrannej periódy a na zmeny „percenta základnej hodnoty“ oproti priemerným koncentráciám DA a 5-HT počas poslednej hodiny odoberania. . Po potvrdení významných hlavných účinkov alebo interakcií v celkových ANOVA sa rozdiely medzi jednotlivými prostriedkami stanovili post-hoc testami Simple Effects ANOVA a Duncan's Multiple Range post hoc. Údaje o samopodávaní etanolu u potkanov DEPENDENT a NONDENDENDENT sa analyzovali na rozdiely v príjme etanolu pomocou obojstrannej Studentovej štúdie.t test.
VÝSLEDKY
Samostatné podávanie etanolu a pozorovania správania
Vzdelávanie operatívnej samosprávy
Štyridsaťtri potkanov sa podrobilo samoliečivému školiacemu postupu etanolu, ktorý stráca cukor. Rovnako ako v predchádzajúcej práci (Weiss a kol., 1990; Weiss a kol., 1993), u väčšiny zvierat sa vyvinuli stabilné dávky etanolového vlastného podávania s denným príjmom dostatočným na produkciu farmakologicky relevantných BAC. Potkany, u ktorých sa nedosiahol významný alebo spoľahlivý denný príjem etanolu (n = 11) boli vylúčení z ďalšieho vzdelávania a testovania. Priemerná ± SEM 30 min. Spotreba etanolu na konci tréningu samostatnej aplikácie bola 0.72 ± 0.10 gm / kg u potkanov, ktorým sa následne pridelila ZÁVISLÁ (n = 11) a 0.68 ± 0.05 gm / kg u potkanov zaradených do NEZÁVISLÉHO (n = 10) skupina. Spotreba vody bola rôzna, ale v priemere zostala pod 40% príjmu etanolu. Všetky potkany ETHANOL-NAÍVNE (n = 11) kontrolná skupina úspešne získala odpoveď na vodu, ale prestala reagovať v neprítomnosti pokračujúcej deprivácie vody počas základného štádia.
Tekutá strava
Denná spotreba tekutín na začiatku režimu tekutej stravy sa pohybovala od približne 70 do 80 ml / d, čo zodpovedá denným dávkam etanolu 6.1–7.0 g. Príjem stravy sa v priebehu 3–5 týždňov liečby zvýšil na 100–120 ml / d (čo zodpovedá 8.7–10.4 g etanolu). Priemerné ± SEM koncentrácie alkoholu v krvi 3. alebo 4. deň po opakovanej expozícii etanolovej diéte, merané medzi 2 a 3 hodinami po doplnení pitných fliaš čerstvou tekutou stravou, boli 98.0 ± 21.7 mg%. Na konci vystavenia tekutej strave neboli zaznamenané signifikantné rozdiely v priemerných ± SEM telesných hmotnostiach medzi ZÁVISLÝMI (549.9 ± 20.4 gm), párovo kŕmenými NEZÁVISLÝMI (503.8 ± 5.4 gm) a kontrolnou diétou párovo kŕmenou ETHANOL-NAIVE (463.5 ± 32.3 g) skupiny (F (2,29) = 3.37; NS).
Odstránenie etanolu
Pozorovanie správania po odstránení etanolovej diéty potvrdilo prítomnosť mierneho abstinenčného syndrómu podobného syndrómu popísanému v inej práci s použitím podobných postupov tekutej diéty na vyvolanie závislosti od etanolu (Hunter a kol., 1974; Merlo Pich a kol., 1995; Schulteis a kol., 1996). Hoci neboli použité žiadne špecifické kvantitatívne opatrenia, pozorované príznaky z vysadenia zahŕňali hyperreaktivitu, príležitostný tremor alebo stuhnutosť chvosta.
Účinky chronického etanolu na bazálne hladiny neurotransmiterov
Hoci DA a 5-HT boli monitorované súčasne u tých istých zvierat, v niektorých prípadoch zostali bazálne hladiny jedného alebo oboch analytov pod hranicou detekcie. V dôsledku toho údaje pre DA neboli dostupné pre dve potkany v každej zo skupín DEPENDENT, NONDEPENDENT a ETHANOL-NAIVE, zatiaľ čo údaje 5-HT neboli dostupné pre tri zvieratá, z ktorých dve boli prítomní, dvaja NEZÁVISLÍ a tri zvieratá užívajúce etanol. Výsledné veľkosti vzoriek boli n = 9/8 (DA / 5-HT) v ZÁVISLOM, n = 8/8 (DA / 5-HT) v NEZÁVISLOM an = 9/8 (DA / 5-HT) v ETHANOL-NAIVE skupinách.
Priemerné koncentrácie ± SEM bazálneho neurotransmiteru dialyzátu namerané počas posledných 2 hodín vystavenia kontrolnej tekutej strave u potkanov ETHANOL-NAIVE boli 3.45 ± 0.64 nm pre DA a 1.15 ± 0.22 nm pre 5-HT. V porovnaní s kontrolnou skupinou liecenou ETHANOL-NAIVE boli hladiny DA bazálneho dialyzátu v podstate nezmenené u ZÁVISLÝCH potkanov s hodnotami 3.90 ± 0.68 nm. Naopak, koncentrácie 5-HT v dialýze boli u týchto zvierat výrazne zvýšené na 1.78 ± 0.28 nm (pozri obr. 3). Štatistická analýza potvrdila, že eflux 5-HT u potkanov DEPENDENT bol významne vyšší ako u ETHANOL-NAIVE (p <0.05) a NEZÁVISLÝ (p <0.05) zvieratá (Duncan po ANOVA:F (2,21) = 3.98; p <0.03).
Dopamín (top) a serotonínu (\ tspodnej) výtok počas poslednej hodiny vystavenia pôsobeniu tekutej etanolovej diéty (ZÁVISLÁ) alebo ekvivalentnej kontrolnej diéty (NEZÁVISLÁ a ETHANOL-NAIVE) a nasledujúcich 8 hodín ochranná lehota. Údaje sú uvedené ako priemer ± SEM percentá bazálnych hodnôt v súboroch troch po sebe nasledujúcich 20 minút vzorkách odobratých v 2 hodinových intervaloch [*p <0.01; odlišné od bazálnych (čas 0) úrovní]. vložky, Priemer ± SEM DA (top) a 5-HT (spodnej) koncentrácie dialyzátov v potkanoch s výskytom, dávke a ETANOL-NAIVE. Údaje o koncentrácii zodpovedajú východiskovým hodnotám pred odberom (čas 0) a 7 – 8 hr bodov odberu percent vyššie uvedených základných údajov. Odstúpenie etanolu bolo spojené s výrazným znížením hladín dialyzátov DA aj 5-HT [*F (1,23) = 23.02, p <0.001; **F (1,21) = 13.46, p <0.0001. Líši sa od príslušnej ZÁVISLEJ východiskovej hodnoty pred odberom (BSL); jednoduché efekty ANOVA]. Všimnite si tiež pretrvávajúce zvýšenie bazálneho výstupu DA u NEZÁVISLÝCH potkanov aklimatizovaných etanolom [+ p <0.05; sa líši od východiskovej hodnoty ZÁVISLÉHO a ETHANOL-NAÍVNEHO (BSL)].
Zatiaľ čo medzi krysami závislými a etanolom naivnými neboli žiadne rozdiely v hladinách DA bazálneho dialyzátu, tok DA bol u potkanov zo skupiny NEZÁVISLÝCH podstatne zvýšený na 6.21 ± 0.72 nm (F (2,23) = 4.76;p <0.02). Hladiny DA v dialýze boli v tejto skupine signifikantne vyššie ako u oboch ZÁVISLÝCH (p <0.05) a NAUTNÉ NA ETANOL (p <0.05) potkany. V priemerných ± SEM bazálnych 5-HT koncentráciách NEZÁVISLÝCH potkanov sa nezistili žiadne rozdiely od kontrolných skupín NAHORUJÚCICH ETHANOLOM, čo bolo 0.97 ± 0.11 nm (Obr. 2).
top, Priemerné ± SEM dialyzátové koncentrácie dopamínu monitorované mikrodialýzou v nucleus accumbens ZÁVISLÝCH potkanov po expozícii chronickej etanolovej tekutej strave, NEDÁVAJÚCICH, ale etanolom vystavených potkanov a kontrolných zvierat ETHANOL. U závislých potkanov sa nepozorovali žiadne rozdiely v bazálnom výdaji dopamínu u potkanov, ktoré doteraz neboli etanolom. Bazálne uvoľňovanie dopamínu však bolo podstatne zvýšené u nesamostatných potkanov, ktorí boli vystavení obmedzenému prístupu k etanolu počas nácviku samostatného podávania (*p <0.05; líši sa od skupín ETA-NAÍVNYCH a ZÁVISLÝCH). dnoKoncentrácie dialyzovaného serotonínu u potkanov DEPENDENT, NONDEPENDENT a ETHANOL-NAIVE. Základný eflux 5-HT bol signifikantne zvýšený u potkanov závislých od etanolu (*).p <0.05; odlišné od etanolovo-naívnych a NEZÁVISLÝCH potkanov).
Zmeny indukované v hladinách DA a 5-HT
Odber etanolu bol spojený s progresívnym poklesom hladín dialyzátu ako DA, tak aj 5-HT počas celého obdobia odňatia. Osem hodín po etanole sa priemerné hladiny ± SEM DA znížili z 3.9 ± 0.68 nm na 2.31 ± 0.48 nm alebo 64.2 ± 8.4% bazálnych hladín pred odberom. Podobné potlačenie nastalo pri 5-HT efluxe, ktorý sa znížil z 1.78 ± 0.26 nm na 0.89 ± 0.15 nm alebo 55.1 ± 10.6% koncentrácií pred odberom. Tieto údaje sú zhrnuté na obrázku 3, ktorý ilustruje aj to, že hladiny DA a 5-HT zostali v tomto období nezmenené v skupinách ETANOL-NAIVE a NONDEPENDENT. Potlačenie uvoľňovania neurotransmiterom indukované abstinenciou bolo potvrdené signifikantnými interakciami medzi liečebnými skupinami a časom odberu vzoriek pre koncentrácie dialyzátu (DA:F (8,92) = 5.86; p <0.0001; 5-HT: F (8,84) = 9.02; p <0.00001) a percento základných hodnôt pred odobratím (DA:F (8,92) = 5.93; p <0.0001; 5-HT: F (8,84) = 4.28; p <0.0002). Následná analýza jednoduchých účinkov (čas vzorkovania) potvrdila významné zníženie koncentrácií dialyzátu (DAF (4,92) = 16.12; p <0.0001; 5-HT: F (4,84) = 23.38; p <0.0001) a percento základných hladín (DAF (4,92) = 16.03; p <0.0001; 5-HT: F (4,84) = 9.67; p <0.0001) v priebehu času v ZÁVISLÝCH, ale nie v NEZÁVISLÝCH alebo ETHANOL-NAÍVNYCH skupinách.
Účinky etanolového podávania na uvoľňovanie DA a 5-HT
Operatívna samospráva
Priemerné ± SEM 60-minútové objemy a množstvá operatívne podávaného etanolu na konci 8-hodinovej ochrannej periódy boli u závislých potkanov 5.55 ± 0.78 ml alebo 0.95 ± 0.14 gm / kg. Príjem etanolu v tejto skupine výrazne prevyšoval príjem u nezávislých potkanov nezávislej skupiny závislej od etanolu, ktorá bola 2.90 ± 0.55 ml alebo 0.57 ± 0.10 gm / kg (obr. 4). Vyššia spotreba etanolu v DEPENDENTE oproti skupine NONDEPENDENT bola potvrdená štatistickou analýzou (t 19 = 2.25;p <0.05).
Príjem alkoholu počas 60 minút trvajúcej relácie samostatnej správy v (ZÁVISLÉ, n = 10) a (NEZÁVISLÉ, n = 11) potkany merané 8 hodín po odstránení etanolu alebo kontrolnej tekutej stravy. Množstvo alkoholu, ktoré si podávali sami počas abstinenčného testu, bolo významne väčšie u závislých ako u nezávislých potkanov (*p <0.05; signifikantne odlišné od nezávislých potkanov, Student t test).
U niektorých zvierat bol na začiatku samopodania detekovateľný iba jeden z dvoch neurotransmiterov. Skupina DEPENDENT (origináln = 11) zahŕňali tri potkany, pre ktoré boli na štatistické porovnanie k dispozícii údaje buď o DA, alebo o 5-HT, ale nie o oboch analytoch. Priemerná spotreba alkoholu v „skupinách“ DA a 5-HT „vyplývajúca z„ asymetrie “v detekovateľnosti dvoch vysielačov bola rovnaká počas 1 h relácie (DA: 0.93 ± 0.44 gm / kg; 5-HT: 0.95 ± 0.18 gm / kg), aj keď v čase bol rozdiel v distribúcii príjmu etanolu (obr. 5 E). V skupine NONDEPENDENT (originál n = 10), hladiny DA boli pod detekčným limitom u troch a 5-HT koncentrácie u štyroch zvierat. Medzi krysami, ktoré neboli etanolom aktívne (pôvodné n = 11), DA nebol zistiteľný u dvoch, zatiaľ čo 5-HT zostal nedetegovateľný u troch zvierat. Výsledné veľkosti vzorky pre túto časť experimentu boli nasledujúce: ZÁVISLÉ (DA / 5-HT: n = 8/8), NEZÁVISLÝ (DA / 5-HT:n = 7/6), ETHANOL-NAIVE (DA / 5-HT: n = 9/8).
Účinky operatívneho samostatného podávania alkoholu u NONDEPENDENTNÝCH a DEPENDENTNÝCH potkanov podstupujúcich stiahnutie etanolu na DA a výtok 5-HT v nucleus accumbens. Hladiny neurotransmiterov dialyzátu sa porovnávajú s hladinami u potkanov ETHANOL-NAIVE, ktorí sú trénovaní na to, aby si sami podávali vodu. Priemerný príjem vody v tejto skupine bol zanedbateľný (<0.8 ml) a nie je uvedený. A, Zmeny vo výstupe neurotransmiterov z úrovní zaznamenaných počas poslednej hodiny odvykania. Dáta sú vyjadrené ako percento základných hodnôt vypočítaných ako priemer z troch 20 minútových vzoriek zhromaždených počas 8. hodiny odoberania uvedených v B-D, Zodpovedajúce koncentrácie dialyzovaných neurotransmiterov sú znázornené v B (Etanol-naivných), C (NONDEPENDENT) aD (Siete). Na ilustráciu zmien v efluxe neurotransmiterov v rôznych experimentálnych fázach, B-D zobraziť aj predvýber (BSL) a odňatia (WD) koncentrácie dialyzátu DA a 5-HT v priebehu 8. hodiny odberu. Prerušované čiary predstavujú stredné hodnoty ± SEM pred alebo bez koncentrácie dialyzátu DA alebo 5-HT. E„Množstvo samostatne podaného etanolu (10% hm./obj.) Počas 10-minútových intervalov pre ZÁVISLÉHO (tuhé tyče) a NEZÁVISLÉHO (otvorené tyče) skupiny. Samopodávanie etanolu u potkanov DEPENDENT obnovilo hladiny DA na hodnoty pred odberom. Naopak, etanolová samospráva nedokázala obnoviť koncentrácie 5-HT na úroveň pred odberom. Etanol však účinne obnovil uvoľňovanie 5-HT na hladiny porovnateľné s hladinami v kontrolnej skupine ETHANOL-NAIVE (pre štatistické porovnania pozri výsledky).
V dialyzátoch kontrolných potkanov ETHANOL-NAIVE neboli zaznamenané žiadne signifikantné zmeny v koncentráciách DA alebo 5-HT, ktoré mali možnosť reagovať na vodu. Na rozdiel od toho, samodávkovanie etanolu spoľahlivo zvýšilo eflux DA a 5-HT (obr. 1). 5). U ZÁVISLÝCH potkanov podstupujúcich abstinenčné príznaky spôsobilo samopodanie etanolu 200 - 250% zvýšenie efluxu DA v porovnaní s abstinenčnými hladinami. V skutočnosti etanol obnovil odtok DA u týchto zvierat na úroveň pred odobratím počas prvých 10 minút po podaní. Navyše, po obnovení sa extracelulárne koncentrácie DA udržiavali na týchto úrovniach príjmom etanolu po zvyšok 1 h testu. Rýchle zvýšenie až do 145% úrovní vysadenia bolo zaznamenané aj pri efluxe 5-HT po nástupe samopodania u závislých potkanov. Avšak etanol nedokázal účinne obnoviť extracelulárne koncentrácie 5-HT na hodnoty zaznamenané pred odobratím. Účinky samopodania alkoholu na uvoľňovanie DA sa potvrdili významnými interakciami skupín × odberu času pre obe koncentrácie dialyzátu (F (20,210) = 2.45; p <0.001) a percento východiskových hladín (F (16,168) = 3.27; p <0.0001) a následnými ANOVA jednoduchých efektov zmien v priebehu času vzorkovania iba v ZÁVISLEJ skupine (koncentrácie dialyzátu: F (10,210) = 5.28;p <0.0001; percento základných údajov:F (10,210) = 4.32; p <0.0001). Alkoholom vyvolané zvýšenie výtoku 5-HT bolo podobne potvrdené významnými interakciami skupín × odberu času (koncentrácie dialyzátu: F (20,190) = 1.67;p <0.05) alebo hlavný účinok skupín (percento základných zmien: F (8,152) = 3.9; p <0.0005) v celkovej ANOVA, po ktorej nasleduje analýza jednoduchých účinkov času vzorkovania (koncentrácie dialyzátu:F (10,190) = 3.27; p <0.001; percento základnej čiary: F (8,152) = 3.59;p <0.001) u ZÁVISLÝCH potkanov.
Samotné podanie etanolu tiež spôsobilo prechodné zvýšenie priemerného ± SEM výtoku DA a 5-HT v NONDEPENDENT skupine dosahujúcej 130 ± 4.0% (DA) a 141 ± 25.2% (5-HT) základných hodnôt (obr.5 C). Tento účinok bol potvrdený analýzami jednoduchých účinkov po celkovej ANOVA (vyššie), ktoré ukázali spoľahlivé rozdiely v oboch koncentráciách dialyzátu (DA:F (2,210) = 4.32; p <0.0001) alebo percento základných údajov (5-HT: F (8,152) = 2.00; p <0.05) v priebehu času vzorkovania.
Opätovné zavedenie tekutej stravy
Po ukončení testu funkčného samopodania boli počas 1 hodiny skúmané účinky opätovného vystavenia účinkom diét obsahujúcich etanol a kontrolných tekutín u niekoľkých náhodne vybraných Závislých (n = 5) a NAETAOL (n = 7) potkany. Počas tejto doby obnovenej dostupnosti tekutej etanolovej stravy sa DA výtok trochu znížil z hladín dosiahnutých pri operatívnom podávaní, ktoré boli mierne (ale nevýznamne) zvýšené v porovnaní s východiskovou hodnotou pred odberom (obr. XNUMX). 6). Priemerná koncentrácia ± SEM dialyzátu DA počas prvej hodiny po prístupe k etanolovej diéte po stiahnutí (3.65 ± 0.71 n.m) sa významne odlišoval od hladín vysadenia (2.24 ± 0.74 nm; plánované porovnanie po celkovej ANOVA:F (3,39) = 5.24; p <0.01), ale zostali štatisticky nerozoznateľné od bazálnych hladín zaznamenaných u týchto zvierat pred odobratím etanolu (3.98 ± 0.97 nm) a od potkanov neúčinných etanolom (4.14 ± 0.53).
Účinky reexpozície na etanol a kontrolné kvapalné diéty na úrovniach DA a 5-HT v DEPENDENT (n = 5) a NAETAOL (n = 7) potkany. Pre porovnanie sú tiež zahrnuté hladiny monoamínov v období pred odobratím, vysadením (hodina 8) a operatívne podmienky samopodania. Všetky údaje predstavujú priemery za 1 hodinu počas príslušných fáz. [*DA, Rozdielny od Pre-Odstúpenie (p <0.05) aSelf-Administration (p <0.01) a líšia sa od zodpovedajúcich stavov u potkanov, ktorí boli NA-etán (p <0.05). 5-HT, Rozdielny odOdňatie a Self-Administration(p <0.05) a líši sa od zodpovedajúceho stavu NAHORNÉHO ETHANOLU (p <0.001]).
Koncentrácie dialyzátu 5-HT v skupine ZÁVISLÝCH sa zvýšili po opätovnom vystavení tekutej diéte s obsahom etanolu na hladiny vyššie ako tie, ktoré sa zaznamenali počas operatívneho podávania (1.25 ± 0.22 oproti 1.46 ± 0.13 n.m; Obr. 6). Aj keď priemerný výtok 5-HT nedosahoval úrovne pred odberom (1.46 ± 0.13 oproti 2.01 ± 0.41 nm), štatistické rozdiely medzi pre-a post-odberom 5-HT už neboli zjavné po prístupe k etanolovej tekutej strave.
Žiadne rozdiely oproti východiskovým hodnotám DA a 5-HT sa nezaznamenali u potkanov NONDEPENDENT, ktorým bol poskytnutý prístup ku kontrolnej diéte po operatívnom samopodaní (údaje nie sú uvedené).
DISKUSIA
Výsledky potvrdzujú, že samopodávanie etanolu zvyšuje extracelulárne hladiny DA a 5-HT v NAC, dvoch neurotransmiteroch, ktoré sa podieľajú na akútnych farmakologických a posilňujúcich účinkoch etanolu, zatiaľ čo abstinencia etanolu je sprevádzaná výrazným potlačením uvoľňovania. týchto monoamínov. Výsledky tiež naznačujú, že závislí potkania budú počas vysadzovania „pracovať“, aby získali etanol v operatívnej úlohe samoliečby, a že spotreba etanolu zvráti abstinenty extraneuronálnych DA a 5-HT spojené s vysadením.
Ústredným záujmom v tejto štúdii bolo skúmanie účasti DA a 5-HT na posilňujúcich účinkoch alkoholu u závislých subjektov. Tradične bolo ťažké preukázať, že odňatie etanolu motivuje správanie zvierat, ktoré vyhľadávajú etanol (pozri prehľad Cicero, 1980; Grant a kol., 1990; Meisch a Stewart, 1994), hoci pozitívne výsledky boli získané u potkanov, ktorí dostali možnosť spojiť príjem etanolu so zmiernením abstinenčných príznakov počas viacerých epizód nútenej abstinencie (Hunter a kol., 1974). Nedávno sa však ukázalo, že s vhodnými postupmi na etanol-iniciovanie potkany si sami podajú značné množstvo etanolu aj počas prvej skúsenosti s vysadením (Schulteis a kol., 1996). Tieto výsledky potvrdzujú toto pozorovanie a poskytujú možný neurochemický základ pre zosilňujúce účinky etanolu u závislých potkanov. Konkrétne údaje naznačujú, že potkany regulovali príjem etanolu počas operatívneho vlastného podávania a následnej konzumácie tekutej stravy spôsobom, ktorý obnovoval a udržiaval tok DA na úrovni pred odberom. V predchádzajúcej správe sa preukázalo, že intragastrická provokačná dávka etanolu obnovuje nedostatočné uvoľňovanie DA vo ventrálnom striate a mení abstinenčné príznaky etanolu (Rossetti a kol., 1992). Zjavná behaviorálna „titrácia“ príjmu etanolu na opätovné získanie podmienok v tomto experimente rozširuje toto zistenie tým, že implikuje uvoľňovanie akumulácie DA v etanolom udržiavanom posilňovaní v závislých subjektoch a extenzívne v pokračujúcom zneužívaní a závislosti.
Na rozdiel od DA sa hladiny 5-HT obnovili iba čiastočne počas samostatného podávania etanolu. Za týmto nálezom môže byť niekoľko vysvetlení. Je možné, že na rozdiel od svojich akútnych účinkov u nezávislých potkanov má etanol postupnejší alebo oneskorený účinok na uvoľňovanie 5-HT u závislých potkanov, aj keď sa to zdá nepravdepodobné, pretože etanol spôsobil rýchle počiatočné zvýšenie výtoku 5-HT do 10 minút nástupu samopodania. Alternatívne môže dôjsť k narušeniu mechanizmov syntézy a / alebo uvoľňovania 5-HT v priebehu chronickej expozície etanolu alebo počas odberu, čo vedie k celkovej zníženej reakcii na účinky etanolu, ako sa to navrhuje napríklad zoslabením účinkov etanolu na accumbal. Hladiny 5-HIAA u potkanov P tolerantných na etanol (Murphy a kol., 1988). Tretia interpretácia súvisí s pozorovaním, že hladiny 5-HT v závislej skupine pred odobraním boli podstatne zvýšené v porovnaní s potkanmi, ktorí neboli liečení etanolom. Ak adaptívne zmeny, ktoré sú základom zvýšenia uvoľňovania 5-HT chronickým etanolom, sú krátkodobé a počas abstinenčného stavu sa rýchlo menia, neočakáva sa úplné obnovenie hladiny pred odobratím. V tomto prípade „čiastočná“ obnova efluxu 5-HT môže v skutočnosti predstavovať „úplnú“ obnovu.
Vzhľadom na dôsledky údajov 5-HT na motivačné účinky odobratia etanolu je pravdepodobné, že zvrátenie deficitu neurotransmitera - aj keď len čiastočného -, ktorý je základom odvykacej tiesne, podporuje správanie, pri ktorom vzniká etanol. Pri preskúmaní literatúry LeMarquand a kolegovia (LeMarquand a kol., 1994) dospeli k záveru, že znížená funkčná aktivita systémov 5-HT, ktoré sprevádzajú abstinenčný stav etanolu, môže vyvolať biochemické podmienky na obnovenie príjmu etanolu. Špecifickú úlohu akumulovaného 5-HT v afektívnych zmenách, ktoré sprevádzajú vysadenie etanolu, však treba ešte stanoviť. Preferencia alkoholu u geneticky vybraných potkanov línie Indiana P a HAD bola spojená so zníženou funkčnou aktivitou neurotransmisie 5-HT v NAC (Murphy a kol., 1982, 1987; Gongwer a kol., 1989; McBride a spol., 1990), a tieto potkany vykazujú zvýšenú anxiogénnu reakciu pri rôznych mierach správania v úzkosti (Stewart a kol., 1993). V rozsahu, v akom akumulačné serotonergné deficity sú základom zvýšenej úzkosti týchto zvierat, je možné špekulovať, že afektívne stavy, ktoré motivujú pitie etanolu v potkanoch preferujúcich alkohol a obnovenie pitia počas vysadenia majú spoločný neurochemický základ.
Progresívny pokles extracelulárneho DA a 5-HT počas 8-hodinového obdobia vysadenia etanolu pred reláciou samopodávania rozširuje predchádzajúce pozorovania zníženia striatálneho obratu DA a obsahu celého tkaniva spojené s vysadením (Gil a kol., 1992), ako aj zníženie metabolizmu 5-HT a obsahu 5-HT alebo jeho metabolitu, kyseliny 5-hydroxyindol-octovej (5-HIAA), v preparátoch hlodavcov v celom mozgu, limbike a striatálnom tkanive (Kahn a Scudder, 1976; Tabakoff a kol., 1977; Badawy a Evans, 1983; Kempf et al., 1990; Wahlström a kol., 1991; Yamamura a kol., 1992). Ešte dôležitejšie je, že tieto výsledky lokalizujú nedostatky súvisiace s abstinenčným syndrómom v monoamínovej funkcii do oblasti odmeňovania mozgu, ktorá sa podieľa na akútnych zosilňujúcich účinkoch alkoholu a iných látok zneužívania.
Čo sa týka mechanizmov, ktoré regulujú uvoľňovanie alebo extraneuronálne koncentrácie DA a 5-HT v NAC, tieto údaje naznačujú vývoj „adaptácie v rámci systémov“ počas chronickej expozície etanolu tak, že rovnaké neurochemické systémy ktoré sú aktivované akútnymi farmakologickými účinkami etanolu vykazujú funkčný deficit v neprítomnosti pokračujúcej stimulácie liečivom (Koob a Bloom, 1988). Alkohol akútne zvyšuje rýchlosť streľby A10 ventrálnych tegmentálnych DA neurónov (Gessa a spol., 1985; Brodie a kol., 1990) keďže neurónová aktivita 10 je drasticky inhibovaná počas odoberania etanolu (Diana a kol., 1992, 1993). Nedodržiavanie zvýšenia hladín DA pred očkovaním u zvierat vystavených etanolovej tekutej strave oproti zvieratám, ktoré už neboli liečení etanolom (obr. 1). 3), v spojení s prudkým poklesom efluxu DA po odstránení etanolu, môže odrážať potlačenie aktivity meso-akumulovaných DA za účelom „vyváženia“ chronickej stimulácie etanolom. Adaptívne zmeny na biochemickej úrovni môžu tiež slúžiť ako mechanizmy ako pre nedostatok rozdielov medzi závislými a etanol-naivnými potkanmi v uvoľňovaní DA pred odobratím, tak aj v redukcii extraneuronálneho DA počas vysadenia. Napríklad chronická expozícia etanolu potláča K+-vydané DA vydanie (Darden a Hunt, 1977) pravdepodobne prostredníctvom inhibície Ca2+ prílev (Kim a kol., 1994) alebo odpojením vstupu vápnika a uvoľňovania DA (Leslie a kol., 1986). Ešte dôležitejšie je, zatiaľ čo akútne podávanie etanolu stimuluje syntézu DA, tento účinok je oslabený u zvierat liečených chronicky etanolom (Tabakoff a Hoffman, 1978;Fadda a kol., 1980).
Neuradaptívny účinok môže byť menej zrejmý v prípade 5-HT, kde boli hladiny predozdávkového (tj chronického etanolom stimulovaného) zvýšenia v porovnaní s etanolom naivnými aj nezávislými potkanmi, čo potvrdzuje skoršie údaje preukazujúce, že chronická liečba etanolom sa zvyšuje. hladiny predného mozgu 5-HT a 5-HIAA (Tytell a Myers, 1973; Mena a Herrera, 1980; Hunt a Majchrowicz, 1983; Morinan, 1987; Kaneyuki a kol., 1991). Je však známe, že zvýšenie obsahu 5-HIAA v mozgu produkované etanolovou expozíciou je znížené u potkanov, ktoré preferujú alkohol (P), najmä v NAC (Murphy et al., 1988; McBride a spol., 1990). Je teda možné, že zvýšený eflux 5-HT na konci chronického etanolového režimu bol znížený (tj vykazoval adaptívne zoslabenie) v porovnaní s počiatočnou serotonergnou odpoveďou na etanolovú diétu. Aj keď táto hypotéza čaká na potvrdenie, potlačenie uvoľňovania 5-HT počas fázy vysadenia jasne naznačovalo prítomnosť neuroadaptívnych zmien funkcie 5-HT v reakcii na chronický etanol.
Extracelulárne monoamínové deficity v NAC potom môžu byť základom určitých abstinenčných príznakov odbúravania alkoholu, najmä afektívnych zmien, ktoré sú opačné ako tie, ktoré sú akútne produkované etanolom. Etanol môže akútne zvýšiť odmenu za stimuláciu mozgu (fenomén, ktorý je aspoň čiastočne závislý od funkčnej integrity mesolimbického prenosu DA) (Moolten a Kornetsky, 1990; Lewis, 1991), keďže stiahnutie etanolu je sprevádzané deficitom odmeňovania, ktorý sa meria zvýšením prahov intrakraniálnej samostimulácie (\ tSchulteis a kol., 1995). Existujú aj dôkazy o tom, že aktivácia 5-HT môže podporovať alebo potencovať odmenu za stimuláciu mozgu (Gibson a kol., 1970;Miliaressis a kol., 1975; Redgrave a Horrell, 1976). Očakáva sa teda, že extraneuronálny deficit tohto vysielača zhorší deficit deficitu závislý od DA, najmä vo svetle nedávnych dôkazov o uľahčujúcej úlohe 5-HT pri uvoľňovaní DA v NAC (Chen a kol., 1991; Devaud a Hollingsworth, 1991; Yoshimoto a McBride, 1992; Parsons and Justice, 1993). V tejto súvislosti je zaujímavé poznamenať, že progresia extracelulárnych deficitov v tejto štúdii úzko súvisí s výskytom a časovým profilom symptómov abstinenčného správania v súvisiacej práci, vrátane deficitu odmeny v mozgovej stimulácii, hyperirritability, inhibície správania a anxiogénnych účinkov (Baldwin a kol., 1991; Rassnick a kol., 1992;Schulteis a kol., 1995). Synchrónny vznik týchto behaviorálnych a neurochemických zmien môže teda odrážať úlohu DA a 5-HT v negatívnych afektívnych stavoch, ktoré sprevádzajú odobratie etanolu.
Hoci úloha DA a 5-HT v odmeňovaní a závislosti od etanolu bola v tejto štúdii prvoradá, účinky zaujímavého podávania etanolu na uvoľňovanie týchto vysielačov u nezávislých potkanov sú tiež zaujímavé. Zvýšenie uvoľňovania DA v nezávislej skupine potvrdzuje predchádzajúcu správu (Weiss a kol., 1993) a ďalej podporuje úlohu DA pri akútnom posilňovaní etanolu. Osobitne dôležité však bolo zistenie, že samodávkovanie etanolu nezávislými potkanmi zvyšuje eflux 5-HT, pretože tieto výsledky rozširujú zistenia zvýšeného uvoľňovania 5-HT v NAC po systémovom a lokálnom podávaní alkoholu (Yoshimoto a kol., 1991, 1992) na možnú úlohu 5-HT pri akútnom zosilňovacom účinku etanolu.
Zistenie, že bazálny výstup DA bol podstatne zvýšený u NEZÁVISLÝCH potkanov, v porovnaní s ETHANOL-NAÍVNOU a ZÁVISLOU skupinou, bolo prekvapujúce, pretože nezávislé zvieratá nedostali prístup k etanolu po dobu 2–3 týždňov - pokiaľ boli umiestnení na kontrolnú tekutú stravu - predtým mikrodialyzačný test. Jednou z možností, ako vysvetliť toto pozorovanie, je, že prerušovaný prístup k alkoholu môže viesť k trvalému zvýšeniu bazálneho uvoľňovania DA. Alternatívne môže byť tento nález spôsobený výberom pokusných a kontrolných zvierat. Krysy trénované s etanolom boli zaradené do NEZÁVISLÝCH alebo ZÁVISLÝCH skupín iba vtedy, ak splnili výberové kritérium (stabilný denný príjem etanolu ≥ 0.5 g / kg príjmu etanolu), zatiaľ čo všetky krysy bez etanolu boli testované bez rozdielu. Ak sa predpokladá, že existuje dopaminergná „abnormalita“, ktorá predisponuje potkany k zvýšenému príjmu etanolu, mohol tento selekčný proces zaviesť „neurochemické vychýlenie“ smerom k zvýšenému bazálnemu uvoľňovaniu DA vo vzorcoch ZÁVISLÉ a NEZÁVISLÉ. Z tohto dôvodu môže byť zvýšený odtok DA u NEZÁVISLÝCH potkanov dôsledkom selekčného postupu, ktorý uprednostňuje zahrnutie jedincov s touto neurochemickou charakteristikou. Vzhľadom na rozdiely v bazálnom odtoku DA medzi ZÁVISLÝMI a NEZÁVISLÝMI skupinami by sa tento účet mal dovolávať aj záveru, že chronický etanol vedie k potlačeniu bazálneho uvoľňovania DA v tejto populácii potkanov.
Proti tomuto výkladu však namieta niekoľko úvah. Absencia rozdielov v extracelulárnej DA medzi údajmi ETANOL-NAIVE a DEPENDENT potkanov je v súlade s predchádzajúcimi \ t in vitro štúdie, ktoré preukázali, že chronicky ošetrené zvieratá s etanolom sa nelíšia od neliečených kontrol v striatálnej alebo akumulovanej DA syntéze a hladinách DOPAC (Tabakoff a Hoffman, 1978; Fadda a kol., 1980; Patel a Pohorecky, 1989; Gil a kol., 1992). Vzhľadom na súlad medzi súčasnými a týmito skoršími údajmi o celom tkanive (ktoré využívali určitú formu núteného podávania etanolu, a teda nezahŕňali potenciálne skreslenie výberu), je nepravdepodobné, že samotné súčasné výberové postupy môžu zodpovedať za vylepšené Vydanie DA v NONDEPENDENT skupine. Priama podpora pre možnosť, že tento účinok súvisí s prerušovanou konzumáciou etanolu, skôr ako so skreslením výberu, pochádza z nedávnej práce v tomto laboratóriu, ktorá ukazuje, že náhodne vybrané potkany Wistar podrobené opakovaným intraperitoneálnym injekciám etanolu výrazne zvýšili bazálne extracelulárne koncentrácie DA v NAC, merané 24 hodín po konečnom pôsobení etanolu (AD Smith a F. Weiss, nepublikované pozorovania). Na druhej strane, aj keď tieto údaje podporujú hypotézu, že opakovaná expozícia etanolu môže zvýšiť bazálny odtok DA v NAC, vytrvalýZvýšenie bazálneho DA efluxu u skupiny NONDEPENDENT si jednoznačne vyžaduje potvrdenie a je potrebné objasniť potenciálny význam tohto zistenia pre správanie, pri ktorom dochádza k etanolu.
Na záver, výsledky naznačujú, že dva systémy neurotransmiterov, o ktorých sa predpokladá, že sprostredkúvajú akútne posilňujúce vlastnosti alkoholu, môžu tiež hrať úlohu pri posilňovaní účinkov alkoholu u závislých subjektov. Tieto výsledky prispievajú k podpore neuroadaptačných teórií, ktoré sledujú abstinenčné prejavy vyplývajúce z fyziologických zmien v obvodoch odmeňovania mozgu, ktoré sa prejavia ako protichodné reakcie po ukončení liečby.
poznámky pod čiarou
- Prijaté November 2, 1995.
- Prijatá revízia Február 23, 1996.
- prijatý Február 28, 1996.
Táto práca bola podporená Národným ústavom pre zneužívanie alkoholu a granty na alkoholizmus AA 08164 a AA 10531 (FW) a Národným ústavom pre zneužívanie alkoholu a alkoholizmus špecializovaným centrom Grant AA 06420 (GK, FW; riaditeľ, GFK). PH bol hosťujúcim vedcom z Biomedical Research Center, Alko Ltd., Helsinki, Fínsko. Toto je publikácia číslo NP-8871 od The Scripps Research Institute.
Korešpondencia by sa mala adresovať Friedbertovi Weissovi, oddeleniu neurofarmakológie (CVN-15), The Scripps Research Institute, 10666 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037.
- Copyright © 1996 Spoločnosť pre neurovedu
;