Kokaínom indukovaná dendritická chrbtica v D1 a D2 dopamínových receptoroch obsahujúcich stredné špinavé neuróny v nucleus accumbens (2006)

Proc Natl Acad Sci USA A. Feb 28, 2006; 103 (9): 3399-3404.
Publikované online Feb 21, 2006. doi:  10.1073 / pnas.0511244103
PMCID: PMC1413917
Neurovedy
Tento článok bol citované iné články v PMC.

abstraktné

Psychostimulantom indukovaná zmena dendritických chvostov na dopamínozcepčných neurónoch v nucleus accumbens (NAcc) bola predpokladaná ako adaptívna neuronálna odpoveď, ktorá je spojená s dlhotrvajúcim návykovým správaním. NAcc sa z veľkej časti skladá z dvoch odlišných subpopulácií stredne veľkých špicových neurónov, ktoré exprimujú vysoké hladiny dopamínových D1 alebo D2 receptorov. V tejto štúdii sme analyzovali dendritickú hustotu chrbtice po chronickej liečbe kokaínom v odlišných stredných špinavých neurónoch obsahujúcich D1 alebo D2 receptor v NAcc. Tieto štúdie použili transgénne myši, ktoré exprimovali EGFP pod kontrolou promótora D1 alebo D2 receptora (Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP). Po 28-dňoch liečby kokaínom a 2-deň odvykania sa zvýšila hustota chrbtice v oboch pozitívnych neurónoch Drd1-EGFP- a Drd2-EGFP. Zvýšenie hustoty chrbtice sa však udržalo iba v prípade Drd1-EGFP-pozitívnych neurónov 30 dní po vysadení lieku. Predovšetkým sa pozorovala zvýšená expresia ΔFosB v neurónoch pozitívnych na Drd1-EGFP- a Drd2-EGFP pozitívnych po 2-dňoch odobratia liečiva, ale iba v neurónoch pozitívnych na Drd1-EGFP po 30-dňoch odobratia liečiva. Tieto výsledky naznačujú, že zvýšená hustota chrbtice pozorovaná po chronickej liečbe kokaínom je stabilná len v neurónoch obsahujúcich receptory D1 a že expresia ΔFosB je spojená s tvorbou a / alebo udržiavaním dendritických nosníkov v D1, rovnako ako s neurónmi obsahujúcimi receptory D2 v NAcc.

Mesolimbická dopaminergná dráha je zložená z neurónov vo ventrálnej tegmentálnej oblasti, ktoré inervujú nucleus accumbens (NAcc), olfactory tubercle, prefrontal cortex a amygdala1), zatiaľ čo nigrostriatálne dopaminergné neuróny v substantia nigra (pars compacta) poskytujú stúpajúcu projekciu do dorzálneho striatu (2). Psychostimulanty zvyšujú synaptické koncentrácie dopamínu v NAcc: kokaíne, blokovaním absorpcie dopamínu z synaptickej štrbiny a amfetamínu podporou uvoľňovania dopamínu z nervových terminálov (3-5). Opakované, prerušované podávanie psychostimulantov vedie k zvýšeným reakciám správania (senzibilizácia) na akútne stimulačné účinky týchto liekov (6-8). Väčšina dôkazov naznačuje, že adaptačné zmeny v dopaminergnom systéme NAcc v oblasti ventrálnej tegmentálnej oblasti sú základom pre zmeny v plasticity závislej od zážitku, ktorá je základom správania vyvolaného liekmi.

Okrem dopamínu je potrebný aj glutamát na rozvoj senzibilizácie správania v reakcii na psychostimulanty (9, 10). Stredne veľké špinavé neuróny (MSN) v ventrálnom striate dostávajú excitatívne glutamatergické projekcie z prefrontálnej kôry, ktoré synaptizujú na hlavy dendritických tŕňov. MSN sú tiež hlavným cieľom pre dopaminergné axóny, ktoré synapsujú na krk chrbtice (1, 11, 12). Preto dendritické tŕne v MSN predstavujú bunkové oddelenie, kde sa spočiatku integruje dopaminergný a glutamatergický prenos.

Dopamín pôsobí na dve podskupiny hlavných receptorov, podrodiny D1 (subtypy D1 a D5) a podrodiny D2 (D2, D3 a D4) (13). V ansomických štúdiách sa ukázalo, že striatónové MSN obsahujú vysoké hladiny D1 receptorov (spolu s látkou P a dynorfínom), zatiaľ čo striatopallidné MSN prevažne exprimujú receptory D2 (spolu s enkefalínom) (14-17). Výčnelky z NAcc sú zložitejšie ako v hrudnom striári, pričom plášťové a jadrové časti NAcc vyčnievajú do odlišných subregiónov ventrálneho pallidu a do ventrálnej tegmentovej oblasti a substantia nigra18). Zatiaľ čo receptory D2 a enkefalín sú vysoko exprimované v projekciách do ventrálneho pallidu, receptory D1 a látka P sú rovnako rozložené v projekciách na ventrálnu pallidum a ventrálnu tegmentálnu oblasť (19). Štúdie agonistov a antagonistov selektívne pre receptory D1 alebo D2 ukázali, že pre zmeny správania závislé od psychostimulantu sú potrebné aj receptory D1 a D2 (20-25). Úlohy týchto receptorov sa však zdajú byť odlišné. Stimulácia receptorov D1 napríklad zoslabuje hľadanie kokaínu indukované injekciami primárneho kokaínu a environmentálnymi podnetmi súvisiacimi s kokaínom, zatiaľ čo stimulácia receptorov D2 uľahčuje obnovenie kokaínu (26-28).

Abnormality správania spojené s psychostimulantnou závislosťou sú mimoriadne dlhé. Preto bol značný záujem identifikovať dlhodobé zmeny indukované liečivami na molekulárnej a štrukturálnej úrovni v neurónových obvodoch regulovaných dopamínom a glutamátom (29-32). Predovšetkým sa zistilo, že dlhodobá expozícia kokaínu alebo amfetamínu zvyšuje počet dendritických vetvených bodov a trhlín MSN v NAcc (33-35). Zistilo sa, že tieto štrukturálne zmeny pretrvávajú až do ≥ 1-3.5 mesiacov po poslednej expozícii lieku (30, 35) a boli navrhnuté, aby boli podložené dlhotrvajúce zmeny synaptickej plasticity spojené s expozíciou psychostimulantu.

Cieľom tejto štúdie bolo preskúmať kokaínom indukované štrukturálne zmeny dendritických tŕňov v subpopuláciách akumulálnych MSN, ktoré exprimujú buď D1, alebo D2 receptory. V týchto štúdiách sme použili transgénne myši bakteriálnych umelých chromozómov (BAC), ktoré exprimujú EGFP pod kontrolou promótora dopamínového receptora D1 (Drd1-EGFP) alebo D2 (Drd2-EGFP)36). Výsledky ukazujú, že hoci sa zvýšená hustota chrbtice spočiatku vyskytuje v MSN s obsahom receptorov D1 a MSN s obsahom receptora D2, zmenená hustota chrbtice je stabilná len v neurónoch obsahujúcich receptory D1. Okrem toho nájdeme podobné zmeny v expresii transkripčného faktora ΔFosB, čo naznačuje, že ΔFosB môže byť zapojený do tvorby a / alebo udržiavania dendritických nosníkov v D1, rovnako ako na neuróny obsahujúce D2 receptor v NAcc.

výsledky

Analýza MSN v transgenických myšiach Drd1-EGFP a Drd2-EGFP BAC.

Progénový vzor MSN z dorzálneho a ventrálneho striatu v transgénnych myšiach Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP BAC bol charakterizovaný analýzou expresie GFP (36). Diferenciálna expresia GFP v MSN dorsálneho striatu zodpovedá všeobecne expresii endogénnych D1 alebo D2 receptorov (36). Ďalej sme analyzovali diferenciálnu expresiu GFP v NAcc u myší Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP (Obr. 1a a b). Hoci ≈ 58% neurónov v NAcc exprimovalo GFP u myší Drd1-EGFP (Obr. 1a), ≈48% neurónov v NAcc exprimovaných GFP u myší Drd-2-EGFP (Obr. 1b). MSN predstavujú 90-95% všetkých neurónov v NAcc (12, 37). Receptory D1 sú exprimované iba v MSN a receptory D2 sú exprimované v MSN a v cholinergných interneurone, ktoré predstavujú 1-3% striatálnych neurónov (37). Pri zohľadnení týchto faktorov výsledky naznačujú, že minimálne ≈ 10-15% MSN v NAcc pravdepodobne vyjadrí ako D1, tak D2 receptory.

Obr. 1. 

Analýza MSN u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP. (a a b) Pevné rezy mozgu z NAcc z Drd1-EGFP (a) alebo Drd2-EGFP (b) BAC transgénne myši sa imunologicky farbili pre GFP a NeuN (ako všeobecný neurónový marker). Zlúčené obrázky zobrazujú žltú farbu ...

Analýza dendritických spiniek u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP.

Expresia GFP u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP bola užitočná na farbenie neuronálnych buniek. Signál GFP v dendritoch a dendritických chrbtoch bol však príliš slabý na to, aby umožnil ich analýzu po imuno-farbení anti-GFP protilátok. Balené dodávanie fluorescenčných farbív sprostredkované časticami sa nedávno používalo na označenie neurónových populácií rýchlym a účinným spôsobom (38). Celé neuróny môžu byť označené touto technikou a metóda sa zdá byť porovnateľná s farbením Golgi-Cox. Aby sme analyzovali dendritickú morfológiu neurónov v NAcc, boli fixované akumulové rezy označené lipofilným fluorescenčným farbivom 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbokyanín-perchlorátom (DiI) pomocou génovej pištole. Príklad MSN zafarbeného DI je uvedený v Obr. 1c, Za použitých podmienok sme všeobecne pozorovali označené neuróny bez akéhokoľvek prekrývajúceho sa dendritu z iných značených neurónov. Pri vyššom zväčšení bolo možné pozorovať detailnú dendritickú morfológiu vrátane dendritických chrbticObr. 1d).

Potom sme použili kombináciu značenia DiI a imunohistochémie pre GFP v transgénnych myšiach Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP, čo bolo možné použitím nízkej koncentrácie detergentu na tkanivovú permeabilizáciu (pozri Metódy). Prostredníctvom dôkladného porovnania farbenia DiI a expresie GFP v bunkových telách MSNs sme mohli identifikovať DiI- a GFP-pozitívne alebo DiI-pozitívne a GFP-negatívne neuróny v Drd1-EGFPObr. 2a) alebo Drd2-EGFP (Obr. 2b) myší. V nasledujúcich štúdiách sme analyzovali dendritickú morfológiu len u neurónov s DI a GFP pozitívnymi z myší Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP.

Obr. 2. 

Analýza dendritických chvostov u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP. Neuróny v NAcc myší buď Drd1-EGFP (a) alebo myši Drd2-EGFP (b) boli najprv označené DI (červená) a potom podrobené imunohistochémii s použitím anti-GFP protilátky (EGFP, zelená). iba ...

Chronické liečenie kokaínom má za následok zvýšenú hustotu chrbtice v akumulátnych MSN, ktoré exprimujú buď Drd1-EGFP, alebo Drd2-EGFP.

Myši Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP boli opakovane injektované kokaínom (30 mg / kg) alebo soľným roztokom počas štyroch po sebe nasledujúcich týždňov (pozri Metódy). Dva dni (2WD) alebo 30 dni (30WD) po poslednom liečení boli mozgy spracované na značenie DiI a imunohistochémiu, ako je opísané vyššie. Predchádzajúca štúdia uvádza, že chronická liečba amfetamínom zvyšuje hustotu chrbtice na distálnych, ale nie proximálnych dendritoch MSN v NAcc (35). Preto sme obmedzili našu analýzu na distálne dendrity (tj tie, ktoré majú pobočky druhého alebo tretieho rádu) vrátane terminálnych oblastí. Pri analýze na 2WD sa zistilo, že hustota chrbtice v Drd1-EGFP-pozitívnych MSN (128% fyziologického roztoku) (Obr. 3a a c) a v menšom rozsahu v Drd2-EGFP-pozitívnych neurónoch (115% soľnej skupiny) (Obr. 3 b a d). Po 30WD bola zvýšená hustota chrbtice v Drd1-EGFP-pozitívnych neurónoch (118% kontroly fyziologického roztoku) (Obr. 3 a a c), ale nie v Drd2-EGFP-pozitívnych neurónoch (Obr. 3 b a d).

Obr. 3. 

Chronické zvýšenie hustoty chrbtice v Drd1-EGFP- alebo Drd2-EGFP-pozitívnych MSNs v NAcc vyvolané chronickým kokaínom. (a a b) Drd1-EGFP (a) alebo Drd2-EGFP (b) myší boli liečené soľným roztokom (Sal) alebo kokaínom (Coc, 30 mg / kg) za týždne 4. Mozog myši 2WD alebo 30WD boli spracované ...

Morfológia dendritických tŕňov je variabilná z hľadiska ich dĺžky a šírky hlavy. Preto sme u 2WD klasifikovali dendritické výčnelky do štyroch tried chrbtice (strnulé, hubové, tenké a filopodia) od kokaínu (údaje nie sú uvedené). Hustota húbového typu (119.7 ± 4.0%, P <0.01) a tenké tŕne (120.0 ± 3.4%, P <0.01) sa zvýšila liečbou kokaínom v Drd1-EGFP-pozitívnych MSN, zatiaľ čo hustota tučného (182.4 ± 21.6%, P A hubové tŕne (0.05 ± 122.5%, P <0.01) sa zvýšila v Drd2-EGFP-pozitívnych MSN. Nezistilo sa žiadne významné zvýšenie stubby tŕňov v neurónoch pozitívnych na Drd1-EGFP alebo tenkých tŕňov v neurónoch pozitívnych na Drd2-EGFP.

Chronický kokaín indukuje expresiu ΔFosB v Drd1-EGFP- alebo Drd2-EGFP-pozitívnych MSN v NAcc.

ΔFosB je členom rodiny Fos transkripčných faktorov. Zatiaľ čo akútne podávanie kokaínu indukuje rýchlu a prechodnú indukciu niekoľkých izoforiem Fos v NAcc, opakovaná expozícia kokaínu zvyšuje hladinu ΔFosB. Navyše, zvýšenie expresie ΔFosB pretrváva v NAcc počas niekoľkých týždňov až mesiacov po ukončení expozície lieku a predpokladá sa, že sa podieľa na dlhodobej regulácii génovej expresie aj po ukončení užívania lieku (29, 39, 40).

Na skúmanie indukcie ΔFosB v NAcc z myší Drd1-EGFP alebo Drd2-EGFP po liečbe kokaínom sme analyzovali expresiu FosB a GFP dvojitým označením (Obr. 4 a Tabuľka 1) Protilátka proti FosB rozpoznáva všetky formy FosB, ale predpokladáme, že zvýšená imunostainová forma predstavuje ΔFosB (pozri Metódy pre ďalšiu diskusiu). U myší ošetrených fyziologickým roztokom 16% Drd1-EGFP-pozitívnych neurónov a 15% Drd2-EGFP-pozitívnych neurónov exprimovali FosB imunoreaktivitu s relatívne slabou intenzitou (Obr. 4 a a b a Tabuľka 1). Opakovaná liečba kokaínom, po ktorej nasleduje 2WD, viedla k významnému zvýšeniu počtu neurónov pozitívnych na Drd1-EGFP, ktoré koexprimovali ΔFosB (55% GFP-pozitívnych neurónov) (Obr. 4c a Tabuľka 1). Menšie, ale stále významné zvýšenie expresie ΔFosB sa zistilo v Drd2-EGFP-pozitívnych neurónoch (25% GFP-pozitívnych neurónov) (Obr. 4d a Tabuľka 1). Rovnako ako pri zmenách hustoty chrbtice bola zvýšená expresia ΔFosB udržovaná v neurónoch pozitívnych na Drd1-EGFP (46% GFP-pozitívnych neurónov), ale nie v Drd2-EGFP pozitívnych neurónoch (15% GFP pozitívnych neurónov) po 30WD (Obr. 4 e a f a Tabuľka 1). Všimnite si, že zvýšená expresia ΔFosB pozorovaná v Obr. 4f je prítomný v Drd2-EGFP-negatívnych neurónoch.

Obr. 4. 

Chronický kokaín indukuje expresiu ΔFosB v MSD ​​v Drd1-EGFP- alebo Drd2-EGFP v NAcc. Drd1-EGFP (a, ca e) alebo Drd2-EGFP (b, da f) boli ošetrené soľným roztokom alebo chronickým kokaínom, ako je opísané v Obr. 3, 2WD (c a d) alebo 30WD (e a ...
Tabuľka 1. 

Kvantifikácia EGFP-pozitívnych neurónov vyjadrujúcich ΔFosB

Diskusia

Predpokladá sa, že dlhodobé adaptácie na dopaminergnú neurotransmisiu podliehajú návykovému správaniu spojenému s psychostimulačnými liekmi. Predovšetkým sa predpokladalo, že psychostimulantom indukované zvýšenie hustoty dendritických chrbtov MSN v NAcc sa predpokladalo, že sú spojené s reorganizáciou synaptickej konektivity (30). NAcc sa vo veľkej miere skladá z dvoch odlišných subpopulácií MSN, ktoré exprimujú vysoké hladiny dopamínových receptorov D1 alebo D2. V tejto štúdii sme po chronickej liečbe kokaínom analyzovali hustotu chrbtice v rozdielnych MSNs obsahujúcich D1 alebo D2 receptor v NAcc. Získané výsledky ukazujú, že hoci sa zvýšená hustota chrbtice spočiatku vyskytuje v MSN s obsahom receptorov D1 a MSN s obsahom receptorov D2, zmenená hustota chrbtice je stabilná len v neurónoch obsahujúcich receptory D1. Okrem toho nájdeme podobný model zmien expresie transkripčného faktora ΔFosB v MSN s obsahom D1 a D2 receptorov.

Tieto štúdie použili transgenické myši BAC, ktoré exprimujú GFP v špecifických subpopuláciách MSN pod kontrolou promótora D1 alebo D2 receptora. Okrem toho sme vyvinuli metódu dvojitého označovania, ktorá kombinovala imunohistochémiu pre GFP s balistickým označením neurónov použitím DiI. Predchádzajúce štúdie použili metódu Golgiho-Cox na analýzu účinku psychostimulancií na hustotu chrbtice (34) a použitá metóda DiI poskytla výsledky, ktoré boli kvantitatívne porovnateľné. Vyvinuli sme metódu dvojitého označovania, pretože Golgiho farbenie nie je kompatibilné s imunohistochemikou. Imunofarbenie obvykle vyžaduje tkanivovú permeabilizáciu s detergentmi, proces, ktorý zvyčajne vedie k solubilizácii lipofilných farbív z membrány (38). Avšak v našich súčasných štúdiách imunologická farba GFP nevyžadovala vysokú koncentráciu detergentu na tkanivovú permeabilizáciu a mohla by sa teda použiť v spojení s lipofilným označením farbiva. Metóda dvojitého označovania by mala byť všeobecne užitočná pri štúdiách štrukturálnych zmien v dendritických chrbtoch, napríklad pri analýze BAC transgénnych myších línií, kde sa GFP exprimuje v špecifických populáciách neurónov v kôre (36).

Napriek tomu, že je stále trochu kontroverzný, predpokladá sa, že receptory D1 a D2 sú vo veľkej miere anatomicky oddelené od priamych (striatonigrálnych) a nepriamych (striatopallidálnych) striatálnych projekčných neurónov17, 41). Počiatočná charakterizácia lokalizácie GFP u myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP bola v súlade s týmto záverom36). Navyše naša analýza počtu GFP-pozitívnych neurónov v NAcc z myší Drd1-EGFP a Drd2-EGFP je konzistentná so záverom, že ≈50% MSNs exprimuje len receptory D1, že ≈35-40% exprimuje iba receptory D2, a že ≈10-15% koexpresuje ako D1 tak aj D2 receptory. Táto hodnota koexpresie je podobná hodnote, ktorá vyplýva z štúdií dorzálneho striatu, ktoré viedli k kombinácii analýzy patch-zvierky jednotlivých striatálnych neurónov s technikami RT-PCR na izoláciu a amplifikáciu mRNA (≈ 17% koexpresia enkefalínu a látky P) (42). Treba poznamenať, že naše súčasné štúdie sa nezaoberajú otázkou expresie receptorov D3, D4 a D5 ani sa nevenujú otázke nízkych hladín expresie receptorov D1 v MSN, ktoré exprimujú vysoké hladiny receptorov D2 alebo naopak.

Niekoľko predchádzajúcich štúdií skúmalo neuronálnu lokalizáciu expresie Fos indukovanej psychostimulantom a úlohu receptorov D1 a D2 (43-45). Tieto štúdie podporili záver, že indukcia Fos a ΔFosB je sprostredkovaná aktiváciou receptorov D1. Avšak bunková lokalizácia expresie Fos je ovplyvnená environmentálnym kontextom, v ktorom sú podávané psychostimulačné liečivá (46, 47). Napríklad amfetamín alebo kokaín podávaný v domácej klietke indukuje prednostne okamžité skoré gény (vrátane Fos) prednostne v bunkách pozitívnych na látku P, ktoré koexprimujú receptory D1. Naproti tomu tieto liečivá môžu indukovať expresiu Fos v MSN s obsahom D1 a D2 receptora, keď sú podávané v novom prostredí. Protokol použitý v našich súčasných štúdiách nezahŕňal párovanie injekcie lieku expozíciou do nového prostredia. Nemôžeme však vylúčiť určitý druh kontextu závislého stresu, ktorý je zodpovedný za expresiu ΔFosB v MSN s obsahom receptora D2.

Pozoruhodným rysom súčasných výsledkov bol paralelný model zvýšenej hustoty chrbtice a expresie ΔFosB. Zvýšená hustota chrbtice a expresia ΔFosB sa spočiatku vyskytli v MSNs exprimujúcich Drd1-EGFP a Drd2-EGFP. Avšak tieto zmeny boli stabilné len v neurónoch obsahujúcich receptory D1. Jedným možným vysvetlením pre pozorovanie, že zvýšená hustota chrbtice a expresia ΔFosB bola prechodne nájdená v neurónoch obsahujúcich receptory D2, je to, že sa vyskytla v malej frakcii MSN, ktorá koexprimuje dopamínové receptory D1 aj D2. Teda prechodná povaha týchto zvyšovaní môže byť spojená s antagonistickými účinkami aktivácie D2 receptora na D1-dependentných signálnych dráhach (48). Je zaujímavé, že zmeny v hustote chrbtice a expresii ΔFosB boli reverzibilné, čo môže odrážať schopnosť signalizačných dráh závislých od receptorov D2 ovplyvňovať stabilitu ΔFosB.

Pozorovanie, že dochádza k paralelným zmenám v expresii ΔFosB a hustoty chrbtice, je v súlade s myšlienkou, že ΔFosB sa podieľa na počiatočnej tvorbe a následnej udržiavaní dendritických tŕňov v neurónoch obsahujúcich receptory D1 v NAcc. Expresia ΔFosB je riadená signálnou dráhou závislou na D1 / DARPP-32 / PP1 v MSN (49). Niekoľko štúdií ukázalo, že ΔFosB hrá dôležitú úlohu pri odmeňovaní a aktivizujúcich aktivitách psychostimulantov (39), pravdepodobne tým, že ovplyvňuje expresiu viacerých génov, ktoré zahŕňajú receptory neurotransmiterov, signálne proteíny a proteíny zapojené do regulácie morfológie neurónov (50). Avšak špecifické molekulárne mechanizmy, ktoré sa podieľajú na chronickej tvorbe chrbtice vyvolanej kokaínom, nie sú v súčasnosti známe. Naše predchádzajúce štúdie ukázali, že intrakumulálna infúzia roscovitínu inhibítora Cdk5 atenkuje zvýšenie hustoty chrbtice indukované kokaínom (51). Cdk5 je navyše cieľový gén pre DFosB a bol zapojený do kompenzačných adaptačných zmien súvisiacich s chronickou liečbou kokaínom (52). Preto je zmena fosforylácie závislej od Cdk5 pravdepodobným mechanizmom, ktorý je založený na tvorbe chrbtice indukovanej kokaínom a / alebo na stability chrbtice. PAK (53), ß-catenin (54), PSD-95 (55) a spinofilínu (56) sú substráty pre Cdk5 a všetky sa podieľajú na regulácii morfogenézy chrbtice (57-60). Ďalšia charakterizácia týchto a iných Cdk5 substrátov v tŕniach bude snáď osvetliť mechanizmy spojené s reguláciou tvorby chrbtice pomocou psychostimulantov.

Metódy

Zvieratá.

Myši nesúce EGFP transgén pod kontrolou buď dopamínových receptorov D1 alebo D2 boli generované transgenickým projektom Gensat BAC (36). Transgénne myši použité v tejto štúdii boli 4-5 týždne staré a boli na pozadí Swiss-Webster. Myši boli udržiavané v 12: 12-h svetlo / tmavý cyklus a umiestnené v skupinách 2-5 s potravinami a vodou dostupnými ad libitum. Všetky protokoly na zvieratách boli v súlade s príručkou pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat v Národnom ústavu pre zdravie a boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá Rockefeller University.

Liečba liečiv.

Zistilo sa, že chronické liečenie kokaínom (30 mg / kg denne) spôsobilo silné zvýšenie hustoty chrbtice MSN v jadre aj škrupine NAcc z potkanov, ale nižšia dávka (15 mg / kg) zvýšila hustotu chrbtice len v škrupina (61). Preto sme použili vyššiu dávku kokaínu na vyvolanie štrukturálnej modifikácie v oboch častiach NAcc. Myši dostali jednu injekciu (ip) 30 mg / kg kokaínu-HCl (alebo fyziologického roztoku) každý deň v nasledujúcich dňoch 5, po ktorých nasledovali dni bez injekcie 2 a tento postup bol opakovaný za 4 po sebe idúcich týždňov. Injekcie sa uskutočnili v domácej klietke. 2WD alebo 30WD boli myšacie mozgy spracované na označenie DiI a / alebo imunohistochémiu.

Balistické označenie s fluorescenčným farbivom.

Myši boli anestetizované 80 mg / kg pentobarbitalu sodného a perfenzované transcardiálne s 5 ml PBS, nasledované rýchlou perfúziou s 40 ml 4% paraformaldehydu v PBS (20 ml / min). Mozgy boli rýchlo odstránené z lebky a postfixované v 4% paraformaldehyde pre 10 min. Plátky mozgu (100 μm) boli označené balistickým dodaním fluorescenčného farbiva DiI (Molecular Probes), ako je opísané v ref. 38, Bola vyvinutá kombinovaná metóda značenia Dil-imunohistochémia s nízkou koncentráciou detergentu. Diely označené rezy boli permeabilizované 0.01% Triton X-100 v PBS na 15 min a potom inkubované v 0.01% Triton X-100 a 10% normálnom kozieho séra v PBS pre 1 h na minimalizáciu nešpecifického označovania. Segmenty tkaniva sa potom inkubovali s 1% normálnym kozím sérom / 0.01% Triton X-100 a anti-GFP protilátkou (Abcam, Cambridge, MA) pri 2 h pri laboratórnej teplote, premyli a inkubovali v riedení 1: 1,000 FITC- konjugovanej sekundárnej protilátky (Molecular Probes). Segmenty boli umiestnené na mikroskopických sklíčkach a pokryté krytom s montážnym médiom. Balistický spôsob označovania umožnil podrobnú analýzu štruktúry dendritickej chrbtice a získané výsledky boli kvalitatívne a kvantitatívne porovnateľné s predchádzajúcimi štúdiami s použitím metódy impregnácie Golgi-Cox v plátkoch mozgu potkana34). Avšak v porovnaní s predchádzajúcimi štúdiami sme zriedka pozorovali dvojhlavé tŕne v neurónoch s farbivom DiI. Tento rozdiel môže byť spôsobený citlivosťou farbiacich metód alebo variability myši (táto štúdia) oproti tkanivu potkana (34).

Imunohistochémia.

Zvieratá boli anestetizované a perfundované, ako je opísané vyššie. Mozgy boli odstránené a skladované cez noc v 4% paraformaldehyde pri 4 ° C. Mozgy sa preniesli na 30% sacharózu v roztoku PBS na kryoprotekciu. Koronálne rezy (12 μm) boli rezané na mraziacom mikrotóme (Leica) a potom spracované na imunohistochémiu. Segmenty mozgu boli potom permeabilizované v 0.3% Triton X-100 v PBS pre 15 min a opláchnuté dvakrát v PBS. Rezy sa predinkubovali v normálnom kozím sére 10% v PBS pre 1 h pri 37 ° C a vystavili sa primárnym protilátkam (zriedeným 1% normálneho kozieho séra v PBS) cez noc pri 4 ° C a potom sa opláchli v PBS a inkubovali so sekundárnym protilátky pre 1 h pri 37 ° C. Použili sa nasledujúce protilátky: králičie anti-pan-FosB (SC-48, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology), myšacie anti-NeuN (Chemicon), králičie anti-GFP, FITC konjugované proti králičiemu IgG a rodamín- konjugovaný anti-myšací IgG (Molecular Probes). Pri trojitých značeniach (ΔFosB, NeuN a GFP) sa najskôr imunizovali rezy mozgu s anti-pan FosB protilátkou a anti-NeuN protilátkou a potom sa inkubovali so sekundárnymi protilátkami (anti-králičie IgG konjugované s rodamínom a cyanom konjugovaným anti-myšacím IgG ). Dvojito zafarbené mozgové rezy boli ďalej spracované na imunologickú farbu GFP použitím technológie značenia Zenon (Zenon Alexa Fluor 488, Molecular Probes). Protilátka anti-pan-FosB bola zvýšená na N koniec FosB a rozpoznávala AFosB a FosB s plnou dĺžkou (62). Na základe predchádzajúcich štúdií, ktoré ukázali, že sa AFFosB, ale nie FosB alebo iné Fos-súvisiace antigény stabilne exprimujú po chronickej liečbe kokaínom, predpokladáme, že dlhodobé zvýšenie imunoreaktivity predstavuje stabilnú expresiu ΔFosB. Avšak identita imunoreaktívneho FosB signálu pozorovaného u myší ošetrených soľným roztokom nie je známa. Štatistická analýza v Tabuľka 1 používa študentov t test.

Analýza dendritickej chrbtice.

Jednotlivé MSN v NAcc boli vybrané pre analýzu chrbtice na základe niekoľkých kritérií. (i) Bolo minimálne alebo žiadne prekrytie s inými označenými bunkami, aby sa zabezpečilo, že procesy z rôznych buniek nebudú zamieňané. (ii) Pre bunky, ktoré sa majú použiť na analýzu, musia byť viditeľné aspoň tri primárne dendrity. (iii) Boli vyšetrené distálne dendrity (terminálne dendrity alebo blízko terminálneho dendritu). Analyzovali sa dendrity z oboch MSN v jadre a obale NAcc. Aj keď sme pozorovali riedko ostnaté MSN (ostnatý typ II), analyzovali sme iba husto ostnaté MSN (ostnatý typ I). Na výpočet hustoty chrbtice sa pomocou konfokálneho mikroskopu (Zeiss LSM 20) s olejovou šošovkou (× 510) vysledovala dĺžka dendritu (dlhá> 40 μm). Všetky obrázky dendritov boli urobené rozdielne z (hĺbkové intervaly 0.5-1 μm), aby sa preskúmala morfológia dendritických tŕňov. Všetky merania sa robili pomocou softvéru na analýzu metamorfného obrazu (Universal Imaging, Downingtown, PA). Štatistická analýza použila Kolmogorovov-Smirnovov test.

Protruzie z dendritov boli rozdelené do štyroch typov na základe ich dĺžky, ako je opísané v ref. 63 a 64. Výčnelky triedy 1, nazývané tiež podsadité výčnelky, mali dĺžku <0.5 μm, chýbala im veľká hlava chrbtice a nejavilo sa, že majú krk; trieda 2 alebo tŕne v tvare húb, boli medzi 0.5 a 1.25 μm dlhé a vyznačovali sa krátkym krkom a veľkou hlavou chrbtice; trieda 3 alebo tenké tŕne, sa pohybovali medzi 1.25 a 3.0 μm a mali pretiahnuté krky chrbtice s malými hlavami; trieda 4, alebo filopodiálne predĺženia, boli dlhé vláknité výčnelky, ktorým chýbala zreteľná hlava chrbtice.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená Grantom DA10044 pre verejné zdravotnícke služby Spojených štátov (na PG a ACN) a Nadáciou Simons, Nadáciou Peter J. Sharp, Nadáciou Picower a Nadáciou FM Kirby.

Skratky

  • NACC
  • nucleus accumbens
  • MSN
  • stredne veľký špinavý neurón
  • BAC
  • bakteriálnym umelým chromozómom
  • Drd1
  • dopamínový receptor D1 podporovaný promótorom
  • Drd2
  • dopamínový receptor D2 podporovaný promótorom
  • DII
  • 1,1'-diotadecyl-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbokyanín-chloristan
  • 2WD
  • 2 dní po poslednej liečbe liekom
  • 30WD
  • 30 dní po poslednej liečbe liekom.

poznámky pod čiarou

 

Vyhlásenie o konflikte záujmov: Žiadne vyhlásené konflikty.

Referencie

1. Totterdell S., Smith ADJ Chem. Neuroanat. 1989, 2: 285-298. [PubMed]
2. Smith Y., Bevan MD, Shink E., Bolam JP Neuroscience. 1998, 86: 353-387. [PubMed]
3. Heikkila RE, Orlansky H., Cohen G. Biochem. Pharmacol. 1975, 24: 847-852. [PubMed]
4. Ritz MC, Lamb RJ, Goldberg SR, Kuhar MJ Science. 1987, 237: 1219-1223. [PubMed]
5. Nestler EJ Trends Pharmacol. Sci. 2004, 25: 210-218. [PubMed]
6. Kalivas PW, Stewart J. Brain Res. 1991: 16: 223-244. [PubMed]
7. Pierce RC, Kalivas PW Brain Res. 1997: 25: 192-216. [PubMed]
8. Robinson TE, Berridge KC Annu. Rev. Psychol. 2003, 54: 25-53. [PubMed]
9. Wolf ME, Khansa MR Brain Res. 1991, 562: 164-168. [PubMed]
10. Vanderschuren LJ, Kalivas PW Psychofarmakológia. 2000, 151: 99-120. [PubMed]
11. Sesack SR, Pickel VMJ Comp. Neurol. 1992, 320: 145-160. [PubMed]
12. Smith AD, Bolam JP Trends Neurosci. 1990, 13: 259-265. [PubMed]
13. Sibley DR, Monsma FJ, Jr. Trends Pharmacol. Sci. 1992, 13: 61-69. [PubMed]
14. Beckstead RM, Cruz CJ Neuroscience. 1986, 19: 147-158. [PubMed]
16. Gerfen CR, Young WS, III Brain Res. 1988, 460: 161-167. [PubMed]
16. Gerfen CR Trends Neurosci. 2000, 23: S64-S70. [PubMed]
17. Gerfen CR, Engber TM, Mahan LC, Susel Z., Chase TN, Monsma FJ, Jr., Sibley DR Science. 1990, 250: 1429-1432. [PubMed]
18. Zahm DS Neurosci. Biobehav. 2000: 24: 85-105. [PubMed]
19. Lu X.-Y., Ghasemzadeh MB, Kalivas PW Neuroscience. 1998, 82: 767-780. [PubMed]
20. Koob GF, Le HT, Creese I. Neurosci. Letí. 1987, 79: 315-320. [PubMed]
21. Woolverton WL, Virus RM Pharmacol. Biochem. Behave. 1989, 32: 691-697. [PubMed]
22. Bergman J., Kamien JB, Spealman RD Behav. Pharmacol. 1990, 1: 355-363. [PubMed]
23. Epping-Jordan MP, Markou A., Koob GF Brain Res. 1998, 784: 105-115. [PubMed]
24. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Bergman JJ Pharmacol. Exp. Ther. 1999, 291: 353-360. [PubMed]
25. De Vries TJ, Cools AR, Shippenberg TS NeuroReport. 1998, 9: 1763-1768. [PubMed]
26. Self DW, Barnhart WJ, Lehman DA, Nestler EJ Science. 1996, 271: 1586-1589. [PubMed]
27. Chroyan TV, Barrett-Larimore RL, Rowlett JK, Spealman RDJ Pharmacol. Exp. Ther. 2000, 294: 680-687. [PubMed]
28. Alleweireldt AT, Weber SM, Kirschner KF, Bullock BL, Neisewander JL Psychopharmacology. 2002, 159: 284-293. [PubMed]
29. Nestler EJ Nat. Rev. Neurosci. 2001, 2: 119-128. [PubMed]
30. Robinson TE, Kolb B. Neurofarmakológia. 2004, 47: 33-46. [PubMed]
31. Kalivas PW Curr. Opin. Pharmacol. 2004, 4: 23-29. [PubMed]
32. Hyman SE, Malenka RC Nat. Rev. Neurosci. 2001, 2: 695-703. [PubMed]
33. Robinson TE, Kolb BJ Neurosci. 1997, 17: 8491-8497. [PubMed]
34. Robinson TE, Kolb B. Eur. J. Neurosci. 1999, 11: 1598-1604. [PubMed]
35. Li Y., Kolb B., Robinson TE Neuropsychopharmacology. 2003, 28: 1082-1085. [PubMed]
36. Gong S., Zheng C., Doughty ML, Losos K., Didkovsky N., Schambra UB, Nowak NJ, Joyner A., ​​Leblanc G., Hatten ME a kol. Nature. 2003, 425: 917-925. [PubMed]
37. Zhou FM, Wilson CJ, Dani JAJ Neurobiol. 2002, 53: 590-605. [PubMed]
38. Grutzendler J., Tsai J., Gan WB Methods. 2003, 30: 79-85. [PubMed]
39. Kelz MB, Chen J., Carlezon WA, Jr., Whisler K., Gilden L., Beckmann AM, Steffen C., Zhang YJ, Marotti L., Self DW, et al. Nature. 1999, 401: 272-276. [PubMed]
40. Nestler EJ Neuropharmacology. 2004, 47: 24-32. [PubMed]
41. Le Moine C., Bloch BJ Comp. Neurol. 1995, 355: 418-426. [PubMed]
42. Surmeier DJ, Song WJ, Yan ZJ Neurosci. 1996, 16: 6579-6591. [PubMed]
43. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M., Nestler EJJ Pharmacol. Exp. Ther. 1995, 275: 1671-1680. [PubMed]
44. Gerfen CR, Keefe KA, Gauda EBJ Neurosci. 1995, 15: 8167-8176. [PubMed]
45. Moratalla R., Elibol B., Vallejo M., Graybiel AM Neuron. 1996, 17: 147-156. [PubMed]
46. Badiani A., Oates MM, Deň HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Behav. Brain. Res. 1999, 103: 203-209. [PubMed]
47. Uslaner J., Badiani A., Norton CS, Day HE, Watson SJ, Akil H., Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2001, 13: 1977-1983. [PubMed]
48. Huff RM, Chio CL, Lajiness ME, Goodman LV Adv. Pharmacol. 1998, 42: 454-457. [PubMed]
49. Zachariou V., Sgambato-Faure V., Sasaki T., Svenningsson P., Berton O., Fienberg AA, Nairn AC, Greengard P., Nestler EJ Neuropsychopharmacology. 2005 Aug 3; 10.1038 / sj.npp.1300832.
50. McClung CA, Nestler EJ Nat. Neurosci. 2003, 6: 1208-1215. [PubMed]
51. Norrholm SD, Bibb JA, Nestler EJ, Ouimet CC, Taylor JR, Greengard P. Neuroscience. 2003, 116: 19-22. [PubMed]
52. Bibb JA, Chen J., Taylor JR, Svenningsson P., Nishi A., Snyder GL, Yan Z., Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC a kol. Nature. 2001, 410: 376-380. [PubMed]
53. Nikolic M., Chou MM, Lu W., Mayer BJ, Tsai LH Nature. 1998, 395: 194-198. [PubMed]
54. Kesavapany S., Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J., Ackerley S., Leigh PN, Shaw CE, Miller CC Eur. J. Neurosci. 2001, 13: 241-247. [PubMed]
55. Morabito MA, Sheng M., Tsai LHJ Neurosci. 2004, 24: 865-876. [PubMed]
56. Futter M., Uematsu K., Bullock SA, Kim Y., Hemmings HC, Jr., Nishi A., Greengard P., Nairn AC Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005, 102: 3489-3494. [Článok bez PMC] [PubMed]
57. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, Zhang D., Chattarji S., Kirkwood A., Tonegawa S. Neuron. 2004, 42: 773-787. [PubMed]
58. Murase S., Mosser E., Schuman EM Neuron. 2002, 35: 91-105. [PubMed]
59. Prange O., Murphy THJ Neurosci. 2001, 21: 9325-9333. [PubMed]
60. Feng J., Yan Z., Ferreira A., Tomizawa K., Liauw JA, Zhuo M., Allen PB, Ouimet CC, Greengard P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97: 9287-9292. [Článok bez PMC] [PubMed]
61. Li Y., Acerbo MJ, Robinson TE Eur. J. Neurosci. 2004, 20: 1647-1654. [PubMed]
62. Perrotti LI, Bolanos CA, Choi KH, Russo SJ, Edwards S., Ulery PG, Wallace DL, Self DW, Nestler EJ, Barrot M. Eur. J. Neurosci. 2005, 21: 2817-2824. [PubMed]
63. Harris KM, Jensen FE, Tsao BJ Neurosci. 1992, 12: 2685-2705. [PubMed]
64. Vanderklish PW, Edelman GM Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002, 99: 1639-1644. [Článok bez PMC] [PubMed]