Účinok nadmernej expresie ΔFosB na signalizáciu sprostredkovanú opiátmi a kanabinoidmi v nucleus accumbens (2011)

Neuropharmacology. 2011 Dec;61(8):1470-6. doi: 10.1016/j.neuropharm.2011.08.046.

Sim-Selley LJ, Cassidy MP, Sparta A, Zachariou V, Nestler EJ, Selley DE.

zdroj

Katedra farmakológie a toxikológie a Ústav pre drogy a alkoholické štúdie, Virginia Commonwealth University School of Medicine, Richmond, VA 23298, USA.

abstraktné

Stabilný transkripčný faktor ΔFosB sa indukuje v nucleus accumbens (NAc) chronickou expozíciou niekoľkých zneužívajúcich liečiv a transgénna expresia ΔFosB v striate zvyšuje odhodlané vlastnosti morfínu a kokaínue. Mechanizmus pre tieto pozorovania je však neúplný. Použili sme bitransgénny myšací model s indukovateľnou expresiou ΔFosB in dopamín D (1) receptor / dynorfín obsahujúci striatálne neuróny na určenie účinku expresie ΔFosB na signalizáciu opioidných a kanabinoidných receptorov v NAc. Výsledky ukázali, že aktivita G-proteínu sprostredkovaná mu opioidmi a inhibícia adenylylcyklázy boli zvýšené v NAc myší, ktoré exprimovali ΔFosB. Podobne bola zvýšená inhibícia kappa opioidu adenylylcyklázy u myší exprimujúcich AFosB. Na rozdiel od toho signalizácia sprostredkovaná kanabinoidným receptorom sa nelíši medzi myšami nadmerne exprimujúcimi ΔFosB a kontrolnými myšami. TToto poznatky naznačujú, že signalizácia opioidných a kanabinoidných receptorov je diferencovane modulovaná expresiou ΔFosB a naznačujú, že expresia ΔFosB môže produkovať niektoré z jej účinkov prostredníctvom zvýšenej signalizácie mu a kappa opioidného receptora v NAc.

Kľúčové slová: G-proteín, adenylylcyklázu, striatum

1. Úvod

Opioidné receptory a kanabinoidné CB1 receptory (CB1R) sú neurobiologické ciele pre dve široko používané triedy liekov, ktoré zahŕňajú opiáty morfínu, heroínu a predpisu a marihuanu (Δ9-tetrahydrokanabinol (THC)). Akútne účinky opioidov a kanabinoidov sú sprostredkované receptormi spojenými s G-proteínom, ktoré primárne aktivujú Gvstup / výstup proteíny a produkujú downstream efektorové reakcie, ako je inhibícia adenylylcyklázy (Childers, 1991, Childers a kol., 1992, Howlett a kol., 2002). Motor, poškodenie pamäti a psychoaktívne účinky D9THC sú vyrábané CB1R (Huestis a kol., 2001, Zimmer a kol., 1999), ktoré sú široko distribuované v mozgu, s vysokými hladinami bazálnych ganglií, hipokampu a malého mozgu (Herkenham a kol., 1991). Analgetické a odmeňujúce účinky väčšiny klinicky relevantných a zneužívaných opioidných liekov sú sprostredkované hlavne mu opioidnými receptormi (MOR) (Matthes a kol., 1996), ktoré sú obohatené o limbický systém a mozgovú kosť (Mansour a kol., 1994). Mesolimbický systém pozostávajúci z dopaminergných projekcií z ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) na nucleus accumbens (NAc) hrá dôležitú úlohu pri odmeňovaní účinkov opiátov a kanabinoidov (Bozarth a Wise, 1984, Vaccarino a kol., 1985, Zangen a kol., 2006), ako aj iné lieky na zneužívanie (Koob a Volkow, 2010). Navyše, endogénne opiátové a kanabinoidné systémy sa podieľajú na odmeňovacích účinkoch viacerých tried psychoaktívnych liekov (Maldonado a kol., 2006, Trigo a kol., 2010). Preto je dôležité objasniť mechanizmy, ktorými sa podáva opiát a CB1R sú regulované v NAc.

Hlavnou otázkou v oblasti zneužívania drog je identifikácia proteínov, ktoré sprostredkovávajú prechod z akútnych až dlhodobých účinkov psychoaktívnych liekov. Transkripčný faktor AP-1 ΔFosB je obzvlášť zaujímavý, pretože je to stabilný skrátený zostrihový variant produktu fosb gén, ktorý sa hromadí pri opakovanom vystavení zneužívaniu drog alebo prírodným odmenám (McClung a kol., 2004, Nestler, 2008, Nestler a kol., 1999). Zistili sme, že ΔFosB je indukovaný v mozgu po opakovanej expozícii morfínu, Δ9-THC, kokaínu alebo etanolu, pričom každé liečivo produkuje jedinečný regionálny vzorec expresie ΔFosB (Perrotti a kol., 2008). Dôsledné zistenie liekov bolo, že ΔFosB bol vysoko indukovaný v striate, kde všetky štyri lieky indukovali ΔFosB v jadre NAc a všetky s výnimkou Δ9-THC významne indukovala expresiu v NAc škrupine a caudate-putamen.

Farmakologické štúdie ukázali, že súčasné podávanie dopamínu D1 receptor (D1R) antagonistu SCH 23390 zablokoval indukciu AFc v NAc a caudate-putamen po prerušovanom podávaní kokaínu alebo morfínu, čo naznačuje potenciálny význam D1R-exprimujúcich neurónov (Muller a Unterwald, 2005, Nye a kol., 1995). Účinok indukcie ΔFosB na správanie sprostredkované liečivom sa skúmal s použitím bitransgénnych myší, ktoré exprimujú ΔFosB v špecifických neurónových populáciách NAc a dorzálneho striatu (Chen a kol., 1998). Myši, ktoré exprimujú ΔFosB v dynorfíne / D1R pozitívne neuróny v NAc a dorzálny striatum (línia 11A) ukazujú zmenené reakcie na drogy zneužívania, najmä zvýšenú citlivosť na odmeňujúce účinky kokaínu alebo morfínu (Colby a kol., 2003, Kelz a kol., 1999, Zachariou a kol., 2006). Tieto zmeny nastali v neprítomnosti zmien hladín MOR alebo rôznych podjednotiek G-proteínu. Avšak hladiny dynorfínovej mRNA boli redukované v NAc myší exprimujúcich ΔFosB (Zachariou a kol., 2006), čo naznačuje, že jeden cieľ ΔFosB je gén kódujúci endogénny opioidný peptid. Indukcia ΔFosB môže tiež spôsobiť zmeny správania reguláciou signalizácie receptora v NAc, ale táto možnosť nebola skúmaná. Preto súčasné štúdie použili bitransgénny myší model na určenie, či nadmerná expresia ΔFosB v dynorfíne / D1R obsahujúci striatálne neuróny mení aktivitu G-proteínu sprostredkovanú MOR a inhibíciu adenylylcyklázy sprostredkovanú MOR a KOR v NAc. Účinok ΔFosB na CB1R-sprostredkovaná aktivita G-proteínu bola tiež hodnotená, pretože Δ9Podávanie THC indukuje ΔFosB v NAc (Perrotti a kol., 2008) a je známe, že endokanabinoidný systém reguluje okruhy odmeňovania mozgu (Gardner, 2005, Maldonado a kol., 2006), ale účinok ΔFosB na endokanabinoidný systém nebol skúmaný.

2. Materiály a metódy

2.1. reagents

[35S] GTPyS (1250 Ci / mmol), [a-32P] ATP (800 Ci / mmol) a [3H] cAMP (26.4 Ci / mmol) boli zakúpené od firmy PerkinElmer (Shelton, CT). ATP, GTP, GDP, cAMP, hovädzí sérový albumín, kreatínfosfokináza, papaverín, imidazol a WIN-55212-2 boli zakúpené od spoločnosti Sigma Aldrich (St. Louis, MO). GTPyS bol zakúpený od spoločnosti Roche Diagnostic Corporation (Chicago, IL). Program DAMGO bol poskytnutý Programom na poskytovanie drog Národným inštitútom pre zneužívanie drog (Rockville, MD). Scintilačná kvapalina Econo-1 bola získaná od firmy Fisher Scientific (Norcross, GA). Ekolitová scintilačná tekutina bola získaná od ICN (Costa Mesa, CA). Všetky ostatné chemikálie boli získané od firmy Sigma Aldrich alebo Fisher Scientific.

2.2. myši

Samce bitransgénne myši odvodené z NSE-tTA (línia A) x TetOp-ΔFosB (línia 11) sa generovali tak, ako je opísané v Kelz et al. (Kelz a kol., 1999). Bitransgénne myši boli koncipované a zdvihnuté na doxycyklíne (100 μg v pitnej vode) na potlačenie expresie transgénu. V týždňoch veku 8 bol do polovice myší vynechaný doxycyklín z vody, aby sa umožnila expresia transgénu, zatiaľ čo zvyšné myši sa udržiavali na doxycyklíne na potlačenie transgénu. Mozgy boli zhromaždené 8 týždne neskôr, čas, v ktorom sú transkripčné účinky ΔFosB maximálne (McClung a Nestler, 2003). Bola použitá druhá transgénna myšacia línia, v ktorej je AC-Jun, dominantný negatívny antagonista c-Jun, exprimovaný v D1R / dynorfin a D2R / enkefalínové bunky striatu, hipokampu a parietálnej kôry (Peakman a kol., 2003). C-Jun a súvisiace proteíny rodiny Jun dimerizujú s rodinnými proteínmi Fos a viažu sa na miesto AP-1 cieľových génov na reguláciu transkripcie. Skrátenie N-konca c-Jun (Δc-Jun) komplikuje transkripčne neaktívny komplex a je schopný zabrániť väzbe DNA aktívnych komplexov AP-1. Samce bitransgénne myši odvodené z NSE-tTA (línia A) x TetOp-FLAG-AC-Jun (línia E) sa generovali spôsobom popísaným v Peakman et al. (Peakman a kol., 2003). Bitransgénne myši boli koncipované a zdvihnuté na doxycyklíne (100 μg v pitnej vode) na potlačenie expresie transgénu. Kŕče boli odstavené v 3 týždňoch, genotypizované a rozdelené do skupín, pričom polovica bola udržiavaná na vode obsahujúcej doxycyklín a polovicu na pravidelnej pitnej vode na vyvolanie expresie FLAG-AC-Jun. Mozgy boli zhromaždené 6 týždne neskôr, čas, v ktorom boli merané maximálne hladiny FLAG-Δc-Jun (Peakman a kol., 2003). Všetky postupy na zvieratách boli vykonávané v súlade s príručkou pre starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat v National Institutes of Health.

2.3. Príprava membrán

Mozgy sa uskladnili pri -80 ° C až do dňa testu. Pred testom bol každý mozog roztopený a NAc bol rozrezaný na ľade. Každá vzorka bola homogenizovaná v 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 7.4 (membránový pufor) s 20 zdvihmi zo skleneného homogenizátora pri 4 ° C. Homogenát bol centrifugovaný pri 48,000x g pri 4 ° C počas 10 min, resuspendované v membránovom tlmivom roztoku, znovu centrifugované pri 48,000 x g pri 4 ° C pre 10 min a resuspendované v 50 mM Tris-HCl, 3 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 100 mM NaCl, pH 7.4 (testovací pufer). Hladiny proteínov sa stanovili metódou Bradford (Bradford, 1976) s použitím hovädzieho sérového albumínu (BSA) ako štandard.

2.4. Stimulovaný agonistom [35S] GTPyS Väzba

Membrány sa predinkubovali v 10 minúte pri 30 ° C s adenozín deaminázou (3 mU / ml) v testovacom pufri. Membrány (5-10 μg proteín) boli potom inkubované v 2 hodinách pri 30 ° C v testovacom pufri obsahujúcom 0.1% (hmotnosť / objem) BSA, 0.1 nM [35S] GTPγS, 30 μM GDP a adenozín deaminázy (3 mU / ml) s príslušnými koncentráciami DAMGO alebo WIN55,212-2 a bez nich. Nešpecifická väzba sa merala pomocou 20 μM GTPyS. Inkubácia sa ukončila filtráciou cez filtre zo sklenených vlákien GF / B, potom sa 3 premývali s 3 ml ľadovo studeného 50 mM Tris-HCl, pH 7.4. Naviazaná rádioaktivita bola stanovená kvapalinovou scintilačnou spektrofotometriou po extrakcii cez noc filtrov v scintilačnej kvapaline Econo-1.

2.5. Test adenylylcyklázy

Membrány (5-25 μg proteín) boli predbežne inkubované s adenozín deaminázou, ako je opísané vyššie, potom boli inkubované v 15 min pri 30 ° C v prítomnosti alebo neprítomnosti 1M forskolínu s alebo bez DAMGO, U50,488H alebo WIN55,212-2 v testovacom pufri obsahujúcom 50 pM ATP, [a-32(1.5 μCi), 0.2 mM DTT, 0.1% (hmotn./objem) BSA, 50 μM cyklický AMP, 50 μM GTP, 0.2 mM papaverín, 5 mM fosfokreatín, 20 jednotky / ml kreatínfosfokinázy a adenozín deaminázy / ml) v konečnom objeme 3 μl. Za týchto podmienok celkový [a-32P] cAMP bol všeobecne nižší ako 1% z celkového množstva pridaného [a-32P] ATP v každej vzorke. Reakcia bola ukončená varením 3 min a [32P] Cyklický AMP bol izolovaný metódou dvojitého stĺpca (Dowex a alumina) Salomonu (Salomon, 1979). [3H] cAMP (10,000 dpm) sa pridala do každej skúmavky pred kolónovou chromatografiou ako vnútorným štandardom. Rádioaktivita bola stanovená kvapalinovou scintilačnou spektrofotometriou (účinnosť 45% pre 3H) po rozpustení 4.5 ml eluátu v 14.5 ml scintilačnej kvapaliny Ecolite.

2.6. Analýza dát

Ak nie je uvedené inak, údaje sú uvedené ako priemerné hodnoty ± SE oddelených experimentov 4-8, z ktorých každá bola vykonaná trojmo. Sieťovo stimulované [35S] GTPyS sa vypočíta ako agonistom stimulovaná väzba mínus bazálna väzba. Čistá aktivita adenylyl cyklázy stimulovaná forskolínom je definovaná ako forskolínom stimulovaná aktivita - bazálna aktivita (pmol / mg / min). Percentuálna inhibícia aktivity forkolínom stimulovanej adenylylcyklázy je definovaná ako (čistá aktivita stimulovaná forskolínom v neprítomnosti agonistu - čistá forskolínom stimulovaná aktivita v prítomnosti agonistu / čistého forskolínom stimulovanej aktivity v neprítomnosti agonistu) X 100. Všetky krivky a štatistické analýzy boli vykonané pomocou Prism 4.0c (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Krivky koncentračného účinku boli analyzované iteračnou nelineárnou regresiou, aby sa získala EC50 a Emax hodnôt. Štatistická významnosť údajov o koncentrácii a účinku bola stanovená dvojcestnou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím dávky agonistu a indukcie génu (zapnuté alebo vypnuté) ako hlavných faktorov. Štatistická významnosť hodnôt naklonenia krivky (Emax alebo EC50) bol stanovený nepárnym dvojstranným Studentovým t-testom, s použitím Welchovej korekcie alebo transformácie druhej odmocniny údajov, kde je to potrebné na korekciu nerovnakých odchýlok (detegovaných F-testom) v EC50 hodnôt.

3. výsledok

3.1. Účinok expresie ΔFosB na aktiváciu G-proteínu sprostredkovanú opioidmi a kanabinoidmi

Určiť, či MOR- alebo CB1R-sprostredkovaná aktivácia G-proteínu sa zmenila indukovateľnou transgénnou expresiou AFosB v NAc, stimulovanom agonistom [35S] GTPyS sa skúmala v izolovaných membránach pripravených z tejto oblasti bitransgénnych myší, ktoré podmienene exprimovali (ΔFosB on) alebo neexprimovali (ΔFosB off) transgén ΔFosB. Na aktiváciu MOR bol použitý MOR-selektívny enkefalínový analóg DAMGO a kanabinoid aminoalkylindol WIN55,212-2 bol použitý na aktiváciu CB1R. Tieto ligandy boli predtým preukázané ako plné agonisty pri MOR a CB1R, respektíve (Breivogel a kol., 1998, Selley a kol., 1997). Nebolo možné preskúmať aktivitu G-proteínu sprostredkovanú KOR, pretože signál je príliš nízky v mozgu hlodavcov (Childers a kol., 1998). Výsledky ukázali koncentráciu závislú stimuláciu aktivity G-proteínu tak DAMGO, ako aj WIN55,122-2 v NAc z DFosB off a ΔFosB na myšiach (Obrázok 1). Pre aktivitu stimulovanú DAMGO (Obrázok 1A), obojsmerná ANOVA údajov o koncentrácii a účinku odhalila významné hlavné účinky stavu ΔFosB (p <0.0001, F = 22.12, df = 1) a koncentrácie DAMGO (p <0.0001, F = 29.65, df = 5) bez významná interakcia (p = 0.857, F = 0.387, df = 5). Nelineárna regresná analýza kriviek koncentrácia-efekt odhalila signifikantne vyššiu DAMGO Emax hodnota v ΔFosB na myšiach (Emax = Stimulácia 73 ± 5.2%) v porovnaní s myšími s myšou protilátky proti IFFosB (Emax = 56 ± 4.1% stimulácie; p <0.05 odlišné od ΔFosB na myšiach pomocou Studentovho t-testu). DAMGO EC50 Hodnoty hodnôt sa nelíšia medzi myšiam AFOSB a myšími s IFFB (302 ± 72 nM v porovnaní s 212 ± 56 nM, respektíve, p = 0.346).

Obrázok 1 

Účinok expresie ΔFosB na agonistom stimulovaný [35S] GTPyS v NAc. Membrány z myší exprimujúcich ΔFosB (ΔFosB on) alebo kontrolné myši (ΔFosB off) boli testované ako je opísané v Metódach s použitím rôznych koncentrácií ...

Na rozdiel od výsledkov získaných s agonistom MOR DAMGO neboli pozorované žiadne rozdiely závislé od stavu na aktivácii G-proteínu závislé od stavu na základe kanabinoidného agonistu WIN55,212-2 (Obrázok 1B). Obojsmerná ANOVA z údajov o účinku koncentrácie WIN55,212-2 odhalila významný hlavný účinok koncentrácie WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 112.4, df = 7), ale nie na stav ΔFosB (p = 0.172 , F = 1.90, df = 1) a nedošlo k žiadnej interakcii (p = 0.930, F = 0.346, df = 7). Podobne nebol žiadny účinok ΔFosB stavu na WIN55,212-2 Emax (103 ± 6% v porovnaní s 108 ± 8% stimuláciou u myší na myši a pri vypnutých myšiach), alebo EC (p = 0.813 podľa študentského t-testu)50 (103 ± 20 nM verzus 170 ± 23 nM v myších myšiach s IFF a myší, p = 0.123).

Na základe tvaru kriviek a skutočnosti, že naše predchádzajúce štúdie ukázali dvojfázové krivky koncentrácie s účinnosťou WIN55,212-2 v mozgu (Breivogel a kol., 1999, Breivogel a kol., 1998) sa krivky WIN55,212-2 analyzovali aj pomocou dvojmiestneho modelu. Analýza priemerovaných údajov ukázala mierne zlepšenie dobrého prispôsobenia použitím dvojmiestneho modelu (R2 = 0.933 a 0.914, súčet štvorcov = 3644 a 5463 v prípade myšacích myší A a FF) v porovnaní s modelom s jedným miestom (R2 = 0.891 a 0.879, súčet štvorcov = 6561 a 6628 v myších myšiach s myšou ΔFosB). Avšak neboli zistené žiadne významné rozdiely medzi myšou AF a myšími v Emax alebo EC50 hodnoty miest s vysokou alebo nízkou potenciou (Doplnková tabuľka 1), hoci bol trend smerom k nižšej úrovni ES50 hodnota na mieste s vysokou účinnosťou u myší s AFFosB na (EC50vysoký = 28.0 ± 10.6 nM) v porovnaní s látkami s vypnutým ΔFosB (EC50vysoký = 71.5 ± 20.2 nM; p = 0.094). Navyše nebol žiadny vplyv štádia ΔFosB na bazálnu [35S] GTPyS v membránach NAc (253 ± 14 versus 226 ± 14 fmol / mg v AFosB na myšiach a naopak, p = 0.188). Tieto údaje naznačujú, že indukovateľná transgénna expresia ΔFosB v NAc myší zvýšila aktiváciu G-proteínu sprostredkovanú MOR bez významného ovplyvnenia CB1R-sprostredkovanej alebo bazálnej G-proteínovej aktivity.

3.2. Účinok ΔFosB na inhibíciu adenylylcyklázy sprostredkovanú opioidmi a kanabinoidmi

Na vyhodnotenie účinku indukovateľnej transgénnej expresie ΔFosB na moduláciu downstream efektorovej aktivity pomocou MOR a CB1R, bola inhibovaná aktivita adenylylcyklázy stimulovaná 1M forskolínom v membránach NAc. Okrem MOR - a CB1R-sprostredkovanú inhibíciu aktivity adenylylcyklázy sa skúmali aj účinky aktivity KOR pomocou KOR-selektívneho plného agonistu U50,488 (Zhu a kol., 1997), pretože predchádzajúce výsledky ukázali, že dynorfínová mRNA bola cielom ΔFosB v bitransgénnom modeli (Zachariou a kol., 2006). Výsledky ukázali, že DAMGO, U50,488 a WIN55,212-2 produkovali na koncentrácii závislú inhibíciu aktivity adenylyl-cyklázy u myší ako u AFosB, tak aj u AFosB (Obrázok 2). Dvojcestná ANOVA údajov o koncentrácii DAMGO (Obrázok 2A) odhalil významné hlavné účinky stavu ΔFosB (p = 0.0012, F = 11.34, df = 1) a koncentrácie DAMGO (p <0.0001, F = 29.61, df = 6), ale bez významnejšej interakcie (p = 0.441, F = 0.986) , df = 6). Nelineárna regresná analýza kriviek závislosti účinku na koncentrácii DAMGO odhalila signifikantne nižšie DAMGO EC50 hodnota v ΔFosB na myšiach (101 ± 11 nM) v porovnaní s ΔFosB mimo myší (510 ± 182 nM, p <0.05 podľa študentovho t-testu). Avšak v DAMGO E nebol významný rozdielmax (20.9 ± 1.26% oproti 19.8 ± 1.27% inhibícia u myší ΔFosB, respektíve p = 0.534).

Obrázok 2 

Účinok expresie ΔFosB na inhibíciu aktivity adenylylcyklázy v NAc. Membrány z myší exprimujúcich ΔFosB (ΔFosB on) alebo kontrolné myši (ΔFosB off) boli testované ako je opísané v Metódach v prítomnosti 1 uM ...

KOR-sprostredkovaná inhibícia adenylylcyklázy sa tiež líšila ako funkcia indukovateľnej transgénnej expresie ΔFosB (Obrázok 2B). Údaje o obojsmernej analýze ANOVA s hodnotou U50,488 0.0006 o účinku na koncentráciu preukázali významné hlavné účinky stavu ΔFosB (p = 14.53, F = 1, df = 50,488) a koncentrácie U0.0001 26.48 (p <3, F = 0.833, df = 0.289) bez významnejšej interakcie (p = 3, F = 50,488, df = XNUMX). Nelineárna regresná analýza kriviek koncentrácia-efekt odhalila vyššiu UXNUMX XNUMX E.max hodnota v ΔFosB na myšiach (18.3 ± 1.14% inhibícia) v porovnaní s ΔFosB mimo myší (12.5 ± 2.03% inhibícia; p <0.05 odlišné od ΔFosB v pomocou Studentovho t-testu), bez významného rozdielu v U50,488 EC50 (310 ± 172 nM verzus 225 ± 48 nM v myších myšiach s IFF a myší, p = 0.324).

Na rozdiel od účinkov pozorovaných pri MOR a KOR, nedošlo k žiadnemu významnému účinku indukovateľnej expresie transgénneho ΔFosB na inhibíciu adenylylcyklázy kanabinoidným agonistom WIN55212-2Obrázok 2C). Údaje o obojsmernej ANOVA z údajov o koncentrácii a účinku WIN55,212-2 preukázali signifikantný účinok koncentrácie liečiva (p <0.0001, F = 23.6, df = 2), ale nie ΔFosB stavu (p = 0.735, F = 0.118, df = 1) nedošlo ani k významnej interakcii (p = 0.714, F = 0.343, df = 2). Ďalej nebol žiadny účinok statusu AFosB na bazálnu alebo forskolínom stimulovanú aktivitu adenylyl cyklázy v neprítomnosti žiadneho agonistu. Bazálna aktivita adenylylcyklázy bola 491 ± 35 pmol / mg / min v AFosB u myší v porovnaní s 546 ± 44 v AFOSB myšiach (p = 0.346 podľa Studentovho t-testu). Rovnako aktivita adenylylcyklázy v prítomnosti 1 uM forskolínu bola 2244 ± 163 pmol / mg / min v ΔFosB u myší oproti 2372 ± 138 pmol / mg / min v ΔFosB mimo myší (p = 0.555).

3.3. Účinok ΔcJun na inhibíciu adenylylcyklázy sprostredkovanú opiátmi a kanabinoidmi

Pretože indukovateľná transgénna expresia ΔFosB zvýšenej inhibičnej signálnej transdukcie z MOR a KOR na adenylylcyklázu v NAc, bolo zaujímavé určiť, či dominantný negatívny inhibítor transkripcie sprostredkovanej ΔFosB by moduloval signalizáciu opioidného receptora opačným spôsobom. Na riešenie tejto otázky bola skúmaná inhibícia forskolínom stimulovanej aktivity adenylylcyklázy pomocou DAMGO a U50,488 v membránach pripravených z NAc bitransgénnych myší kondične exprimujúcich ΔcJun. Výsledky nepreukázali významný vplyv expresie ΔcJun na inhibíciu aktivity adenylylcyklázy MOR alebo KOR (Obrázok 3). Obojsmerná ANOVA kriviek závislosti účinku na koncentrácii DAMGO ukázala významný hlavný účinok koncentrácie DAMGO (p <0.0001, F = 20.26, df = 6), ale nie na stav ΔcJun (p = 0.840, F = 0.041, df = 1) a nedošlo k významnej interakcii (p = 0.982, F = 0.176, df = 6). Podobne nebol významný rozdiel v E.max alebo EC50 hodnôt medzi myšami s ΔcJun na (Emax = 23.6 ± 2.6%; EC50 = 304 ± 43 nM) alebo ΔcJun off (Emax = 26.1 ± 2.5%, p = 0.508; EC50 = 611 ± 176 nM, p = 0.129). Podobné výsledky boli pozorované u U50,488 0.0001, takže obojsmerná ANOVA kriviek koncentrácia-efekt vykázala signifikantný vplyv koncentrácie (p <11.94, F = 6, df = 0.127), ale nie na stav ΔcJun (p = 2.391) , F = 1, df = 0.978) a nedošlo k významnej interakcii (p = 0.190, F = 6, df = XNUMX). Rovnako tak neboli významné rozdiely v Emax alebo EC50 hodnôt medzi myšami s ΔcJun na (Emax = 14.8 ± 2.9%; EC50 = 211 ± 81 nM) alebo vypnuté (Emax = 16.7 ± 1.8%, p = 0.597; EC50 = 360 ± 151 nM, p = 0.411).

Obrázok 3 

Vplyv expresie ΔcJun na inhibíciu aktivity adenylylcyklázy v NAc. Membrány z myší exprimujúcich ΔcJun (ΔcJun on) alebo kontrolných (ΔcJun off) myši sa inkubovali v prítomnosti DAMGO (A), U50,488H (B) alebo WIN55,212-2 ...

Expresia ΔcJun tiež významne neovplyvnila inhibíciu adenylylcyklázy v NAc kanabinoidným agonistom. Obojsmerná ANOVA kriviek účinku na koncentráciu WIN55,212-2 ukázala významný hlavný účinok koncentrácie WIN55,212-2 (p <0.0001, F = 15.53, df = 6), ale nie genotypu (p = 0.066, F = 3.472, df = 1) a nedošlo k významnej interakcii (p = 0.973, F = 0.208, df = 6). Rovnako tak neboli významné rozdiely vo WIN55,212-2 Emax (13.0 ± 2.3% a 13.6 ± 0.9% inhibícia v ΔcJun na protilátke proti myši, respektíve p = 0.821) a alebo EC50 (208 ± 120 nM a 417 ± 130 nM v ΔcJun na protilátok proti myšiam, p = 0.270). Takže aj keď bol mierny trend smerom k zníženiu účinnosti WIN55,212-2 u myší exprimujúcich ΔcJun, transgén významne nemenil kanabinoidnú inhibíciu adenylylcyklázy. Navyše nebol žiadny účinok štádia ΔcJun na bazálnu alebo forskolínom stimulovanú aktivitu adenylylcyklázy. Základná aktivita adenylylcyklázy bola 1095 ± 71 pmol / mg / min a 1007 ± 77 pmol / mg / min (p = 0.403) u myší s aktivovanou alebo vypnutou ΔcJun. Adenylyl cyklázová aktivita stimulovaná 1 μM forskolínom bola 4185 ± 293 pmol / mg / min v porovnaní s 4032 ± 273 pmol / mg / min (p = 0.706) u myší s aktivovanou alebo vypnutou ΔcJun.

3.4. diskusia

Výsledky tejto štúdie odhalili zvýšenú aktiváciu G-proteínu sprostredkovanú MOR a inhibíciu adenylylcyklázy v NAc myší s indukovateľnou transgénnou expresiou AFosB v dynorfíne / D1R obsahujúci neuróny. KOR-sprostredkovaná inhibícia aktivity adenylylcyklázy bola tiež zvýšená v NAc myší exprimujúcich ΔFosB, čo naznačuje, že ΔFosB reguluje endogénny opiátový systém v NAc. DAMGO Emax hodnota bola vyššia pre MOR-stimulované [35S] GTPyS a jeho EC50 hodnota bola nižšia pre inhibíciu adenylylcyklázy v myšiach s nadmerným expresiou DFosB v porovnaní s kontrolnými myšami. Tieto zistenia naznačujú možnosť receptorovej rezervy na efektorovú moduláciu, ale nie aktiváciu G-proteínu za skúmaných podmienok testu. Zistenie, že maximálna inhibícia adenylylcyklázy agonistom KOR bola ovplyvnená expresiou ΔFosB, naznačuje nízku receptorovú rezervu pre KOR sprostredkovanú odozvu, čo je v súlade s nízkymi hladinami KOR väzbových miest v myšom mozgu (Unterwald a kol., 1991). Na rozdiel od toho CB1R-sprostredkovaná aktivita G-proteínu a inhibícia adenylylcyklázy neboli ovplyvnené expresiou ΔFosB, čo naznačuje, že opioidné a kanabinoidné systémy sa líšia v odpovedi na ΔFosB v týchto neurónoch NAc.

Účinok ΔFosB na signalizáciu sprostredkovanú opioidnými receptormi je v súlade s našou predchádzajúcou správou, že expresia ΔFosB v striate zmenila akútne a chronické účinky morfínu (Zachariou a kol., 2006). Jedným z výsledkov tejto štúdie bolo, že myši s transgénnou expresiou ΔFosB v dynorfíne / D1R striatálne neuróny boli citlivejšie na morfín na kondicionovaní ako kontrolné. Okrem toho tento účinok bol napodobovaný virálne sprostredkovanou expresiou AFosB injekciou špecifickou pre danú lokalitu do NAc. Tieto pozorovania sú v súlade s aktuálnymi výsledkami, ktoré ukazujú zvýšenú signalizáciu MOR v NAc.

Predtým sme identifikovali kódovanie génu dynorfínu ako cieľu ΔFosB a navrhol, aby redukovaný dynorfín bol konzistentný so zvýšenou obohacujúcimi vlastnosťami morfínu v bitúrozgénnych myšiach DFosB (Zachariou a kol., 2006). Súčasné výsledky ukazujú, že KOR-sprostredkovaná inhibícia adenylylcyklázy v NAc je zvýšená u myší exprimujúcich ΔFosB, čo môže odrážať kompenzačné zvýšenie citlivosti KOR po redukovanom dynorfíne. Predchádzajúce štúdie ukázali, že KOR bol upregulovaný v určitých oblastiach mozgu myší s vyradeným prodynorfínom vrátane NAc (Clarke a kol., 2003).

Na rozdiel od ΔFosB, indukovateľná transgénna expresia ΔcJun, dominantný negatívny skrátený mutant spojovacieho partnera ΔFosB cJun, nezmenila inhibíciu adenylylcyklázy MOR alebo KOR agonistami. Tieto výsledky naznačujú, že bazálne hladiny expresie ΔFosB, ktoré sú relatívne nízke, nehrájú významnú úlohu pri udržiavaní signalizácie opioidného receptora na tejto úrovni prenosu signálu v NAc. Skutočnosť, že v predchádzajúcej štúdii bol znížený expresívny účinok morfínu znížený expresiou ACc (Zachariou a kol., 2006) naznačuje, že morfínová indukcia AFosB počas procesu kondicionovania je dôležitá pri regulácii behaviorálnych odpovedí na liečivo alebo že transkripčné účinky ALFosB, iné ako tie, ktoré ovplyvňujú proximálnu signalizáciu opioidnými receptormi, môžu ovplyvniť opiátovú odmenu. V každom prípade výsledky tejto štúdie jasne ukazujú, keď je expresia ΔFosB zvýšená nad bazálne hladiny v striatálnom dynorfíne / D1R-exprimujúcich neurónov, dochádza k výraznému zvýšeniu väzby MOR a KOR na inhibíciu adenylylcyklázy v NAc.

Mechanizmy, pomocou ktorých je MOR a KOR sprostredkovaná signalizácia zvýšená nadmernou expresiou DFosB, sú nejasné, ale predtým sme ukázali, že hladiny MOR,3H] naloxónu, nie sú odlišné v NAc na AFosB na protilátok proti myšiam (Zachariou a kol., 2006). V tej istej štúdii sa zistilo, že Gαi1 a 2 proteínové hladiny neboli v tejto oblasti ovplyvnené expresiou ΔFosB. Predchádzajúce analýzy génovej expresnej sústavy však ukázali, že Gαo mRNA bola upregulovaná v NAc na AFosB na myšiach (McClung a Nestler, 2003). Bude zaujímavé v budúcich štúdiách komplexne preskúmať účinok expresie transgénneho ΔFosB na expresiu G-proteínovej podjednotky na úrovni proteínu, ako aj na expresiu mnohých G-proteín modulujúcich proteínov.

Je zaujímavé, že expresia ΔFosB nezvýšila CB1R-sprostredkovanú signalizáciu v NAc. Je možné, že zmeny v CB1R signalizácia sa vyskytuje v diskrétnej populácii neurónov, ktorá je zakrytá v celom prípravku NAc. Napríklad podávanie Δ9- THC významne indukoval ΔFosB v jadre, ale nie v škrupine NAc (Perrotti a kol., 2008). jandued, bolo preukázané, že výzva s Δ9-THC po opakovanom podaní Δ9-THC zvýšilo uvoľňovanie dopamínu v jadre NAc, ale znížilo uvoľnenie v plášti (Cadoni a kol., 2008). Je tiež dôležité poznamenať, že línia 11A bitransgénnych myší exprimuje ΔFosB len v dynorfíne / D1R pozitívne stredné špinavé neuróny striatum, ale CB1R sú vyjadrené ako v dynorfíne / D1R a enkefalín / D2R pozitívnych striatálnych neurónov (Hohmann a Herkenham, 2000), ako aj na termináloch kortikálnych aferentov (Robbe a spol., 2001). Expresia dominantného negatívneho regulátora transkripcie sprostredkovanej ΔFosB, ΔcJun, tiež nemala významný vplyv na signalizáciu kanabinoidného receptora, hoci ΔcJun je indukovateľne exprimovaný v obidvoch D1 a D2- obsahujúce populácie stredne štipľavých neurónov u týchto myší (Peakman a kol., 2003). Je však možné, že bazálna expresia ΔFosB je dostatočne nízka, aby ΔcJun neovplyvnila signalizáciu receptora, ako to naznačujú výsledky s MOR a KOR. Je tiež možné, že CB1R signalizácia je mierne zvýšená základnou expresiou ΔFosB, takže ďalšie zvýšenie expresie ΔFosB alebo blokovanie jeho pôsobenia pomocou ΔcJun malo len nepatrné účinky, ktoré nedosiahli úroveň štatistickej významnosti. Nepriama podpora pre túto interpretáciu možno vidieť porovnaním WIN55,212-2 EC50 hodnoty medzi myšami exprimujúcimi ΔcJun versus ΔFosB. Pomer WIN55,212-2 EC50 hodnoty pre inhibíciu adenylylcyklázy u myší s indukovanou expresiou ACcun na jej EC50 hodnota pre aktiváciu G-proteínu u myší s indukovanou expresiou ΔFosB bola 4.0, zatiaľ čo rovnaký pomer u myší bez indukcie jedného z týchto transgénov bol 1.2.

Alternatívne môžu kanabinoidy indukovať expresiu ΔFosB bez akéhokoľvek priameho účinku na CB1R signalizácia. V tomto scenári môžu kanabinoidy modulovať reakciu na psychoaktívne účinky iných liekov prostredníctvom transkripčnej regulácie sprostredkovanej ΔFosB. jaV skutočnosti správa d9-THC produkuje krížovú senzibilizáciu na opiáty a amfetamín (Cadoni a kol., 2001, Lamarque a kol., 2001), v súlade s touto hypotézou. Okrem toho sa zistilo, že opakované podávanie kanabinoidného agonistu CP55,940 zvyšuje MOR-sprostredkovanú aktiváciu G-proteínu v NAc, podobne ako myši indukovateľne exprimujúce ΔFosB v predloženej štúdii (Vigano a kol., 2005). Vplyv vyjadrenia ΔFosB na Δ9THC sprostredkované správanie nebolo vyhodnotené, ale súčasné výsledky nevylučujú interakciu. Výsledky tejto a našej predchádzajúcej štúdie (Zachariou a kol., 2006) ukazujú indukované zmeny v MOR a KOR / dynorfin v striate. Odmeňujúce účinky Δ9-THC, merané podľa miesta preferencie, sú zrušené u MOR nulových myší, zatiaľ čo delecia KOR zoslabeného A9-THC miesto averzie a odhalil Δ9-Preferencie miesta THC (Ghozland a kol., 2002). Podobne, kondiciovanie podmieneného miesta na Δ9-THC chýba pri knock-out pro-dynorphinu v porovnaní s myší divého typu (Zimmer a kol., 2001). Z týchto údajov vyplýva, že Δ9-THC môže byť výhodnejšie po indukcii ΔFosB a následnej indukcii signalizácie MOR so znížením expresie dynorfínu.

V súhrney, výsledky tejto štúdie ukázali, že expresia ΔFosB v D1R / dynorfín-pozitívne striatálne neuróny zlepšili signalizáciu sprostredkovanú MOR a KOR na úrovni G-proteínu sprostredkovanej inhibície aktivity adenylyl cyklázy v NAc. Toto zistenie je v súlade so štúdiami, ktoré preukázali úlohu endogénneho opioidného systému za odmenu (Trigo a kol., 2010) a poskytujú potenciálny mechanizmus účinkov sprostredkovaných ΔFosB na odmenu, Na rozdiel od toho CB1R-sprostredkovaná signalizácia v NAc nebola signifikantne ovplyvnená striatálnou expresiou ΔFosB za skúmaných podmienok, hoci ďalšie štúdie sú opodstatnené na určenie účinku indukcie ΔFosB na endokanabinoidný systém.

Významné poznatky výskumu

  • MOR signalizácia je zosilnená v nucleus accumbens myší, ktoré exprimujú ΔFosB
  • KOR inhibícia adenylylcyklázy je tiež zvýšená u myší exprimujúcich ΔFosB
  • Expresia ΔFosB nemení CB1R v nucleus accumbens

Doplnkový materiál

Poďakovanie

Autori ďakujú Hengjun He, Jordan Cox a Aaron Tomarchio za technickú pomoc s [35S] GTPyS. Táto štúdia bola podporovaná grantmi USPHS Grants DA014277 (LJS), DA10770 (DES) a P01 DA08227 (EJN).

poznámky pod čiarou

Zrieknutie sa zodpovednosti vydavateľa: Toto je súbor PDF s neupraveným rukopisom, ktorý bol prijatý na uverejnenie. Ako službu pre našich zákazníkov poskytujeme túto skoršiu verziu rukopisu. Rukopis sa podrobí kopírovaniu, sádzaniu a preskúmaniu výsledného dôkazu skôr, ako sa uverejní vo svojej konečnej podobe. Upozorňujeme, že počas výrobného procesu môžu byť zistené chyby, ktoré by mohli mať vplyv na obsah, a všetky právne zrieknutia sa zodpovednosti, ktoré sa vzťahujú na časopis.

Referencie

  • Bozarth MA, Wise RA. Anatomicky odlišné oblasti opiátových receptorov sprostredkovávajú odmenu a fyzickú závislosť. Science. 1984;224: 516-517. [PubMed]
  • Bradford MM. Rýchla a citlivá metóda na kvantifikáciu mikrogramových množstiev proteínov využívajúcich princíp väzby proteín-farbivo. Anal. Biochem. 1976;72: 248-254. [PubMed]
  • Breivogel CS, Childers SR, Deadwyler SA, Hampson RE, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Chronická delta9-tetrahydrokanabinol spôsobuje časovo závislú stratu G-proteínov aktivovaných kanabinoidným receptorom v mozgu. J. Neurochem. 1999;73: 2447-2459. [PubMed]
  • Breivogel CS, Selley DE, Childers SR. Účinnosť agonistu receptora kanabinoidov na stimuláciu [35S] GTPyS na potkanie cerebelárnych membrán koreluje s poklesom afinity indukovanej agonistom. J. Biol. Chem. 1998;273: 16865-16873. [PubMed]
  • Cadoni C, Pisanu A, Solinas M, Acquas E, Di Chiara G. Behaviorálna senzibilizácia po opakovanej expozícii Delta 9-tetrahydrokanabinolom a krížová senzibilizácia morfínom. Psychofarmakológia (Berl) 2001;158: 259-266. [PubMed]
  • Cadoni C, Valentini V, Di Chiara G. Behaviorálna senzibilizácia na delta 9-tetrahydrokanabinol a krížová senzibilizácia morfínom: diferenciálne zmeny v akumulálnom systéme a prenosu jadra dopamínu. J. Neurochem. 2008;106: 1586-1593. [PubMed]
  • Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgénne zvieratá s indukovateľnou cieľovou expresiou génu v mozgu. Mol. Pharmacol. 1998;54: 495-503. [PubMed]
  • Childers SR. Druhí poslovia viazaní na opioidné receptory. Life Sci. 1991;48: 1991-2003. [PubMed]
  • Childers SR, Fleming L, Konkoy C, Marckel D., Pacheco M, Sexton T, Ward S. Opioid a inhibícia kanabinoidného receptora adenylylcyklázy v mozgu. Ann. NY Acad. Sci. 1992;654: 33-51. [PubMed]
  • Childers SR, Xiao R, Vogt LJ, Sim-Selley LJ. Stimulácia Kappa opioidného receptora [35S] GTPyS v mozgu morčiat: Nedostatok dôkazov o kappa2selektívnu aktiváciu G-proteínov. Biochem. Pharmacol. 1998;56: 113-120. [PubMed]
  • Clarke S, Zimmer A, Zimmer AM, Hill RG, Kuchyňa I. Regionálne selektívne upregulovanie mikro-, delta- a kappa-opioidných receptorov, ale nie 1 receptorov podobných opioidným receptorom v mozgu enkefalínu a myší s vyradeným dynorfínom. Neuroscience. 2003;122: 479-489. [PubMed]
  • Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadmerná expresia DeltaFosB špecifického pre špecifický typ buniek zvyšuje motiváciu kokaínu. J. Neurosci. 2003;23: 2488-2493. [PubMed]
  • Gardner EL. Endokanabinoidný signalizačný systém a odmena za mozog: dôraz na dopamín. Pharmacol. Biochem. Behave. 2005;81: 263-284. [PubMed]
  • Ghozland S, Matthes HW, Simonin F, Filliol D, Kieffer BL, Maldonado R. Motivačné účinky kanabinoidov sú sprostredkované mu-opioidnými a kappa-opioidnými receptormi. J. Neurosci. 2002;22: 1146-1154. [PubMed]
  • Herkenham M, Lynn AB, Johnson MR, Melvin LS, de Costa BR, Rice KC. Charakterizácia a lokalizácia kanabinoidných receptorov v mozgu potkanov: kvantitatívna autorádiografická štúdia in vitro. J. Neurosci. 1991;11: 563-583. [PubMed]
  • Hohmann AG, Herkenham M. Lokalizácia kanabinoidnej CBR (1) receptorovej mRNA v neuronálnych subpopuláciách striatum potkana: double-label in situ hybridizačná štúdia. Synapsie. 2000;37: 71-80. [PubMed]
  • Howlett AC, Barth F, Bonner TI, Cabral G, Casellas P, Devane WA, Felder CC, Herkenham M, Mackie K, Martin BR, Mechoulam R, Pertwee RG. Medzinárodná federácia pre farmakológiu. XXVII. Klasifikácia kanabinoidných receptorov. Farmakologický prieskum. 2002;54: 161-202.
  • Huestis MA, Gorelick DA, Heishman SJ, Preston KL, Nelson RA, Moolchan ET, Frank RA. Blokovanie účinkov údenej marihuany pomocou CB1-selektívneho antagonistu kanabinoidného receptora SR141716. Arch. Gen. Psychiatry. 2001;58: 322-328. [PubMed]
  • Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Expresia transkripčného faktora deltaFosB v mozgu riadi citlivosť na kokaín. Príroda. 1999;401: 272-276. [PubMed]
  • Koob GF, Volkow ND. Neurocircuitry závislosti. Neuropsychopharmacology. 2010;35: 217-238. [Článok bez PMC] [PubMed]
  • Lamarque S, Taghzouti K, Simon H. Chronická liečba Delta (9) -tetrahydrokanabinol zvyšuje lokomotorickú odpoveď na amfetamín a heroín. Dôsledky zraniteľnosti voči drogovej závislosti. Neuropharmacology. 2001;41: 118-129. [PubMed]
  • Maldonado R, Valverde O, Berrendero F. Zapojenie endokanabinoidného systému pri drogovej závislosti. Trendy Neurosci. 2006;29: 225-232. [PubMed]
  • Mansour A, Fox CA, Thompson RC, Akil H, Watson SJ. mu-opioidného receptora expresie mRNA v potkanoch CNS: porovnanie s väzbou mu-receptora. Brain Res. 1994;643: 245-265. [PubMed]
  • Matthes HWD, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Kuchyňa I, Befort K, Dierich A, LeMeur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Strata morfínom indukovanej analgézie, odmeňového účinku a abstinenčných príznakov u myší, ktorým chýba gén opioidného receptora. Príroda. 1996;383: 819-823. [PubMed]
  • McClung CA, Nestler EJ. Regulácia génovej expresie a odmeňovania kokaínom CREB a DeltaFosB. Nat. Neurosci. 2003;6: 1208-1215. [PubMed]
  • McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekulárny prepínač pre dlhodobú adaptáciu v mozgu. Brain Res. Mol. Brain Res. 2004;132: 146-154. [PubMed]
  • Muller DL, Unterwald EM. Dopaminové receptory D1 modulujú indukciu deltaFosB v striatom potkana po prerušovanom podávaní morfínu. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005;314: 148-154. [PubMed]
  • Nestler EJ. Preskúmanie. Transkripčné mechanizmy závislosti: úloha spoločnosti DeltaFosB. Philos. Trans. R. Soc. Londa. B. Biol. Sci. 2008;363: 3245-3255. [Článok bez PMC] [PubMed]
  • Nestler EJ, Kelz MB, Chen J. DeltaFosB: molekulárny mediátor dlhodobej nervovej a behaviorálnej plasticity. Brain Res. 1999;835: 10-17. [PubMed]
  • Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologické štúdie regulácie chronickej indukcie antigénu súvisiacej s FOS kokaínom v striate a nucleus accumbens. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1995;275: 1671-1680. [PubMed]
  • Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Indukovateľná expresia dominantného negatívneho mutantu c-Jun v transgénnych myšiach špecifických pre mozgovú oblasť znižuje citlivosť na kokaín. Brain Res. 2003;970: 73-86. [PubMed]
  • Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Výrazné vzory indukcie DeltaFosB v mozgu drogami zneužívania. Synapsie. 2008;62: 358-369. [Článok bez PMC] [PubMed]
  • Robbe D, Alonso G., Duchamp F., Bockaert J, Manzoni OJ. Lokalizácia a mechanizmy účinku kanabinoidných receptorov na glutamatergických synapsách myšacieho nucleus accumbens. J. Neurosci. 2001;21: 109-116. [PubMed]
  • Salomon Y. Adenylát cyklázový test. Prísl. Cyclic Nucleotide Res. 1979;10: 35-55. [PubMed]
  • Selley DE, Sim LJ, Xiao R, Liu Q, Childers SR. Mu opioidného receptora stimulovaného [35S] GTPyS v potkaního talamu a kultivovaných bunkových líniách: mechanizmy transdukcie signálu, na ktorých je založená účinnosť agonistov. Mol. Pharmacol. 1997;51: 87-96. [PubMed]
  • Trigo JM, Martin-Garcia E, Berrendero F., Robledo P, Maldonado R. Endogénny opiátový systém: spoločný substrát pri závislosti od drog. Drogový alkohol závisí. 2010;108: 183-194. [PubMed]
  • Unterwald EM, Knapp C, Zukin RS. Neuroanatomická lokalizácia k1 a k2 opioidných receptorov v mozgu potkanov a morčiat. Brain Res. 1991;562: 57-65. [PubMed]
  • Vaccarino FJ, Bloom FE, Koob GF. Blokáda opiátových receptorov nucleus accumbens zoslabuje intravenóznu odmenu heroínu u potkanov. Psychofarmakológia (Berl) 1985;86: 37-42. [PubMed]
  • Vigano D, Rubino T, Vaccani A, Bianchessi S, Marmorato P, Castiglioni C, Parolaro D. Molekulárne mechanizmy zapojené do asymetrickej interakcie medzi kanabinoidnými a opioidnými systémami. Psychofarmakológia (Berl) 2005;182: 527-536. [PubMed]
  • Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Podstatná úloha DeltaFosB v nucleus accumbens pri morfínových akciách. Nat. Neurosci. 2006;9: 205-211. [PubMed]
  • Zangen A, Solinas M, Ikemoto S, Goldberg SR, Wise RA. Dve mozgové miesta pre odmenu kanabinoidov. J. Neurosci. 2006;26: 4901-4907. [PubMed]
  • Zhu J, Luo LY, Li JG, Chen C, Liu-Chen LY. Aktivácia klonovaného ľudského kappa opioidného receptora agonistami zvyšuje viazanie [35S] GTPyS na membrány: stanovenie účinnosti a účinnosti ligandov. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1997;282: 676-684. [PubMed]
  • Zimmer A, Valjent E, Konig M, Zimmer AM, Robledo P, Hahn H, Valverde O, Maldonado R. Absencia dysforických účinkov delta-9-tetrahydrokanabinolu v myšiach s deficitom dynorfínu. J. Neurosci. 2001;21: 9499-9505. [PubMed]
  • Zimmer A, Zimmer AM, Hohmann AG, Herkenham M, Bonner TI. Zvýšená úmrtnosť, hypoaktivita a hypoalgézia u myší s kanabinoidným knockoutovým účinkom na kanabinoidné receptory. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999;96: 5780-5785. [Článok bez PMC] [PubMed]