DeltaFosB nepriamo reguluje Cck promótorovú aktivitu (2010)

Brain Res. 2010 Môže 6; 1329: 10 – 20.

Publikované online 2010 March 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ a Colleen A. McClung^{2, *}

Informácie o autorovi ► Autorské práva a licenčné informácie

Konečná upravená verzia tohto článku vydavateľa je k dispozícii na stránke Brain Res

Pozri ďalšie články v PMC to citát publikovaný článok.

abstraktné

Zdá sa, že niektoré z dôležitých biochemických, štrukturálnych a behaviorálnych zmien vyvolaných chronickou expozíciou drogám zneužívania sú sprostredkované vysoko stabilným transkripčným faktorom AFosB. Predchádzajúca práca ukázala, že nadmerná expresia AFosB u myší po týždňoch 2 vedie k zvýšeniu expresie mnohých génov v striate, z ktorých väčšina je neskôr downregulovaná po 8 týždňoch expresie AFosB. Je zaujímavé, že veľký počet týchto génov bol tiež nadregulovaný u myší nadexprimujúcich transkripčný faktor CREB. Z tejto štúdie však nebolo jasné, či krátkodobé AFosB reguluje tieto gény prostredníctvom CREB. Tu zistíme, že 2 týždne nadmernej expresie AFosB zvyšuje expresiu CREB v striate, čo je efekt, ktorý sa rozpadá o 8 týždňov., Včasná indukcia je spojená so zvýšenou väzbou CREB na určité promótory cieľového génu v tejto oblasti mozgu. Prekvapivo, jeden gén, ktorý bol podozrivý z CREB cieľa na základe predchádzajúcich správ, cholecystokinin (Cck), nebol kontrolovaný CREB v striate. Ďalšie skúmanie regulácie. \ T CCK po nadmernej expresii AFosB sme potvrdili, že krátkodobá nadmerná expresia AFosB sa zvyšuje CCK aktivity promótora a génovej expresie. Tiež zvyšuje väzbovú aktivitu v domnelom väzbovom mieste CREB (CRE) v. \ T CCK promótor. Zatiaľ čo miesto CRE je nevyhnutné pre normálnu bazálnu expresiu CCKnie je potrebný na indukciu AFosB CCK, Súhrnne povedané, tieto výsledky naznačujú, že zatiaľ čo krátkodobá indukcia AFosB zvyšuje expresiu CREB a aktivitu u určitých génových promótorov, toto nie je jediný mechanizmus, ktorým sú gény upregulované za týchto podmienok.

Kľúčové slová: nucleus accumbens, transkripcia, závislosť

ÚVOD

Chronické vystavenie návykovým látkam spôsobuje biochemické a štrukturálne zmeny v niekoľkých oblastiach mozgu. Predpokladá sa, že tieto zmeny zahŕňajú zmeny v profiloch génovej expresie v mezolimbickom systéme. Tento systém sa skladá z dopaminergných neurónov, ktoré vychádzajú z ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) v strednom mozgu do stredne ostnatých neurónov v jadre accumbens (NAc) (ventrálne striatum), ako aj v mnohých iných oblastiach mozgu. Zmeny v aktivite dvoch transkripčných faktorov, väzbového proteínu cAMP responzívneho elementu (CREB) a AFosB (proteín rodiny Fos), boli navrhnuté na sprostredkovanie mnohých biochemických, štrukturálnych a behaviorálnych zmien pozorovaných pri chronickej expozícii drogám zneužívania ( hodnotené Nestler, 2005).

CREB je všadeprítomne exprimovaný transkripčný faktor, ktorý je členom rodiny CREB / ATF. Homodiméry CREB sa viažu na variácie sekvencie CRE (konsenzus: TGACGTCA) nachádzajúcej sa v promótoroch mnohých génov. Fosforylácia CREB (prevažne na seríne 133, hoci boli identifikované aj iné miesta) môže byť stimulovaných niekoľkými signálnymi kaskádami vrátane tých, ktoré sú v smere dopamínových receptorov (Cole a kol., 1995). Po fosforylácii na seríne 133 CREB získava ko-aktivátor CREB viažuci proteín (CBP) alebo príbuzné proteíny, čo vedie k zvýšenej expresii génu Johannessen a kol., 2004). Chronická expozícia opiátovým alebo psychostimulačným liekom proti zneužívaniu indukuje prechodné zvýšenie aktivity CREB v nucleus accumbens (Barrot a kol., 2002; Shaw-Lutchman a kol., 2002, 2003), adaptačná myšlienka na zníženie odmeňovacích vlastností týchto liekov a na prispenie k negatívnemu emocionálnemu stavu vysadenia drog (Nestler, 2005).

LPredpokladá sa, že pretrvávajúce adaptácie na drogy zneužívania sú čiastočne sprostredkované AFosB, vysoko stabilným variantom zostrihu FosB. (Nestler a kol., 1999; McClung a kol., 2004; Nestler, 2008). Členovia rodiny Fos dimerizujú s členmi rodiny Jun za vzniku komplexu aktivátorového proteínu 1 (AP-1). AP-1 transkripčné komplexy sa viažu na variácie AP-1 responzívneho elementu (konsenzus: TGACTCA) na reguláciu transkripcie. Chinenov a Kerppola, 2001). Kým akútna expozícia drogám zneužívania vedie k krátkodobej indukcii (hrs) členov rodiny Fos (ako aj zvýšenej aktivite CREB), opakovaná expozícia lieku vedie k akumulácii vysoko stabilného AFFB (Hope a kol., 1994; Perrotti a kol., 2008), ktorého výraz pretrváva niekoľko týždňov.

Bi-transgénne myši indukčne nadmerne exprimujúce buď AFosB alebo CREB v striatum dospelých vykazujú mnoho biochemických a behaviorálnych fenotypov pozorovaných u zvierat opakovane vystavených psychostimulanciám alebo iným drogám zneužívania. nalýza zmien génovej expresie u týchto transgénnych zvierat identifikovala početné gény upregulované krátkodobou (2 týždňov) nadmernou expresiou AFosB, zmeny spojené so sprievodným poklesom odmeňovania liekov. Zmeny v génovej expresii a behaviorálnej odpovedi s krátkodobým AFosB boli pozoruhodne podobné zmenám pozorovaným u zvierat nadexprimujúcich CREB počas 2 alebo 8 týždňov (McClung a Nestler, 2003). V nápadnom kontraste dlhodobá nadmerná expresia (8 týždňov) AFosB znížila expresiu mnohých týchto rovnakých génov a viedla k zvýšeniu odmeňovania liekov (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003).

Jeden gén identifikovaný v týchto štúdiách je cholecystokinín (CCK), neuropeptid produkovaný v niekoľkých oblastiach mozgu, vrátane striatum (Hokfelt a kol., 1980). CCK môže modulovať dopaminergnú transmisiu (Vaccarino, 1992), sa podieľa na odmeňovaní a posilňovaní drog (Josselyn et al., 1996; Josselyn a kol., 1997; Hamilton a kol., 2000; Beinfeld a kol., 2002; Rotzinger a kol., 2002) a je indukovaný v striate chronickým kokaínom (Ding a Mocchetti, 1992). Okrem toho CCK Ukázalo sa, že promótor reaguje na komplexy CREB aj AP-1 (Haun a Dixon, 1990; Deavall a kol., 2000; Hansen, 2001). Pretože mnoho génov (vrátane CCK), ktoré vykazovali zvýšenú expresiu po CREB aj krátkodobej expresii AFosB, boli známe alebo boli podozrivé na cieľové gény CREB (McClung a Nestler, 2003), chceli sme určiť, či krátkodobá expresia AFosB vedie k regulácii týchto génov (so zameraním na CCK) prostredníctvom regulácie CREB alebo prostredníctvom komplexnejších mechanizmov génovej regulácie.

VÝSLEDKY

Nadmerná expresia AFosB prechodne zvyšuje hladiny CREB

Použili sme Western blot na zistenie, či nadmerná expresia AFosB zvyšuje hladiny proteínu CREB v striate myši. Na túto štúdiu sme použili bi-transgénne myši (línia 11A), ktoré nesú ako NSE-tTA transgén, tak TetOp-AFosB transgén. V neprítomnosti doxycyklínu tieto myši vykazujú silné zvýšenie expresie AFosB v neurónoch pozitívnych na dynorfín v striate (Kelz a kol., 1999). Tento spôsob nadmernej expresie AFosB bol značne dokumentovaný a umožňuje nadmernú expresiu v regióne, ktorá je paralelná s indukciou AFosB pozorovanou u zvierat vystavených chronickému kokaínu (Hope a kol., 1994; Kelz a kol., 1999). Zistili sme, že u myší 11A, ktoré nadmerne exprimovali AFosB, boli hladiny CREB proteínu signifikantne upregulované po 2 týždňoch expresie a tieto hladiny sa vrátili na východiskové hodnoty po 8 týždňoch expresie (Obrázok 1A, n = 8). Aby sme zistili, či je možné zmeny v hladinách CREB s krátkodobou nadmernou expresiou ΔFosB replikovať v inom systéme, prechodne sme nadmerne exprimovali ΔFosB v bunkách PC12 a zistili sme, že hladiny CREB sa v porovnaní s kontrolami významne zvýšili (p <0.05) (Obrázok 1Bn = 4). Tieto výsledky ukazujú, že krátkodobá expresia AFosB zvyšuje hladiny proteínu CREB.

Hladiny CREB sa zvyšujú s nadmernou expresiou AFosB. Westernová analýza lyzátov z. \ T (A) myší striata z myší 11A mimo dox pre 2 alebo 8 týždne alebo (B) Bunky PC12 nadexprimujú AFosB. Údaje vo formáte A sú zobrazené ako percentuálna zmena v porovnaní dox dox ...

AFosB aj CREB sa viažu na promótory špecifických cieľových génov v striate po krátkodobej nadmernej expresii AFosB

Použili sme testy ChIP (chromatínová imunoprecipitácia) striatálneho tkaniva, aby sme zistili, či sa väzba AFosB alebo CREB vyskytla na určitých promótoroch cieľových génov a ak sa táto väzba zvýšila po krátkodobej nadmernej expresii AFosB. Analyzovali sme väzbu na BDNF a CCK pretože obidva gény sú vysoko upregulované po krátkodobej nadmernej expresii AFosB, nadmernej expresii CREB alebo chronickej liečbe kokaínom (McClung a Nestler, 2003). Analyzovali sme aj väzbu na CDK5 promótor, pretože je známym priamym cieľom AFosB (Chen a kol., 2000; Bibb a kol., 2001; Kumar a kol., 2005). Nakoniec sme merali väzbu na prodynorphin predošlé štúdie zistili, že môže byť viazaný tak AFF, ako aj CREB za rôznych podmienok (Andersson a kol., 2001; Zachariou a kol., 2006).

ChIP analýza sa uskutočnila na striata od myší 11A, ktoré nadmerne exprimovali AFosB počas 2 týždňov použitím protilátok, ktoré rozpoznávajú CREB alebo AFosB. Za normálnych podmienok sme zistili, že AFosB sa viaže na CDK5 a prodynorphin zatiaľ čo na receptore nie je detekovateľná väzba. \ t BDNF or CCK promotory (Tabuľka 1). Okrem toho nadmerná expresia AFosB zvýšila väzbu AFosB na CDK5 promótor, ale nie na prodynorphin promótor. Ďalej sme merali väzbu CREB na týchto promótoroch a zistili, že CREB sa viaže na CDK5, BDNF a prodynorphin promótory, ale nie CCK v normálnom striate a že nadmerná expresia AFosB pre 2 týždne zvyšuje väzbu CREB na BDNF a prodynorphin promótory, ale nie CDK5 promótor. Tieto výsledky spoločne ukazujú, že AFosB a CREB sa môžu viazať na určité génové promótory, ako sú napr prodynorphin a CDK5viazanie CREB je však špecifické pre iné promótory, ako je napr BDNF, Nadmerná expresia AFosB navyše vedie k zvýšeniu väzby AFosB na určitých promótoroch, ako by sa dalo očakávať, ale aj k väzbe CREB na špecifické promótory, čo je v súlade s indukciou CREB sprostredkovanou AFosB pozorovanou v tomto časovom bode.

Väzba predpokladaných regulačných proteínov na rôzne promótory u myší nadexprimujúcich AFosB počas dvoch týždňov.

Predchádzajúca práca ukázala, že zmeny v génovej expresii vyvolané dlhodobou nadmernou expresiou AFosB sú spojené s modifikáciami chromatínu, najmä acetyláciou histónu H3, na špecifických génových promótoroch (Kumar a kol., 2005). Aby sa určilo, či by to mohlo zodpovedať za zmeny v génovej expresii pri krátkodobej nadmernej expresii AFosB, zmerali sme väzbu acetylovaného histónu H3 (histónová modifikácia spojená s transkripčne aktívnym chromatínom), alebo metylovaný histón H3 (Lys9, modifikácia histónu spojená s transkripčne inaktívny chromatín). Zistili sme, že nadmerná expresia AFosB pre 2 týždne neviedla k žiadnym zmenám vo väzbe acetylovaného H3 na žiadny z študovaných promótorov génov (Tabuľka 1). Zistili sme významné zníženie viazania metylovaného histónu H3 na prodynorphin promótor, ale žiadne viazanie na CCK promótor a žiadna zmena vo väzbe na CDK5 a BDNF To znamená, že toto nie je všeobecný mechanizmus, ktorým by AFosB v krátkodobom horizonte reguloval expresiu génu. Boli sme prekvapení a zaujatí skutočnosťou, že v našich testoch ChIP sme nezistili žiadne rozdiely, ktoré by mohli byť príčinou nárastu CCK expresia mRNA u myší 11A po 2 týždňoch expresie AFosB a rozhodla sa tento mechanizmus ďalej skúmať.

Krátkodobý AFosB sa zvyšuje CCK expresiu vo viacerých systémoch

Mikročipová charakterizácia bi-transgénnych myší 11A nadmerne exprimujúcich AFosB v striate zistila, že CCK hladiny expresie sa zvyšujú po 2 týždňoch nadmernej expresie a potom sa postupne znižujú s dlhšími obdobiami expresie AFosB (Obrázok 2An = 3). Tento efekt sme potvrdili pre CCK použitím PCR v reálnom čase na oddelenej skupine zvierat v týždňoch 2 a 8 a zistili sa výsledky v dvoch časových bodoch, ktoré sú podobné analýze microarray (údaje nie sú uvedené).

Krátkodobá nadmerná expresia AFosB sa zvyšuje CCK expresia génu. (A) CCK expresia mRNA v striate po nadmernej expresii AFosB u myší 11A pre 1, 2, 4 alebo 8 týždňov. Mikroarray analýza sa uskutočnila na striatálnych vzorkách a CCK úrovní ...

Na ďalšie skúmanie schopnosti AFosB regulovať CCK Použili sme bunky PC12 prechodne transfekované a CCKreportérového plazmidu -luciferázy a buď expresného plazmidu AFosB alebo rovnakého množstva pCDNA. Obe dve (n = 5-9) a tri (n = 11-13) dni nadmernej expresie AFosB viedli k významnému zvýšeniu CCKexpresia -luciferázy. Okrem toho tri dni nadmernej expresie AFosB viedli k podstatne väčšiemu množstvu CCKindukcia -luciferázy v porovnaní s dvomi dňami nadmernej expresie (Obrázok 2B). Nadmerná expresia AFosB neindukovala expresiu konštruktu bez promótora luciferázy (údaje nie sú uvedené). Za žiadnych podmienok liečby nedochádzalo k redukcii CCK-luciferázová aktivita. Tieto výsledky ukazujú, že krátkodobá expresia AFosB zvyšuje aktivitu CCK a ponecháva nezodpovedaný mechanizmus, ktorým dlhodobá nadmerná expresia AFosB potláča CCK výrazom.

Nadmerná expresia AFosB zvyšuje väzbu na domnelom väzbovom mieste CREB v. \ T CCK zakladateľ

Naše analýzy to zistili CCK Expresia je zvýšená po krátkodobej expresii AFosB, ale naše testy ChIP zistili, že ani CREB, ani AFosB sa neviažu na CCK promótor. Určiť, či existujú nejaké zmeny vo väzbe na proteín na. \ T CCK po nadmernej expresii AFosB sme použili testy posunu elektroforetickej mobility (EMSA) so sondou obsahujúcou predpokladané miesto podobné CRE prítomné v CCK promótor. Použitím nukleárnych extraktov zo striata myší 11A nadexprimujúcich AFosB počas 2 týždňov sme zistili zvýšenie väzby na domnelý CRE miesto v CCK promótor (Obrázok 3 A, Cn = 4). Zaujímavé je, že myši 11A nadmerne exprimovali AFosB po dobu 8 týždňov, ktoré vykazujú zníženie CCK prejavili zvýšenú väzbu na tomto mieste (Obrázok 3B, Cn = 4). Pre porovnanie sme skúmali väzbu na konsenzus CRE miesto u myší nadexprimujúcich AFosB po dobu 2 týždňov a zistili, že robustná väzba CRE v striatálnych extraktoch, ale žiadne zvýšenie väzby po indukcii AFosB (Obrázok 3Fn = 4). Takže aj napriek zvýšeniu hladín celkového CREB indukovaného AFosB v tomto časovom bode sú tieto výsledky v súlade s našimi testami ChIP, ktoré zistili, že zvýšené viazanie CREB na promótoroch po nadmernej expresii AFosB je špecifické len pre určité gény a nie je globálnym fenoménom. , Určiť, či je CREB viazaný na CCK V našej analýze EMSA sme uskutočnili testy supershift s CREB špecifickou protilátkou. V súlade s našimi testami ChIP sme nenašli žiadnu väzbu CREB na a CCK Sonda obsahujúca predpokladané miesto CRE v testoch EMSA, zatiaľ čo CREB sa významne viazala a supershiftovala konsenzuálne miesto CRE (Obrázok 3D, En = 4). DNA väzbová aktivita na. \ T CCK promótor tiež nebol ovplyvnený protilátkou proti AFosB (údaje nie sú uvedené), za podmienok uvedených v niekoľkých predchádzajúcich štúdiách na blokovanie väzby AFosB na miesta bona fide AP-1 (Hope et al., 1994a, 1994b; Chen a kol., 1995, Hiroi a kol., 1998). Tiež sme uskutočnili ChIP testy na striata 11A zvierat po 8 týždňoch expresie AFosB a stále sa na nich nenachádzala žiadna väzba CREB alebo AFosB. CCK promótor (údaje nie sú uvedené). Expresia AFosB teda vedie k zvýšeniu väzby proteínu na CCK promótor po expresii 2 aj 8 týždňov; identita týchto faktorov však zostáva neznáma.

Proteínová väzba na. \ T CCK promótor. (A, B) Test posunu elektroforetickej pohyblivosti s použitím. \ T CCK CRE-podobné miesto so striatálnym tkanivom zo zvierat nadexprimujúcich AFosB počas 2 týždňov (A) alebo 8 týždňov (B). V (A), súťaž s nadbytočným neoznačeným pretekárom ...

Predpokladaná stránka CRE v CCK promótor nie je zodpovedný za zvýšenú aktivitu promótora

Vzhľadom k tomu, že sme zistili zvýšenie väzby na proteín pomocou fragmentu CCK promotor, ktorý obsahuje predpokladané CRE miesto, po nadmernej expresii AFosB, sme chceli určiť, či je toto miesto potrebné na zvýšenie CCK po expresii AFosB. Na otestovanie tejto možnosti sme transfekovali bunky PC12 pomocou a CCKPlazmid -luciferázy obsahujúci jeho intaktné CRE-podobné miesto alebo miesto obsahujúce mutáciu v mieste, ktoré by zrušilo akúkoľvek interakciu s CREB. Je zaujímavé, že mutácia miesta podobného CRE znížila bazálne hodnoty CCK aktivita promótora o 32% (Obrázok 4A, n = 9), ale neovplyvnila CCK indukcia promótora nadmernou expresiou ΔFosB (Obrázok 4Bn = 11-13). To naznačuje, že hoci CCK Promótor vyžaduje intaktné miesto podobné CRE pre úplnú bazálnu aktivitu, zvýšená aktivita promótora indukovaná nadmernou expresiou AFosB nevyžaduje sekvenciu podobnú CRE.

CCK- podobná stránka CRE nie je potrebná CCK indukcia AFosB. (A) CCKAktivita -luciferázy bola meraná 2 dní po transfekcii buď normálnou CCK-luciferáza alebo látka, v ktorej bolo mutované miesto podobné CRE. * p <0.05 (B) CCK-luciferase ...

cFos sa viaže na CCK zakladateľ

Predchádzajúce štúdie to zistili cFos mRNA sa zvyšuje s krátkodobou expresiou AFosB, avšak po predĺženej expresii AFosB sa znižuje schopnosť liečby kokaínom indukovať cFos v striate (McClung a Nestler, 2003; Renthal a kol., 2008). Preto by mohlo byť možné, že cFos prispieva k nárastu CCK expresia po krátkodobej expresii AFosB. Uskutočnili sme testy ChIP s protilátkou špecifickou pre cFos a nameranou väzbou cFos na CCK promótor s a bez krátkodobej expresie AFosB. Zatiaľ čo sme zistili, že cFos sa viaže na CCK táto väzba sa významne nezvýšila po nadmernej expresii AFosB (Obrázok 5n = 5). To naznačuje, že keďže cFos viaže CCK môže prispieť k všeobecnej regulácii. \ t CCK výraz, ale pravdepodobne nie je zapojený do regulácie. \ t CCK promótorom AFosB.

cFos sa viaže na CCK promótor. Testy imunoprecipitácie chromatínu sa uskutočňovali so špecifickou protilátkou pre cFos s použitím striatálneho tkaniva z myší s nadmernou expresiou AFosB buď na dox, alebo po 2 týždňoch odstránenia dox. PCR analýza v reálnom čase bola ...

DISKUSIA

Táto štúdia potvrdzuje a rozširuje predchádzajúce zistenia, ktoré ukazujú, že AFosB reguluje génovú expresiu v striate a zistíme, že tak robí prostredníctvom viacerých mechanizmov po krátkodobej expresii. Ukázali sme, že po 2 týždňoch nadmernej expresie sa AFosB viaže priamo na promótory v určitých génoch, čo vedie k zmenám v expresii (tj CDK5). Okrem toho zvyšuje hladiny proteínov CREB, účinok pozorovaný v kultivovaných bunkách, ako aj v striate, čo vedie k zvýšeniu väzby CREB u iných génových promótorov (napr. dynorfin a BDNF). V predchádzajúcej štúdii sme zistili, že krátkodobá nadmerná expresia AFosB v striate vedie k mnohým rovnakým zmenám génovej expresie, ktoré sa vyskytujú, keď je CREB nadmerne exprimovaný, a vedie k podobným reakciám na správanie pri meraní preferencií kokaínu (McClung a Nestler, 2003). Súčasné zistenie, že AFosB vedie k indukcii CREB, ako aj väzbu CREB na určité génové promótory, teda pomáha vysvetliť, prečo tieto dve transkripčné faktory zdieľali tak veľa zmien génovej expresie.

Indukcia CREB prostredníctvom AFosB je zaujímavá, pretože sa ukázalo, že zneužívané lieky indukujú zmeny hladín CREB fosforylovaného serínom 133 (Mattson a kol., 2005) a zvýšiť transkripciu sprostredkovanú CRE (Barrot a kol., 2002; Shaw-Lutchman a kol., 2002, 2003), bez zmeny celkovej úrovne CREB. Je možné, že zmeny hladín CREB môžu byť prechodné, a preto sa môžu ľahko vynechať v iných štúdiách. V našich rukách sme v konkrétnych experimentoch pozorovali zvýšenie CREB mRNA indukované kokaínom, tento účinok je však vysoko variabilný (nepublikované pozorovanie). Pretože transgénne myši 11A aj bunky PC-12 vykazujú indukciu CREB po krátkodobej nadmernej expresii AFosB, to naznačuje, že CREB je skutočne indukovaný AFosB (alebo cieľom AFosB), čím poskytuje ešte ďalší mechanizmus na vysvetlenie zmien vyvolaných liekmi v géne výrazom.

Prekvapivo sme zistili, že ani CREB, ani AFosB sa neviažu na CCK aj keď CCK Po expresii krátkodobého AFosB je expresia jasne zvýšená. Cck je bohatý neuropeptid exprimovaný ako VTA, tak NAc (Hokfelt a kol., 1980) a je pravdepodobne zapojený do behaviorálnych reakcií na drogy zneužívania (Josselyn et al., 1996; Josselyn a kol., 1997; Hamilton a kol., 2000; Beinfeld a kol., 2002; Rotzinger a kol., 2002). V skúškach bunkovej kultúry CCK promótor bol značne charakterizovaný a bolo preukázané, že reaguje na členov rodiny CREB a AP-1 (prehľad Hansen, 2001). Haun a Dixon (1990) ukázali, že AP-1 komplexy sa môžu viazať na CCK Stránka podobná CRE in vitroa neskôr sa ukázalo, že s použitím neuroblastómových buniek SK-N-MC táto mutácia miesta podobného CRE znížila citlivosť promótora na nadmerne exprimovanú cFos / cJun (Rourke a kol., 1999). Naozaj, tiež nájdeme zvýšené CCK aktivita promótora (Obrázok 2) a viazanie na alebo okolo prvku podobného CRE (Obrázok 3) po nadmernej expresii AFosB, ďalšieho člena rodiny AP-1, ale nenašli sme žiadnu priamu väzbu AFosB na CCK zakladateľ in vivo or in vitro, dokonca aj pri jeho nadmernej expresii.

Veľa práce preukázalo úlohu CREB pri regulácii. \ T CCK aktivity promótora. CCK Miesto podobné CRE je konzervované naprieč stavovcami (Hansen, 2001) a v niektorých testoch na bunkových kultúrach sa CREB aj AP-1 komplexy viažu na toto miesto a sú nevyhnutné pre CCK aktivita promótora (Haun a Dixon, 1990; Deavall a kol., 2000; Hansen, 2001). Okrem toho, niekoľko známych aktivátorov CCK (vrátane bFGF, PACAP, peptonov a depolarizácie) sa preukázalo, že pôsobia prostredníctvom CREB (Hansen a kol., 1999; Deavall a kol., 2000; Bernard a kol., 2001; Gevrey a kol., 2002; Hansen a kol., 2004). náš CCKÚdaje z reportérového génu -luciferázy podporujú podstatnú úlohu pre CRE-podobné miesto v regulácii CCK promótorovej aktivity, pretože mutácia tohto miesta znižuje bazálne hodnoty CCK aktivity promótora a CCKexpresia -luciferázy indukovaná VP16-CREB, konštitutívne aktívna forma CREB, sa stráca, keď je toto miesto mutované (nepublikované pozorovanie). Preto sme boli prekvapení, že CREB sa nezdá byť viazaný na CCK promótor v striatálnych extraktoch buď na základnej línii alebo na krátkodobej nadmernej expresii AFosB, keď sú hladiny CREB zvýšené. To tvrdí, že úrovne CREB sama o sebe nie sú jediným faktorom pri určovaní výšky záväzku na tejto stránke, a to je podporované prácou iných (Cha-Molstad a kol., 2004). Pretože promótory iných, predtým identifikovaných cieľových génov CREB, ako sú napr BDNF a prodynorphin, viazali CREB, sme presvedčení o našom zistení, že CREB nie je záväzný pre CCK promótor v striatálnych jadrových extraktoch. Okrem toho, indukcia CCKAktivita -luciferázy prostredníctvom AFosB nebola závislá od intaktného miesta podobného CRE, čo naznačuje, že AFosB neupravuje CCK reguláciou priameho viazania CREB na. \ t CCK promótor.

Naša neschopnosť odhaliť CREB interakciu s CCK je podporovaný Renthal a kol. (2009), ktorí použili ChIP-chip prístup na preskúmanie globálnych zmien vo fosforylovanom CREB (pCREB) a AFosB väzbe v striate po chronickej expozícii kokaínu. V týchto experimentoch boli komplexy DNA-proteín imunoprecipitované protilátkami AFosB alebo pCREB a precipitovaná DNA bola po značení hybridizovaná na promótorový mikročip. Zatiaľ čo s týmto prístupom boli identifikované mnohé predtým charakterizované cieľové gény CREB (napr. BDNF, prodynorfín), CCK nebol identifikovaný. Okrem toho sa preukázalo, že väzba CREB na konsenzus CRE miesto sa medzi kultivovanými bunkovými líniami značne líši (Cha-Molstad a kol., 2004). Všetky predchádzajúce štúdie, ktoré zistili interakcie CREB s. \ T CCK promótory boli uskutočňované v bunkovej kultúre (nie mozog, z ktorého boli získané naše vzorky EMSA a ChIP) a použité testy gélového posunu na skúmanie interakcií proteín-DNA. Zatiaľ čo EMSA môže vyhodnotiť potenciál faktora viazať sa na DNA sekvenciu, ChIP testy poskytujú nový pohľad na tieto interakcie. in vivo, Okrem toho väčšina údajov preukazujúcich buď indukciu CCK aktivity promótora alebo väzby CREB na. \ t CCK promótory boli získané z buniek, ktoré boli stimulované faktormi, ako sú peptony (Bernard a kol., 2001), depolarizácia (Hansen a kol., 2004), alebo rôzne aktivátory intracelulárnych signálnych kaskád vrátane cAMP a ERK (Hansen a kol., 1999). V našich experimentoch bol jediným „stimulom“ nadmerná expresia AFosB, ktorá je dostatočná na indukciu CCK výrazom. Celkovo to naznačuje, že schopnosť CREB viazať sa na (a potenciálne regulovať) CCK promótor je vysoko závislý od typu bunky a aktivácie určitých signálnych dráh. Okrem toho CCK Promótorový prvok podobný CRE (aspoň v neindukovaných bunkách PC12 a v myšom striate) nie je priamym cieľom ani CREB ani AFosB. Zaujímavé je, že regulácia FosB Expresia CREB je tiež špecifická pre bunkový typ a typ stimulácie. Štúdia Anderssona et al, zistili, že injekcia CREB antisense oligonukleotidov do striatum myši čiastočne inhibovala indukciu FosB po podaní kokaínu (\ tAndersson a kol., 2001). Zistili však tiež, že schopnosť L-Dopa indukovať FosB Expresia v striatu poškodenom 6-OHDA nebola ovplyvnená prítomnosťou CREB antisense oligonukleotidov.

Keďže sa zdá, že CREB a AFosB nepriamo regulujú. \ T CCK promótor a zmeny v štruktúre chromatínu boli dokumentované ako odozva na rôzne stimuly, ktoré indukujú AFosB (Tsankova a kol., 2004; Kumar a kol., 2005; Renthal a kol., 2008) sme usúdili, že AFosB by mohol nepriamo modulovať promótorovú aktivitu zmenou štruktúry chromatínu. Avšak u myší nadexprimujúcich AFosB po dobu 2 týždňov nedošlo k žiadnej zmene v acetylácii histónu H3 pri CCK promótor (Tabuľka 1). Toto je podporované údajmi čipu ChIP Renthal a kol. (2009), ktorá neuviedla žiadnu zmenu v väzbe acetylovaného H3 na. \ t CCK promótor u myší vystavených chronickému kokaínu. Od roku 2006. \ T CCK Účinok promótora v striate je aktívny, neočakáva sa ani pozoruje represívna metylovaná histónová väzba H3. Zaujímavé je, že sme tiež nevideli žiadnu zmenu v dôsledku nadmernej expresie AFosB v acetylovanej väzbe H3 na BDNF promótor (ktorý vykazoval zvýšenú väzbu CREB) alebo. \ t CDK5 a prodynorphin promótory (ktoré vykazovali zvýšené naviazanie AFosB). Pretože existuje mnoho nespočetných modifikácií histónov spojených so zmenami aktivity promótora (pozri prehľad Rando a Chang, 2009), pravdepodobne existujú iné modifikácie chromatínu, ktoré sa spájajú s indukciou týchto génov. Akákoľvek jednotlivá modifikácia chromatínu, hoci často predpovedá úroveň aktivity promótora, sa nesmie meniť počas aktivácie konkrétneho génu. V budúcej práci by bolo zaujímavé pozrieť sa na ďalšie potenciálne zmeny v štruktúre chromatínu v okolí CCK promótor po nadmernej expresii AFosB. Je zaujímavé, že chronický kokaín (pravdepodobne via Indukcia AFosB indukuje expresiu sirtuínu 1 a 2, histónových deacetyláz triedy III, ktoré pravdepodobne menia neuronálnu fyziológiu, signalizáciu ERK a reakcie na správanie kokaínu (Renthal a kol., 2009). Indukcia históndeacetylázy by mala schopnosť súčasne regulovať expresiu veľkého počtu génov via globálne zmeny v štruktúre chromatínu.

Jeden možný kandidát zapojený do CCK regulácia po nadmernej expresii AFosB bola členom rodiny AP-1 cFos. Expresia cFos je regulovaná CREB (Sheng a kol., 1990; Impey a kol., 2004) a zvýšená expresia cFos (zhodná s nadexpresiou jeho väzbového partnera cJun) sa zvyšuje CCK aktivita promótora (Rourke a kol., 1999). Zvýšené hladiny CREB v dôsledku krátkodobej nadmernej expresie AFosB by preto mohli zvýšiť hladiny cFos a viesť k zvýšenej väzbe na \ t CCK Stránka podobná CRE. CFO mRNA je indukovaná u myší po dvoch týždňoch nadmernej expresie AFosB (McClung a Nestler, 2003) a znížená u myší vystavených chronickej nadmernej expresii AFOSB alebo kokaínu (Renthal a kol., 2008). Tu zistíme, že cFos sa viaže priamo na CCK Nadmerná expresia AFosB však významne nezvyšuje väzbu. To naznačuje, že zatiaľ čo cFos by mohli byť zapojené do regulácie CCK Expresia všeobecne, zmena vo väzbe samotného cFos nie je pravdepodobne mechanizmom, ktorým reguluje AFosB CCK výrazom. Je však možné, že AFosB môže indukovať post-translačné zmeny v cFos (napr. Zmenenú fosforyláciu) alebo indukovať expresiu väzbového partnera (ako je cJun) alebo ko-aktivátorového proteínu. Pretože však intaktné miesto podobné CRE (ktoré bolo predtým preukázané ako väzbové miesto pre komplexy AP-1, pozri Haun a Dixon, 1990) nie je potrebné na zvýšenie CCK promótorová aktivita pozorovaná s nadmernou expresiou AFosB (ako sa hodnotí v našich pokusoch s reportérovými génmi) je logické, že iné trans-pôsobiace faktory sú tiež regulované AFosB.

CCK Promótorový fragment použitý v našich experimentoch luciferázového reportérového génu obsahuje konzervované Sp1 väzbové miesto a E-box (prehľad Hansen, 2002). Ukázalo sa, že najmä sekvencie E-boxu viažu početné transkripčné faktory (preskúmané Forrest a McNamara, 2004). Použitím buniek PC12 sme zistili, že mutácia E-boxu sa znižuje CCK aktivity promótora, ale nemení reakciu promótora na AFosB (údaje nie sú uvedené). Zaujímavé je, že CCKreportér obsahujúci -luciferázu obsahujúci mutácie v CRE mieste aj v E-boxe nemá žiadnu detegovateľnú bazálnu aktivitu a nereaguje na nadmernú expresiu AFosB (nepublikované pozorovanie). Ďalší potenciálny mediátor pôsobenia AFosB na. \ T CCK promótormi sú ATF, o ktorých je známe, že niektoré formy sú indukované v striatu chronickou psychostimulačnou expozíciou (Green et al., 2008). Nezistili sme však žiadny dôkaz o indukcii AFosB týchto ATF (údaje nie sú uvedené) a neočakáva sa, že by sa ATF viazali na mutované miesto podobné CRE na CCK promótor.

Jednou z námietok tejto štúdie je, že používame bi-transgénny systém na nadmernú expresiu AFosB, a preto musíme byť konzervatívni pri vykresľovaní paralel medzi touto paradigmou a podávaním chronického kokaínu. Transgénne myši 11A však poskytujú jedinečnú príležitosť pozrieť sa na špecifické účinky AFosB v striate, pretože nadmerná expresia je obmedzená na túto oblasť mozgu (Chen a kol., 1998), zatiaľ čo podávanie kokaínu indukuje zmeny v širokej škále iných oblastí mozgu, ktoré potom môžu nepriamo ovplyvniť striatum. Okrem toho niekoľko štúdií dokumentovalo podobné behaviorálne a molekulárne fenotypy u myší 11A v porovnaní s netransgénnymi zvieratami liečenými chronickým kokaínom (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003; Renthal a kol., 2009). navyše, Bibb a kol. (2001) podobné úrovne striatalu Cdk5 indukcia mRNA a proteínu v tomto rovnakom kmeni 11A v porovnaní s nekogénnymi súrodencami liečenými kokaínom, ako aj podobné zmeny v cieľoch CDK5, p35 a DARPP-32.

Na záver zistíme, že krátkodobá expresia AFosB vedie k indukcii génov v striate prostredníctvom viacerých mechanizmov. Patrí medzi ne priama väzba promótora, indukcia proteínu CREB a aktivita, modifikácia chromatínu, okrem ciest, ktoré ešte neboli stanovené.

EXPERIMENTÁLNE PROCEDÚRY

zver

V tejto štúdii boli použité samčie bi-transgénne zvieratá 11A (NSE-tTA x TetOP-AFosB) a sú charakterizované Kelz a kol., 1999, Na nadmernú expresiu AFosB boli myši odstránené z doxycyklínu medzi 3 a 6 týždňami veku, zatiaľ čo kontrolné myši boli udržiavané na doxycyklíne. Všetky myši boli chované v skupine a udržiavané na cykle 12: 12 svetlo / tma, rozsvietené svetlá pri 7 am a svetlá zhasnuté pri 7 pm, s ad lib prístup k potravinám a vode. Všetky experimenty na myšiach boli v súlade s protokolmi schválenými komisiou pre starostlivosť o zvieratá a ich použitie na University of Texas Southwestern Medical Center v Dallase.

Reportérové a expresné plazmidy

Divoký typ (WT) CCK reportér promotor-luciferáza sa pripravil vložením približne 200 bp PCR fragmentu do vektora pGL3-luc (Promega). Tento fragment sa získal z myšej genómovej DNA (priméry: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' upstream a 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' downstream) a pôvodne sa vložil do vektora pGEM-T Easy (Promega, #A1360). Promótorový fragment sa potom klonoval do miest restrikčného enzýmu Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Vytvorenie CRE bodovej mutácie v. \ T CCK promótor, mutagénny primér namierený proti predtým hlásenému miestu podobnému CRE (sense primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primér: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3') bol použitý v kombinácii so inštrukciou pre súpravu Stratagene Quik Change (II) . Týmto sa prevedie hlásené miesto podobné CRE (ACTGCGTCAGC) na ACTGAGCTCC. Všetky reportérové plazmidy sa potvrdili sekvenovaním DNA. Expresný plazmid AFosB obsahuje sekvenciu AFosB plnej dĺžky vloženú do mnohonásobného klonovacieho miesta pCDNA 3.1 a bol už skôr opísaný (Ulery a Nestler, 2007).

Bunková kultúra a transfekcie DNA

Bunky potkaného feochromocytómu (PC12) sa udržiavali v Dulbeccovom modifikovanom Eaglovom médiu F-12, doplnenom 10% konským sérom, 5% fetálnym hovädzím sérom a 1% penicilínom / streptomycínom pri 37 ° C a 5% CO₂. Bunky sa transfekovali elektroporáciou pomocou elektroporátora BTX 360 (350 V, 0 ohmov a 850 μF) v 800 ul Dulbeccovho fosfátového pufrovaného soľného roztoku v kyvetách s medzerou 4 mm s 10 μg reportéra a 5 μg expresného konštruktu. Na normalizáciu celkového množstva DNA sa použil prázdny vektorový plazmid (pCDNA). Po transfekcii boli bunky pestované na uvedených 35 mm miskách potiahnutých kolagénom po stanovenú dobu.

Testy luciferázy

Dva alebo tri dni po transfekcii boli bunky trikrát premyté Dulbeccovým fosfátom pufrovaným soľným roztokom, lyžované (použitím 3 mM glycylglycínu, 25 mM MgSO₄4mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1mM DTT), zozbierali a vyčistili centrifugáciou. 30 μL lyzátu sa kombinoval s 140 μL luciferázovým testovacím tlmivým roztokom (25mM glycylglycín, 15mM MgS04).₄4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM fosforečnanu draselného, 1 mM koenzýmu A, pH 7.8). Luminiscenčná aktivita bola meraná s použitím fluorescenčnej čítačky FLx-800 mikrodoštičiek po automatizovanej injekcii 40 μL 1mM luciferínu na jamku. Aktivita luciferázy bola normalizovaná na celkový obsah proteínu, ako bolo stanovené testom proteínu BioRad.

Skúška posunu elektroforetickej mobility

Jadrové extrakty z bilaterálnych rezov striata z bi-transgénnych myší 11A (ktoré sa uchovávali na alebo mimo doxycyklínu počas 2 alebo 8 týždňov) (McClung a Nestler, 2003) boli pripravené podľa Huang a Walters (1996). ³²P-značené dvojvláknové oligonukleotidové sondy boli pripravené s použitím protokolu systému Promega Gel Shift Assay (#E3300) a sondy boli purifikované s použitím Roche Quick Spin Columns. Konsenzusové sekvencie CRE a AP-1 boli od Promega (#E328A a E320B) a CCK CRE sekvencie boli (Cck-CRE sense: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTGCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Väzbové reakcie a elektroforéza sa uskutočnili s použitím modifikácií systému Promega Gel Shift Assay System (#E3300). 50,000 CPM značenej sondy sa spojila s 10 μg striatálnym jadrovým extraktom. Pred zavedením rádioaktívne značených sond sa pridala studená konkurenčná DNA alebo protilátky. Na supershift experimenty sa použilo 2 μg protilátky CREB (Upstate Biotechnology # 06-083). Reakcie boli podrobené elektroforéze na 4% polyakrylamidových géloch, vysušené a vystavené filmu (s použitím intenzívnych obrazoviek pre 1 hodinu až 2 dní).

imunoblotu

Pre bunky PC12 sa 35 mm doštičky transfekovaných buniek premyli v ľadovom Dulbeccovom fosfátom pufrovanom soľnom roztoku a lyzáty sa pripravili v ľadovom RIPA lyzačnom pufri (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCI, 5 mM EDTA, 1% deoxycholát, 1 Triton X-100, 0.1% dodecylsulfát sodný) obsahujúce inhibítory proteázy. Po sonifikácii, vyčistení a Bradfordovom proteínovom teste boli lyzáty úplne denaturované a 50 ug každej vzorky bolo podrobené elektroforéze na 10% SDS polyakrylamidových géloch. Proteíny sa preniesli na PVDF membránu, blokovali sa 1 hodinu v 3% odtučnenom suchom mlieku v Tris pufrovanom soľnom roztoku obsahujúcom 0.1% Tween-20 (TBS-T mlieko) a sondovali sa cez noc pri 4 ° C s primárnymi protilátkami (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, použitá v pomere 1: 1,000 8795; GAPDH-Sigma # G1, použitá v pomere 80,000: 1 5,000) zriedená v TBS-T mlieku. Po viacnásobnom premytí v TBS-T sa bloty sondovali jednu hodinu pri izbovej teplote s použitím sekundárnych protilátok konjugovaných s alkalickou fosfatázou (Sigma) zriedených 170: 6432 XNUMX v TBS-T mlieku. Po viacnásobnom premytí v soľnom roztoku pufrovanom Tris sa farebná reakcia uskutočnila podľa pokynov BioRad (# XNUMX-XNUMX). Membrány sa sušili cez noc, skenovali sa na plochom skeneri a denzitometria sa uskutočňovala pomocou ImageJ (pozri nižšie).

V prípade striatálnych extraktov boli testy Western blot uskutočňované tak, ako bolo publikované predtým (Hope a kol., 1994). Tkanivo bolo odstránené z dekapitovaných myší, umiestnené na ľad a rozrezané na mozgovej matrici v hrúbke 1 mm. Potom boli odobrané tkanivové raznice a zmrazené pri -80 ° C až do použitia. Tkanivo sa sonikovalo na ľade v modifikovanom pufri na báze detergentu, ktorý obsahoval inhibítory fosfatázy a proteázy (Roche, Sigma). Po sonikácii sa vzorky denaturovali vo vriacej vode a centrifugovali pri 15,000xg počas 15 minút; supernatant bol následne odobratý a spracovaný; Množstvo proteínovej koncentrácie sa potom kvantifikovalo použitím Bradfordovho testu (Bio-Rad). Vzorky sa spracovali na 10% akrylamidovom / bisakrylamidovom géli, preniesli na PVDF membránu, blokovali v mlieku 5% a inkubovali s primárnymi protilátkami (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Bloty sa následne vizualizovali použitím chemiluminiscenčného systému (Pierce). Všetky vzorky boli normalizované na GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Boli uskutočnené štandardné krivky, aby sa zaistilo, že sme v lineárnom rozsahu testu.

Denzitometrická analýza

Pre imunobloty PC12 sa uskutočnila denzitometrická analýza s použitím ImageJ s kalibráciou rodbardom. Od každého merania sa odpočítal priemerný signál pozadia a pre každú vzorku sa vypočítal pomer signálu CREB ku GAPDH. Na striatálne imunobloty a analýzu EMSA sa použil Scion Image 1.62c s odčítaním pozadia.

Chromatínová imunoprecipitácia (ChIP)

Testy ChIP sa uskutočňovali podľa metód Tsankova a kol. (2004) a Kumar a kol. (2005). Stručne, dvojstranné striatálne vzorky z 11A myší udržiavané na alebo mimo doxycyklínu boli zosieťované 1% formaldehydom a zosieťovanie bolo ukončené glycínom (konečná koncentrácia 0.125 M). Tieto vzorky boli z celých mozgových rezov odobratých na úrovni nucleus accumbens s odstránenou kôrou. Chromatín sa strihal pôsobením ultrazvuku na fragmenty s veľkosťou približne 0.2 až 1 kb, vyčistil sa pomocou guľôčok proteínu G (Thermo Scientific # 22852) a vstupné vzorky sa zmrazili na -80 ° C. Na každé vyzrážanie sa použilo 60 až 100 μg chromatínu. Použilo sa 5-10 μg každej primárnej protilátky (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetylovaná H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metylovaná H3 (LYS9): Cell Signaling Technology, cFos: Santa Cruz Biotechnology # SC-7202x). Komplexy protilátka-chromatín sa imunoprecipitovali s guľôčkami Protein G plus podľa pokynov výrobcu (Thermo Scientific # 22852). Po reverznom zosieťovaní vstupných a vyzrážaných vzoriek sa každá vzorka podrobila kvantitatívnej PCR (qPCR). Použitie všetkých týchto protilátok na ChIP bolo rozsiahlo validované (Tsankova a kol., 2004; Kumar a kol., 2005; Renthal a kol., 2009).

Hladiny väzby proteínu na každom požadovanom génovom promótore boli stanovené meraním množstva asociovanej DNA pomocou qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Vstup alebo celková DNA (neimunoprecipitovaná) a imunoprecipitovaná DNA sa amplifikovali trojmo v prítomnosti SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Hodnoty Ct z každej vzorky boli získané pomocou softvéru Sequence Detector 1.1. Relatívna kvantifikácia templátovej DNA sa uskutočnila s použitím metódy AACt (Tsankova a kol., 2004). Použité priméry: BDNF promótor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5 promótor: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promótor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG Prodynorfínový promótor: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Štatistická analýza

Všetky údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná chyba priemeru. Štatistický rozdiel sa stanovil pomocou Studentovho obojstranného t-testu (p <0.05). Keď sa urobilo viac porovnaní, p-hodnoty sa upravili pomocou Bonferroniho korekcie.

Poďakovanie

Radi by sme poďakovali Willovi Renthalovi a Arvindovi Kumarovi za užitočné diskusie. Taktiež by sme chceli poďakovať NIDA za financovanie týchto experimentov.

poznámky pod čiarou

Zrieknutie sa zodpovednosti vydavateľa: Toto je súbor PDF s neupraveným rukopisom, ktorý bol prijatý na uverejnenie. Ako službu pre našich zákazníkov poskytujeme túto skoršiu verziu rukopisu. Rukopis sa podrobí kopírovaniu, sádzaniu a preskúmaniu výsledného dôkazu skôr, ako sa uverejní vo svojej konečnej podobe. Upozorňujeme, že počas výrobného procesu môžu byť zistené chyby, ktoré by mohli mať vplyv na obsah, a všetky právne zrieknutia sa zodpovednosti, ktoré sa vzťahujú na časopis.

Termíny klasifikácie:

Sekcia: #1 Bunková a molekulárna biológia nervových systémov

Referencie

Andersson M, Konradi C, Cenci MA. Proteín viažuci sa na cAMP odozvu sa vyžaduje pre expresiu génu závislú od dopamínu v intaktnom, ale nie v dopaminom denervovanom striate. J Neurosci. 2001, 21: 9930-43. [PubMed]
Barrot M., Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. Aktivita CREB v jadre nucleus accumbens kontroluje bránenie reakcií správania na emocionálne podnety. Proc Natl Acad Sci US A. 2002: 99: 11435 – 40. [Článok bez PMC] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Liečba kokaínom zvyšuje extracelulárny cholecystokinín (CCK) v jadre accumbens shell bdelého, voľne sa pohybujúceho potkana, čo je účinok, ktorý je zosilnený u potkanov, ktoré sú behaviorálne senzitivizované na kokaín. J Neurochem. 2002, 81: 1021-7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptones stimulujú transkripciu génu črevného cholecystokinínu prostredníctvom faktorov viažucich cyklické adenozínmonofosfátové elementy. Endocrinology. 2001, 142: 721-9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Účinky chronickej expozície kokaínu sú regulované neurónovým proteínom Cdk5. Nature. 2001, 410: 376-80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Väzba transkripčného faktora CREB špecifická pre bunkový typ na prvok odpovedajúci na cAMP. Proc Natl Acad Sci US A. 2004: 101: 13572 – 7. [Článok bez PMC] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Regulácia delta FosB a FosB-podobných proteínov elektrokonvulzívnou záchvatovou a kokaínovou liečbou. Mol Pharmacol. 1995, 48: 880-9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgénne zvieratá s indukovateľnou, cielenou expresiou génu v mozgu. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Indukcia cyklín-dependentnej kinázy 5 v hipokampuse chronickými elektrokonvulzívnymi záchvatmi: úloha AFosB. J Neurosci. 2000, 20: 8965-71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Blízke stretnutia mnohých druhov: interakcie Fos-Jun, ktoré sprostredkúvajú regulačnú špecifickosť transkripcie. Oncogene. 2001, 20: 2438-52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Neuronálna adaptácia na amfetamín a dopamín: molekulárne mechanizmy regulácie prodynorfínového génu v striatum potkana. Neurón. 1995, 14: 813-23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Kontrola transkripcie génu CCK pomocou PACAP v bunkách STC-1. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2000, 279: G605-12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergná regulácia obsahu mRNA cholecystokinínu v striatume potkana. Brain Res Mol Brain Res. 1992, 12: 77-83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Id rodiny transkripčných faktorov a tvorby vaskulárnych lézií. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004, 24: 2014-20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M., Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Ko-požiadavka na cyklické AMP- a vápnikovo závislé proteínkinázy na transkripčnú aktiváciu génu cholecystokinínu proteínovými hydrolyzátmi. J. Biol. Chem. 2002, 277: 22407-13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Indukcia aktivačných transkripčných faktorov (ATF) ATF2, ATF3 a ATF4 v nucleus accumbens a ich regulácia emocionálneho správania. J Neurosci. 2008, 28: 2025-32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Preplnenie dopamínu a cholecystokinínu v jadre potkana sa v reakcii na akútne podanie liečiva. Synapsie. 2000, 38: 238-42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogénom aktivovaná proteínkináza a proteínkináza A signálne dráhy stimulujú transkripciu cholecystokinínu prostredníctvom aktivácie proteínu viažuceho sa na prvok cyklickej adenozín 3 ', 5'-monofosfátovej odpovede. Mol Endocrinol. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Regulácia transkripcie génu neuronálneho cholecystokinínu. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001, 234: 61-7. [PubMed]
Hansen TV. Transkripcia génu cholecystokinínu: promótorové elementy, transkripčné faktory a signálne dráhy. Peptidy. 2001, 22: 1201-11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl a forskolín synergicky up-regulujú expresiu génu cholecystokinínu prostredníctvom koordinovanej aktivácie CREB a ko-aktivátora CBP. J Neurochem. 2004, 89: 15-23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Zosilňovač transkripcie nevyhnutný na expresiu génu potkanieho cholecystokinínu obsahuje sekvenciu identickú s elementom -296 ľudského génu c-fos. J. Biol. Chem. 1990, 265: 15455-63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Podstatná úloha fosB génu pri molekulárnych, bunkových a behaviorálnych účinkoch chronických elektrokonvulzívnych záchvatov. J Neurosci 1998. 1998, 18: 6952-62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Dôkazy o koexistencii dopamínu a CCK v meso-limbických neurónoch. Nature. 1980, 285: 476-8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Chronická liečba elektrokonvulzívnym záchvatom (ECS) vedie k expresii dlhodobého komplexu AP-1 v mozgu so zmeneným zložením a charakteristikami. J Neurosci. 1994, 14: 4318-28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Indukcia dlhodobého AP-1 komplexu pozostávajúceho z pozmenených proteínov typu Fos v mozgu chronickým kokaínom a inými chronickými liečeniami. Neurón. 1994, 13: 1235-44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergná regulácia väzbovej aktivity DNA transkripčného faktora AP-1 v striatume potkana. Neuroscience. 1996, 75: 757-75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Definovanie CREB regulonu: genómová analýza regulačných oblastí transkripčného faktora. Bunka. 2004, 119: 1041-54. [PubMed]
Johannessen M, Delghandi MP, Moens U. Čo robí CREB? Cell Signal. 2004, 16: 1211-27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Protichodné účinky antagonistov CCK (A) a CCK (B) na vývoj podmienenej aktivity u potkanov. Behav Pharmacol. 1996, 7: 505-512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Dôkaz o CCK (A) receptorovom zapojení pri získavaní podmienenej aktivity produkovanej kokaínom u potkanov. Brain Res. 1997, 763: 93-102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Expresia transkripčného faktora deltaFosB v mozgu riadi citlivosť na kokaín. Nature. 1999, 401: 272-6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatínová remodelácia je kľúčovým mechanizmom, ktorý je základom plasticity indukovanej kokaínom v striate. Neurón. 2005, 48: 303-14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Fosforylácia CREB indukovaná kokaínom v nucleus accumbens potkanov senzibilizovaných kokaínom je umožnená zvýšenou aktiváciou extracelulárnej signálnej kinázy, ale nie proteínkinázy A. J Neurochem. 2005, 95: 1481-94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulácia génovej expresie a odmeňovania kokaínom CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulárny prepínač pre dlhodobú adaptáciu v mozgu. Brain Res Mol Brain Res. 2004, 132: 146-54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. AFosB: Molekulárny mediátor dlhodobej neurálnej a behaviorálnej plasticity. Brain Res. 1999, 835: 10-17. [PubMed]
Nestler EJ. Existuje spoločná molekulárna cesta pre závislosť? Nat Neurosci. 2005, 8: 1445-9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkripčné mechanizmy závislosti: úloha DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-55. [Článok bez PMC] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Výrazné vzory indukcie DeltaFosB v mozgu drogami zneužívania. Synapsie. 2008, 62: 358-69. [Článok bez PMC] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Pohľady chromatínovej štruktúry na celý genóm. Annu Rev Biochem. 2009, 78: 245-71. [Článok bez PMC] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd, Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB sprostredkováva epigenetickú desenzibilizáciu génu c-fos po chronickej expozícii amfetamínu. J Neurosci. 2008, 28: 7344-9. [Článok bez PMC] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Nestler EJ. Genómová analýza regulácie chromatínu pomocou kokaínu odhaľuje úlohu sirtuínov. Neurón. 2009, 62: 335-48. [Článok bez PMC] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Cholecystokinínová modulácia mezolimbickej dopamínovej funkcie: regulácia motivovaného správania. Pharmacol Toxicol. 2002, 91: 404-13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negatívna kooperatívnosť medzi juxtaponovanými E-boxmi a cAMP / TPA responzívnymi prvkami v promótore génu cholecystokinínu. FEBS Lett. 1999, 448: 15-8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regionálne a bunkové mapovanie CRE-sprostredkovanej transkripcie počas abstinencie morfínu vyzrážaného naltrexónom. J Neurosci. 2002, 22: 3663-3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Regulácia transkripcie sprostredkovanej CRE v mozgu myší amfetamínom. Synapsie. 2003, 48: 10-7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membránová depolarizácia a vápnik indukujú transkripciu c-fos prostredníctvom fosforylácie transkripčného faktora CREB. Neurón. 1990, 4: 571-82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Modifikácie histónov v oblastiach promótorov génov v hipokampuse potkanov po akútnych a chronických elektrokonvulzívnych záchvatoch. J Neurosci. 2004, 24: 5603-10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulácia transkripčnej aktivity DeltaFosB fosforyláciou Ser27. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus accumbens interakcie dopamín-CCK pri psychostimulačnej odmene a súvisiacom správaní. Neurosci Biobehav Rev. 1992, 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. AFosB: Základná úloha pre AFosB v nucleus accumbens pri účinku morfínu. Nature Neurosci. 2006, 9: 205-11. [PubMed]