Indukcia DeltaFosB v orbitofronálnej kôre potencuje lokomotorickú senzibilizáciu napriek zoslabeniu kognitívnej dysfunkcie spôsobenej kokaínom (2009)

2. metódy

Všetky experimenty sa uskutočňovali v prísnom súlade s NIH Guide for Care and Use Laboratory Animals a boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a použitie na UT Southwestern.

2.5. Kvantifikácia mRNA

Potkany dostali intra-OFC injekcie AAV-GFP alebo AAV-AFosB, po ktorých nasledoval 21 dvakrát denne injekcie fyziologického roztoku alebo kokaínu, presne tak, ako je opísané pre behaviorálne experimenty. Zvieratá sa použili 24 h po poslednej injekcii fyziologického roztoku alebo kokaínu. Potkany sa usmrtili dekapitáciou. Mozgy sa rýchlo extrahovali a získali sa bilaterálne 1 mm hrubé 12 kalibračné razníky NAc a okamžite sa zmrazili a uskladnili pri -80 ° C až do izolácie RNA. Raznice z OFC boli tiež odstránené na analýzu pomocou DNA mikročipu, ktorý potvrdil úspešný prenos génov sprostredkovaný vírusmi v tejto oblasti (pozri (Winstanley a kol., 2007) pre podrobnejšie výsledky). RNA bola extrahovaná zo vzoriek NAc s použitím činidla RNA Stat-60 (Teltest, Houston, TX) podľa inštrukcií výrobcu. Kontaminujúca DNA bola odstránená pôsobením DNázy (DNA-Free, katalóg # 1906, Ambion, Austin TX). Purifikovaná RNA bola reverzne transkribovaná do cDNA (Superscript First Strand Synthesis, Catalog # 12371-019; Invitrogen). Transkripty pre požadované gény boli kvantifikované pomocou qPCR v reálnom čase (SYBR Green; Applied Biosystems, Foster City, CA) na termocykleri Stratxene (La Jolla, CA) Mx5000p 96. Všetky priméry boli syntetizované na zákazku operónom (Huntsville, AL; pozri Tabuľka 1 pre sekvencie) a pred experimentami overené na linearitu a špecificitu. Všetky PCR údaje boli normalizované na hladiny glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH), ktorá nebola ovplyvnená liečbou kokaínom, podľa nasledujúceho vzorca: ΔC_t =C_t(požadovaný gén) - C_t (GAPDH). Upravené hladiny expresie pre potkany AAV-AFosB a AAV-GFP, ktorým bol podávaný kokaín, a potkany AAV-AFosB, ktorým bol podávaný chronický fyziologický roztok, boli potom vypočítané v porovnaní s kontrolami (skupina AAV-GFP, ktorým bol podávaný chronický fyziologický roztok) nasledujúcim spôsobom: AAC_t = ΔC_t - AC_t (kontrolná skupina). V súlade s odporúčanou praxou v danej oblasti (Livak a Schmittgen, 2001), potom sa expresné hladiny v porovnaní s kontrolami vypočítali pomocou nasledujúceho výrazu: 2^-ΔΔCt.

  

Tabuľka 1

Sekvencia primérov použitých na kvantifikáciu hladín cDNA prostredníctvom PCR v reálnom čase.

3. výsledok

experiment 1

Chronické podávanie kokaínu vyvoláva senzibilizáciu na hyperlokomotorické účinky akútneho kokaínu, ktorý je napodobňovaný AFosB.

Ako by sa dalo očakávať, silná lokomotorická senzibilizácia sa pozorovala u kontrolných zvierat po chronickej expozícii kokaínu, pričom zvieratá liečené chronicky kokaínom vykazovali zvýšenú hyperaktivitu v reakcii na akútnu kokaínovú výzvu (Obrázok 1A, chronická liečba: F_1,34 = 4.325, p<0.045). Zvieratá nadmerne exprimujúce ΔJunD, dominantný negatívny mutant JunD, ktorý pôsobí ako antagonista ΔFosB (Zachariou a kol., 2006), v OFC boli nerozoznateľné od kontrolných zvierat (\ tObrázok 1C, GFP vs unJunD, skupina: F_{1, 56} = 1.509, NS). Zvieratá nadmerne exprimujúce AFosB v OFC, ktoré dostávali opakované injekcie fyziologického roztoku, sa však zdali byť „precitlivené“: vykazovali zvýšenú lokomotorickú odpoveď na akútny kokaín, ktorý bol nerozoznateľný od senzibilizovanej reakcie ich náprotivkov liečených chronickým kokaínom (Obrázok 1B, GFP vs operácia AFosB × chronická liečba: F_{1, 56} = 3.926, p<0.052; ΔFosB iba: chronická liečba: F_1,22 = 0.664, NS). Zvieratá AFosB boli mierne hyperaktívne v prvom 15 min, ktoré boli umiestnené do lokomotorických boxov (GFP vs AFosB, chirurgia: F_1,56 = 4.229, p <0.04), ale hladiny lokomočnej aktivity boli porovnateľné s kontrolami 15 minút pred podaním kokaínu (chirurgický zákrok: F_{1, 56} = 0.138, NS).

  

Obr. 1

Lokomotorická senzibilizácia na kokaín. Akútny kokaín spôsobil väčšie zvýšenie lokomotorickej aktivity u kontrolných zvierat liečených chronicky kokaínom oproti fyziologickému roztoku (panel A). U zvierat nadmerne exprimujúcich AFosB (panel B), tie, ktorým bol podávaný opakovaný fyziologický roztok (viac ...)

Keď vezmeme do úvahy, že pri podávaní kokaínu počas 5CSRT, rovnaké zvieratá vykazovali relatívne zvýšenú schopnosť zadržať pred uskutočnením predčasných motorických odpovedí, táto hyperaktivita sa javí špecifická pre ambulantnú lokomóciu, tj druh pohybu, ktorý sa typicky zaznamenáva v štúdiách lokomotorickej senzibilizácie. Hoci zvýšená aktivita v odozve na stimulačné liečivá by mohla odrážať anxiogénny profil, nadmerná expresia AFFB v intra-OFC nezvyšuje úzkosť, ako sa meria pomocou testu so zvýšeným plus bludiskom alebo testom s otvoreným poľom (údaje nie sú uvedené). Zvieratá boli tiež dobre zvyknutí na IP injekcie a injekcie fyziologického roztoku nezmenili ich kognitívny výkon (Winstanley a kol., 2007), preto tento motorický účinok nemožno pripísať všeobecnej odpovedi na IP injekciu. V súhrne tieto zistenia naznačujú, že indukcia AFosB v OFC je dostatočná (ale nie nevyhnutná) pre senzibilizovanú lokomotorickú reakciu na kokaín, aj keď AFosB v tej istej oblasti spôsobuje toleranciu voči účinkom kokaínu na motiváciu a impulzívnosť (Winstanley a kol., 2007).

3.1. ΔFosB / FosB

Hladiny FosB mRNA v NAc neboli zmenené ani chronickou liečbou (Obrázok 2A, liek: F_1,14 = 1.179, ns) alebo expresia AFosB v OFC (chirurgia: F_{1, 14} = 0.235, ns). Avšak hladiny ΔFosB boli signifikantne vyššie u zvierat liečených chronicky kokaínom v súlade s predchádzajúcimi hláseniami (Chen a kol., 1997); Obrázok 2B, liek: F_1,14 = 7.140, p<0.022). Je zaujímavé, že množstvo AFOSB mRNA v NAc zvierat liečených soľným roztokom bolo nižšie u tých, u ktorých bol tento transkripčný faktor nadmerne exprimovaný v OFC (liečivo: F_1,14 = 9.362, p<0.011). Absencia interakcie liek × chirurgický zákrok však naznačuje, že chronická liečba kokaínom mala rovnaký účinok ako v skupinách liečených AAV-GFP, tak aj AAV-ΔFosB, čím úmerne zvyšovala hladiny ΔFosB v podobnom rozsahu (liek × chirurgický zákrok: F_{1, 14} = 0.302, ns).

  

Obr. 2

Zmeny v mRNA v NAc zvierat nadexprimujúcich buď GFP alebo AFosB v OFC, a liečené chronicky buď fyziologickým roztokom alebo kokaínom. Údaje indikujú lineárne násobné zmeny v expresii ako podiel kontrolných hodnôt. Zobrazené údaje sú (viac ...)

4. diskusia

Tu sme ukázali, že nadmerná expresia AFosB v OFC senzibilizovala potkany na lokomotorický stimulačný účinok kokaínu, napodobňujúcich akcie chronického podávania kokaínu. Doteraz sme ukázali, že výkonnosť tých istých zvierat na 5CSRT a paradigmách oneskoreného diskontovania je menej ovplyvnená akútnym kokaínom a že podobný účinok podobný tolerancii je pozorovaný po opakovanej expozícii kokaínu. Senzibilizácia a tolerancia k rôznym účinkom kokaínu sa teda môže pozorovať u tých istých zvierat, pričom obidve adaptácie sprostredkované rovnakou molekulou, AFosB, pôsobia v rovnakej oblasti mozgu. Skutočnosť, že obidva javy môžu byť súčasne vyvolané napodobňovaním jedného z účinkov kokaínu na jedinom frontokokortálnom mieste, zdôrazňuje význam kortikálnych oblastí v následkoch chronického príjmu liekov., Okrem toho tieto údaje naznačujú, že tolerancia a senzibilizácia odrážajú dva zdanlivo kontrastné, ale úzko súvisiace aspekty odpovede na návykové lieky.

Vzhľadom na to, že zvýšená expresia AFosB v NAc je kriticky zapojená do vývoja lokomotorickej senzibilizácie, jedna pravdepodobná hypotéza by bola, že nadmerná expresia AFosB v OFC vopred senzibilizuje zvieratá na kokaín zvýšením hladiny AFosB v NAc. Zistil sa však inverzný výsledok: hladiny AFosB v NAc boli signifikantne nižšie u zvierat nadmerne exprimujúcich AFosB v OFC. Dôsledky správania tohto poklesu NAc AFosB je ťažké interpretovať, pretože inhibícia účinkov AFosB prostredníctvom nadmernej expresie AJunD v tejto oblasti znižuje mnohé účinky kokaínu u myší (Peakman a kol., 2003). Medzi týmito pozorovaniami a pozorovaniami týkajúcimi sa dopamínového systému existujú určité paralely. Napríklad čiastočná deplécia dopamínu v NAc môže viesť k hyperaktivite, ako je priama aplikácia agonistov dopamínu v tejto oblasti (Bachtell a kol., 2005; Costall a kol., 1984; Parkinson a kol., 2002; Winstanley a kol., 2005b). Podobne skutočnosť, že zvýšenie kortikálnych hladín AFosB môže znížiť subkortikálnu expresiu, pripomína dobre zistené zistenie, že zvýšenie prefrontálneho dopaminergného prenosu je často sprevádzané recipročným poklesom hladín striatálneho dopamínu (Deutch a kol., 1990; Mitchell a Gratton, 1992). Ako takýto mechanizmus spätnej väzby môže fungovať pre intracelulárne signálne molekuly je v súčasnosti nejasný, ale môže odrážať zmeny vo všeobecnej aktivite určitých neurónových sietí spôsobenej zmenou transkripcie génov. Zvýšenie AFosB v OFC vedie napríklad k zvýšeniu lokálnej inhibičnej aktivity, čo dokazuje zvýšenie hladín GABA._A receptor, mGluR5 receptor a substancia P, ako sa detegovala pomocou analýzy microarray (\ tWinstanley a kol., 2007). Táto zmena aktivity OFC by potom mohla ovplyvniť aktivitu v iných oblastiach mozgu, čo by mohlo viesť k lokálnej zmene expresie AFosB. To, či hladiny AFosB odrážajú relatívne zmeny v dopamínovej aktivite, je otázkou, ktorá si vyžaduje ďalšie skúmanie.

Všetky zvieratá vykazovali signifikantné zvýšenie hladín mRNA AFosB v NAc po chronickej liečbe kokaínom v súlade s predchádzajúcimi hláseniami o zvýšených hladinách proteínov (Chen a kol., 1997; Hope a kol., 1992; Nye a kol., 1995). Nedávna správa však zistila, že hladiny AFosB mRNA už neboli významne zvýšené 24 h po chronickej liečbe amfetamínom, hoci významné zvýšenie bolo pozorované 3 h po poslednej injekcii (Alibhai a kol., 2007). Tento rozdiel môže byť spôsobený rozdielom v užívanom psychostimulačnom lieku (kokaín proti amfetamínu), ale vzhľadom na kratší polčas rozpadu kokaínu by bolo rozumné očakávať, že jeho účinky na expresiu génu by sa normalizovali rýchlejšie ako účinky amfetamínu, a nie naopak. Vhodnejším dôvodom týchto odlišných výsledkov je to, že zvieratám v tejto štúdii sa injekčne podala stredná dávka lieku dvakrát denne počas 21 dní v porovnaní s jednorazovou vysokou dávkou injekcie počas 7 dní (Alibhai a kol., 2007). Rozšírenejší režim liečby mohol viesť k výraznejším pozorovaným zmenám.

Hoci zmeny v génovej expresii pozorované v NAc po chronickom kokaíne sú vo všeobecnosti v zhode s predtým publikovanými nálezmi, rozsah účinkov je v súčasnej štúdii menší. Jedným z možných dôvodov je, že zvieratá boli usmrtené iba 24 h po poslednej injekcii kokaínu, zatiaľ čo väčšina štúdií použila tkanivo získané dva týždne od poslednej expozície lieku. Štúdie skúmajúce časový priebeh lokomotorickej senzibilizácie naznačujú, že v tomto neskoršom časovom bode sú pozorované výraznejšie zmeny v správaní a expresii génu / proteínu. Hoci uvádzame mierny nárast mRNA pre dopamín D₂ Všeobecným konsenzom je, že úrovne expresie D₂ alebo D₁ Po rozvoji lokomotorickej senzibilizácie nie sú receptory permanentne zmenené, hoci v D sa zvyšuje aj znižuje₂ krátko po ukončení senzibilizačného režimu (pozri (pozri časť 4.4).Pierce a Kalivas, 1997) na diskusiu). Naše pozorovanie, že GluR1 a GluR2 mRNA sa nezmenili po chronickej liečbe kokaínom v tomto skorom časovom bode, je tiež v súlade s predchádzajúcou správou (Fitzgerald a kol., 1996), hoci zvýšenie mRNA GluR1 bolo zistené v neskorších časových bodoch po ukončení chronickej psychostimulačnej liečby (\ tChurchill a kol., 1999).

Zaznamenali sme však malé zvýšenie PSD95 mRNA v NAc zvierat liečených chronicky kokaínom. PSD95 je molekula lešenia a je jedným z hlavných proteínov v postsynaptickej hustote excitačných synapsií. Na synapse zakotvuje niekoľko receptorov glutamátu a pridružených signálnych proteínov a predpokladá sa, že zvýšenie expresie PSD95 odráža zvýšenú synaptickú aktivitu a zvýšenú inzerciu a stabilizáciu receptorov glutamátu v synapsiach (van Zundert a kol., 2004). Úloha PSD95 pri rozvoji lokomotorickej senzibilizácie bola navrhnutá predtým (Yao a kol., 2004).

Zvýšenie expresie Arc tiež súvisí so zvýšením synaptickej aktivity. Aj keď sa pozorovalo zvýšenie expresie Arc v NAc 50 min po injekcii amfetamínu (\ tKlebaur a kol., 2002), naše údaje naznačujú, že chronické podávanie kokaínu nezvyšuje Arc v NAc natrvalo, aj keď sa pozorovalo zvýšenie Arc 24 h po chronickom podávaní antidepresív (Larsen a kol., 2007) a amfetamínu (\ tUjike a kol., 2002). Zvýšenie fosforylácie CREB sa pozorovalo aj v NAc po akútnom podaní kokaínu a amfetamínu (Kano a kol., 1995; Konradi a kol., 1994; Self a kol., 1998), ale možno nie je prekvapujúce, že po chronickom podávaní kokaínu nebolo pozorované žiadne zvýšenie CREB mRNA. Predpokladá sa, že signalizácia cez CREB dráhu je dôležitejšia v počiatočných fázach užívania liekov, pričom transkripčné faktory, ako napríklad AFosB, budú dominovať v priebehu progresie závislosti (McClung a Nestler, 2003). Hoci sa CREB podieľa na účinku odmeňovania kokaínu (Carlezon a kol., 1998), neboli hlásené, že zvyšujúca sa expresia CREB ovplyvňuje senzibilizáciu lokomotorického systému, hoci zvýšenie endogénneho dominantného negatívneho antagonistu CREB, indukovateľného skorého represorového proteínu cAMP alebo ICER, sprostredkovaného vírusom, zvyšuje hyperaktivitu spôsobenú akútnou injekciou amfetamínu (Green et al., 2006).

Stručne povedané, hoci väčšina pozorovaných zmien vyvolaných liečivom je v súlade s predikciami z literatúry, nezistili sme žiadne zmeny v expresii génov v NAc, ktoré by mohli vysvetliť senzibilizovanú lokomotorickú odpoveď na kokaín pozorovanú u liečených naivných zvierat. s intra-OFC AAV-AFosB. To zvyšuje možnosť, že zvýšenie AFosB v OFC nemusí ovplyvňovať senzibilizáciu motora prostredníctvom NAc, hoci by mohlo byť možné zapojiť mnoho ďalších génov, ktoré tu neboli študované. Značné dôkazy naznačujú, že modulácia mediálneho prefrontálneho kortexu (mPFC) môže zmeniť striatálnu aktivitu a tým prispieť k behaviorálnej senzibilizácii psychostimulancií (Steketee, 2003; Steketee a Walsh, 2005), hoci menej je známe o úlohe viac ventrálnych prefrontálnych oblastí, ako je OFC. NAc prijíma niektoré projekcie z OFC (Berendse a kol., 1992). Avšak novšia a podrobnejšia štúdia identifikovala len veľmi málo priamych projekcií OFC-NAc: zriedkavé značenie naj laterálnejšej časti NAc škrupiny bolo pozorované po injekciách anterográdneho indikátora do laterálnych a ventrolaterálnych oblastí OFC a naj ventrálnejšej OFC. región pošle minimálne projekcie do jadra NAc (Schilman a kol., 2008). Centrálna caudate-putamen dostáva oveľa hustejšiu inerváciu. Vo svetle tohto anatomického dôkazu by väčšina tkaniva NAc analyzovaného v našich PCR reakciách nebola priamo inervovaná OFC, čo by znížilo pravdepodobnosť, že akékoľvek zmeny v génovej expresii by boli úspešne detegované.

OFC silne premieta do regiónov, ktoré sú silne spojené s NAc, ako je mPFC, basolaterálna amygdala (BLA), kaudát putamen a subtalamické jadro (STN). Otázka, či zmeny v OFC môžu nepriamo modulovať fungovanie NAc prostredníctvom jej vplyvu v týchto oblastiach, je otvorenou otázkou. Ukázalo sa, že aktivita v BLA sa mení po OFC léziách a že to významne prispieva k deficitom reverzného učenia spôsobeného poškodením OFC (Stalnaker a kol., 2007), ale žiadne účinky v oblastiach, ako je NAc, ešte neboli nahlásené. Môže byť produktívnejšie zamerať pozornosť na iné oblasti silnejšie prepojené s OFC a ktoré sú tiež silne zapojené do riadenia motora. Zvlášť sľubným cieľom je STN, pretože nielen lézie STN a OFC majú podobné účinky na impulzívnosť a Pavlovovské učenie (Baunez a Robbins, 1997; Chudasama a kol., 2003; Uslaner a Robinson, 2006; Winstanley a kol., 2005a), ale psychostimulačná indukovaná lokomotorická senzibilizácia je spojená so zvýšením expresie c-Fos v tejto oblasti (Uslaner a kol., 2003). Budú zaručené budúce experimenty určené na testovanie toho, ako zmeny vyvolané liečivom v génovej expresii v OFC ovplyvňujú fungovanie oblastí po prúde, ako je STN. OFC tiež vysiela malú projekciu do ventrálnej tegmentálnej oblasti (Geisler a kol., 2007), oblasti, o ktorej je známe, že sa kriticky podieľa na rozvoji lokomotorickej senzibilizácie. Je možné, že nadmerná expresia AFosB v OFC môže teda ovplyvniť lokomotorickú senzibilizáciu prostredníctvom tejto dráhy.

Presná povaha vzťahu medzi liekmi indukovanými zmenami kognitívnych funkcií a lokomotorickej senzibilizácie je v súčasnosti nejasná a doteraz sme sa zamerali na OFC. Vzhľadom na tieto zistenia je možné, že zmeny v génovej expresii spojené s rozvojom lokomotorickej senzibilizácie v iných oblastiach mozgu môžu mať naopak určitý vplyv na kognitívnu reakciu na kokaín. Experimenty, ktoré skúmajú súhru medzi kortikálnymi a subkortikálnymi oblasťami po podaní návykových liekov, môžu vrhnúť nové svetlo na to, ako sa vytvára a udržiava závislý stav, a na interaktívne úlohy, ktoré v tomto procese zohrávajú senzibilizácia a tolerancia.

Referencie