Biol Psychiatry. 2008 Dec 1; 64 (11): 941-50. Epub 2008 Jul 26.
Teegarden SL, Nestler EJ, Bale TL.
zdroj
Oddelenie živočíšnej biológie, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA 19104-6046, USA.
abstraktné
POZADIE:
Citlivosť na odmenu bola zapríčinená predispozičným faktorom správania súvisiaceho s užívaním drog a prejedaním. Základné mechanizmy prispievajúce k odmeňovaniu citlivosti však nie sú známe. Predpokladali sme, že dysregulácia v dopamínovej signalizácii môže byť základnou príčinou zvýšenej citlivosti na odmeňovanie, pričom odmeňovanie stimulov by mohlo viesť k normalizácii systému.
metodika:
Použili sme genetický myš model s vyššou citlivosťou na odmenu, myši s nadmernou expresiou Delta FosB, aby sme skúmali zmeny v odmeňovaní v reakcii na chutnú stravu s vysokým obsahom tukov. Značkovacie signály odmeňovania u týchto myší boli vyšetrené ako základne, tak aj po 6 týždňoch vystavenia chutnej stravy. Myši sa vyšetrili v behaviorálnom teste po vysadení vysoko-tukových diét, aby sa zistila zraniteľnosť tohto modelu na odstránenie odmeňujúcich stimulov.
Výsledky:
Naše výsledky ukazujú zmenu aktivácie dráhy odozvy pozdĺž obvodov jadra accumbens-hypothalamic-ventral tegmental oblasti vyplývajúce z nadmernej expresie Delta FosB v nucleus accumbens a striatal oblastiach, Úrovne fosforylujúceho proteínu viažuceho proteínový element cyklického adenozínmonofosfátu (cAMP) (PCREB), neurotrofický faktor odvodený z mozgu (BDNF), a dopamínový a cyklický fosfoproteín riadený adenozínmonofosfátom s molekulovou hmotnosťou 32 kDa (DARPP-32) v nucleus accumbens boli znížené u myší Delta FosB, čo naznačuje zníženú signalizáciu dopamínu. Šesť týždňov vystavenia vysokým obsahom tukov úplne zmierňuje tieto rozdiely, čo odhaľuje silnú odmeňovaciu kapacitu chutnej stravy. Myši Delta FosB tiež vykazovali signifikantné zvýšenie lokomotorickej aktivity a reakcie súvisiace s úzkosťou 24 hodín po vysokom odbúravaní tuku.
Záver:
Tieto výsledky prinášajú základnú citlivosť na zmeny v odmeňovaní súvisiace s dysreguláciou signálu Delta FosB a dopamínovou signalizáciou, ktorá môže byť normalizovaná s chutnými diétami a môže byť predisponujúcim fenotypom v niektorých formách obezity.
úvod
Napriek rastúcim znalostiam nervových systémov, ktoré kontrolujú chuť a sýtosť, miera obezity naďalej rastie v Spojených štátoch. Súčasná liečba liekom má obmedzenú účinnosť a zmeny správania trpia minimálnym dlhodobým zlučiteľnosťou (1). Spotreba kaloricky hustých chutných jedál bola spojená so zmenami stresových a odmeňovacích dráh v mozgu, čo naznačuje, že odmeňujúce vlastnosti takýchto potravín môžu mať vplyv na signály energetickej bilancie (2-4). Potraviny s vysokým obsahom tuku pôsobia ako prirodzené odmeny, aktivujú strediská odmeňovania mozgu podobným spôsobom ako drogy zneužívania a ako také sa používajú v paradigmoch samoadministrácie (5-8). Preto je pravdepodobné, že správanie a motivácia pre prejedanie sa a užívanie drog zdieľajú spoločné základné mechanizmy, ktoré potenciálne otvárajú nové možnosti liečby oboch stavov.
Pri štúdiu vzťahu medzi chutnými potravinami a cestami regulujúcimi odmenu a stres v mozgu, v minulosti sme identifikovali molekulárne a biochemické markery so zníženou odmenou a zvýšeným stresom po stiahnutí z chutnej stravy s vysokým obsahom tukov (HF). Podobne ako zneužívanie liekov, expozícia chutnej stravy v našich štúdiách viedla k zvýšeniu hladiny transkripčného faktora ΔFosB v nucleus accumbens (NAc), centrálnej štruktúre mozgovej odmeny (9, 10), Myši, ktoré indukovateľne nadmerne exprimujú ΔFosB, vykazujú zvýšenú inštrumentálnu reakciu na odmenu za potravu (11), čo je cenný nástroj na skúmanie úlohy citlivosti odmeňovania a dlhodobej dysregulácie odmeňovacieho systému v molekulárnej a biochemickej reakcii na chutnú stravu.
V tejto štúdii sme použili myši nadmerne exprimujúce ΔFosB na preskúmanie dlhodobých zmien markerov odmeňovania v neurocirkularite NAc-hypotalamus-ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) ako odpoveď na chutnú HF stravu. Na základe predchádzajúcich štúdií u týchto myší citlivých na odmenu sme hypotézu, že zmeny v citlivosti na odmeňovanie vyvolané pomocou DFosB zahŕňajú dysreguláciu v dopamínovej signalizácii, ktorá je výsledkom spätnej väzby NAc na VTA. Ďalej sme predpokladali, že expozícia prirodzenej odmeny energeticky hustou diétou HF by potom normalizovala dopaminergný systém u týchto myší, čo by viedlo k prehnanej reakcii na stres odchodu z tejto diéty HF, Jedinečný aspekt využívania chutnej stravy ako odmeňujúcej látky nám umožňuje zahrnúť hypotalamické vstupy na odmeňovanie obvodov vo fenotype, ktorý môže predpovedať populáciu predisponovanú k obezite odolnej voči liečbe. Na preskúmanie tejto hypotézy sme študovali markery dopamínovej neurotransmisie vrátane pCREB, BDNF a DARPP-32 v NAc a tyrozínhydroxyláze a dopamínový transportér vo VTA po expozícii HF. Preskúmali sme aj špecifické markery energetickej rovnováhy, o ktorých je známe, že ovplyvňujú dopamínový výstup, vrátane leptínu a orexínových receptorov v expresii VTA a orexínu v bočnom hypotalame.
Materiály a metódy
zver
Samčie bitransgénne myši, ktoré indukovateľne nadmerne exprimujú ΔFosB v dynorfin-pozitívnych neurónoch v NAc a dorzálny striatum (Kelz a kol., 1999), boli vytvorené na zmiešanom pozadí (ICR: C57Bl6 / SJL) na University of Texas Southwestern Medical Center testované na univerzite v Pensylvánii. Všetky myši sa udržiavali na doxycyklíne (100 μg / ml v pitnej vode) až do príchodu na University of Pennsylvania. Na vyvolanie nadmernej expresie sa odstránil doxycyklín (n = 23) (12). Kontrolné myši (n = 26) naďalej dostávali liek. Myšiam boli zaradené do diétnych skupín osem týždňov po odstránení doxycylínu, v ktorej sa ukázalo, že expresia dosiahla maximálne hladiny (13). Myši boli udržiavané na 12: 12 svetlo-tmavý cyklus (svetlá na 0700) s jedlom a vodou k dispozícii ad libitum. Všetky štúdie boli vykonané podľa experimentálnych protokolov schválených Výborom pre starostlivosť o deti a starostlivosť o zvieratá University of Pennsylvania a všetky postupy boli vykonané v súlade s inštitucionálnymi usmerneniami.
Expozícia stravy
Myši sa udržiavali na domácom krmivu (n = 16) alebo sa umiestnili na HF (n = 16-17) počas šiestich týždňov. Domáce krmivo (Purina Lab Diet, St. Louis, MO) obsahovalo 4.00 kcal / g, pozostávajúce z 28% proteínu, 12% tuku a 60% sacharidov. HF diéta (Research Diets, New Brunswick, NJ) obsahovala 4.73 kcal / g, pozostávajúca z 20% proteínu, 45% tuku a 35% sacharidov.
Biochemia a génová expresia
Myši sa analyzovali po šiestich týždňoch expozície stravy. Mozgy boli odstránené z lebky a buď zmrazené celé na suchom ľade, alebo NAc rozrezané (približne 0.5 - 1.75 mm z bregma, v hĺbke 3.5 - 5.5 mm) a zmrazené v kvapalnom dusíku. Tkanivo sa skladovalo pri -80 ° C až do stanovenia.
Biochemické analýzy
Metódy pre Western blot sú opísané v doplnkových materiáloch. Použité protilátky boli: Cdk5, CREB a BDNF (1: 500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) a fosfo-CREB (pCREB) (Ser 133) (1: 500, Cell Signaling Technology, Danvers, MA).
Receptorová autorádiografia
Podrobné metódy autorádiografie sú opísané v doplnkových materiáloch. Použité ligandy boli 2 nM H3 - SCH 23390 a 5 nM H3 - spiperón (PerkinElmer, Boston, MA).
In situ hybridizácia
Spracovanie tkaniva a hybridizácia sa uskutočnili tak, ako už bolo opísané (14). Sonda DARPP-32 bola láskavo poskytnutá P. Greengardom (Rockefellerovou univerzitou) a sondou orexínu od J. Elmquista (University of Texas Southwestern Medical Center). Sklíčka testované na DARPP-32 sa použili na filmy na 3 dni a sklíčka testované na orexín sa použili na filmy na 4 dni. Kvantifikácia filmových obrazov bola uskutočnená tak, ako už bolo opísané (10).
QRT-PCR
RNA bola izolovaná z VTA a expresia jednotlivých génov bola hodnotená pomocou testov expresie génu TaqMan (Applied Biosystems, Foster City, CA). Podrobné metódy a štatistické analýzy sa nachádzajú v doplnkových materiáloch.
Behaviorálne analýzy
Na preskúmanie účinkov citlivosti odmeny na zmeny správania indukované diétou bola po štyroch týždňoch expozície odobraná podskupina myší z HF a vrátená do domáceho krmiva (n = 9 kontrola, n = 8 ΔFosB). Dvadsaťštyri hodín po vysadení boli myši vystavené testu na otvorenom poli v súlade s našou predtým publikovanou paradigmou odoberania potravy (10). Stručne, myš sa umiestnila do stredu prístroja s otvoreným poľom a sledovala sa päť minút. Boli merané celkové kríženie línie, fekálne choroby, čas v strede a kríže do stredu.
štatistika
Všetky údaje okrem Western blotov sa analyzovali pomocou obojsmernej ANOVA, po ktorej nasledoval Fisherov PLSD test s liečením doxycyklínom (expresia AFosB) a stravovacie podmienky ako nezávislé premenné. Pre analýzy RT-PCR sa znížená hodnota P použila na korekciu viacnásobného porovnania v rámci skupín príbuzných génov (pozri doplňujúce materiály). Western bloty sa analyzovali pomocou študentovho t-testu s ošetrením doxycyklínom ako nezávislou premennou, pričom sa porovnali optické hustoty v rámci rovnakého blotu. Všetky údaje sú uvedené ako priemer ± SEM.
výsledky
Základné biochemické rozdiely
Na objasnenie molekulárnych dráh, ktoré sú základom zvýšenej citlivosti na odmenu u myší s nadmernou expresiou AFosB, sa v NAc skúmali hladiny niekoľkých kľúčových signálnych molekúl. Existoval trend zvýšených hladín Cdk5 v NAc myší ΔFosB v porovnaní s kontrolnými zvieratami spolužiaka udržiavanými na doxycyklíne (F = 5.1, P = 0.08; obr. 1A). Myši ΔFosB exprimovali významne znížené hladiny pCREB (F = 7.4, P <0.05; obr. 1 B), ako aj celkové hladiny CREB (F = 5.4, P = 0.05; obr. 1 C). Signifikantné zníženie BDNF sa tiež pozorovalo u NAc myší AFOSB (F = 10.6, P <0.05; obr. 1D).
Obrázok 1
Myši s nadmernou expresiou ΔFosB vykazovali v NAc biochemické markery zníženej signalizácie dopamínu
Príjem potravy a telesná hmotnosť na diéte s vysokým obsahom tukov
Ďalej sme skúmali účinky prirodzene odmeňujúcej sa HF diéty na zmeny v signálnych molekulách u myší exprimujúcich ΔFosB. Medzi myšami ΔFosB a kontrolami neboli žiadne rozdiely v príjme potravy ani v dome, ani v HF. Avšak došlo k celkovému zníženiu kalorického príjmu normalizovaného na telesnú hmotnosť pri vystavení HF, ktorý bol špecifický pre myši AFosB (F = 11.2, P <0.01; obr. 2A). Na konci šesťtýždňovej expozície strave vážili myši, ktoré dostávali HF, významne viac ako myši s chow dietou (F = 17.2, P <0.001) a myši s AFosB celkovo menej ako kontroly (F = 5.6, P <0.05; obr.) 2B). Tento účinok bol špecifický pre rozdiely medzi skupinami na kŕmnej strave (P <0.05).
Obrázok 2
Nadmerne exprivujúce myši s AIFF nevykazovali žiadne rozdiely v príjme potravy na diétách s jedlom alebo vysokým obsahom tuku (HF)
Biochemické rozdiely v strave s vysokým obsahom tukov
Na stanovenie toho, ako môžu byť základné zmeny v signalizácii NAc zmenené pomocou diéty HF, sa skúmali rovnaké signalizačné proteíny na začiatku testu u zvierat, ktoré dostali šesť týždňov HF. Neboli žiadne významné rozdiely v hladinách Cdk5 (obrázok 3A). Úrovne pCREB a celkovej CREB už neboli po šiestich týždňoch HF odlišné (obrázok 3B, C). Hladiny BDNF boli signifikantne zvýšené u myší ΔFosB po šiestich týždňoch vystavenia HF (F = 6.5, P = 0.05, obrázok 3D).
Obrázok 3
Diéta s vysokým obsahom tuku (HF) zmiernila signalizačné rozdiely pozorované v NAc myší s nadmernou expresiou DFosB
Autorádiografia receptora dopamínu
Použili sme autorádiografiu receptora na posúdenie, či zmeny indukované ΔFosB v signalizácii dopamínu v NAc súvisia so zmenami v expresii dopamínového receptora (obr. 4A). Zdá sa, že strava s vysokým obsahom tukov mierne zvyšovala hustotu väzby dopamínového receptora Dl (P = 1) a tento rozdiel bol väčší u myší AFosB (obr. 0.14B). Existoval tiež trend smerom k zvýšeniu väzbovej oblasti Dl po HF (P = 4) a post hoc testovanie ukázalo, že to je významné u myší AFosB (P <1; obr. 0.06C). Na rozdiel od D0.05 receptorov nedošlo k žiadnym zmenám v hustote väzby na D4 receptor (kontrolná dávka = 1 ± 2, kontrolná HF = 97.6 ± 6.9, ΔFosB dávka = 101.1 ± 8.2, ΔFosB HF = 91.6 ± 1.0) alebo väzobná plocha (kontrolná dávka = 94.8) V NAc boli pozorované ± 9.5, kontrolná HF = 47.3 ± 3.4, ΔFosB potrava = 53.8 ± 6.0, FFosB HF = 51.9 ± 3.7).
Obrázok 4
Strava s vysokým obsahom tukov (HF) viedla k zmenám v väzbe D1 dopamínového receptora a expresii DARPP-32 v nucleus accumbens (NAc) myší s nadmernou expresiou DFosB
Výraz DARPP-32 v NAc
Na stanovenie hladín expresie DARPP-32 v NAc sa použila hybridizácia in situ (obr. 4D). Diéta s vysokým obsahom tukov významne zvýšila expresiu DARPP-32 v tejto oblasti mozgu (F = 5.1, P <0.05) a došlo k významnej interakcii medzi diétou a expresiou ΔFosB (F = 8.9, P <0.05), pričom myši ΔFosB vykazovali vyššiu zmena vyvolaná stravou (obr. 4E). Bazálny rozdiel v expresii DARPP-32 medzi kontrolnými a ΔFosB myšami sa odhalil post hoc testovaním (P <0.01), ako aj významné zvýšenie expresie DARPP-32 v ÁFosB myšiach na HF (P <0.01).
Genetická expresia vo VTA
Na vyhodnotenie zmien v génovej expresii vo VTA sa použila QRT-PCR so zameraním na niekoľko kľúčových génov, ktoré sa predtým podieľali na regulácii odmeny. Všetky vzorky sa normalizovali na p-aktín. Aby sa zabezpečilo, že sa expresia p-aktínu nezmenila liečením, uskutočnil sa samostatný test na porovnanie p-aktínu s druhou vnútornou kontrolou, GAPDH. Nezistili sa významné rozdiely v expresii β-aktínu (hodnoty ΔCT, β-aktín - GAPDH: kontrolná dávka = 2.29 ± 0.21, kontrolná hodnota HF = 2.01 ± 0.04, hodnota ΔFosB = 2.32 ± 0.49, ΔFosB HF = 2.37 ± 0.10).
Bol pozorovaný trend interakcie medzi expresiou ΔFosB a diétnou liečbou pri expresii tyrozínhydroxylázy (F = 3.6, P <0.06; obr. 5A). Zdá sa, že šesť týždňov vystavenia HF znižovalo expresiu tyrozínhydroxylázy u kontrolných myší a zvyšovalo expresiu u myší AFosB. Signifikantná interakcia medzi expresiou ΔFosB a expozíciou diéte bola pozorovaná pri expresii dopamínového transportéra (F = 6.7, P <0.03; obr. 5B). Podobne ako tyrozínhydroxyláza, vystavenie HF znížilo expresiu dopamínového transportéra u kontrolných myší a významne zvýšilo expresiu u myší ΔFosB (P <0.05). Bazálny rozdiel v expresii dopamínového transportéra medzi kontrolnými a ΔFosB myšami nedosahoval významnosť (P = 0.16), ale po 6 týždňoch HF ΔFosB myši exprimovali významne zvýšené hladiny dopamínového transportéra v porovnaní s kontrolami (P <0.05).
Obrázok 5
Expozícia s vysokým obsahom tukov (HF) a expresia ΔFosB viedli k zmenám v expresii viacerých kľúčových molekúl vo VTA
Existoval trend naznačujúci účinok zvýšenej expresie ΔFosB na zníženie hladín TrkB vo VTA (F = 5.7, P <0.04; obr. 5C). Aj keď neexistovali žiadne hlavné účinky na expresiu κ-opioidného receptora, bol zaznamenaný trend k zníženej expresii u myší ΔFosB (P = 0.08; obr. 5D). Expresia leptínového receptora bola tiež stanovená vo VTA. Zistil sa signifikantný účinok expozície strave (F = 6.1, P <0.03), pričom HF významne znižoval hladiny leptínového receptora vo VTA ako u AFOSB, tak u kontrolných myší (obr. 5E). Skúmala sa tiež expresia orexínového receptora 1 vo VTA. Došlo k významnému účinku stravy na expresiu orexínového receptora (F = 9.0, P <0.02), pričom myši boli vystavené HF, ktorý exprimoval vyššie hladiny vo VTA (obr. 5F). U myší ΔFosB tiež existoval trend k expresii celkovo vyšších hladín orexínového receptora 1 v tejto oblasti mozgu (P <0.05).
Expresia orexínu v laterálnom hypotalamu
Hladiny orexínu v laterálnom hypotalame, pôvode orexinergickej inervácie VTA, sme merali in situ hybridizáciou (obr. 6A). Došlo k významnej interakcii medzi expresiou ΔFosB a expozíciou potravy na expresiu orexínu (F = 9.1, P <0.01), pričom HF významne zvyšoval hladiny orexínu u kontrolných myší (P <0.05) a znižoval expresiu u myší ΔFosB (obr. 6B). Aj keď v bazálnom stave neboli žiadne významné rozdiely v expresii orexínu, po 6 týždňoch HF, myši AFOSB exprimovali významne znížené hladiny orexínu v porovnaní s kontrolami (P <0.05).
Obrázok 6
Diéta s vysokým obsahom tuku (HF) mala rozdielne účinky na expresiu orexínu u kontrolných myší (Ctrl) a myší s nadmernou expresiou DFosB
Beštatistické analýzy
Na vyhodnotenie zmien vzrušenia a emocionality v dôsledku zmeny stravovania boli myši vystavené testu v otvorenom poli 24 hodín po vysadení vysokofrekvenčnej stravy (10). Celkové kríženie čiar, ktoré sa hodnotilo ako miera vzrušenia, bolo významne ovplyvnené expresiou AFosB (F = 6.6, P <0.05) a diétou (F = 4.6, P <0.05; obr. 7A). ΔFosB myši boli v novom prostredí aktívnejšie ako kontrilové a post hoc testovanie ukázalo, že myši odobraté z HF boli významne aktívnejšie ako myši vystavené chow (P <0.05). Fekálne boli počítané ako miera úzkostného správania (10). Došlo k hlavnému účinku expresie AFosB (F = 10.2, P <0.01), pričom myši s nadmernou expresiou AFosB produkujúce viac fekálnych boli v novom prostredí, najmä v skupinách domácej potravy a odobratia HF (obr. 7B). ΔFosB myši udržiavané na HF diéte produkovali menej fekálnych bolí ako tie, ktoré sa udržiavali na chove a tie, ktoré sa odobrali 24 hodín pred testom. Zdá sa, že kontrolné myši neboli ovplyvnené stravou. Neboli zaznamenané žiadne významné účinky ani expresie ΔFosB, ani diéty na čas strávený v strede otvoreného poľa (kontrolná dávka = 14.5 ± 3.1 s, kontrolná hodnota HF = 18.0 ± 3.2 s, kontrola W / D = 15.4 ± 1.9 s, secFosB dávka = 16.9 ± 2.4 s, ΔFosB HF = 13.1 ± 3.9 s, ΔFosB W / D = 19.8 ± 2.6 s).
Obrázok 7
Myši nadmerne exprimujúce ΔFosB boli citlivejšie na účinky odňatia s vysokým obsahom tukov (HF)
Diskusia
Pri liečbe obezity existuje kritická potreba identifikácie faktorov, ktoré ovplyvňujú náchylnosť k prejedaniu a prírastku hmotnosti. Reťazce odmeňovania mozgu zohrávajú dôležitú úlohu v motivácii a reakcii na chutné potraviny a stravovacie zmeny (6, 10, 15, 16). Keďže orexigénové a anorexigénne signály môžu priamo ovplyvniť signalizáciu odmeňovania prostredníctvom okruhu hypotalamus-VTA-NAc, objasnenie génov citlivých na chutné stravovanie bohaté na energiu v centrách odmeňovania môže poskytnúť nové terapeutické ciele v liečbe obezity (17, 18). Preto sme skúmali biochemické a molekulárne markery signalizácie odmeňovania a energetickej rovnováhy pozdĺž okruhu hypotalamus-VTA-NAc ako odpoveď na diétu HF u myší nadmerne exprimujúcich ΔFosB ako model zvýšenej citlivosti na zmeny odmeny (13, 19, 20) , a citlivosť na správanie po odstúpení od stravy. Predpokladali sme, že bazálna dysregulácia signalizácie dopamínu u myší ΔFosB by bola normalizovaná odmeňujúcimi účinkami HF diéty zahŕňajúcej priesečník signálov energetickej bilancie a dopamínového systému.
Na skúmanie markerov naznačujúcich dysreguláciu v dopamínovej signalizácii v NAc sme skúmali hladiny D1 receptorov a downstream effectors. Aj keď neexistovali významné rozdiely v väzbe na receptor D1, existuje tendencia k vystaveniu HF zvýšeniu viazanej oblasti u myší ΔFosB. To je zaujímavé ako indukcia ΔFosB pomocou lieku a prírodné odmeny sa javia ako prevládajúce v dynorfín-pozitívnom subtype stredne štipľavých neurónov, ktoré primárne exprimujú receptory D1 (9, 21). Úrovne cieľového pCREB signalizačného dopamínového signálu boli významne znížené u myší ΔFosB podporujúcich zníženú aktiváciu receptora D1 v tejto oblasti mozgu (22, 23). Zaujímavé je tiež, že sme zaznamenali významný pokles celkových hladín CREB u myší ΔFosB, čo naznačuje ďalšiu redukovanú schopnosť prenosu dopamínového signálu, ktorá môže byť sekundárna vzhľadom na spätnú väzbu vyplývajúcu z predĺženého poklesu pCREB (24). Expresia BDNF je regulovaná pCREB, je zvýšená aktiváciou D1 a je dôležitým mediátorom neuroplasticity súvisiacej s odmenou v NAc (25, 26). Preto sme zistili signifikantný pokles BDNF proteínu v NAc myší AFosB.
Všetky stredne štipľavé neuróny v NAc exprimujú DARPP-32 (27). Jeho početné downstreamové efektory robia z neho dôležitý hráč v odmeňovacích dráhach (28) a zapájajú sa do drogovej závislosti a ďalších porúch zahŕňajúcich dopamínový systém vrátane afektívnych porúch a schizofrénie (27, 29). Zistili sme hlboké bazálne zníženie expresie DARPP-32 v NAc myši AFosB. Expresia DARPP-32 je regulovaná BDNF, a preto redukovaná expresia môže priamo súvisieť so znížením hladín BDNF detegovaných u myší ΔFosB (27, 29, 30). Dokonca aj mierne zmeny vo fosforylačnom stave DARPP-32 môžu viesť k podstatným zmenám v intracelulárnej signalizácii v rámci NAc (27). Predchádzajúce štúdie nezaznamenali žiadnu zmenu proteínu DARPP-32 u myší ΔFosB po odstránení 12-wk z doxycyklínu pri vykonávaní širšieho striatálneho hodnotenia (31) čo naznačuje, že účinky ΔFosB na DARPP-32 môžu byť špecifické pre čas a oblasť.
Predpokladali sme, že dramatické zníženie indexov dopamínovej signalizácie v NAc myší ΔFosB pravdepodobne zahŕňa zmeny VPA dopaminových projekčných neurónov, hoci ΔFosB nie je v týchto neurónoch nadmerne exprimovaný, Preto sme skúmali expresiu génov súvisiacich s dopamínom vo VTA, vrátane tyrozínhydroxylázy a dopamínového transportéra. Hladiny tyrozínhydroxylázy a dopamínového transportéra sú pozitívne korelované s dopamínovým výstupom. Existoval trend, aby myši ΔFosB vykazovali zníženú tyrozínhydroxylázu a významné zníženie dopamínového transportéra v súlade s dysreguláciou signalizácie dopamínu v NAc. Pretože tieto bazálne redukcie génov súvisiacich s dopamínom vo VTA myší ΔFosB pravdepodobne odrážajú zmenenú spätnú väzbu od NAc počas dlhodobej nadmernej expresie ΔFosB, skúmali sme expresiu receptora BDNF, TrkB ako možný mechanizmus spätnej väzby NAc na VTA (32). Podobne ako tyrozín hydroxyláza a dopamínový transportér, expresia TrkB tiež ukázala tendenciu, ktorá bola zásadne znížená u myší ΔFosB, ktoré nedosiahli význam, keď boli korigované na viacnásobné porovnanie. Komplex BDNF-TrkB môže byť retrográdne transportovaný a pôsobiť v rámci VTA, aby ovplyvnil lokálnu expresiu génov a podporil rast a udržiavanie buniek (33). Okrem toho aktivácia BDNF presynaptického TrkB v rámci NAc môže priamo stimulovať dopamínovú neurotransmisiu (32), podporujúcu skryté zníženie dopamínovej signalizácie u týchto myší.
Dynorfínová aktivácia k-opioidných receptorov reguluje dopamínovú signalizáciu a je ďalším mechanizmom, pri ktorom NAc poskytuje spätnú väzbu na VTA (34). Zistili sme, že expresia k-opioidného receptora vo VTA ukázala trend, ktorý má byť znížený u myší s AFosB. Pretože sa ukázalo, že nadmerná expresia ΔFosB znižuje expresiu dynorfínu v NAc (20), myši ΔFosB pravdepodobne majú výrazné zníženie čistého VTA κ-aktivácia opioidov. Aj keď dynorfínová signalizácia zvyčajne vykazuje inhibičný účinok na dopamínové neuróny (35), potkany, ktoré vykazujú lepšie samopodávanie návykových látok, vykazujú zníženú hladinu dynorfínu v NAc, čo poukazuje na úlohu zásadne zníženej dynorfínovej signalizácie pri zvyšovaní citlivosti na odmenu (36) , 37). Dysregulácia dynorfín - κ-opioidného systému bola spojená so získavaním a pretrvávaním zneužívania drog, čo podporuje kritickú rovnováhu signalizácie opioidov pri normalizácii dopamínových dráh. (38).
Na základe odmeňujúcej kapacity diéty s vysokou energetickou hustotou sme predpokladali, že dysregulácia v dopamínovej a opioidnej odmene signalizácie u myší ΔFosB predisponuje tieto myši k zvýšeným odmeňovaným odpovediam na takú diétu, čím sa normalizuje systém odmeňovania prostredníctvom aktivácie hypotalamu -VTA-NAc, Počas šesťtýždňovej diétnej expozície neboli pozorované žiadne rozdiely v príjme potravy medzi ΔFosB a kontrolnými myšami, čo naznačuje, že zmeny zistené v biochemických a molekulárnych markeroch signalizácie odmien u myší ΔFosB neboli spôsobené rozdielmi v spotrebovaných kalóriách. Ako bolo predpokladané, zistené bazálne rozdiely v hladinách pCREB, celkových CREB, BDNF, DARPP-32 a κ-opioidných receptorov medzi ΔFosB a kontrolnými myšami boli pravdepodobne kvôli zvýšenému dopamínovému výstupu u myší ΔFosB na HF (29, 39-41) ,
Skúmanie tyrozínhydroxylázy a dopamínového transportéra v VTA odhalilo prekvapujúce protichodné odpovede na AFosB a kontrolné myši po HF. Kontrolné myši vykazovali zníženie expresie tyrozínhydroxylázy a dopamínového transportéra, zatiaľ čo myši s myšou AFosB vykazovali zvýšenú expresiu obidvoch týchto génov súvisiacich s dopamínom. Zaujímavé je, že expresia tyrozínhydroxylázy je zmenená vo VTA chronickým podávaním kokaínu alebo metamfetamínu (42-44), čo naznačuje, že myšiam AFOSB môže byť prirodzená odmena HF oveľa výraznejšia ako kontrolné myši.
S cieľom preskúmať, ako môže potenciálny prívod hypotalamu do VTA prenášať signály, ktoré odrážajú energetickú rovnováhu, sa tiež skúmala expresia receptora leptínu a receptoru orexínu-1. Hladiny cirkulujúceho leptínu sa zvyšujú pomocou HF a leptín môže naopak pôsobiť na VTA na zmenu signalizácie dopamínu (18, 45). VTA expresia leptínového receptora bola rovnako znížená pomocou HF tak u myší AFosB, ako aj u kontrolných myší, pričom sa udržiaval podobný prírastok hmotnosti a príjem diéty pri HF. Vysoký obsah tuku taktiež zvýšil expresiu orexínového receptora-1 vo VTA ako u AFosB, tak aj u kontrolných myší. Orexín aktivuje dopamínové neuróny vo VTA, podporuje VTA plasticitu a zvyšuje hladiny dopamínu v NAc (46-48). Ukázalo sa, že stravovanie s vysokým obsahom tukov zvyšuje expresiu orexínu u myší podľa našich pozorovaní (49, 50). Zvýšená expresia orexínového receptora, ako aj zmeny v signalizácii leptínu vo VTA by mohli podporiť odmenu stravy ako u myší AFOSB, tak aj u kontrolných myší, čo podporuje disociáciu medzi dráhami prenášajúcimi signály energetickej rovnováhy a signálmi, ktoré sú viazané priamo na odmenu.
Na preskúmanie účinkov odčerpania odmien, ktoré vyvolávajú stres, boli myši vyšetrené v otvorenom poli 24 hrs po odstránení HF. Myši ΔFosB boli citlivejšie na akútne účinky prednostného odberu diéty, ktoré vykazovali zvýšenú aktivitu vzrušenia a produkciu fekálnej choroby v novom otvorenom prostredí v porovnaní so všetkými ostatnými kontrolnými a diétnymi skupinami. Myši ΔFosB tiež ukázali zaujímavý behaviorálny model v tomto teste, ktorý naznačuje odmenu a stresovú citlivosť, pričom HF dieta spočiatku znižuje produkciu fekálnej choroby v porovnaní s chow a stiahnutie znova zvyšuje túto odpoveď súvisiacu s úzkosťou. Toto pozorované zvýšenie aktivity na otvorenom poli korelovalo so zmenami expresie orexínu, čo naznačuje vzťah k stresom indukovanému vzrušeniu, ktorý nie je iba účinkom zmien v signalizácii sprostredkovanej orexínom. Tieto údaje celkovo podporujú našu hypotézu, že myši ΔFosB budú citlivejšie na akútne účinky uprednostňovanej diéty z dôvodu ich zvýšenej citlivosti na odmenu.
Ako dlhodobá nadmerná expresia ΔFosB v NAc vedie k takýmto zmenám v správaní a odmeňovaní? Navrhli sme model detekcie koincidenčného VTA, kde zmenená spätná väzba od signálov NAc a hypotalamusových relé signalizuje stav odmeňovania na určenie regulácie dopamínového systému, ktorý môže podporovať spojenie medzi dysreguláciou odchodovej dráhy a predispozíciou k obezite (obrázok 8). Počas expozície vysokofrekvenčného žiarenia sa na VTA viažu viac vstupov, ktoré odrážajú energetickú bilanciu a stav odmeňovania. Zvyšovanie signalizácie leptínu a orexínu, ako aj zmenená spätná väzba od NAc k bočnému hypotalamu môže ovplyvniť, ako tieto orexigénne signály reagujú na HF u myší ΔFosB (17, 18, 45, 47, 51-53). Výskyt BDNF indukovaný vysokým obsahom tukov môže poskytnúť spätnú väzbu na VTA, čo ďalej podporuje zmeny v expresii génov súvisiacich s dopamínom.
Obrázok 8
Diéta s vysokým obsahom tuku (HF) normalizuje dysregulovanú výmennú signalizáciu u myší ΔFosB
Tieto výsledky vymedzujú molekulárne markery citlivosti odmeňovania a naznačujú, že dlhodobá dysregulácia dopamínového systému môže predisponovať jedinca k závislosti a obezite. Ďalej tieto údaje poskytujú dôležitý krok smerom k určeniu potenciálnych nových terapeutických cieľov pri liečení a prevencii obezity a iných porúch, ktoré sa môžu sústrediť na systém odmeňovania. V budúcnosti bude dôležité preskúmať, ako tento systém reaguje na odstránenie HF diéty, a tiež preskúmať akékoľvek rozdiely medzi pohlaviami v citlivosti na odmeňovanie a vysokú tukovú diétu.
Doplnkový materiál
Supp. metódy
Kliknite tu pre zobrazenie. (61K, doc)
Poďakovanie
Autori chcú poďakovať Cathy Steffenovej za pomoc pri chove a premiestňovaní zvierat. Táto práca bola podporená grantom z University of Pennsylvania Diabetes Center (DK019525) a grantmi Národného inštitútu duševného zdravia (R01 MH51399 a P50 MH66172) a Národného ústavu na zneužívanie drog (R01 DA07359).
poznámky pod čiarou
Finančné zverejnenia: Všetci autori vyhlasujú, že nemajú žiadne biomedicínske finančné záujmy alebo potenciálne konflikty záujmov.
Referencie
1. Wadden TA, Berkowitz RI, Womble LG, Sarwer DB, Phelan S, Cato RK, Hesson LA, Osei SY, Kaplan R, Stunkard AJ. Randomizovaná štúdia modifikácie životného štýlu a farmakoterapie pre obezitu. N Engl J Med. 2005, 353 (20): 2111-20 [PubMed].
2. Blendy JA, Strasser A, Walters CL, Perkins KA, Patterson F, Berkowitz R, Lerman C. Zníženie nikotínovej odmeny pri obezite: krížové porovnanie u človeka a myši. Psychofarmakológia (Berl) 2005
3. Franken IH, Muris P. Jednotlivé rozdiely v odmeňovaní sú spojené s túžbou po potravinách a relatívnou telesnou hmotnosťou u zdravých žien. Chuti do jedla. 2005, 45 (2): 198-201 [PubMed].
4. Kelley AE, Berridge KC. Neurónové prírodné odmeny: relevantnosť pre návykové drogy. J Neurosci. 2002, 22 (9): 3306-11 [PubMed].
5. Cagniard B, Balsam PD, Brunner D, Zhuang X. Myši s chronicky zvýšeným dopamínom vykazujú zvýšenú motiváciu, ale nie učenie, za odmenu za potravu. Neuropsychofarmakologie. 2006, 31 (7): 1362-70 [PubMed].
6. Liang NC, Hajnal A, Norgren R. Sham kŕmiaci kukuricový olej zvyšuje adumbín dopamínu u potkanov. Am J Physiol Regul Integ Comp Physiol. 2006, 291 (5): R1236-9 [PubMed].
7. Mendoza J, Angeles-Castellanos M, Escobar C. Ustúpenie chutným jedlom vyvoláva aktivitu predvídania potravy a expresiu c-Fos v mozgových oblastiach súvisiacich s odmeňovaním. Neuroscience. 2005, 133 (1): 293-303 [PubMed].
8. Schroeder BE, Binzak JM, Kelley AE. Spoločný profil prefrontálnej kortikálnej aktivácie po vystavení kontextuálnym podnetom spojeným s nikotínom alebo čokoládou. Neuroscience. 2001, 105 (3): 535-45 [PubMed].
9. Nestler EJ, Barrot M, Self DW. DeltaFosB: trvalý molekulárny prepínač závislosti. Proc Natl Acad Sci US A. 2001; 98 (20): 11042-6. [PMC bezplatný článok] [PubMed]
10. Teegarden SL, Bale TL. Zníženie diétnej preferencie spôsobuje zvýšenú emocionalitu a riziko recidívy z potravy. Biol Psychiatry. 2007, 61 (9): 1021-9 [PubMed].
11. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Nestler EJ, Taylor JR. dFosB v spoločnosti Nucleus Accumbens upravuje prístrojové správanie a motiváciu posilňovanú potravinami. Journal of Neuroscience. 2006, 26 (36): 9196-9204 [PubMed].
12. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgénne zvieratá s indukovateľnou cieľovou expresiou génu v mozgu. Mol Pharmacol. 1998, 54 (3): 495-503 [PubMed].
13. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Expresia transkripčného faktora deltaFosB v mozgu riadi citlivosť na kokaín. Nature. 1999, 401 (6750): 272-6 [PubMed].
14. Bale TL, Dorsa DM. Pohlavné rozdiely a účinky estrogénu na expresiu ribonukleovej kyseliny v receptoroch oxytocínového receptora v ventromedálnom hypotalame. Endocrinology. 1995, 136 (1): 27-32 [PubMed].
15. Avena NM, Long KA, Hoebel BG. Krysy závislé od cukru vykazujú zvýšenú reakciu na cukor po abstinencii: dôkaz o účinku deprivácie cukru. Physiol Behav. 2005, 84 (3): 359-62 [PubMed].
16. Budú MJ, Franzblau EB, Kelley AE. Nucleus accumbens mu-opioidy regulujú príjem stravy s vysokým obsahom tukov prostredníctvom aktivácie distribuovanej siete mozgu. J Neurosci. 2003, 23 (7): 2882-8 [PubMed].
17. Zheng H, Patterson LM, Berthoud HR. Orexínová signalizácia vo ventrálnej tegmentálnej oblasti je potrebná pre vysoký obsah tuku vyvolaný opioidnou stimuláciou nucleus accumbens. J Neurosci. 2007, 27 (41): 11075-82 [PubMed].
18. Hommel JD, Trinko R, Sears RM, Georgescu D, Liu ZW, Gao XB, Thurmon JJ, Marinelli M, DiLeone RJ. Signalizácia receptora leptínu v dopamínových neurónoch stredného mozgu reguluje kŕmenie. Neurón. 2006, 51 (6): 801-10 [PubMed].
19. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadmerná expresia DeltaFosB špecifického pre špecifický typ buniek zvyšuje motiváciu kokaínu. J Neurosci. 2003, 23 (6): 2488-93 [PubMed].
20. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Podstatná úloha DeltaFosB v nucleus accumbens pri morfínových akciách. Nat Neurosci. 2006, 9 (2): 205-11 [PubMed].
21. Lee KW, Kim Y, Kim Am, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Kokaínom indukovaná tvorba dendritickej chrbtice v D1 a D2 dopamínových receptoroch obsahujúcich stredné špinavé neuróny v nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006; 103 (9): 3399-404. [PMC bezplatný článok] [PubMed]
22. Blendy JA, Maldonado R. Genetická analýza drogovej závislosti: úloha proteínu väzbového proteínu cAMP. J Mol Med. 1998, 76 (2): 104-10 [PubMed].
23. Nestler EJ. Molekulárne mechanizmy drogovej závislosti. Neuropharmacology. 2004; 47 1: 24-32. [PubMed]
24. Tanis KQ, Duman RS, Newton SS. CREB väzba a aktivita v mozgu: Regionálna špecifickosť a indukcia elektrokonvulzívnym záchvatom. Biol Psychiatry. 2007
25. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Chromatínová remodelácia je kľúčovým mechanizmom, ktorý je základom plasticity indukovanej kokaínom v striate. Neurón. 2005, 48 (2): 303-14 [PubMed].
26. Graham DL, Edwards S, Bachtell RK, Dileone RJ, Rios M, Self DW. Dynamická aktivita BDNF v nucleus accumbens s užívaním kokaínu zvyšuje samoadministráciu a relaps. Nat Neurosci. 2007, 10 (8): 1029-37 [PubMed].
27. Svenningsson P, Nairn AC, Greengard P. DARPP-32 sprostredkúva činnosť viacerých drog. Aaps J. 2005, 7 (2): E353-60. [PMC bezplatný článok] [PubMed]
28. Palmer AA, Verbitsky M, Suresh R, Kamens HM, Reed CL, Li N, Burkhart-Kasch S, McKinnon CS, Belknap JK, Gilliam TC, Phillips TJ. Génové expresné rozdiely u myší divergentne vybraných pre citlivosť na metamfetamín. Mamm Genome. 2005, 16 (5): 291-305 [PubMed].
29. Bogush A, Pedrini S, Pelta-Heller J, Chan T, Yang Q, Mao Z, Sluzas E, Gieringer T, Ehrlich ME. AKT a CDK5 / p35 sprostredkovávajú indukciu DARPP-32 neurotrofného faktora odvodeného z mozgu v stredne veľkých ostrých neurónoch in vitro. J Biol Chem. 2007, 282 (10): 7352-9 [PubMed].
30. Benavides DR, Bibb JA. Úloha Cdk5 pri zneužívaní a plasticite. Ann NY Acad Sci. 2004; 1025 :. 335-44 [PubMed]
31. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Účinky chronickej expozície kokaínu sú regulované neurónovým proteínom Cdk5. Nature. 2001, 410 (6826): 376-80 [PubMed].
32. Blochl A, Sirrenberg C. Neurotrofíny stimulujú uvoľňovanie dopamínu z mesencefalálnych neurónov potkanov prostredníctvom receptorov Trk a p75Lntr. J Biol Chem. 1996, 271 (35): 21100-7 [PubMed].
33. Berton O, McClung CA, Dileone RJ, Krishnan V, Renthal W, Russo SJ, Graham D, Tsankova NM, Bolanos CA, Rios M, Monteggia LM, Self DW, Nestler EJ. Základná úloha BDNF v mezolimbickej dopamínovej dráhe v spoločenskom porážkovom strese. Science. 2006, 311 (5762): 864-8 [PubMed].
34. Nestler EJ, Carlezon WA., Jr Mesolimbický dopamínový odmeňovací okruh v depresii. Biol Psychiatry. 2006, 59 (12): 1151-9 [PubMed].
35. Ford CP, Beckstead MJ, Williams JT. Kappa opiátová inhibícia somatodendritických dopamínových inhibičných postsynaptických prúdov. J Neurophysiol. 2007, 97 (1): 883-91 [PubMed].
36. Nylander I, Vlaskovska M, Terenius L. Brainové dynorfíny a enkefalínové systémy u potkanov Fischer a Lewis: účinky morfínovej tolerancie a abstinencie. Brain Res. 1995, 683 (1): 25-35 [PubMed].
37. Nylander I, Hyytia P, Forsander O, Terenius L. Rozdiely medzi potkanmi s prednosťou alkoholu (AA) a potláčaním alkoholu (ANA) v prody- norfínových a proenkefalínových systémoch. Alcohol Clin Exp. 1994, 18 (5): 1272-9 [PubMed].
38. Kreek MJ. Kokaín, dopamín a endogénny opiátový systém. J Addict Dis. 1996, 15 (4): 73-96 [PubMed].
39. Carlezon WA, Jr, Duman RS, Nestler EJ. Mnoho tvárí CREB. Trendy Neurosci. 2005, 28 (8): 436-45 [PubMed].
40. Dudman JT, Eaton ME, Rajadhyaksha A, Macias W, Taher M, Barczak A, Kameyama K, Huganir R, Konradi C. Receptory dopamínu D1 sprostredkovávajú CREB fosforyláciu fosforyláciou receptora NMDA v Ser897-NR1. J Neurochem. 2003, 87 (4): 922-34 [PubMed].
41. Vlastné DW. Regulácia užívania a hľadania správania neuroadaptáciami v mezolimbickom dopamínovom systéme. Neuropharmacology. 2004; 47 1: 242-55. [PubMed]
42. Beitner-Johnson D, Nestler EJ. Morfín a kokaín majú spoločné chronické účinky na tyrozínhydroxylázu v dopamínergických oblastiach odmeňovania mozgu. J Neurochem. 1991, 57 (1): 344-7 [PubMed].
43. Lu L, Grimm JW, Shaham Y, Hope BT. Molekulárne neuroadaptácie v oblasti adumbens a ventrálnej tegmentálnej oblasti počas prvých 90 dní nútenej abstinencie od samého podávania kokaínu u potkanov. J Neurochem. 2003, 85 (6): 1604-13 [PubMed].
44. Shepard JD, Chuang DT, Shaham Y, Morales M. Účinok samotného podávania metamfetamínu na hladiny tyrozínhydroxylázy a dopamínových transportérov v mezolimbických a nigrostriatálnych dopamínových dráhach potkana. Psychofarmakológia (Berl) 2006, 185 (4): 505-13 [PubMed]
45. Fulton S, Pissios P, Manchon RP, Stiles L, Frank L, Pothos EN, Maratos-Flier E, Flier JS. Leptínová regulácia dráhy mesoakumbénového dopamínu. Neurón. 2006, 51 (6): 811-22 [PubMed].
46. Narita M, Nagumo Y, Miyatake M, Ikegami D, Kurahashi K, Suzuki T. Implikácia proteínovej kinázy C v orexínom indukovanom zvýšení hladiny extracelulárneho dopamínu a jeho odhodlaný účinok. Eur J Neurosci. 2007, 25 (5): 1537-45 [PubMed].
47. Narita M, Nagumo Y, Hashimoto S, Khotib J, Miyatake M, Sakurai T, Yanagisawa M, Nakamachi T, Shioda S, Suzuki T. Priame zapojenie orexinergných systémov pri aktivácii mezolimbickej dopamínovej dráhy a súvisiaceho správania indukovaného morfínom. J Neurosci. 2006, 26 (2): 398-405 [PubMed].
48. Borgland SL, Taha SA, Sarti F, Fields HL, Bonci A. Orexín A vo VTA je rozhodujúci pre indukciu synaptickej plasticity a behaviorálnej senzibilizácie kokaínu. Neurón. 2006, 49 (4): 589-601 [PubMed].
49. Park ES, Yi SJ, Kim JS, Lee HS, Lee IS, Seong JK, Jin HK, Yoon YS. Zmeny v expresii orexínu-A a neuropeptidu Y v hypotalame potkanov nasycených jedlom a s vysokým obsahom tukov. J Vet Sci. 2004, 5 (4): 295-302 [PubMed].
50. Wortley KE, Chang GQ, Davydova Z, Leibowitz SF. Peptidy, ktoré regulujú príjem potravy: expresia génu orexínu sa zvyšuje počas stavov hypertriglyceridémie. Am J Physiol Regul Integ Comp Physiol. 2003, 284 (6): R1454-65 [PubMed].
51. Zheng H, Corkern M, Stoyanova I, Patterson LM, Tian R, Berthoud HR. Peptidy, ktoré regulujú príjem potravy: manipulácia vyvolávajúca chuť do jedla aktivuje hypotalamické orexínové neuróny a inhibuje neuróny POMC. Am J Physiol Regul Integ Comp Physiol. 2003, 284 (6): R1436-44 [PubMed].
52. Baldo BA, Gual-Bonilla L, Sijapati K, Daniel RA, Landry CF, Kelley AE. Aktivácia subpopulácie hypotalamických neurónov obsahujúcich orexín / hypocretin pomocou inhibície sprostredkovanej receptorom GABAA sprostredkovaného receptorom nucleus accumbens, ale nie vystavením novému prostrediu. Eur J Neurosci. 2004, 19 (2): 376-86 [PubMed].
53. Harris GC, Wimmer M, Aston-Jones G. Úloha bočných hypotalamických orexínových neurónov pri odmeňovaní. Nature. 2005, 437 (7058): 556-9 [PubMed].
;