Skúsenosť s liekom epigeneticky primuje indukovateľnosť Fosbového génu v jadrovom nucleus accumbens (2012)

abstraktné

úvod

Drogová závislosť je charakterizovaná návykovým hľadaním a užívaním drog napriek vážnym nepriaznivým následkom (Kalivas a kol., 2005; Hyman a kol., 2006). Chronická expozícia lieku spôsobuje pretrvávajúce zmeny génovej expresie vo ventrálnom striate (alebo nucleus accumbens, NAc) a dorzálny striatum (alebo caudate putamen, CPu), striatálne štruktúry spojené s odmeňovaním a závislosťou od drog (Freeman a kol., 2001; Robinson a Kolb, 2004; Shaham a nádej, 2005; Maze a Nestler, 2011). ΔFosB, skrátený a stabilný proteín kódovaný bezprostredne skorým génom, Fosb, je dobre charakterizovaným transkripčným faktorom indukovaným v NAc a CPu chronickým vystavením prakticky všetkým liekom zneužívania, kde sprostredkováva senzibilizované behaviorálne odpovede na opakované podávanie lieku (Nestler, 2008). Avšak, či už predchádzajúca chronická expozícia lieku zneužitia pozmenila následnú indukciu ΔFosB zostáva neznáma.

Nedávno sme predpokladali, že modifikácie chromatínu ako odpoveď na chronickú expozíciu liečiva môžu zmeniť indukovateľnosť špecifických génov v cieľových oblastiach mozgu (Robison a Nestler, 2011). Zvyšujúce sa dôkazy ukázali, že lieky na zneužívanie po chronickom podaní menia štruktúru a transkripčnú dostupnosť chromatínu prostredníctvom mnohých typov modifikácií vrátane fosforylácie, acetylácie a metylácie histónových chvostov. Novšie práce v systémoch bunkových kultúr sa zamerali na získavanie RNA polymerázy II (Pol II) do promótora "indukovateľných" génov pred ich expresiou, s polylom viazaným perzistentne k proximálnym promótorovým oblastiam a okolo štartovacieho miesta transkripcie (TSS ) v "zablokovanom" stave (Core a Lis, 2008; Nechaev a Adelman, 2008). Aktivácia zastaveného Pol II je potom považovaná za zodpovednú za jeho únik z promótorových a TSS oblastí a jeho transkripciu týchto "základných" génov (Zeitlinger a kol., 2007; Saha a kol., 2011; Bataille a kol., 2012).

Tu ukazujeme, že predtým chronická expozícia kokaínu, po ktorej nasleduje predĺžená doba stiahnutia, menia indukčnosť Fosb génu na následné podávanie kokaínu, pričom NAc je primárne indukovaný na indukciu, zatiaľ čo CPu nie je. Potom identifikujeme zreteľné podpisy chromatínu na Fosb génového promótora v NAc a CPu, ktoré sú spojené s takou aberantnou inducibilitou Fosb génu, vrátane náboru zastaveného Pol II na Fosb proximálneho promótora v NAc, rovnako ako zmeny v niekoľkých aktivujúcich alebo represívnych histónoch v obidvoch oblastiach mozgu. Tieto výsledky poskytujú nový pohľad na dynamiku chromatínu na Fosb promótora génu a po prvýkrát ukazujú mechanizmus, ktorým sa zablokuje primér Pol II Fosb pre väčšiu aktiváciu v NAc po opätovnom vystavení kokaínu.

Materiály a metódy

výsledky

väčšia Fosb indukovateľnosť v NAc, ale nie CPu, u potkanov skúsených s kokaínom

Na preskúmanie vplyvu predchádzajúceho chronického priebehu kokaínu, po ktorom nasleduje predĺženie obdobia stiahnutia, na indukovateľnosť Fosb génu v reakcii na následnú provokáciu s kokaínom boli potkany, ktoré boli predtým injikované ip dvakrát denne s fyziologickým roztokom alebo kokaínom (15 mg / kg) v dňoch 10, dávky po podaní dávky lieku po 28 dňoch odobratia (Obr. 1A). Najprv sme merali lokomotorické odpovede v jednej skupine zvierat na potvrdenie indukcie lokomotorickej senzibilizácie predchádzajúcou expozíciou kokaínu, čo je očakávaný trvalý následok podania lieku. Dospelí potkaní, ktorí mali skúsenosti s kokaínom a vykazovali ekvivalentnú lokomotorickú aktivitu na začiatku liečby, pričom výskyt kokaínu vyvolávajú nežiaduce zvieratá zvyšujúce ich pohybovú aktivituObr. 1B, Opakované opatrenia obojsmerné ANOVA, liečba: F_1,66 = 30.42, p <0.0001; kokaínová výzva: F_2,66= 58.39, p <0.0001; liečba x kokaínová výzva: F_2,66= 8.56, p = 0.0005, post-testy Bonferroni ^{^}p <0.001). Táto výzva kokaínu vyvolala signifikantne vyššiu lokomotorickú aktivitu, tj senzibilizáciu, u potkanov, ktorí mali skúsenosti s kokaínom (Bonferroniho post-testy * p <0.001).

  

Obrázok 1

Účinok predchádzajúcej chronickej expozície kokaínu na pohybovú aktivitu a Fosb indukcie v NAc a CPu po opätovnom vystavení lieku

Na vyhodnotenie účinkov tohto režimu na predbežnú liečbu kokaínu na expresiu ΔFosB v NAc a CPu sme merali proteín ΔFosB s imunohistochemickými metódami 24 hr po zvieratách, ktoré už neboli skúmané kokaínom a kokaínom, boli ošetrené denným podaním kokaínu 0, 1, 3 alebo 6 injekcie (15 mg / kg; Obr. 1A). Ako bolo predtým stanovené (Nye a kol., 1995), Injekcie s kokaínom 3 boli dostatočné na to, aby signifikantne indukovali proteín ΔFosB v NAc a CPu u zvierat bez predchádzajúcich liečiv a jeho akumulácia zostala významná po 6 dňoch kokaínových injekcií (Obr. 1C, Opakované merania obojsmernej ANOVA, NAc core, liečba: F_1,28= 23.5, p <0.0001; kokaínová výzva: F_3,28= 49.16, p <0.0001; liečba x kokaínová výzva: F_3,28= 6.83, p = 0.0014; NAc shell, liečba: F_1,28= 18.69, p <0.0001; kokaínová výzva: F_3,28= 31.52, p <0.0001; liečba x kokaínová výzva: F_3,28= 3.21, p <0.05; CPu, ošetrenie: F_1,28= 9.47, p <0.001; kokaínová výzva: F_3,28= 19.74, p <0.0001; liečba x kokaínová výzva: F_3,28= 0.94, p> 0.05. V jadre, plášti a CPu NAc, Bonferroni po testoch ^{^}p <0.05). U zvierat predtým liečených kokaínom sa nezistili dôkazy pretrvávajúcej indukcie ΔFosB v NAc alebo CPu po 28 dňoch od vysadenia, v súlade s predchádzajúcimi správami, že signál ΔFosB sa do tohto časového bodu úplne rozptýli ((Nye a kol., 1995), dôvod, prečo bol tento čas použitý v tejto štúdii. Zdá sa však, že u potkanov skúsených s kokaínom, ktorí dostali 3 alebo 6 injekciu s kokaínom, sa prejavila signifikantne väčšia indukcia fosforu proteínov pri NAc, čo je zjavné ako v subregiónoch jadra, ako aj v shellových subregiónochObr. 1C. Bonferroniho post-testy * p <0.05). Na rozdiel od toho sa v CPu nepozorovala taká väčšia indukcia proteínu AFosB; namiesto toho bola v tejto oblasti pozorovaná ekvivalentná indukcia ΔFosB po 3 alebo 6 dňoch injekčných injekcií s kokaínom u potkanov, ktoré ešte neboli kokaínom a neskúsené (Obr. 1C).

Aby sme získali prehľad o transkripčných zmenách, ktoré sa vyskytli v NAc a CPu v reakcii na provokáciu kokaínu, sme študovali časový priebeh (45, 90 a 180 min) indukovateľnosti transkriptov DFosB a FosB mRNA po jednorazovej aplikácii kokaínu alebo fyziologického roztoku na potkany bez skúsenosti s kokaínom a skúsených po 28 dňoch odvykania (pozri Obr. 1A). V porovnaní so slanou provokáciou vyvolala provokácia kokaínom rýchly nárast hladín mRNA v AFosB a FosB vo všetkých troch časových bodoch v NAc a CPu zvierat, ktoré neboli predtým kokaínom (Obr. 1D, Opakované opatrenia jednorazovo ANOVA za časové obdobie; Post-testy Bonferroni ^{^}p <0.05). V NAc sme po kokaínovej výzve pozorovali väčšiu indukciu mRNA ΔFosB a FosB u zvierat predtým liečených kokaínom v porovnaní so zvieratami predtým neliečenými kokaínom, pričom efekt bol významný po 90 minútach, zatiaľ čo na rozdiel od toho bola indukovateľnosť mRNA ΔFosB a FosB v CPu významne poklesla u zvierat, ktoré už mali skúsenosti s kokaínom (Obr. 1D, Post-testy Bonferroni ^%p = 0.08, * p <0.05).

Charakterizácia prívodných signalizačných ciest v NAc a CPu u potkanov skúsených s kokaínom

Jedno možné vysvetlenie zmenenej indukovateľnosti Fosb génu v NAc a CPu po predchádzajúcom chronickom priebehu kokaínu je to, že vzdialenosť histórie expozície kokaínu by mohla vyvolať trvalé zmeny v signálnych cestách, ktoré sú pred Fosb že indukcia kokaínu potom indukuje gén do aberantného stupňa. Na štúdium tejto hypotézy sme analyzovali dva transkripčné faktory, SRF a CREB, ktoré boli nedávno preukázané, že sú potrebné pre indukciu kokaínu ΔFosB v týchto oblastiach mozgu (Vialou a kol., 2012) spolu s proteínkinázami proti smeru prúdu, ERK a AKT, ktoré sa tiež podieľajú na akcii kokaínu (Valjent a kol., 2000; Lu a kol., 2006; Boudreau a kol., 2009). Nepodarilo sa zistiť žiadne zmeny v celkových alebo fosforylovaných hladinách týchto rôznych proteínov, ktoré by mohli vysvetliť zmenenú inducibilitu Fosb bez zmien v SRF, CREB alebo AKT (Obr. 2B, C). Nedostatok zmien v pSRF a pCREB v NAc v reakcii na výzvu na kokaín je v súlade s nedávnou správou, ktorá zistila, že obidve sú významne indukované iba chronickým kokaínomVialou a kol., 2012).

  

Obrázok 2

Vplyv predchádzajúcej chronickej expozície kokaínu na kaskády molekulovej signalizácie proti smeru prúdenia v NAc a CPu

V NAc a CPu zvierat, ktoré ešte neboli liečení, 20 min po počiatočnej expozícii lieku (Obr. 2A), jediné podanie kokaínu znížilo hladiny pERK42 / 44 (Obr. 2B, C. Dvojstranný Studentov t-test: * p <0.05). Existujú predchádzajúce správy o zvýšených hladinách pERK v týchto regiónoch po akútnom podaní kokaínu (Valjent a kol., 2000). Toto je ťažké porovnať s ostatnými dokumentmi skúmajúcimi fosforyláciu ERK v NAc počas stiahnutia z opakovaných injekcií kokaínu (Boudreau a kol., 2007; Shen et al., 2009), ako v našej štúdii pERK bol kvantifikovaný po 28 dňoch odvykania a po podaní kokaínu alebo soľného roztoku. V porovnaní s neliečenými zvieratami, ktoré prvýkrát zažili kokaín, opätovná expozícia kokaínu u potkanov skúsených s kokaínom po 28 dňoch odvykania spôsobila významné zvýšenie hladín pERK42 / 44 v CPu (Obr. 2B, C. Dvojstranný študentský t-test: * p <0.05).

Chromatínová krajina na Promótor génu Fosb v NAc a CPu u potkanov skúsených s kokaínom

Ďalej sme preskúmali, či zmeny v Fosb indukovateľnosť génov sú spojené so zmenami v štruktúre chromatínu. ChIP sa uskutočňovala na NAc a CPu s použitím protilátok namierených proti trom dobre charakterizovaným formám histónových modifikácií: trimetylácia Lys4 histónu H3 (H3K4me3) spojená s aktiváciou génov a H3K27me3 a H3K9me2 spojených s represiou génov. Analýzu sme analyzovali po podaní dávok 28 bez podávania kokaínu a bez skúseností - buď bez alebo s provokačnou injekciou kokaínu, pričom zvieratá boli vyšetrené 1 h neskôr (Obr. 3A). V NAc sme nezistili žiadne významné zmeny vo väzbe ktorejkoľvek z týchto troch histónových modifikácií na Fosb génový promótor v neprítomnosti provokačnej dávky kokaínu, aj keď došlo k trendu znížených hladín H3K9me2 (Obr. 3B-D, Študijný t-test s dvoma sledmi. ^#p = 0.2 v porovnaní s príslušnými kontrolami užívajúcimi liečivo). Tento účinok bol významný po podaní kokaínu a bol špecifický pre proximálnu promótorovú oblasť génu (Obr. 3C. * p <0.05). Zatiaľ čo hladiny H3K9me2 sú v niektorých génoch veľmi nízke, Fosb génový promótor vykazuje značné hladiny tejto značky v NAc za kontrolných podmienok (Maze a kol., 2010, údaje nezobrazené). Naproti tomu v CPu sme zistili malé, ale významné zníženie väzby H3K4me3 a nárast väzby H3K27me3 na Fosb promótor v neprítomnosti kokaínovej námahy, účinky stratené po expozícii (Obr. 3D. * p <0.05).

  

Obrázok 3

Účinok predchádzajúcej chronickej expozície kokaínu na epigenetickú náplasť Fosb génu v NAc a CPu

Ďalej sme prešetrili záväznosť Pol II k Fosb gén založený na nedávnych zisteniach v bunkovej kultúre, že stagnácia Pol II na TSS, ktorá je charakterizovaná jeho fosforyláciou v Ser 5 v jeho opakovanej oblasti CTD, je spojená s primingom génov (pozri úvod). Preto sme analyzovali väzbu Pol II-pSer5 Fosb v štyroch odlišných oblastiach génu (Obr. 3B). Táto analýza odhalila významné obohatenie Pol II-pSer5 na Fosb génu v jeho proximálnom promotorovom regióne a okolo jeho TSS v NAc zvierat, ktoré boli skúsené s kokaínom po predĺženom vysadení bez prítomnosti kokaínu v porovnaní s kontrolnými zvieratami (Obr. 3E. * p <0.05). Toto obohatenie nebolo zjavné v dvoch oblastiach tela génu Fosb, v súlade s polarizáciou Pol II opísanou v jednoduchších experimentálnych systémoch. Zaujímavé je, že po podaní kokaínu sa viazanie Pol II-pSer5 stále vyznačovalo známkami obohatenia, hoci už nie významne, na Fosb proximálnej promótorovej oblasti (Obr. 3E. ^%p = 0.1), ale vrátili sa do kontrolných úrovní v TSS. Zistenia v CPu boli viac premenlivé, bez pozorovania jasného vzoru väzby Pol II-pSer5.

Diskusia

Táto štúdia poskytuje nový pohľad na trvalú reguláciu Fosb týždňoch po ukončení opakovanej expozície kokaínu. Ukazujeme, že predchádzajúce chronické podávanie kokaínu spôsobuje Fosb gén viac indukovateľný v NAc, čo viedlo k rýchlejšej akumulácii ΔFosB po opätovnom vystavení lieku. Vzhľadom na prevalenciu dôkazov, že indukcia ΔFosB v NAc sprostredkováva senzibilizovanú reakciu na správanie kokaínu (Nestler, 2008), naše zistenia odhaľujú nový mechanizmus pre rýchlejšie obnovenie takýchto senzibilizovaných reakcií po dlhšom odstúpení.

Preukazujeme, že zvýšená indukcia ΔFosB v NAc je spojená s zmenami chromatínu na Fosb gén, ktorý by mal očakávať jeho väčšiu indukciu. Ukazujeme teda zvýšenú väzbu Pol II k proximálnemu promótoru a TSS oblastiam génu, ktoré sú prítomné po týždňoch 4 odstúpenia od predchádzajúceho chronického podávania kokaínu. Takéto obohacovanie Pol II na TSS sa pri výzvách na kokaín rýchlo stratilo a Fosb indukcie, čo je v súlade s modelom v bunkovej kultúre, že ustálený Pol II je uvoľňovaný z TSS po aktivácii génov (pozri úvod). Výzvou na kokaín tiež indukuje rýchle zníženie väzby H3K9me2 - známky represie génov - na Fosb promótor. Na rozdiel od toho sme nezistili žiadnu trvalú indukciu niekoľkých transkripčných faktorov alebo ich kináz proti smeru expresie, o ktorých je známe, že sprostredkovávajú Fosb indukcia kokaínom. Tieto výsledky podporujú našu hypotézu, že zvýšená indukcia ΔFosB v NAc je sprostredkovaná prostredníctvom epigenetického primingu Fosb génu a nie prostredníctvom zvýšenej regulácie predchádzajúcich udalostí.

Veľmi odlišné výsledky boli získané pre CPu. Nebol tu žiadny dôkaz o tom, že sa Pol II zastavil Fosb u potkanov skúsených s kokaínom pred podaním kokaínu, aj keď existovali malé, ale významné histónové modifikácie v súlade s represiou génov: zvýšená väzba H3K27me3 a znížená väzba H3K4me3. Nezaznamenala sa ani žiadna zmena transkripčných faktorov alebo kináz proti smeru expresie, ktoré by zodpovedali redukovaným faktorom Fosb indukcie. Tieto zistenia naznačujú, že po chronickom podávaní kokaínu slúžia epigenetické modifikácie na tlmenie Fosb indukovateľnosti génov v CPu, na rozdiel od primárnej reakcie pozorovanej v NAc. Napriek tomu, že tieto účinky potláčajú indukciu indukcie mRNA pri indukcii kofakínu, nedochádza k žiadnej strate akumulácie proteínu ΔFosB. Mechanizmus, ktorý je základom tohto paradoxu, si teraz vyžaduje ďalšie vyšetrovanie.

Vo všeobecnosti, naše výsledky podporujú model, kde zmeny v chromatínovej krajine na špecifických génoch ako odpoveď na chronické podávanie kokaínu slúžia na primárne alebo tupé zachytenie týchto génov pre následnú indukciu pri opätovnom vystavení lieku. Takéto zmeny chromatínu, ktoré sa môžu považovať za "epigenetické jazvy", by sa vynechali pri analýzach hladín mRNA v rovnovážnom stave génov. Týmto spôsobom charakterizácia epigenómu závislostí sľubuje odhalenie čerstvých informácií o molekulárnej patogenéze poruchy, ktorá sa môže ťažiť pre vývoj nových liečebných postupov.

Poďakovanie

Referencie