PMCID: PMC2820240
NIHMSID: NIHMS174679
abstraktné
Zmeny v expresii génov vyvolané kokaínom spôsobujú zmeny v morfológii a správaní neurónov, ktoré môžu byť základom závislosti na kokaíne. Identifikovali sme zásadnú úlohu pre histón 3 lyzín 9 (H3K9) dimetyláciu a lyzín dimetyltransferázu G9a v kokaínom indukovanej štrukturálnej a behaviorálnej plasticite. Opakované podávanie kokaínu znížilo globálne hladiny dimetylácie H3K9 v nucleus accumbens. Tjeho redukcia metylácie histónov bola sprostredkovaná represiou G9a v tejto oblasti mozgu, ktorá bola regulovaná kokaínom indukovaným transkripčným faktorom AFosB. Použitím podmienenej mutagenézy a prenosu génov sprostredkovaného vírusmi sme zistili, že G9a downregulácia zvyšuje plasticitu dendritickej chrbtice neurónov nucleus accumbens a zvyšuje preferenciu kokaínu, čím vytvára rozhodujúcu úlohu pre metyláciu histónov pri dlhodobých účinkoch kokaínu.
úvod
Opakovaná expozícia kokaínu je charakterizovaná pretrvávajúcimi zmenami v génovej expresii a zmenenou morfológiou neurónov v jadre nucleus accumbens (NAc), ktorá je kľúčovou zložkou systému odmeňovania mozgu (1-2). Remodelácia chromatínu je dôležitá pri aberantných transkripčných zmenách v tejto oblasti mozgu, ktoré môžu byť základom aspektov závislosti od kokaínu. (3-9). Regulácia chromatínovej štruktúry kokaínu v NAc je čiastočne výsledkom priamych modifikácií enzymatického aparátu chromatínu indukovaných kokaínom, čo vedie k zmenám acetylácie a fosforylácie histónov (4, 7-9); avšak úlohy enzýmov riadiacich metyláciu histónov ešte neboli skúmané.
Nedávna analýza promótorov na celom genóme s použitím imunoprecipitácie chromatínu spojenej s mikročipmi (ChIP-Chip) identifikovala zmenené vzory represie histónového H3 lyzínu 9 (H3K9) a metylácie 27 (H3K27) v špecifických promótoroch génov v NAc po opakovanej liečbe kokaínom (6). Preto sme profilovali početné lyzínové metyltransferázy (KMT) a demetylázy (KDM), o ktorých je známe, že riadia metyláciu H3K9 alebo H3K27 (Obrázok 1A). Len dva enzýmy, G9a a GLP, vykazovali perzistentnú transkripčnú reguláciu 24 hodín po opakovanom podávaní kokaínu, keď bola expresia oboch génov významne znížená.. Pretože G9a a GLP špecificky katalyzujú dimetyláciu H3K9 (H3K9me2), ich downregulácia kokaínom je v súlade so zníženými globálnymi hladinami euchromatického H3K9me2 pozorovaného v tomto časovom bode (Obrázok 1B). Naopak, globálne hladiny heterochromatickej metylácie H3K27 zostali nezmenené opakovanou expozíciou kokaínom (Obr. S1 v podpornom online materiáli). Vzhľadom na vysokú úroveň katalytickej aktivity in vitro a in vivo (10), sme sa rozhodli ďalej skúmať funkčný význam represie G9a po opakovanej expozícii kokaínu v NAc. Hladiny proteínu G9a, podobne ako hladiny jeho mRNA, boli významne znížené 24 hodín po opakovanom podávaní kokaínu (Obrázok S2). Hoci expresia mRNA G9a bola znížená o 35% v NAc, imunohistochemická analýza odhalila miernejšie zníženie 15% proteínových hladín G9a, čo je v súlade s pozorovaným poklesom 21% H3K9me2 po opakovanom podávaní kokaínu (Obrázok 1B). Expresia mRNA G9a bola tiež znížená v tejto oblasti mozgu pomocou 20% po opakovanom samopodaní kokaínu (Obrázok S3).
Aby sme zistili, či zmeny v euchromatickom H3K9me2 korelujú so zmenami génovej expresie v NAc v celom genóme, použili sme analýzy microarray na skúmanie profilov génovej expresie indukovaných provokačnou dávkou kokaínu u zvierat s predchádzajúcou expozíciou kokaínu alebo bez neho (pozri dodatok génové zoznamy v Tabuľky S1 – S3). Zvieratá, ktoré dostali opakovaný kokaín, vykazovali dramaticky zvýšenú expresiu génu 1 hodinu po provokačnom podaní kokaínu v porovnaní s akútne liečenými zvieratami (Obrázok 1C). Táto zvýšená expresia génu sa stále vyskytovala v reakcii na kokaínovú výzvu podanú po týždni 1 po vysadení z opakovaného kokaínu. V súlade s predchádzajúcimi správami malé percento génov (~ 10%) vykazovalo desenzibilizované transkripčné reakcie po opakovanom podávaní kokaínu (Obrázok 1C; vidieť Tabuľka S1) (5). Na priame skúmanie úlohy downregulácie G9a v zosilnenej génovej expresii pozorovanej po opakovanom kokaíne dostali myši intra-NAc injekcie vektorov vírusu Herpes simplex (HSV) exprimujúcich buď GFP alebo G9a a boli ošetrené fyziologickým roztokom alebo opakovaným kokaínom, aby sa určilo, či nadmerná expresia G9a bola dostatočná na blokovanie opakovaného zvýšenia expresie génu indukovaného kokaínom. Zo súboru 12 náhodne vybraných génov, ktoré vykazovali zvýšené hladiny expresie po opakovanom kokaíne, sme pozorovali, že G9a významne znížil zvýšenú expresiu 50% týchto génov (Tabuľka S4).
Na identifikáciu upstream transkripčných javov, ktoré sprostredkovávajú opakovanú represiu expresie G9a indukovanú kokaínom, sme skúmali možnú úlohu AFosB, vysoko stabilného produktu zostrihu bezprostredného skorého génu. fosB, ΔFosB sa akumuluje v NAc po opakovanej expozícii kokaínu, kde sa spája so zvýšenou odmenou kokaínu (11). AFosB môže pôsobiť ako transkripčný aktivátor alebo represor v závislosti od cieľového génu (3, 5, 6, 12). Použitie bitransgénneho NSE-TTA × tetOP-AFosB myši, kde expresia AFosB môže byť indukovaná selektívne v NAc a dorzálnom striate dospelého zvieraťa (13) sme skúmali vplyv expresie AFosB na reguláciu kokaínu H3K9me2 a KMTs v NAc. Nadmerná expresia AFosB bola dostatočná na zníženie hladín H3K9me2 (Obrázok 1D) a výraz G9a (Obrázok 1E), čím sa napodobňujú účinky opakovaného kokaínu. Na rozdiel od toho, AFosB neznížil expresiu GLP v tejto oblasti mozgu a nemal žiadny účinok na SUV39H1 a EZH2, hlavné trimetylačné enzýmy pre H3K9 a H3K27, v tomto poradí (Obrázok S4). Na potvrdenie týchto údajov s použitím nezávislého systému nadmernej expresie AFosB, dospelé myši divokého typu dostali bilaterálne intra-NAc injekcie vektorov Adeno-asociovaného vírusu (AAV) exprimujúcich buď GFP alebo AFosB. Vírusom sprostredkovaná nadmerná expresia AFosB znížila hladiny expresie G9a v tejto oblasti mozgu (Obrázok 1E).
Takáto výrazná a špecifická regulácia G9a nás viedla k skúmaniu, či zmena expresie G9a špecificky v NAc neurónoch reguluje behaviorálne reakcie na kokaín. Myši divokého typu dostávali intra-NAc injekcie vektorov HSV exprimujúcich GFP alebo G9a a potom boli analyzované s použitím objektívnej paradigmy preferovaného miesta preferovaného kokaínu, ktorá poskytuje nepriamu mieru odmien lieku. Vírusová nadmerná expresia G9a v neurónoch NAc bola potvrdená po testovaní správania (Obrázok 2A). Nadmerná expresia G9a významne znížila preferenciu kokaínu v porovnaní so zvieratami nadexprimujúcimi GFP (Obrázok 2B) a zvýšené úrovne H3K9me2 v NAc (Obrázok 2C). Nadmerná expresia katalyticky mŕtveho mutanta G9a (G9aH1093K) (14) neovplyvnila preferencie kokaínu (\ tObrázok 2B) a nemal žiadny vplyv na hladiny H3K9me2 v tejto oblasti mozgu (\ tObrázok 2C).
Na ďalšie skúmanie úlohy G9y v behaviorálnych účinkoch kokaínu a konkrétnejšie na napodobnenie opakovanej kokaínom indukovanej represie expresie G9a v NAc, dospelý G9afl / fl myši (14) dostali intra-NAc injekcie AAV vektorov exprimujúcich Cre rekombinázu alebo GFP ako kontrolu. AAV-Cre knockdown G9a v NAc, ktorý bol potvrdený imunohistochemicky (Obrázok S5), signifikantne zvýšili účinky kokaínu na pokusy o kondicionovanie a znížili hladiny H3K9me2 v NAc (Obr. 2D, E). Komerčne dostupný farmakologický inhibítor G9a a GLP, BIX01294 (15-16), sa použilo na zistenie, či inhibícia enzýmu podobne ovplyvňuje behaviorálne reakcie na kokaín. Farmakologická inhibícia G9a a GLP významne zvýšila preferenciu kokaínu a znížila H3K9me2 v NAc (Obr. 2F, G).
Opakované podávanie kokaínu zvyšuje hustotu dendritických spinov na NAc stredných ostnatých neurónoch (17), proces spojený s funkčnými zmenami excitačných glutamátergických synapsií na tieto neuróny (18-19) a senzibilizované behaviorálne reakcie na liek (17, 20). Preto sme predpokladali, že downregulácia aktivity G9a v NAc opakovaným kokaínom môže sprostredkovať schopnosť kokaínu regulovať dendritickú hustotu chrbtice NAc neurónov. Použitím imunoprecipitácie chromatínu (ChIP) s anti-G9a protilátkou sme identifikovali niekoľko domnelých G9a génových cieľov v NAc, z ktorých každý bol predtým zapojený do dendritickej plasticity vyvolanej kokaínom (Obrázok 3A) (20-26). Zistili sme, že opakované podávanie kokaínu významne znižuje väzbu G9a, ako aj hladiny H3K9me2, u týchto génových promótorov (Obrázok 3B). Naproti tomu akútne podanie kokaínu rýchlo získalo G9a na niektoré z týchto rovnakých promótorov génov, čo je v súlade so zvýšenou expresiou G9a pozorovanou v NAc 1 hodine po akútnej dávke kokaínu (Obrázok S6). Hoci väzba G9a na špecifických génových promótoroch koreluje so zmenami v jej expresii, zostáva nejasné, či sú takéto udalosti sprostredkované zmenenými globálnymi hladinami G9a v NAc a / alebo rozdielmi v nábore G9a po akútnom vs. opakované podávanie kokaínu.
Na základe G9a regulácie mnohých génov súvisiacich s plasticitou v NAc sme priamo skúmali, či udržanie expresie G9a v tejto oblasti mozgu po opakovanej liečbe kokaínom bolo dostatočné na blokovanie tvorby dendritickej chrbtice vyvolanej kokaínom. Použitie protokolu liečby kokaínom, ktorý sa predtým preukázal na podporu indukcie dendritickej chrbtice v NAc (20), sme skúmali hustotu chrbtice u zvierat, ktorým bol podávaný HSV-GFP alebo HSV-G9a. V súlade s predchádzajúcimi zisteniami sme pozorovali signifikantné zvýšenie dendritickej hustoty chrbtice v NAc po liečbe kokaínom, čo bol účinok, ktorý bol úplne blokovaný nadmernou expresiou G9a (Obrázok 3C). Samotná nadmerná expresia G9a nebola dostatočná na zníženie hustoty NAc dendritickej chrbtice v neprítomnosti kokaínu. Na doplnenie týchto údajov, G9afl / fl myši dostali intra-NAc injekcie HSV-Cre a hustota chrbtice bola kvantifikovaná a porovnaná so zvieratami, ktoré dostávali HSV-GFP v neprítomnosti kokaínu. Knockdown expresie G9a významne zvýšil hustotu chrbtice na stredne ostnatých neurónoch NAc (Obrázok 3C).
Vzhľadom na dôkazy, že G9a downregulácia v NAc po opakovanom kokaíne je sprostredkovaná AFosB, sme ďalej skúmali, či tento transkripčný faktor je podobne zapojený do regulácie NAc dendritických spinov. Hoci AFosB nebol predtým kauzálne spojený s takouto dendritickou plasticitou, niekoľko jeho cieľov, vrátane podjednotiek Cdk5 a NFκB, bolo tak implikovaných (20-23), a pretrvávajúca expresia AFosB v NAc neurónoch koreluje so zvýšenou dendritickou hustotou chrbtice po opakovanej liečbe kokaínom (27). Najprv sme zistili, že indukcia AFosB u bitransgénnych myší v neprítomnosti kokaínu, ktorá downregulovala expresiu G9a a H3K9me2 (Obr. 1D, E), znížila väzbu G9a na početné gény súvisiace s plasticitou, z ktorých mnohé sa tiež ukázali ako priame ciele samotného AFosB (Obrázok 3D) (3, 6). Ďalej sme ukázali, že nadmerná expresia vírusu AFosB v NAc významne zvýšila dendritickú hustotu chrbtice v bazálnych podmienkach, pozorované po opakovanom podávaní kokaínu (\ tObrázok 3E). Naopak, nadmerná expresia v NAc AJunD, dominantného negatívneho mutantného proteínu, ktorý antagonizuje AFOSB transkripčnú aktivitu, blokovala schopnosť opakovaného kokaínu zvyšovať tvorbu dendritickej chrbtice v NAc. (Obrázok 3C).
Naše pozorovanie, že AFosB reguluje expresiu G9a v NAc a že AFosB a G9a regulujú niektoré z rovnakých cieľových génov, nás viedli k skúmaniu ďalších interakcií medzi AFosB a G9a. Po akútnom kokaíne, keď sa zvýšili hladiny G9a, sa väzba G9a na. \ T fosB gén bol zvýšený, zatiaľ čo po opakovanom kokaíne, keď bola expresia G9a potlačená, G9a sa viaže na fosB gén bol znížený (Obrázok 3A). Takáto znížená väzba G9a po opakovanom kokaíne nebola pozorovaná c-fos, keď sa naviazanie G9y zvyšuje opakovaným kokaínom (\ tObrázok S7). To je v súlade so skutočnosťou, že na rozdiel od fosB, c-fos je potlačená, nie je indukovaná chronickou psychostimulačnou expozíciou (\ t5). Nadmerná expresia AFosB u bitransgénnych myší bola dostatočná na výrazné zníženie väzby G9a na. \ T fosb génu (Obrázok 3D). Nadmerná expresia G9a bola navyše dostatočná na zníženie zvýšenej expresie AFosB po opakovanom podávaní kokaínu (Tabuľka S4). Tieto údaje naznačujú autoregulačnú slučku, pričom G9a pôvodne obmedzuje indukciu AFosB akútnym podávaním kokaínu. Pretože sa však AFosB akumuluje s opakovanou expozíciou lieku, potláča G9a a tým zosilňuje jeho vlastnú ďalšiu indukciu.
Na záver sme ukázali, že metylácia histón lyzínu v NAc sa kriticky podieľa na regulácii expresie neurónového génu ako odozvy na kokaín. Represia G9a a H3K9me2 po opakovanom podávaní kokaínu podporuje preferenciu kokaínu, čiastočne prostredníctvom transkripčnej aktivácie mnohých génov, o ktorých je známe, že regulujú aberantné formy dendritickej plasticity. Lepšie pochopenie génov, ktoré sú regulované prostredníctvom takýchto mechanizmov, zlepší naše vedomosti o komplexnom biologickom základe drogovej závislosti a mohlo by pomôcť pri rozvoji efektívnejšej liečby návykových porúch.
Materiály a metódy
Zvieratá a liečba
Pokiaľ nie je uvedené inak, myši sa umiestnili štyri až päť na klietku v kolónii s cyklom 12 hodina svetlo / tma (svetlá zapnuté od 7: 00 AM až 7: 00 PM) pri konštantnej teplote (23 ° C) s podľa chuti prístup k vode a potravinám. Všetky protokoly na zvieratách boli schválené IACUC na UT Southwestern Medical Center a na Mount Sinai School of Medicine.
Pre experimenty s kokaínom [imunohistochemické vyšetrenie, Western blotting, kvantitatívna PCR (qPCR), analýza microarray a imunoprecipitácia chromatínu (ChIP)] sa použili samce myší C8BL / 10J starých myší C57BL / 6J. Zvieratá dostávali denne injekcie buď „fyziologického roztoku“ (fyziologický roztok 7, ip), „akútneho“ kokaínu (6 ošetruje fyziologický roztok + jedna liečba 20 mg / kg kokaín-HCl, ip) alebo „opakovaného“ kokaínu (liečba 7 20 mg / kg kokaín-HCl, ip). Myši boli usmrtené buď v 1 hodine alebo 24 hodinách po poslednom ošetrení. V štúdiách microarray boli zvieratá denne liečené buď „fyziologickým roztokom“ (fyziologický roztok 15, ip), „akútnym“ kokaínom (14 ošetruje fyziologický roztok + liečba 1 20 mg / kg kokaín-HCl, ip), „opakovaný + akútny“ kokaín ( 7 ošetruje fyziologický roztok + liečba 8 20 mg / kg kokaín-HCl, ip) alebo „opakované abstinenčné + akútne“ kokaín (liečba 7 20 mg / kg kokaín-HCl + 7 ošetruje fyziologický roztok + 1 provokačná liečba 20 mg / kg kokaín-HCl, ip) a boli usmrtené 1 hodinu po poslednom spracovaní. V behaviorálnych experimentoch boli myši po chirurgickom zákroku jednotlivo umiestnené a ošetrené 10 mg / kg kokaín-HCl, ip, ako je opísané nižšie. Pre dendritickú analýzu chrbtice a validáciu mikročipu po infekcii HSV-GFP a HSV-G9a-GFP boli myši ošetrené 'fyziologickým roztokom' (5 ošetruje fyziologický roztok, ip) alebo „opakovaný kokaín“ (liečba 5 20 mg / kg kokaín-HCl, ip ) v priebehu 3 dní, pretože tento protokol injekcie preukázal, že zvyšuje hustotu chrbtice na neurónoch nucleus accumbens (NAc) v časovom rámci expresie transgénu vírusu Herpes simplex (HSV) (Doplnkový ref S1). Myši použité na analýzu dendritickej chrbtice boli usmrtené 4 hodín po poslednom ošetrení.
Na indukciu lokálnej delécie transkriptu G9a obmedzeného na NAc neuróny sme použili mutantné myši homozygotné pre floxovanú alelu G9a, ktorá bola podrobne opísaná inde (S2). Cre-indukovaná rekombinácia produkuje exon 22 na 25 zostrih mimo rámca, čo vedie k nonsense sprostredkovanému rozpadu mutovaného transkriptu. Použili sme G9a floxované myši, ktoré boli úplne spätne krížené s C57BL / 6J myšami. Myši boli sterotaxicky injikované do NAc vektormi adeno-asociovaného vírusu (AAV) (sérotyp 2) exprimujúcimi GFP alebo Cre-GFP medzi vekom 7 a 10 týždňov. Imunohistochemická analýza sa použila na overenie účinnosti rekombinácie sprostredkovanej Cre (pozri Doplnkový obrázok S5). Použili sme AN injekčne zvieratá 21 dni po chirurgickom zákroku, pretože rekombinácia u G9a floxovaných myší bola v tomto časovom bode stabilná a maximálna v súlade s publikovanými správami (S3-S4). Experimenty s nadmernou expresiou G9a a AJunD sa podobne uskutočňovali s použitím vektorov vírusu HSV exprimujúcich buď GFP, G9a-GFP divokého typu, katalyticky mŕtvy G9aH1093K-GFP alebo AJunD-GFP (pozri S2 podrobnosti týkajúce sa vývoja G9a konštruktov). Myši s nadmernou expresiou HSV sa použili 3 dni po operácii, pretože nadmerná expresia bola maximálna v tomto časovom bode, ako bolo pozorované prostredníctvom imunohistochémie. Vzhľadom na prechodnú povahu expresie HSV a podstatne stabilnejšiu expresiu AAV boli vektory HSV použité v experimentoch vyžadujúcich rýchlu krátkodobú expresiu transgénu, zatiaľ čo vektory AAV boli použité v experimentoch vyžadujúcich predĺžené obdobia expresie transgénu. Obidva vektory sa v rozsiahlych štúdiách ukázali, že infikujú len telá neuronálnych buniek v oblasti injekcie mozgu, bez akejkoľvek infekcie aferentných alebo eferentných neurónov.
Na behaviorálne experimenty s použitím farmakologického inhibítora G9a / GLP, BIX01294 (25 ng / μl), boli myši sterotaxicky implantované dvomi subkutánnymi mini-pumpami, ako aj bilaterálnymi vodiacimi kanylami do NAc. Mini-pumpy boli aktivované 12 hodín pred implantáciou, čím sa iniciovalo kontinuálne dodávanie (0.25 μl / hodina) vehikula (5 hydroxypropyl-p-cyklodextrín) alebo liečiva počas 14 dní, počas ktorých sa uskutočňovalo hodnotenie správania.
Pre experimenty s nadmernou expresiou AFosB [Western blotting, qPCR a ChIP], samčí bitransgénny NSE-TTA × tetOP-ΔFosB myši (10 týždenne), pričom v neprítomnosti doxycyklínu derivátu tetracyklínu (8 týždne mimo doxycyklínu) zvieratá vykazovali silnú striiatálne obmedzenú konštitutívnu expresiu AFosB (S5). Nadmerná expresia AFosB u týchto myší bola potvrdená prostredníctvom qPCR. Na potvrdenie zistení pomocou NSE-TTA × tetOP-ΔFosB myši myší divokého typu 8 týždne C57BL / 6J samci myší boli sterotaxicky injektovaní intra-NAc s AAV vektormi exprimujúcimi buď GFP alebo AFosB-GFP. V tomto prípade sa použili vektory AAV na zaistenie maximálnej expresie AFosB v 8 týždňoch po operácii, čo umožnilo priame porovnanie medzi myšami infikovanými vírusom a bitransgénnymi myšami nadmerne exprimujúcimi AFosB. Nadmerná expresia vírusu bola potvrdená použitím qPCR v 8 týždňoch po chirurgickom zákroku (15-gauge NAc punč boli vyrezané pod miestom vpichu injekcie). Nadmerne exprimované myši AAV-GFP a AAV-AFosB-GFP, ktoré sa nepoužili na qPCR, sa ošetrili fyziologickým roztokom (fyziologický roztok 14, ip) alebo opakovaným kokaínom (liečba 14 30 mg / kg kokaín-HCl, ip), počnúc 6 týždňami po podaní. ordinácie. 4 dní po poslednom ošetrení sa mozgy fixovali s 4% paraformaldehydom, rozrezali na vibrátore a použili na analýzu dendritickej chrbtice.
Western blot analýza
14-gauge NAc razníky sa odobrali z 1 mm koronálnych rezov získaných použitím matrice mozgu z nehrdzavejúcej ocele a boli sonikované v 1 M HEPES lyzačnom pufri (1% SDS) obsahujúcom inhibítory proteázy a fosfatázy. 10-30 μg vzorky celkového proteínu sa podrobili elektroforéze na 18% SDS géloch. Proteíny sa preniesli na PVDF membrány a inkubovali buď s anti-H3K9me2 (myšacia monoklonálna protilátka, 1: 500), anti-β-tubulínom (myšacia monoklonálna protilátka, 1: 60,000), anti-totálny histón H3 (králičí polyklonálny, 1: 5,000), anti-GFP (používa sa na overenie rovnakej vírusovej expresie v dierovanom tkanive) (králičie polyklonálne, 1: 1000), anti-H3K27me3 (králičie polyklonálne, 1: 500) alebo protilátky proti aktínu (myšacia monoklonálna protilátka, 1: 60,000) cez noc pri 4 ° C (všetky membrány boli blokované v 5% mlieku alebo 5% hovädzieho sérového albumínu). Membrány sa potom inkubovali so sekundárnymi protilátkami označenými peroxidázou (1: 15,000-1: 60,000 v závislosti od použitej primárnej protilátky) a pásy sa vizualizovali použitím substrátu SuperSignal West Dura. Pásy boli kvantifikované pomocou NIH Image J Software a pásy H3K9me2 boli normalizované buď na aktín alebo p-tubulín a na celkový histón H3 na kontrolu pre rovnaké zaťaženie. Opakovaný kokaín nemal žiadny vplyv na hladiny aktínu (Obrázok S8) alebo celkového histónu 3 (Obrázok S1) v NAc. Okrem toho HSV-G9a-GFP a HSV-G9aH1093K-GFP infekcia nemali žiadny vplyv na celkové hladiny p-tubulínu v NAc (Obrázok S8).
imunohistochémia
Myši boli upokojené letálnou dávkou chloralhydrátu a perfundované 4% paraformaldehydom predtým, ako boli analyzované jednoduchou alebo dvojitou imunohistochémiou, ako bolo opísané vyššie (S6). Stručne, post-fixované mozgy boli inkubované pri teplote miestnosti cez noc v 30% sacharóze pred tým, ako boli rozdelené na 35 μm (mozgy použité na analýzu dendritickej chrbtice boli rozdelené na vibračné rezy v rezoch 100 μm v neprítomnosti 30% sacharózy). Voľne plávajúce NAc rezy boli premyté 1X PBS, blokované (3% normálne oslové sérum, 0.1% tritonX, 1X PBS) a neskôr inkubované s anti-GFP (kuracie polyklonálne, 1: 8000) a / alebo anti-G9a (králičie polyklonálne , 1: 500) protilátky v blokovacom roztoku. Rezy analyzované na dendritické chrbtice boli inkubované s králičou polyklonálnou anti-GFP protilátkou v 1: 200. Po inkubácii cez noc sa sekcie NAc opláchli 3 krát 10 minút s 1X PBS, nasledovala inkubácia s Cy2 a / alebo Cy3 fluorescenčne viazanými sekundárnymi protilátkami v 1X PBS blokujúcom roztoku po dobu 2 hodín. Rezy použité na morfologické štúdie boli inkubované v sekundárnej protilátke cez noc pri teplote miestnosti. Spoločné farbenie jadrom sa dosiahlo inkubáciou rezov v 1X PBS obsahujúcom DAPI (1: 50,000) počas 10 minút. Rezy sa ešte raz premyli, nasledovala dehydratácia etanolom a montáž s DPX. Všetky rezy sa zobrazili pomocou konfokálnej mikroskopie.
Izolácia RNA a qPCR
Obojstranné razníky NAc s mierkou 14 sa homogenizovali v Trizole a spracovali sa podľa pokynov výrobcu. RNA bola purifikovaná pomocou stĺpcov RNAesy Micro a spektroskopia potvrdila, že dávky RNA 260/280 a 260/230 boli> 1.8. RNA sa potom reverzne transkribovala pomocou súpravy Bio-Rad iScript Kit. cDNA sa kvantifikovala pomocou qPCR s použitím SYBR Green. Každá reakcia prebiehala dvakrát alebo trikrát a analyzovala sa pomocou metódy AACt, ako už bolo opísané, s použitím glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázy (GAPDH) ako kontroly normalizácie (S7). vidieť doplnková tabuľka S5 pre sekvencie primérov mRNA.
Analýza DNA microarray
Štyri skupiny (3 nezávislé biologické replikáty na skupinu) sa použili na štúdiu microarray, pričom sa použili mikročipy 12. 1 hodina po poslednej injekcii kokaínu boli zvieratá rýchlo dekapitované a mozgy boli odstránené a umiestnené na ľad. Rezy NAc sa odobrali s použitím ihly 15-gauge a rýchlo sa zmrazili na suchom lade, až kým sa RNA nevyextrahovala. Bilaterálne razníky sa spojili zo štyroch zvierat na jednu replikáciu, pričom sa v každej skupine použili myši 12. Izolácia RNA, spracovanie mikročipom a analýza dát boli uskutočnené tak, ako bolo opísané vyššie (S8). Stručne, RNA bola izolovaná a purifikovaná, ako je opísané vyššie, a bola skontrolovaná kvalita pomocou Agilent's Bioanalyzer. Reverzná transkripcia, amplifikácia, značenie a hybridizácia na polia Illumina MouseWG-6 v2.0 sa uskutočňovali pomocou štandardných postupov jadrom microTray spoločnosti UT Southwestern. Surové dáta boli odpočítané na pozadí a kvantilizovaný normalizovaný pomocou softvéru Beadstudio. Normalizované údaje sa analyzovali pomocou softvéru GeneSpring a zoznamy génov sa generovali pomocou kritérií významnosti 1.3-násobného medzného limitu zmeny spojeného s neprimeraným medzným medzným hodnotám p <0.05.
Udržiavame vysoký stupeň dôvery v tieto údaje z niekoľkých dôvodov. Za prvé, so všetkými zvieratami sa za rovnakých podmienok zaobchádzalo, ošetrovalo a usmrcovalo v rovnakom čase. Rovnako sa uskutočnilo súčasne spracovanie všetkých RNA a matíc. Po druhé, vykonali sme trojnásobné polia a zoskupili viac zvierat na jednu matricovú vzorku, čím sme minimalizovali rozdiely v dôsledku individuálnej variability a zvyšujúcej sa štatistickej sily (S9). Po tretie, kritériá analýzy údajov použité v našej štúdii sú odporúčané v projekte kontroly kvality MicroArray, pretože tieto kritériá boli validované, aby poskytli vysoký stupeň reprodukovateľnosti medzi lokalitami a reprodukovateľnosť inter- a intraplatform (S10-S11).
Konštrukcia vírusových vektorov
Kvôli obmedzeniam veľkosti inzercie vírusového vektora boli kódujúce sekvencie buď pre G9a divokého typu (G9a) alebo pre katalyticky mŕtvy G9a (G9aH1093K) subklonované do bicistrónneho plazmidu p1005 + HSV exprimujúceho GFP pod kontrolou ľudského bezprostredne skorého cytomegalovírusového promótora (CMV) (G9a). veľkosť inzercie bola ~ 3.96 kb, čo presahuje maximálnu veľkosť inzercie pre vektory AAV-2). Promótor IE4 / 5 riadi expresiu G9a. Fragmenty boli subklonované do bicistrónneho plazmidu p1005 + HSV prostredníctvom ligácií s tupými koncami s Klenowom ošetreným PmeI a G9a štiepeným EcoRI (z pcDNA3.1) a CX ošetreného p1005 + po štiepení EcoRI. Na produkciu HSV-AJunD-GFP bola kódujúca sekvencia AJunD lemovaná restrikčnými miestami EcoRI vytvorená pomocou PCR s použitím primérových oligonukleotidov obsahujúcich miesto EcoRI. Produkt PCR sa potom ligoval do miesta EcoRI vektora p1005 +. Lokálna expresia Cre rekombinázy v NAc neurónoch bola dosiahnutá vírusovo sprostredkovaným génovým podávaním použitím AAV vektora, ako je opísané (S12). GFP alebo N-terminálna fúzia GFP s Cre bola subklonovaná do rekombinantného AAV-2 vektora obsahujúceho CMV promótor so zostrihovou donorovou akceptorovou sekvenciou a polyadenylačným signálom. Všetky vektorové inzercie boli potvrdené dideoxy-sekvenovaním. Vírusové vektory boli produkované s použitím trojnásobnej transfekcie, bez helperovej metódy, ako bolo opísané vyššie (S13). Purifikovaný vírus bol skladovaný pri -80 ° C. Vírusová kvalita bola hodnotená infekčným titrom hodnoteným v bunkách HEK293. Vírusy AAV-AFosB-GFP boli podobne pripravené. Pre HSV-Cre bola expresia Cre riadená promótorom IRES, na rozdiel od promótora IE4 / 5, aby sa minimalizovala expresia Cre a zabránilo sa neuronálnej toxicite (pozri S14 pre stavbu vírusov). Vo všetkých prípadoch bola overená nadmerná expresia vírusu in vitro a in vivo, cez qPCR, a vírusy boli imunohistochemicky potvrdené, aby sa prejavila expresia NAc obmedzená po operácii.
Stereotaxická chirurgia
Pod anestéziou ketamínom (100 mg / kg) / xylazínom (10 mg / kg) sa myši umiestnili do stereotaxického prístroja pre malé zvieratá a kraniálny povrch sa exponoval. Na injekčné podanie 0.5 μl vírusu do NAc v uhle 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) v množstve 0.1 μl / min sa použili ihly s injekčnou striekačkou s objemom tridsaťtri gauge. Zvieratá dostávajúce HSV injekcie sa nechali zotaviť počas 2 dní po chirurgickom zákroku, zatiaľ čo myši použité na behaviorálne testovanie prijímajúce AAV vektory sa nechali zotaviť počas 20 dní pred tým, ako sa podrobili kondicionovaniu na mieste. Tieto časy sú konzistentné s periódami maximálnej expresie transgénu sprostredkovanej vírusom pre tieto dva vektory. Pre infúzie BIX01294 sa každé z dvoch mini-pumpy umiestnilo subkutánne na chrbát myši. Umiestnenie kanyly sa dosiahlo vyvŕtaním dvoch malých lebečných dier nad NAc a dodaním kanyly z bregma (AP + 1.5; ML + 1.0; DV-5.4). Myši sa nechali zotaviť z chirurgického zákroku pre 4 na 5 dní pred začiatkom procedúry kondicionovania miesta na kokaín, ako je opísané nižšie.
Preferenčné miesto preferencie
Postup kondicionovania miesta bol uskutočnený tak, ako bolo opísané vyššie, s nasledujúcimi modifikáciami (S7). Stručne, 3 dni po intra-NAc infúziách HSV-G9a-GFP, HSV-G9aH1093K-GFP alebo HSV-GFP boli myši umiestnené do kondicionovacích komôr, ktoré pozostávajú z troch odlišných prostredí. Myši, ktoré vykazovali významnú preferenciu pre ktorúkoľvek z dvoch kondicionovacích komôr, boli zo štúdie vylúčené (<10% všetkých zvierat). Kondičné skupiny sa potom vyvážili tak, aby sa upravili na akékoľvek skreslenie komory, ktoré ešte môže existovať. Nasledujúce dni sa zvieratám injekčne podal soľný roztok a popoludní sa 30 minút nechali v jednej komore a potom sa im injekčne podal kokaín (10 mg / kg, ip) a večer sa v nich počas ďalších 30 dní (dva soľný roztok a dva páry kokaínu). V deň testu sa myši umiestnili späť do prístroja bez ošetrenia na 2 minút a testovali sa na vyhodnotenie, ktorej strane dávajú prednosť. Lokomotorické reakcie na kokaín sa hodnotili pomocou zlomov lúčov v komorách párovaných s kokaínom, aby sa zaistila účinnosť liečby drogami. Pre experimenty AAV a BIX20 CPP sa použil mierne upravený protokol. Zvieratám sa opäť injikoval soľný roztok alebo kokaín (01294 mg / kg, ip) a ponechali sa v špecifických komorách po dobu 10 minút, namiesto toho sa kondicionovali iba raz denne počas 30 dní, po ktorých nasledoval test 4. deň (zvieratá sa kondicionovali). večer sa striedali kondičné procedúry). Pre všetky skupiny sa hodnotila východisková lokomócia ako odpoveď na soľný roztok, aby sa zabezpečilo, že lokomócia nebola ovplyvnená liečením vírusmi alebo inhibítormi.
Intravenózne podávanie kokaínu
Boli získané mužské dospievajúce potkany Long-Evans s hmotnosťou 230-250 g na začiatku pokusu. Boli umiestnené v prostredí s kontrolovanou vlhkosťou a teplotou pri obrátenom cykle 12 hodín svetla / tmy (svetlá vypnuté pri 9: 00 am) s podľa chuti prístup k potravinám a vode. Potkany sa nechali aklimatizovať v novom prostredí a denne sa s nimi manipulovalo počas týždňa 1 pred začiatkom experimentu. Všetky procedúry boli uskutočnené v súlade s Národným inštitútom pre zdravotnú starostlivosť a starostlivosť o laboratórne zvieratá a boli schválené Výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie zvierat na Sinai. Samoobslužné zariadenie bolo vybavené infračervenými lúčmi na meranie pohybového správania. Samopodávanie sa uskutočnilo tak, ako bolo opísané vyššie (S15-S16) katétrom implantovaným do pravej jugulárnej žily v anestézii izofluránom (2.4–2.7%). Katétre sa prepláchli 0.1 ml soľného roztoku obsahujúceho 10 U heparínu a ampicilín (50 mg / kg). Po jednom týždni rekonvalescencie po chirurgickom zákroku sa začalo školenie o samostatnom podávaní počas fázy tmavého cyklu svetlo / tma. Zvieratám bol umožnený 3-hodinový denný prístup ku kokaínu (0.75 mg / kg / infúzia) podľa spevňovacieho plánu s fixným pomerom-1 (FR1), kde 1 aktívny pákový lis viedol k jednej infúzii liečiva. Potkany stabilizovali príjem kokaínu po 6 dňoch (<15% variácia v miere odpovede počas 3 po sebe nasledujúcich dní, pričom najmenej 75% odpovedalo na zosilnenú páku). 24 hodín po poslednom sedení s vlastným podávaním sa potkany rýchlo dekapitovali, mozgy sa rýchlo odstránili a spracovali na izoláciu RNA a qPCR.
Chromatínová imunoprecipitácia (ChIP)
Čerstvé NAc raznice boli formaldehydové zosieťované a pripravené pre ChIP, ako bolo opísané vyššie (S17-S18) s menšími úpravami. V stručnosti, 4 14-gauge NAc razníky na zviera (5 zvieratá spojené na jednu vzorku) boli odobrané, zosieťované s 1% formaldehydom a ukončené pomocou 2 M glycínu pred zmrazením pri -80 ° C. 1 deň pred sonikáciou vzorky sa pripravili ovčie anti-králičie / myš (v závislosti na precipitačnej protilátke) magnetické guľôčky IgG inkubáciou vhodných magnetických guľôčok buď s anti-G9a (králičia polyklonálna ChIP stupeň) alebo anti-H3K9me2 (myšací monoklonálny stupeň ChIP) protilátky cez noc pri 4 ° C za konštantnej rotácie v blokovom roztoku. Sonifikácia tkaniva a strih chromatínu boli uskutočňované tak, ako bolo opísané vyššie (S17). Po sonikácii boli rovnaké koncentrácie chromatínu prenesené do nových skúmaviek a ~ 5% konečných produktov bolo uložených, aby slúžili ako vstupné kontroly. Po dôkladnom premytí a resuspendovaní zmesi konjugovaných guľôčok / protilátok sa do každej vzorky chromatínu pridali rovnaké objemy zmesí protilátka / guľôčka (~ 7.5 μg protilátky / vzorka) a inkubovali sa počas približne 16 hodín pri konštantnej rotácii pri 4 ° C. Vzorky boli ďalej premyté a spätne zosieťované pri 65 ° C cez noc pred čistením DNA s použitím PCR purifikačnej súpravy. Po purifikácii DNA boli vzorky podrobené qPCR a boli normalizované na ich vhodné 'vstupné' kontroly, ako bolo opísané vyššie (S17). Imunoprecipitácie normálnych myších IgG s použitím myšej polyklonálnej anti-IgG protilátky sa tiež uskutočnili na kontrolu vhodného obohatenia amplifikácie signálu. Ako negatívna kontrola pre experimenty s nadmernou expresiou kokaínu a AFosB sa použila fosforibozyltransferáza adenínu (APRT). vidieť Doplnková tabuľka S5 pre sekvencie promótorových primérov.
Analýza dendritickej chrbtice
Na štúdium úlohy G9a v regulácii morfológie neurónov in vivo sme použili metódy opísané vyššie s nasledujúcimi modifikáciami (S1). Tri dni po injekcii HSV-GFP, HSV-G9a-GFP, HSV-AJunD-GFP (všetky vírusy sa použili u myší divokého typu C57Bl / 6J) alebo HSV-Cre-GFP (použité v G9afl / fl myši), keď bola vírusová expresia maximálna, myši boli perfundované, mozgy boli kryochránené a neskôr rozdelené na 100 μm na vibrátore. Rezy sa potom imunofarbili s použitím protilátky proti GFP, ako je opísané vyššie (pozri Imunohistochémia). Na posúdenie účinkov nadmernej expresie a knockoutu G9a na čísla chrbtice, ako aj účinok nadmernej expresie JUND, sme zmerali počet spinov na približne neuritoch 1 – 2 na neurón, čo predstavuje aspoň 299 μm sekundárnych dendritov z média GFP-exprimujúceho NAc. spinálne neuróny (MSN). Vzhľadom na to, že MSN sú morfologicky odlišné od iných neuronálnych populácií v NAc, ako aj predchádzajúce správy naznačujúce, že HSV primárne infikuje neuróny exprimujúce DARPP-32 v tejto oblasti mozgu (S19) sme presvedčení, že MSN boli v týchto štúdiách hodnotené výlučne. Pre každé zviera sme skúmali neuróny 6 – 8 u zvierat 3 – 4 na skupinu (skupiny 7), po ktorých bola pre každé zviera získaná priemerná hodnota pre štatistickú analýzu. Experimenty navrhnuté na skúmanie účinkov nadmernej expresie AFosB na hustotu NAc chrbtice sa uskutočnili podobne ako vyššie opísané, s tou výnimkou, že sa AAV vektory použili na expresiu GFP alebo AFosB-GFP počas dlhších časových období (8 týždňov). Všetky HSV obrazy boli zachytené pomocou konfokálneho mikroskopu s 100X olejovým imerzným objektívom (AAV obrazy boli zachytené s 63X olejovým imerzným objektívom). Snímky boli získané s dierkou nastavenou na 1 ľubovoľnej jednotke a veľkosťou 1024 × 1024 rámca. Dendritická dĺžka bola meraná pomocou softvéru NIH Image J a primárne experimentátor počítal slepé čísla, pretože sklíčka boli kódované pred experimentálnym skenovaním. Vypočítal sa priemerný počet spinov na 10 μm dendritu.
Štatistická analýza
Vykonali sa jedno- a dvojcestné ANOVA, aby sa určila významnosť pre podmienené miesto a dendritická analýza chrbtice s väčšími ako dvoma skupinami. Študentské t testy boli použité pre iné porovnania vrátane qPCR, Western blotting, dendritickej analýzy chrbtice porovnávajúcej HSV-GFP s HSV-Cre v G9afl / fl myši, microarray analýzy (pozri vyššie) a chromatínové imunoprecipitačné experimenty. Plánované t-testy študenta boli použité po obojsmernej ANOVA analýze hustoty dendritickej chrbtice po nadmernej expresii ΔFosB s potvrdením významných hlavných účinkov liečby liekom a vírusu. Všetky hodnoty zahrnuté v legendách obrázka predstavujú priemer ± SEM (* p ≤ 0.05; ** p <0.001). Podrobné štatistické analýzy za rok XNUMX Obr. 1-3 v hlavnom texte sú uvedené v: Podrobný obrázok Legendy vrátane štatistiky.
poznámky pod čiarou
Potvrdzujem, že žiadny z materiálov uvedených v rukopise nie je oprávnený Základná úloha histónmetyltransferázy G9a v kokaínom indukovanej plasticite boli predtým zverejnené alebo sa posudzujú inde, vrátane internetu.
Všetky práce zahŕňajúce použitie zvierat boli uskutočnené v súlade s pokynmi inštitúcie a IACUC na Univerzite v Texasu, Southwestern Medical Center a na Mount Sinai School of Medicine.
Odkazy a poznámky
;
