(Ľudia) Behaviorálne a štrukturálne reakcie na chronický kokaín Vyžadujú napájanie krvného obehu zahŕňajúceho ΔFosB a proteínkinázu II závislé od kalcia / kalmodulínu v jadre Nucleus Accumbens Shell (2013)

J Neurosci. 2013 Mar 6;33(10):4295-4307.

Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, Wee S, Koob G, Turecki G, Neve R, Thomas M, Nestler EJ.

zdroj

Fishberg Department of Neuroscience a Friedman Brain Institute, Mount Sinai School of Medicine, New York, New York, 10029, oddelenia neurovedy a psychológie, Inštitút humánnej genetiky, University of Minnesota, Minneapolis, Minnesota 55455, Výbor pre neurobiológiu návykových porúch Výskumný inštitút Scripps, La Jolla, Kalifornia 92037 Program depresívnych porúch, Douglasov inštitút pre duševné zdravie a Univerzita McGilla, Montréal, Québec, Kanada, H4H 1R3 a Katedra Brain and Cognitive Sciences, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, Massachusetts 02139 ,

abstraktné

Transkripčný faktor AFosB a mozgom obohatená proteínkináza II závislá od vápnika / kalmodulínu (CaMKIIa) sú indukované v nucleus accumbens (NAc) chronickou expozíciou kokaínu alebo iných psychostimulačných liečiv zneužívania, v ktorých tieto dva proteíny sprostredkovávajú senzitívne reakcie na liečivá , Hoci AFosB a CaMKIIa regulujú expresiu a funkciu AMPA glutamátového receptora v NAc, tvorbu dendritickej chrbtice na NAc stredných ostnatých neurónoch (MSN) a lokomotorickú senzibilizáciu na kokaín, doteraz nebola skúmaná žiadna priama väzba medzi týmito molekulami. Tu demonštrujeme, že AFosB je fosforylovaný CaMKIIa na proteín-stabilizujúcom Ser27 a že CaMKII je potrebné na akumuláciu AFOSB sprostredkovanú kokaínom v potkaních NAc.

Naopak, ukázali sme, že AFosB je nevyhnutný aj dostatočný na indukciu expresie génu CaMKIIa in vivo, čo je účinok selektívny pre D1-typ MSN v subregióne NAc shell.

Okrem toho indukcia dendritických spinov na NAc MSN a zvýšená behaviorálna citlivosť na kokaín po NAc nadmernej expresii AFosB sú obe závislé od CaMKII.

Dôležité je, že sme demonštrovali prvú indukciu AFosB a CaMKII v NAc závislých na kokaíne, navrhujúc možné ciele pre budúcu terapeutickú intervenciu. Tieto údaje dokazujú, že AFosB a CaMKII sa angažujú v pozitívnej doprednej slučke špecifickej pre bunkový typ a mozog v regióne ako kľúčový mechanizmus na reguláciu odmeňovacieho obvodu mozgu ako odozvy na chronický kokaín.

úvod

Zvyšujúce sa dôkazy podporujú názor, že zmeny v génovej expresii prispievajú k mechanizmom drogovej závislosti (Robison a Nestler, 2011). Jedným dôležitým mediátorom týchto zmien je AFosB, transkripčný faktor rodiny Fos (Nestler, 2008). Chronické podávanie prakticky akéhokoľvek liečiva na zneužívanie indukuje dlhodobú akumuláciu AFosB v nucleus accumbens (NAc), čo je limbická oblasť, ktorá je nevyhnutná pre správanie pri odmeňovaní. SIndukcia indukcie sa javí špecifická pre triedu NAc stredne ostnatého neurónu (MSN), ktorý exprimuje D1 dopamínové receptory. Indukovateľná nadmerná expresia AFosB u týchto MSNs NAc typu D1 zvyšuje lokomotorickú a odmeňujúcu odpoveď na kokaín a morfín (Kelz a kol., 1999; Zachariou a kol., 2006) vrátane zvýšenej samokontroly kokaínu (\ tColby a kol., 2003). Okrem toho genetická alebo vírusová blokáda transkripčnej aktivity AFosB znižuje odmeňujúce účinky týchto liekov (Zachariou a kol., 2006), čo ukazuje, že táto trvalá indukcia AFosB je kritickým mediátorom trvalých zmien indukovaných v NAc pri chronickom podávaní liečiva..

Neobvyklá stabilita AFosB (vo vzťahu ku všetkým ostatným proteínom rodiny Fos) je ako vnútorná vlastnosť molekuly v dôsledku skrátenia degronových domén prítomných v FosB plnej dĺžky (Carle a kol., 2007) a regulovaný proces. AFosB je fosforylovaný in vitro a in vivo v Ser27 a táto reakcia ďalej stabilizuje AFosB, ~ 10-krát, v bunkovej kultúre a NAc in vivo (Ulery-Reynolds a kol., 2009). Hoci sa ukázalo, že Ser27-AFosB je substrátom pre kazeínkinázu-2 in vitro (Ulery a kol., 2006), jeho mechanizmus. \ t in vivo fosforylácia zostáva neznáma.

Proteínkináza II (CaMKII) závislá od vápnika / kalmodulínu je vysoko exprimovaná serín / treonínkináza, ktorej izoformy a a p tvoria dodekamérne homo- a hetero-holoenzýmy in vivoa sú nevyhnutné pre viac foriem neuroplasticity (Lisman a kol., 2002; Colbran a Brown, 2004). CaMKIIa je indukovaný selektívne v NAc shell chronickým amfetamínom (Loweth a kol., 2010) a farmakologická blokáda aktivity CaMKII v NAc škrupine znižuje behaviorálnu senzibilizáciu na amfetamín (Loweth a kol., 2008) a kokaínu (Pierce a kol., 1998), zatiaľ čo vírusová nadmerná expresia CaMKIIα v tomto subregióne NAc zvyšuje lokomotorickú senzibilizáciu a samodávkovanie amfetamínu (Loweth a kol., 2010). CaMKIIa môže ovplyvniť správanie odmeňovania prostredníctvom modulácie podjednotiek glutamátového receptora AMPA (Pierce a kol., 1998), pretože aktivita CaMKIIa bola dlho spojená s funkciou AMPA receptora a synaptickým zacielením v niekoľkých formách neuroplasticity (Malinow a Malenka, 2002).

Táto literatúra demonštruje niekoľko paralel medzi AFosB a CaMKII: obe sú nevyhnutné a postačujúce pre viacnásobné behaviorálne účinky liekov zneužívania, pričom obidva zvyšujú dendritické spiny v rôznych typoch neurónových buniek. in vivo (Jourdain a kol., 2003; Maze a kol., 2010) a obaja prejavujú aspoň niektoré zo svojich účinkov na správanie prostredníctvom modulácie receptorov AMPA (\ tKelz a kol., 1999; Malinow a Malenka, 2002; Vialou a kol., 2010). Napriek týmto paralelám nie je známa žiadna funkčná väzba medzi AFosB a CaMKII. Tu stanovíme recipročnú reguláciu medzi AFosB a CaMKII a demonštrujeme, že tieto dva proteíny tvoria D1-MSN-špecifickú feed-forward slučku v NAc škrupine, ktorá je indukovaná kokaínom a reguluje rozsah odpovedí kokaínu. in vivo.

Prejsť na:

Materiály a metódy

Experiment 1: iTRAQ Proteomická analýza NAc Shell a Core po liečbe kokaínom (Obr. 1A)

Dospelým (8 týždňov) samcom potkanov sa podával 20 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku vehikula IP raz denne počas siedmich dní. 24 h po poslednej injekcii, mikrotisekcia NAc shell a jadra (Obr. 1A) a bleskovo zmrazené. Analýzy iTRAQ boli uskutočnené tak, ako bolo opísané vyššie (Ross a kol., 2004; Davalos a kol., 2010).

Obrázok 1

Obrázok 1

Shell-špecifická indukcia CaMKII v NAc kokaínom

Experiment 2: Kvantifikácia zmien proteínov v jadre potkana NAc a Shell po liečbe kokaínom (Obr. 1B – D)

Dospelým (8 týždňom) samcom potkanov sa podával 10 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku vehikula IP raz denne počas siedmich dní v lokomotorických záznamových komorách. Lokomotorické odpovede na jednorazovú injekciu kokaínu (5 mg / kg IP) boli zaznamenané u zvierat predtým liečených kokaínom (nazývaných „chronické“) a časti pacientov liečených fyziologickým roztokom (tzv. „Akútne“) a lokomotorických odpovedí na fyziologický roztok samotný bol zaznamenaný u zvyšných zvierat liečených fyziologickým roztokom (tzv. „fyziologický roztok“). Testy lokomotorickej aktivity sa uskutočnili tak, ako je opísané (Hiroi a kol., 1997). V stručnosti, dospelé samce potkanov sa umiestnili do 18 ”x 24” PAS otvorených boxov na nahrávanie na poli (San Diego Instruments) pre 30 min na habituáciu, dostali jedinú IP injekciu fyziologického roztoku a monitorovali sa ďalšie 30 min. jednorazová IP injekcia 5 mg / kg kokaínu a monitorovaná na 30 min.

24 h po tejto poslednej injekcii boli potkany dekapitované bez anestézie, aby sa zabránilo účinkom anestetík na hladiny neuronálneho proteínu a fosfo-stavov. Mozgy sa sériovo rozrezali v matrici 1.2 mm (Braintree Scientific) a cieľové tkanivo sa odstránilo vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku obsahujúcom proteázu (Roche) a fosfatázu (Sigma Aldrich) inhibítory s použitím 14 kalibračného razidla pre NAc jadro a 12 gauge punch zvyšných tkanivo pre NAc shell (pozri Obr. 1A) a okamžite zmrazené na suchom ľade. Vzorky boli homogenizované ľahkou sonikáciou v modifikovanom RIPA pufri: 10 mM Tris báza, 150 mM chlorid sodný, 1 mM EDTA, 0.1% dodecylsulfát sodný, 1% Triton X-100, 1% deoxycholát sodný, pH 7.4, inhibítory proteázy a fosfatázy ako je uvedené vyššie. Po pridaní Laemmliho pufra boli proteíny separované na 4-15% polyakrylamidových gradientových géloch (Criterion System, BioRad) a Western blotting bol uskutočňovaný s použitím systému Odyssey (Li-Cor) podľa protokolu výrobcu.

Experiment 3: Kvantifikácia proteínových zmien v jadre potkana NAc a Shell po stiahnutí kokaínu (Obr. 1E)

Dospelým (8 týždňov) samcom potkanov sa podával 10 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku vehikula IP raz denne počas siedmich dní. 14 dní po poslednej injekcii dostali zvieratá liečené fyziologickým roztokom inú injekciu fyziologického roztoku (nazývanú „fyziologický roztok“) a zvieratám, ktorým bol podávaný kokaín, bola podaná ďalšia injekcia fyziologického roztoku (nazývaná 14 deň vysadenia alebo „14d WD“) alebo jedna injekcia kokaínu ( „14d WD Chal“. Jednu hodinu po poslednej injekcii sa zvieratá dekapitovali a Western blotting sa uskutočnil ako v experiment 2.

Experiment 4: Kvantifikácia zmien proteínov v krysom NAc jadre a Shell po kokaínovej samospráve (Obr. 2A – C)

Potkany boli vyškolené, aby si sami podávali 0.5 mg / kg / infúziu kokaínu počas jednodňových sedení v programe 1 s fixným pomerom počas deviatich dní. Po deviatich základných vyšetreniach boli potkany rozdelené do dvoch skupín vyvážených príjmom kokaínu na posledných dvoch sedeniach. Jednej skupine potkanov bolo povolené podávať kokaín (0.5 mg / kg / infúzia) v priebehu jednej hodiny (krátky prístup, ShA), zatiaľ čo druhá skupina potkanov podávala kokaín samostatne v šiestich hodinách (dlhý prístup, LgA). ) na ďalších desať dní (eskalácie).

Rezy mozgu boli spracované na imunohistochémiu, ako je opísané (Perrotti a kol., 2004). Mozgy boli perfundované 18-24 h po poslednej expozícii lieku, čo viedlo k degradácii akéhokoľvek reziduálneho proteínu FosB plnej dĺžky tak, že celá zostávajúca imunoreaktivita odráža AFosB. Táto degradácia bola potvrdená Western blotom, ktorý nevykazoval žiadne významné farbenie protilátkou namierenou proti C-koncu FosB plnej dĺžky, ktorý nerozpoznáva AFosB (dáta nie sú uvedené). Po narezaní na 35 um rezy sa počet AFosB imunopozitívnych buniek kvantifikoval zaslepeným pozorovateľom v dvoch častiach cez NAc každého potkana a priemerné hodnoty na 40 x pole sa potom vypočítali podľa regiónu pre každé zviera. Každé zviera bolo považované za individuálne pozorovanie pre štatistickú analýzu. Oblasti záujmu boli identifikované pomocou Paxinos a Watson (Paxinos a Watson, 2007).

Kvantifikácia CaMKIIa imunoreaktivity sa uskutočnila s použitím systému Licor, ako je opísané (Covington a kol., 2009). Integrované intenzity CaMKII a GAPDH boli stanovené pomocou softvéru Odyssey. Výsledky sú prezentované ako integrované hodnoty intenzity na mm2 a sú prezentované ako priemer ± sem (n = 4 – 10 na skupinu). Hodnoty GAPDH sa použili ako referencia na normalizáciu intenzity CaMKII pre hrúbku a podmienky rezu.

Obrázok 2

Obrázok 2

Indukcia CaMKII v NAc škrupine samo-podávaných potkanov a závislých na kokaíne

Experiment 5: Kvantifikácia hladín proteínov u ľudí závislých od kokaínu (Obr. 2D)

Postup

Postmortálne ľudské mozgové tkanivá boli získané z Quebec Suicide Brain Bank (Douglas Mental Health University Institute, Montreal, Quebec, Kanada). Konzervácia tkaniva prebiehala v podstate tak, ako je opísané (Quirion a kol., 1987). Stručne povedané, raz extrahovaný mozog sa umiestni na mokrý ľad v boxe na polystyrén a ponáhľa sa do zariadenia Quebec Suicide Brain Bank. Hemisféry sú okamžite oddelené sagitálnym rezom uprostred mozgu, mozgového kmeňa a mozočku. Krvné cievy, epifýza, choroidný plexus, polovica cerebellu a polovica mozgového kmeňa sa typicky oddelia z ľavej hemisféry, ktorá sa potom pred zmrazením narezáva koronálne do rezov s hrúbkou 1 cm. Druhá polovica mozočka sa pred zmrazením prerezáva do sutín 1cm. Tkanivá sa rýchlo zmrazia v 2-metylbutáne pri -40 ° C pre 60 sek. Všetky mrazené tkanivá sa uchovávajú oddelene v plastových vreckách pri teplote -80 ° C na dlhodobé skladovanie. Špecifické oblasti mozgu sa odoberajú zo zmrazených koronárnych rezov na doske z nerezovej ocele so suchým ľadom všade okolo, aby sa kontrolovala teplota prostredia. Western blot sa uskutočnil ako je opísané v experiment 2.

kohorta

Kohorta bola zložená zo samíc 37 a samíc 3, vo veku od 15 – 66 rokov. Všetci pacienti náhle uhynuli bez predĺženého agonistického stavu alebo predĺženého lekárskeho ochorenia. V každom prípade bola príčina smrti zistená úradom Quebec's Coroner a bola vykonaná toxikologická skúška so vzorkami tkanív na získanie informácií o medikácii a užívaní nelegálnych látok v čase smrti. Predmetnú skupinu tvorili jedinci 20, ktorí splnili kritériá SCID-I pre závislosť od kokaínu. Kontrolná skupina pozostávala z jedincov 20 bez anamnézy závislosti na kokaíne a bez veľkých psychiatrických diagnóz. Všetci pacienti náhle zomreli z príčin, ktoré nemali priamy vplyv na mozgové tkanivo. Skupiny boli porovnané pre priemerný vek subjektu, oneskorenie chladenia a pH. Pre všetky subjekty boli psychologické pitvy uskutočnené tak, ako bolo opísané vyššie (Dumais a kol., 2005), čo nám umožňuje prístup k podrobným prípadovým informáciám o psychiatrickej a lekárskej anamnéze, ako aj o ďalších relevantných klinických a sociodemografických údajoch. Stručne povedané, školený anketár vykonal Štruktúrovaný klinický rozhovor pre DSM-IV Psychiatrických porúch (SCID-I) s jedným alebo viacerými informátormi zosnulého. Panel lekárov zhodnotil hodnotenia SCID-I, kazuistiky, poznámky koronera a lekárske záznamy na získanie konsenzuálnych psychiatrických diagnóz.

Experiment 6: Imunoprecipitácia chromatínu pre potkanie NAc (Obr. 3A – C)

Dospelým (8 týždňov) samcom potkanov sa podával 10 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku vehikula IP raz denne počas siedmich dní. 24 h po poslednej injekcii sa mikrozissekovala NAc škrupina a jadro. Imunoprecipitácia chromatínu (ChIP) sa uskutočňovala spojením bilaterálnych NAc punčoch škrupiny alebo jadra zo siedmich potkanov na skupinu v celkových skupinách 14 (celkový počet zvierat 98, kokaínové bazény 7, bazény fyziologického roztoku 7). Tkanivá boli zosieťované, premyté a skladované pri -80 ° C až do strihania chromatínu sonikáciou. Strihaný chromatín sa inkuboval cez noc s protilátkami predtým viazanými na magnetické perličky (Dynabeads M-280, Invitrogen). Ako kontrola sa použil neimunitný IgG. Po reverznom zosietení a purifikácii DNA sa na meranie hladín promótorovej DNA CaMKIIa použil qPCR. Priméry sa navrhli tak, aby amplifikovali oblasť obsahujúcu konsenzuálnu sekvenciu AP-1 umiestnenú ~ 450 bp pred miestom štartu transkripcie (Forward: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; Reverse: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Obrázok 3

Obrázok 3

Indukcia indukcie CaMKIIa indukovaná bunkovým typom a regiónom in vivo

Experiment 7: Meranie CaMKII transkriptu a proteínovej expresie s bunkovou expresiou špecifickou pre AFosB (Obr. 3D)

Myši bitransgénne myši pochádzajú z NSE-TTA (riadok A) × TetOp-ΔfosB (riadok 11) a NSE-TTA (riadok B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (línia 11) myší (Chen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999; Werme a spol., 2002; Zachariou a kol., 2006) boli vytvorené a zvýšené na 100 ug / ml doxycyklínu, aby sa potlačila expresia AFosB počas vývoja. Vrh sa rozdelil na odstavenie: polovica zostala na doxycyklíne a polovica sa presunula na vodu a zvieratá sa použili 8 na 11 týždne neskôr, keď transkripčné účinky AFosB sú maximálne (Kelz a kol., 1999; McClung a Nestler, 2003). Pre transkripčné analýzy boli myši rýchlo dekapitované a mozgy boli odstránené a umiestnené na ľad. Rezy NAc sa odobrali pomocou ihly 14-gauge a rýchlo sa zmrazili na suchom lade, až kým sa RNA nevyextrahovala. Izolácia RNA, qPCR a analýza dát boli uskutočnené tak, ako bolo opísané vyššie (LaPlant a kol., 2009). Stručne povedané, RNA bola izolovaná s činidlom TriZol (Invitrogen), ďalej purifikovaná súpravou RNAeasy micro od spoločnosti Qiagen a skontrolovaná z hľadiska kvality pomocou zariadenia Aganent's Bioanalyzer. Reverzná transkripcia sa uskutočnila použitím iScript (BioRad). qPCR sa uskutočňoval v systéme Applied Biosystems 7900HT RT PCR s nasledujúcimi parametrami cyklu: 10 min pri 95 ° C; 40 cykly 95 ° C pre 1 min, 60 ° C pre 30 sec, 72 ° C pre 30 sec; stupňovité zahrievanie na 95 ° C na vytvorenie disociačných kriviek na potvrdenie jednotlivých PCR produktov. Imunohistochemické analýzy AFosB a expresie proteínu CaMKIIa boli uskutočnené tak, ako je opísané v experiment 4.

Experiment 8: Účinky antagonistov receptorov dopamínového receptora Intra-NAc D1 a D2 na zmeny proteínov sprostredkované kokaínom (Obr. 3H)

Dospelým (8 týždňom) samcom potkanov sa podával 10 mg / kg kokaín alebo fyziologický roztok („vehikulum“) IP raz denne počas siedmich dní. 30 min pred každou injekciou kokaínu boli potkanom IP podávané buď antagonisty receptora D1 SCH 23390 (skupina 0.5 mg / kg, skupina „D1 Ant“) alebo etikloprid antagonista receptora D2 (0.5 mg / kg, skupina „D2 Ant“). alebo injekcia na kontrolu fyziologického roztoku (skupina „kokaín“). 24 h po poslednej injekcii sa zvieratá dekapitovali a proteíny sa kvantifikovali metódou Western blotting experiment 2.

Experiment 9: Účinky AAV-sprostredkovanej AFosB nadmernej expresie na proteínovú expresiu (Obr. 4 A – C)

Stereotaxická chirurgia sa uskutočnila na dospelých samcoch potkanov (8 týždňov) na injekciu AAV-GFP (zelený fluorescenčný proteín) alebo AAV-GFP-AFosB (Maze a kol., 2010). 33 kalibračné ihly (Hamilton) sa použili pre všetky operácie, počas ktorých sa 0.5 ul purifikovaného vírusu s vysokým titrom bilaterálne infundovalo počas doby 5 min, po ktorej nasledovala ďalšia perióda 5 min po infúzii. Všetky vzdialenosti sa merajú vzhľadom na Bregma: uhol 10 °, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. 14 dní po chirurgickom zákroku sa zvieratám podala jediná IP injekcia 10 mg / kg kokaínu v lokomotorických monitorovacích komorách, aby sa vyhodnotili behaviorálne účinky nadmernej expresie AFosB. 24 hod. Po tejto poslednej injekcii boli potkany dekapitované podľa postupu experiment 2a mikrodisekcia tkaniva sa uskutočnila pod fluorescenčným mikroskopickým navádzaním, aby sa získalo GFP-pozitívne NAc tkanivo. Potom sa uskutočnilo Western blotovanie podľa postupu Experiment 2.

Obrázok 4

Obrázok 4

AFosB je nevyhnutný aj dostatočný pre indukciu CaXKIIa závislú od kokaínu sprostredkovanú D1 receptorom v NAc shell

Experiment 10: Účinky AAV-sprostredkovanej nadmernej expresie JunD na expresiu proteínov závislých od kokaínu (Obr. 4 D – F)

Stereotaxická injekcia AAV-GFP alebo AAV-GFP-AJunD bola uskutočnená podľa postupu Experiment 8. 14 dní po chirurgickom zákroku sa zvieratám podávali 10 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku IP raz denne počas siedmich dní v lokomotorických záznamových komorách. Zaznamenali sa lokomotorické reakcie na jedinú injekciu kokaínu (5 mg / kg IP) alebo fyziologického roztoku. 24 h po tejto poslednej injekcii boli potkany dekapitované, odobrané tkanivá a uskutočnené Western bloty ako v Experiment 9.

Experiment 11: In vitro Testy proteínovej kinázy (Obr. 5A – D)

Rekombinantné CaMKIIa a AFosB boli purifikované z hmyzích buniek (Brickey a kol., 1990; Jorissen a kol., 2007) a proteínkinázové testy (Colbran, 1993), ako bolo opísané vyššie. Stručne, CaMKII bol preinkubovaný na ľade s 2.5 uM (alebo indikovanou koncentráciou) AFosB, 1 mM Ca2+40mM Mg2+15 uM kalmodulínu a 200mM HEPES pH 7.5. Fosforylácia sa iniciovala pridaním 200 uM ATP s alebo bez [y-32P] ATP a nechá sa prebiehať 10 min pri teplote miestnosti (Obr. 5A a B) alebo 2 min na ľade (Obr. 5C a D). Produkty boli rozdelené pomocou Western blotov (Obr. 5A a B) alebo autoradiogramom a scintilačným počítaním (obr. B – D).

Obrázok 5

Obrázok 5

AFosB je silný substrát pre CaMKIIa

Experiment 12: Identifikácia fosforylácie Ser27 AFosB (Obr. 5E)

In vitro kinázové testy sa uskutočňovali ako v experiment 11proteíny boli separované pomocou SDS-PAGE a pásy zodpovedajúce AFosB boli vyrezané a podrobené tandemovej hmotnostnej spektrometrii. Priradenia m / z zodpovedajúcich iónových fragmentov vo všetkých paneloch sú označené na vrchole iónov. Nie všetky fragmentové ióny sú v dôsledku priestorových obmedzení označené. Všeobecne platí, že text pre fragmentové iónové značky sú sfarbené v čiernej farbe, s výnimkou prípadov, keď priamo potvrdzujú alebo pridávajú dôkazy o prítomnosti fosforylačných miest záujmu, v tomto prípade sú označené červenou farbou. Dôkazy o produktoch fragmentácie chrbtice sú prezentované v odčítaní sekvencie fosfopeptidu, pričom detegované miesto fosforylačného zvyšku je označené červenou farbou s označením jednej aminokyseliny. Číselný opis pozorovaných fragmentových iónov je tiež označený na peptidovej sekvencii ako b a y ióny. Faktory zoomu pre úseky osi m / z, aby sa zobrazili fragmenty iónov s nižšou intenzitou, sú vyznačené v hornej časti každého hmotnostného spektra fragmentu. Fragmentové ióny uvedené v paneli H potvrdzujú prítomnosť fosforylovanej izoformy Ser27, avšak v zmesi iných fosforylovaných izoforiem v miestach Ser28, Ser31, Ser34 a Thr37. Prítomnosť iónov pa5, pa5-P, pb5 a pb5-P jednoznačne potvrdzuje fosforyláciu zvyšku Ser27.

Experiment 13: Kvantifikácia fosforylácie Ser27 (Obr. 5F)

Štandardné peptidy boli navrhnuté tak, aby napodobňovali fosfo a nefosfo formy Ser27 AFosB. Po syntéze a čistení bol každý „ťažký“ idiotypový peptid rozpustený v pufri 50 / 50 acetonitril / voda a odoslaný na analýzu aminokyselín, aby sa stanovila absolútna koncentrácia na zásobnom roztoku syntetického peptidu. Každý "ťažký" peptid bol potom priamo infundovaný do hmotnostného spektrometra 4000 QTRAP (MS), aby sa určila najlepšia energia kolízie pre MS / MS fragmentáciu a dva až štyri prechody MRM. Ďalej boli čisté "ťažké" peptidy podrobené LCMS na 4000 QTRAP, aby sa zaistila separácia peptidov. Prístroj bol spustený v trojitom kvadrupólovom móde, pričom Q1 bol nastavený na špecifickú hodnotu prekurzora m / z (Q1 nie je skenovaný) a Q3 je nastavený na špecifickú hodnotu m / z zodpovedajúcu špecifickému fragmentu tohto peptidu. V režime MRM sa sekvenčne sledovala séria jednotlivých reakcií (prekurzorové / fragmentové iónové prechody, v ktorých sa kolízna energia vyladila na optimalizáciu intenzity sledovaných iónov fragmentov) a cyklus (typicky 1 – 2 sec) sa cyklicky sledoval po celú dobu HPLC separácie. Prechody MRM boli stanovené z MS / MS spektier existujúcich peptidov. Potom sa vybrali dva prechody na peptid, zodpovedajúce iónom s vysokou intenzitou fragmentov a optimalizovala sa kolízna energia, aby sa maximalizovala sila signálu prechodov MRM s použitím automatizačného softvéru. Piky získané zo štandardných peptidov a vzoriek AFosB vystavených CaMKII alebo kontrole sa potom porovnali, aby sa stanovila absolútna abundancia každej peptidovej formy v reakcii. Analýza dát na dátach LC-MRM sa vykonáva pomocou softvéru AB Multiquant 1.1.

Experiment 14: Indukcia AFosB v CaMKII nadmerne exprimujúcich myšiach (Obr. 5G & H)

Transgénne myši nadexprimujúce T286D CaMKII (Mayford a kol., 1996; Kourrich a kol., 2012) a súrodenci divokého typu boli odchovaní v neprítomnosti doxycyklínu, aby sa umožnila expresia transgénu. Dospelým myšiam sa podával 20 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku jedenkrát denne počas 14 dní. 24 h po poslednej injekcii boli zvieratá dekapitované a imunohistochémia a kvantifikácia expresie AFosB bola vykonaná ako v experiment 4.

Experiment 15: Účinky HSV-sprostredkovanej AFosB nadmernej expresie a CaMKII inhibície na NAc dendritických spinoch (Obr. 6A – E)

Dospelí samci myší (8 týždne) boli stereotaxicky injektovaní do NAc s HSV-GFP, HSV-GFP-AFosB (Olausson a kol., 2006), HSV-GFPAC3I alebo HSV-GFPAC3I-AFosB. V týchto konštruktoch je AC3I, inhibítor peptidu na báze CaMKII na báze peptidu, fúzovaný s C-koncom GFP. GFPAC3I bol klonovaný pomocou PCR s použitím vektora pMM400 obsahujúceho GFPAC3I ako templátu s nasledujúcimi primérmi: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGT 3' (clampNheIKozakmet); GFP-AC3I-R: 5 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 3' (clampBspEIstop). Výsledný PCR produkt sa vložil do vektorov p1005 + a p1005 + -A FosB použitím miest NheI a BspEI. Konštrukt bol validovaný sekvenovaním. Stereotaxické súradnice boli: 10 ° uhol, AP = + 1.6 mm, Lat = + 1.5 mm, DV = -4.4 mm (Barrot et al., 2002). Perfúzia a delenie mozgu sa uskutočňovali podľa experiment 4.

Analýza chrbtice sa uskutočnila ako je opísané (Christoffel a kol., 2011). Stručne, dendritické segmenty 50 – 150 µm od somy boli náhodne vybrané z buniek infikovaných HSV, ktoré exprimujú GFP. Obrázky boli získané na konfokálnom LSM 710 (Carl Zeiss) na morfologickú analýzu s použitím NeuronStudio s algoritmom rayburst. NeuronStudio klasifikuje chrbtice ako tenké, hubovité alebo stubby založené na nasledujúcich hodnotách: (1) pomer strán, (2) pomer hlavy a krku a (3) priemer hlavy. Hroty s krkom môžu byť klasifikované ako tenké alebo huby, a tie bez výrazného krku sú klasifikované ako tvrdohlavé. Hroty s hrdlom sú označené ako tenké alebo hubovité na základe priemeru hlavy.

Obrázok 6

Obrázok 6

Blokáda aktivity CaMKII zabraňuje morfologickým a behaviorálnym účinkom AFosB v NAc

Experiment 16: Účinky nadmernej expresie AFos-sprostredkovanej AFosB a inhibície CaMKII na reakcie kokaínu (Obr. 6F)

Dospelým mužským myšiam sa injikovali vírusy podľa experiment 15a lokomotorické odozvy na jednu injekciu kokaínu 5 mg / kg sa merali podľa Experiment 9. Lokomotorické údaje sú vyjadrené ako celkové prerušenia lúča počas 30 min po injekcii kokaínu.

Ďalšie informácie

Bývanie zvierat

Samce potkanov Sprague Dawley (250 – 275 g; Charles River Laboratories) sa umiestnili do dvojice. Osem týždňov staré samce myší C57BL / 6J (Jackson Laboratory) boli umiestnené v skupine s maximálne piatimi zvieratami na klietku. Všetky zvieratá boli navštevované v zariadení pre zvieratá počas ≥1 týždňa pred experimentálnymi manipuláciami a umiestnené v klimatizovaných miestnostiach (23-25 ° C) v cykle 12 hr svetlo / tma (svetlá zapnuté v 7: 00 AM) s prístupom k potravinám a vodu podľa chuti, Experimenty sa uskutočnili v súlade s pokynmi Spoločnosti pre neurovedy a výboru pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie (IACUC) na hore Sinai.

Drogy

Lieky boli podávané IP a rozpustené v sterilnom fyziologickom roztoku, vrátane kokaínu (5-20 mg / kg na 10 µl pre myši, na 1 ml pre potkany, NIDA) a SCH 23390 alebo hydrochloridu eticlopridu (0.5 mg / kg na 1 ml, Tocris) , Na stereotaxickú operáciu boli myši anestetizované „koktailom“ ketamínu (100 mg / kg) a xylazínu (10 mg / kg) (Henry Schein) v sterilnom fyziologickom roztoku.

protilátky

CaMKIIα (celkom): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

AFosB (celkom): Signalizácia bunky 5G4, 1: 250

AFosB fosfo-Ser27: fosfosolutions, 1: 500

GluA1 (celkom): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 phospho-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Štatistické analýzy

Všetky štatistické analýzy sa uskutočňovali použitím softvérového balíka Prism 6 (GraphPad). Študentské t-testy boli použité pre všetky párové porovnania (uvedené vo výsledkoch, kde je uvedená hodnota t) a pre všetky viacnásobné porovnania boli použité jednosmerné ANOVA (uvedené v časti výsledkov, kde je uvedená hodnota F).

Prejsť na:

výsledky

Chronický kokaín indukuje CaMKII v NAc Shell

Mnohé štúdie ukázali, že MSNs v NAc škrupine a jadre majú rôzne biochemické a fyziologické reakcie na chronickú expozíciu drogám zneužívania (Kourrich a Thomas, 2009; Loweth a kol., 2010) a že tieto dve subregióny diferencovane regulujú správanie zamerané na hľadanie drog (Ito a kol., 2004). Určiť rozdielne účinky kokaínu na proteínové zložky NAc shell vs. Použili sme multiplexované izobarické značkovanie (iTRAQ) a tandemovú hmotnostnú spektroskopiu (MS / MS). Dospelým samcom potkanov sa injikoval IP kokaín (20 mg / kg) alebo fyziologický roztok denne počas 7 dní; 24 h po poslednej injekcii, mikrotisekcia NAc shell a jadra (Obr. 1A) a bleskovo zmrazené. Proteíny v týchto vzorkách sa potom kvantifikovali použitím iTRAQ. Všetky štyri izoformy CaMKII vykazovali veľké zvýšenie expresie po liečbe kokaínom, ktoré bolo špecifické pre NAc shell v porovnaní s jadrom. Niekoľko proteínových fosfatáz, vrátane PP1 katalytických a regulačných podjednotiek a PP2A, ktoré boli predtým spojené s rôznymi substrátmi CaMKII v iných systémoch (Colbran, 2004), nasledoval podobný vzor. Tieto zistenia poskytli nový, objektívny dôkaz, že signálna dráha CaMKII je prominentne regulovaná kokaínom v NAc spôsobom špecifickým pre shell.

Kvôli kvantitatívnemu overeniu tohto zistenia sme potkany ošetrili tak, ako je uvedené vyššie, kokaínom (v rôznych dávkach) alebo fyziologickým roztokom a merali lokomotorické odpovede na kokaín (5 mg / kg) alebo dávku na podanie fyziologického roztoku. Opakovaná expozícia 10 mg / kg kokaínu vyústila do typického vzoru senzibilizácie pohybového aparátu (Obr. 1B). Ďalšie štúdie s týmto dávkovacím režimom odhalili pomocou Western blottingu, že opakovaný kokaín indukuje CaMKIIa selektívne v NAc shell 24 h po poslednej injekcii kokaínu (Obr. 1C a D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Okrem toho fosforylácia kanonického substrátu CaMKII Ser831 podjednotky GluA1 receptora AMPA bola významne zvýšená v NAc shell a nie v jadre (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), zatiaľ čo autofosforylácia CaMKIIa Thr286 mala silnú, ale nie významný trend smerom k indukcii len v shell (Obr. 1D). Niekoľko ďalších glutamátových receptorov nebolo ovplyvnených. Na rozdiel od týchto meraní CaMKII, rovnaké tkanivové vzorky vykazovali indukciu AFosB v oboch škrupinách (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) a jadro (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) NAc. (Obr. 1C a D), v súlade s predchádzajúcimi zisteniami (\ tPerrotti a kol., 2008).

Pretože niekoľko predchádzajúcich štúdií regulácie kokaínu AMPA receptorov analyzovalo zvieratá po ~ 14 dňoch vysadenia z chronického kokaínu (pozri Diskusia), v tomto časovom bode sme tieto biochemické analýzy zopakovali. Zistili sme, že 14 dní po poslednej injekcii kokaínu zostáva AFosB zvýšený v NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), zatiaľ čo ani CaMKII ani fosforylácia GluA1 Ser831 zostáva zvýšená (Obr. 1E). Avšak 1 h po jednorazovej expozičnej dávke kokaínu 10 mg / kg, hladiny celkového CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) a GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforylácia je zvýšená na úroveň podobnú tej, ktorá sa zistila po počiatočnej chronickej expozícii kokaínu (\ tObr. 1E). Tieto údaje ukazujú, že neuróny škrupiny NAc sú primárne aktivované na indukciu CaMKII počas predĺžených období abstinencie, napríklad priamym primovaním promótora génu CaMKII (pozri Diskusia). Okrem toho skutočnosť, že indukcia AFosB je perzistentnejšia ako indukcia CaMKII, svedčí o existencii ďalších mechanizmov, či už na báze chromatínu alebo inak, ktoré pôsobia „brzdou“ na reguláciu CaMKII, ako je uvedené v diskusii.

Na ďalšie posilnenie týchto pozorovaní sme skúmali modely samoobsluhy kokaínu, ktoré zahŕňajú dobrovoľný príjem liekov. Dospelým samcom potkanov bol poskytnutý buď krátky alebo dlhý prístup ku kokaínu; podľa očakávania (Ahmed a Koob, 1998), iba podmienky s dlhodobým prístupom viedli k eskalujúcemu samopodaniu lieku (Obr. 2A). AFosB bol indukovaný vo väčšom rozsahu dlho vs. krátky prístup ku kokaínu v NAc škrupine (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) a jadre (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). Naproti tomu, CaMKIIa bol indukovaný v NAc škrupine iba dlhým prístupom ku kokaínu (Obr. 2B a C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Je zaujímavé porovnať priemerný denný príjem kokaínu u zvierat s krátkym prístupom (12 mg / kg IV), zvierat s dlhým prístupom (~ 70 mg / kg IV) a pokusných zvierat (10 mg / kg) a sa pýtajú, prečo táto vyvoláva silnú indukciu AFosB a CaMKII, zatiaľ čo krátky prístup nie. Tento rozpor je pravdepodobne spôsobený rozdielmi v maximálnych hladinách kokaínu (experimentálne podávaný kokaín sa podáva ako jednorazová bolusová IP, zatiaľ čo kokaín podávaný samostatne je podávaný prostredníctvom viacerých IV dávok), alebo rozdielmi v dĺžke vystavenia lieku (7 dní pre experimentátorov). podávanie, 19 dní pre samopodanie).

Napriek rozsiahlej literatúre o AFosB a CaMKII pri kokaínovom pôsobení neexistujú štúdie týchto proteínov u užívateľov kokaínu. Tu uvádzame prvý dôkaz, že hladiny AFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) a CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) sú zvýšené v NAc ľudí závislých od kokaínu (Obr. 2D, Tabuľka 1). Tieto údaje ukazujú, že naše vyšetrenie indukcie AFosB a CaMKII kokaínom u hlodavcov NAc je klinicky relevantné pre závislosť od kokaínu u ľudí.

Tabuľka 1

Tabuľka 1

Charakterizácia vzoriek z ľudí závislých od kokaínu a kontrolnej skupiny

AFosB reguluje CaMKII transkripciu selektívne v D1-type MSNs NAc Shell

Zistenie, že CaMKII aj AFosB sú upregulované kokaínom v NAc hlodavcov, nás viedlo k stanoveniu, či by AFosB mohol regulovať transkripciu génu CaMKII. Predtým sme opísali CaMKIIa ako možný cieľ pre AFosB v nestrannej mikroarray analýze NAc (McClung a Nestler, 2003), ale toto zistenie nebolo v tejto štúdii ďalej potvrdené. Najprv sme použili kvantitatívne ChIP (qChIP-ChIP nasledované kvantitatívnou PCR) na stanovenie, či sa AFosB viaže na CaMKIIa génový promótor v NAc dospelých samcov potkanov a zistilo sa, že táto väzba je významne zvýšená, pri chronickom podávaní kokaínu, v škrupine ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ale nie jadro, subregión (Obr. 3A). Na ďalšie pochopenie mechanizmov súvisiacich s týmto subregiónom špecifickým rozdielom vo väzbe AFosB k promótoru CaMKIIa sme použili qChIP na charakterizáciu stavu modifikácií histónov v tejto genómovej oblasti. Predchádzajúce štúdie demonštrovali indukciu acetylácie H3 na promótore CaMKIIa v celkovej myšacej NAc na kokaíneWang a kol., 2010). Na rozdiel od toho sme zistili, že kokaín znižuje acetyláciu H3 na promótore CaMKIIa selektívne v jadre NAc (Obr. 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), bez zmeny viditeľnej v škrupine, čo je v súlade so subregionálnymi zmenami chromatínu nad väzbou AFosB. qChIP pre represívnu značku, dimetylovaný H3 lyzín 9 (H3K9me2), odhalil trendy v poklesoch v subregiónoch shell aj core (Obr. 3C).

Na stanovenie, či AFosB reguluje transkripciu CaMKIIa in vivoPoužili sme dve bitransgénne myšacie línie, ktoré indukovali nadmerne expresiu AFosB špecificky v D1 vs. MSNs typu D2 spôsobom kontrolovaným podávaním doxycyklínu v pitnej vode (\ tChen a kol., 1998; Kelz a kol., 1999; Werme a spol., 2002). Dospelí samci myší nadexprimujúci AFosB výhradne v MSN typu D1 mali signifikantne zvýšené hladiny CaMKIIa mRNA v NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), čo je účinok, ktorý nebol pozorovaný u myší nadmerne exprimujúcich AFosB prevažne v MSNs typu D2 (Obr. 3D). Zvýšenie mRNA CaMKIIa, indukované expresiou AFosB v MSN typu D1, bolo sprevádzané sprievodným zvýšením proteínu CaMKIIa v obidvoch NAc shell (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) a jadro (p = 0.0392; = 2.275, df = 14; Obr. 3E a F). Tieto údaje ukazujú, že AFosB je schopný riadiť expresiu génu CaMKIIa v MSN typu D1 v oboch subregiónoch, hoci Obrázok 3B naznačuje, že chromatínové zmeny sprostredkované kokaínom v promótore CaMKIIa (napr. znížená acetylácia) zabraňujú AFOSB v upregulácii CaMKII v jadrovom subregióne po kokaíne.

Pretože naše údaje o transgénnych myšiach naznačovali, že ΔFosB indukcia expresie génu CaMKII je špecifická pre MSN typu D1 v NAc, ďalej sme sa snažili zistiť, či si regulácia CaMKII závislá od kokaínu vyžaduje aktiváciu dopamínového receptora D1. Dospelým samcom potkanov sa podával chronický kokaín alebo soľný roztok ako predtým, ale 30 minút pred každou injekciou sa potkanom v skupine s kokaínom podala IP injekcia soľného roztoku, antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) alebo antagonista receptora D2 etikloprid (0.5 mg / kg). Zvieratá sa analyzovali 24 hodín po poslednej injekcii kokaínu. Western blot ukázal, že antagonista D1, ale nie D2, úplne blokoval kokainom sprostredkované zvýšenie ΔFosB (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), ako už bolo uvedené (Nye a kol., 1995), ako aj v CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Obr. 3G a H). Tieto údaje podporujú hypotézu, že kokaín zapája zvýšenie expresie CaMKII génu sprostredkovaného AFosB špecificky v MSNs typu D1 NAc shell. V budúcich štúdiách by bolo dôležité demonštrovať priamo tento špecifický účinok kokaínu na bunkový typ na expresiu CaMKII v tejto oblasti mozgu.

AFosB je nevyhnutný aj dostatočný na indukciu kokaínu CaMKII v NAc Shell

Na doplnenie použitia bitransgénnych myší sme ďalej študovali úlohu AFosB pri sprostredkovaní indukcie kokaínu CaMKIIa použitím vírusom sprostredkovaného prenosu génu u potkanov. Bilaterálne injektovali adeno-asociované vírusové (AAV) častice do NAc škrupiny dospelých samcov potkanov (kde môže byť selektívne zacielený shell) na nadmernú expresiu AFosB plus GFP alebo GFP samotného. Zvieratám sa potom podala jedna IP injekcia 10 mg / kg kokaínu. Zvieratá nadmerne exprimujúce AFosB / GFP vykazovali zvýšenú lokomotorickú odozvu v porovnaní so zvieratami nadexprimujúcimi samotný GFP (Obr. 4A). 24 h po jedinej injekcii kokaínu sa z týchto zvierat vyrezalo tkanivo GFP-pozitívne NAc disekciou pod fluorescenčným svetelným zdrojom. Western blotovanie tohto tkaniva (Obr. 4B a C) preukázali silnú nadmernú expresiu AFosB, ako aj významné zvýšenie celkového proteínu CaMKIIa v porovnaní so zvieratami GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), podobné indukcii pozorovanej pri chronickom podávaní kokaínu. Okrem toho bola autofosforylácia CaMKIIa pri Thr286 (indikujúca aktiváciu enzýmu) zvýšená nadmernou expresiou AFosB (p = 0.0330; t = 2.243; df = 28), rovnako ako fosforylácia substrátu CaMKII, Ser831 z GluA1 (p = 0.0540; t = 2.012, df = 28), opäť napodobňujúcich účinky chronického kokaínu (Obr. 1C a D). Ttieto údaje poskytujú ďalšie dôkazy, že expresia AFosB v NAc škrupine je dostatočná na lokomotorickú senzibilizáciu na kokaín a na indukciu a aktiváciu CaMKII v tomto subregióne.

Použili sme podobný prístup na stanovenie, či je AFosB tiež nevyhnutný pre indukciu CaMKIIa sprostredkovanú kokaínom v NAc shell. AAV sa použil na nadmernú expresiu skráteného JunD proteínu, označeného AJunD, ktorý je negatívnym regulátorom AFosB transkripčnej aktivácie (Winstanley a kol., 2007) plus GFP alebo GFP samotný. O dva týždne neskôr, keď je expresia transgénu maximálna, boli zvieratám podávané kokaín (10 mg / kg) alebo fyziologický roztok denne počas 7 dní a testované na lokomotorické odpovede na kokaínovú výzvu (5 mg / kg) 24 h po poslednej chronickej injekcii (Obr. 4D). Nadmerná expresia JunD zabránila lokomotorickej senzibilizácii na kokaín a tiež zabránila indukcii a aktivácii CaMKIIa v NAc shell (Obr. 4E a F; p = 0.0437; F = 2.997; celkový df = 38), čo ukazuje, že AFosB transkripčná aktivita je nevyhnutná pre indukciu CaMKIIa sprostredkovanú kokaínom v tomto subregióne. Zaujímavé je, že sme zistili, že AJunD znížil hladiny AFosB v podmienkach liečených fyziologickým roztokom a kokaínom (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), čím sa zvýšila nová možnosť, že AFosB závisí od aktivity AP-1 pre svoje vlastné hladiny expresie.

CaMKII fosforyluje AFosB v Ser27

Použitím in vitro stanovením proteínkinázy sme zistili, že purifikovaný AFosB je robustný substrát pre CaMKIIa. Inkubácia His6-FosB s CaMKIIa a ATP spôsobili posun elektroforetickej mobility AFosB smerom nahor (Obr. 5A); niekoľko výsledných pásov navrhlo viacnásobné miesta fosforylácie. Podobný in vitro kinázové testy s použitím [y-32P] ATP ukázala inkorporáciu rádioaktívne značeného fosfátu do posunutých pásiem AFosB (Obr. 5B), čo demonštruje priamu fosforyláciu proteínu. Vytvorili sme fosfo-špecifickú protilátku k predtým charakterizovanému Ser27AFosB (Ulery a kol., 2006). Aj keď táto protilátka nevytvára signál proti mozgovým extraktom, ktoré obsahujú fosforylovaný AFosB Ser27 (údaje nie sú uvedené), boli sme schopní detegovať fosforyláciu Ser27 v in vitro test kinázy s použitím CaMKII (Obr. 5B). Kinetické analýzy fosforylácie CaMKII AFosB naznačujú, že je silným substrátom pre kinázu (Obr. 5C), so zdanlivým KM 5.7 ± 2.0uM a KCAT 2.3 ± 0.3min-1, Tieto výsledky sú porovnateľné s mnohými dobre charakterizovanými in vivo substráty CaMKII (Colbran a Brown, 2004). Okrem toho sme zistili, že CaMKII fosforyluje AFosB so stechiometriou 2.27 ± 0.07 mol / mol (Obr. 5D), čo ukazuje, že v His sú aspoň tri miesta fosforylácie CaMKII6-FosB proteín, po dohode s Obr. 5A.

Na skúmanie jednotlivých miest fosforylácie sme použili MS analýzy vzoriek z našich in vitro kinázové testy. Obr. 5E demonštruje AFosB fosforyláciu na skôr charakterizovanom Ser27 a na niekoľkých ďalších miestach (dáta nie sú uvedené). Vzhľadom na predchádzajúcu funkčnú charakterizáciu Ser27 sme sa zamerali na toto miesto generovaním značených syntetických peptidov napodobňujúcich fosfo- a nefosfo-stavy Ser27, potom sa použili známe množstvá týchto peptidov ako štandardy v MRM analýzach AFosB pred a po in vitro fosforylácia pomocou CaMKII. Následná kvantifikácia (Obr. 5F) potvrdzuje, že Ser27 je silný substrát pre CaMKII. Tieto výsledky ukazujú, že medzi viacerými fosforylovanými zvyškami v AFosB je Ser27 zvlášť účinný substrát pre CaMKII.

CaMKII sprostredkuje akumuláciu kokaínu AFosB v NAc Shell

Pretože CaMKII môže fosforylovať AFosB in vitro na mieste, ktoré výrazne zvyšuje jeho stabilitu in vitro a in vivo (Ulery a kol., 2006; Ulery-Reynolds a kol., 2009), určili sme, či aktivita CaMKII kontroluje hladiny AFosB v NAc in vivo, Na riešenie tejto otázky sme najprv použili myšiu líniu nadexprimujúcu kalcium-nezávislý mutant CaMKIIa (T286D) vo viacerých oblastiach mozgu vrátane NAc (Mayford a kol., 1996; Kourrich a kol., 2012). Injektovali sme dospelým mužským mutantom a vrhom divokého typu v súlade s vekom s 20 mg / kg kokaínu alebo fyziologického roztoku raz denne počas 14 dní, potom analyzovali zvieratá jeden deň po poslednej injekcii. Zistili sme, že bazálne hladiny AFosB sa zvýšili u mutantných zvierat v NAc shell (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ale nie jadro (Obr. 5G a H). Prekvapivo bola indukovaná indukcia AFOSB závislá od kokaínu u mutantných zvierat ako v škrupine, tak v jadre, čo naznačuje, že hoci CaMKII môže priamo regulovať stabilitu AFosB v škrupine NAc, môže tiež ležať upstream od AFosB v dráhach aktivovaných kokaínom v oboch subregiónoch NAc. ,

Aktivita CaMKII sa vyžaduje pre štrukturálne a behaviorálne plasty sprostredkované AFosB

Indukcia dendritických spinov kokaínu na NAc MSNs je jedným z najlepšie zavedených adaptácií vyvolaných liekmi v tejto oblasti mozgu a takáto indukcia chrbtice bola korelovaná so senzitizovanými reakciami správania na liek (Robinson a Kolb, 2004; Russo a kol., 2010) a uviedli, že sú selektívne pre MSN typu D1 (Lee et al., 2006). Nedávno sme preukázali, že indukcia dendritických spinov v NAc kokaínom je závislá na AFosB a jeho downstream transkripčnom programe (Maze a kol., 2010). Hoci existuje rozsiahla literatúra týkajúca sa zapojenia CaMKII do morfológie a indukcie dendritickej chrbtice v iných oblastiach mozgu a experimentálnych systémoch (Jourdain a kol., 2003; Penzes a kol., 2008; Okamoto a kol., 2009), jeho úloha v NAc MSN chrbtovej tvorbe nebola študovaná. Preto sme určili, či je aktivita CaMKII potrebná pre indukciu dendritických spinov MSN sprostredkovanú AFosB, s využitím nadmernej expresie sprostredkovanej inhibítorom CaMKII AC3I sprostredkovanej HSV fúziou s GFP, konštruktom, o ktorom sa preukázalo, že inhibuje aktivitu CaMKII. in vivo (Zhang a kol., 2005; Klug a kol., 2012). Vírusová nadmerná expresia ΔFosB v NAc škrupine dospelých myší vyvolala významné zvýšenie hustoty dendritickej chrbtice MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Obr. 6A a B), ako bolo predtým oznámené (Maze a kol., 2010), a tento nárast bol primárne poháňaný tenkými (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) a pahýľavými (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) typmi chrbtice (obe sú považované za nezrelé chrbtice) (Obr. 6C – E). Žiadny účinok nebol pozorovaný na zrelších chrbticiach v tvare húb. Avšak keď bol GFP-AC3I koexprimovaný, indukcia AFosB spinov bola úplne zrušená (Obr. 6A – E), čo indikuje, že aktivita CaMKII je potrebná na indukciu AFosB dendritických spinov v NAc shell.

Ďalej sme použili rovnaké vírusové nástroje na určenie, či je aktivita CaMKII potrebná pre účinky AFosB na behaviorálnu citlivosť na kokaín. 72 h po vírusovej injekcii do NAc škrupiny sa zvieratám podala jedna injekcia 5 mg / kg kokaínu a zaznamenala sa ich lokomotorická aktivita. Ako bolo ukázané vyššie s rozšírenejšou AAV nadmernou expresiou AFosB (Obr. 4A) Nadmerná expresia AFOS sprostredkovaná HSV zvýšila lokomotorickú citlivosť na kokaín (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Obr. 6F). Rovnako ako pri indukcii dendritických spinov, inhibícia aktivity CaMKII koexpresiou GFP-AC3I úplne blokovala zvýšenie citlivosti kokaínu sprostredkované AFosB, čo naznačuje, že aktivita CaMKII je potrebná pre zmeny vyvolané faktorom AFOSB vyvolané behaviorálnymi účinkami kokaínu.

Prejsť na:

Diskusia

Predložená štúdia opisuje nový mechanizmus doprednej potravy, kde kokaín indukuje AFosB v NAc, ktorý selektívne reguluje transkripciu génu CaMKIIa v NAc škrupine. CaMKIIa následne fosforyluje a stabilizuje AFosB, čo vedie k väčšej akumulácii AFosB a k ďalšej indukcii CaMKIIa (Obr. 6G). Ko-eskalačné hladiny dvoch proteínov počas chronického vystavenia kokaínu potom prispievajú k podstatným spôsobom k senzibilizovaným behaviorálnym reakciám na liek. Toto je obzvlášť príťažlivá hypotéza, pretože ako AFosB, tak CaMKII boli predtým preukázané, že sú potrebné na zvýšenie reakcií na správanie kokaínu. (Pierce a kol., 1998; Peakman a kol., 2003) a tento nález replikujeme na AFosB v NAc škrupine špecificky použitím vírusového prístupu (Obr. 4 a and66).

Hoci transgénna nadmerná expresia AFosB v MSN typu D1 môže riadiť indukciu CaMKII v oboch NAc škrupinách a jadre zvierat bez predchádzajúcej kokaínu v kontexte kokaínu, akumulácia endogénneho AFosB, ktorý sa vyskytuje v oboch subregiónoch, riadi indukciu CaMKII špecificky v NAc škrupine , Tento rozdiel sa môže týkať vyšších hladín AFosB indukovaných v našom bitransgénnom modeli, môže však tiež odrážať schopnosť kokaínu diferencovane meniť CaMKIIa promótor v škrupine vs. jadrové MSN, aby buď podporovali väzbu AFosB v predchádzajúcom alebo ju vylučovali v druhom subregióne. V skutočnosti, naše ChIP dáta, ktoré odhaľujú kokaínom sprostredkovanú deacetyláciu histónov v CaMKIIa génovom promótore iba v NAc jadre, podporujú možné zapojenie chromatínového mechanizmu. V súlade s touto hypotézou bola nadmerná expresia AFosB v MSN typu D1 schopná riadiť indukciu CaMKIIa v jadre NAc v neprítomnosti kokaínu (Obr. 3F), čo naznačuje, že existujú aktívne modifikácie promótora CaMKIIa, ktoré zabraňujú tejto indukcii počas chronickej expozície kokaínu. Regulácia chromatínovej krajiny v promótore CaMKII by tiež mohla vysvetliť, prečo je CaMKII indukovaný stimulačnou dávkou kokaínu v NAc škrupine chronických kokaín-odoberajúcich potkanov (Obr. 1E), ale nie na zvieratách predtým neliečených \ tObr. 1D). To by mohlo predstavovať epigenetický účinok „génového primingu“ AFosB (Robison a Nestler, 2011), a preto môže byť jedným molekulárnym mechanizmom inkubácie túžby po kokaíne (Pickens a kol., 2011). Aby však táto zmena chromatínu bola kauzálne spojená s inkubáciou túžby, musela by časom rásť. Bude zaujímavé zistiť, či je to tento prípad, a študovať, či iné gény vykazujú reguláciu závislú od AFosB, subregiónu špecifickú pre kokaín. Je tiež dôležité poznamenať, že spätná slučka, ktorú opisujeme, nevedie k nekonečnej akumulácii CaMKII alebo AFosB (Obr. 1E); Odhalenie molekulárnej „brzdy“, ktorá je za to zodpovedná, je dôležitým cieľom budúcich štúdií.

Známe funkcie AFosB a CaMKII v niekoľkých experimentálnych systémoch a oblastiach mozgu sa zbiehajú na mnohých úrovniach (Obr. 6F). Obe molekuly sú úzko spojené s rastom dendritického chrbtice: CaMKII interaguje s cytoskeletom aktínu (Okamoto a kol., 2009), reguluje veľkosť hlavy chrbtice (Matsuzaki a kol., 2004), a je nevyhnutný aj dostatočný na zvýšenie filopodie a synapse indukovaného plasticity v kultúrach hippokampálnych organotypových rezov (Jourdain a kol., 2003), wHile AFosB je nevyhnutný aj dostatočný na tvorbu dendritickej chrbtice vyvolanej kokaínom v NAc MSN (Maze a kol., 2010). Okrem toho obe molekuly sú spojené s reguláciou receptorov glutamátu AMPA. CaMKII nereguluje celkové hladiny podjednotiek receptora AMPA, ale riadi inzerciu receptorov AMPA do synapsií a zvyšuje vodivosť kanálov AMPA fosforyláciou GluA1 v Ser831 v hipokampálnych pyramídových neurónoch v kultúre a in vivo (skontrolované v jazyku (Malinow a Malenka, 2002; Colbran a Brown, 2004)). Takýto zvýšený obchod s GluA1om na synapsiu sa prejavuje aj pri chronickom účinku kokaínu (Boudreau a Wolf, 2005). Okrem toho, behaviorálne reakcie na aktiváciu AMPA receptora v NAc sú zosilnené nadmernou expresiou CaMKIIa v D1 dopamínovom receptore závislom spôsobe (Singer a kol., 2010). Ukázalo sa, že dlhodobá D1-špecifická nadmerná expresia AFosB indukuje transkripciu GluA2 v NAc (Kelz a kol., 1999), ktorý tlmí reakcie AMPA sprostredkované prostredníctvom GluA1, zatiaľ čo tu uvádzame, že krátkodobá nadmerná expresia AFosB - ako aj kratšia expozícia kokaínu - nemajú na túto podjednotku žiadny vplyv (obr 1). Nedávno sme však zistili, že krátkodobá nadmerná expresia AFosB napriek tomu znižuje AMPA odozvy v MSNs typu D1 v NAc (Grueter a kol., 2013). Tieto údaje svedčia o časovo odlišných mechanizmoch, ktoré môžu predstavovať časovo závislú sériu neuroadaptácií na kokaín, ktoré sú základom rôznych aspektov progresie závislosti, ktoré ešte nie sú dobre známe. Na úrovni správania sa CaMKII aj AFosB vyžadujú na lokomotorickú senzibilizáciu na kokaín (pozri vyššie) a obe sú potrebné na trvalé podávanie kokaínu u hlodavcov (Colby a kol., 2003; Wang a kol., 2010), čo naznačuje, že tieto dva proteíny sú dôležité tak pre krátkodobé, ako aj dlhodobé behaviorálne adaptácie na expozíciu lieku, hoci prostredníctvom čiastočne odlišných základných mechanizmov. Predpokladá sa, že AFosB a CaMKII regulujú takéto komplexné behaviorálne adaptácie prostredníctvom zmien v NAc synaptickej funkcii, aj keď je potrebná ďalšia práca na priame spojenie synaptických javov so zmenou správania.

Holoenzým CaMKII súčasne interaguje s rôznymi synapse asociovanými proteínmi (Robison a kol., 2005), o ktorých sa predpokladá, že regulujú jeho zameranie na postsynaptickú hustotu (PSD), čo je jav, ktorý je dôležitý pre synaptickú plasticitu. Nedávno sa ukázalo, že interakcia CaMKII s podjednotkou GluN2B glutamátového receptora typu NMDA reguluje synaptickú plasticitu aj učenie (Halt a kol., 2012). Aj keď peptid AC3I napodobňuje autoinhibičnú doménu CaMKII, a tak inhibuje katalytickú aktivitu enzýmu, blokuje tiež mnoho interakcií proteín-proteín (Strack a kol., 2000; Robison a kol., 2005). Teda, behaviorálne a morfologické účinky tu opísaného HSV-GFP-AC3I by sa mohli vyskytnúť prostredníctvom zníženej fosforylácie cieľových proteínov CaMKII, zmien v cielení na CaMKII alebo zmeny v štruktúrnej úlohe navrhovanej v CaMKII v synapsiach (Lisman a kol., 2002).

Obmedzenie navrhovanej slučky AFosB-CaMKII na škrupinu NAc má osobitný význam, pretože nedávna práca ukázala niekoľko fyziologických rozdielov medzi NAc škrupinou a jadrom v reakcii na podávanie kokaínu, čo potvrdzujú naše neznáme údaje iTRAQ (tabuľka S1) , MSNs v NAc škrupine vykazujú depresiu v kapacite streľby po chronickom kokaíne, ktorý pretrváva niekoľko týždňov, zatiaľ čo jadrové MSN z tých istých zvierat vykazujú prechodný (1 – 3 deň) zvýšenie kapacity streľby, ktorá sa vracia na základné úrovne v priebehu 2 týždňov (Kourrich a Thomas, 2009). Okrem toho sú v NAc škrupine diferenciálne regulované mnohé synaptické proteíny vs. zvierat vystavených chronickému kokaínu, vrátane GluA2 (\ tKnackstedt a kol., 2010). Keďže chronický amfetamín indukuje CaMKIIa špecificky v NAc shell (Loweth a kol., 2010), nie je prekvapujúce, že s kokaínom nájdeme podobný účinok. Avšak, pretože AFosB je indukovaný v NAc škrupine aj jadre chronickým kokaínom (Perrotti a kol., 2008), a pretože sme ukázali, že indukcia CaMKIIa v škrupine je závislá na AFosB, naše zistenia poskytujú nový dôkaz pre odlišné transkripčné mechanizmy na promótore CaMKIIa medzi týmito dvomi subregiónmi, ktoré sú zodpovedné za selektívnu indukciu CaMKIIa v škrupine.

Veľká časť nedávnej práce sa zamerala na vymedzenie rozdielov medzi NAc MSN typu D1- a D2. Aj keď receptory D1 aj D2 sa podieľajú na odmeňovaní účinkov kokaínu (Vlastné, 2010), nedávna práca ukazuje, že optogenetická aktivácia MSN typu D1 zvyšuje behaviorálne reakcie na kokaín, zatiaľ čo aktivácia MSN typu D2 má opačný účinok (Lobo a kol., 2010). V súlade s týmito zisteniami sú myši s vyradeným receptorom D1 deficientné pri získavaní samopodania kokaínu (Caine a kol., 2007), zatiaľ čo D2 knockouty nie sú (Caine a kol., 2002). Podávanie agonistu D1 priamo do NAc spúšťa správanie pri hľadaní kokaínu v paradigmách obnovenia (Vlastné, 2010). Je zaujímavé, že tento účinok vyžaduje zvýšenie aktivity CaMKII v závislosti od receptora D1 v NAc shell, ale nie v jadre (Anderson a kol., 2008), čo je výsledok, ktorý pekne zapadá do D1- a shell-špecifickej slučky AFosB-CaMKII.

V minulosti sme uviedli, že Ser27 v AFosB môže byť fosforylovaný kazeínkinázou-2 (Ulery a kol., 2006), tu však zistíme, že CaMKII fosforyluje AFosB na tomto a iných miestach s oveľa väčšou kinetikou a stechiometriou a môže replikovať vyššie zdanlivé Mr pozorované pre AFosB (Obr. 5A) s expozíciou kokaínu in vivo (Nestler, 2008). Už vieme, že fosforylácia Ser27 zvyšuje stabilitu AFOSB a transkripčnú aktivitu (Ulery a kol., 2006; Ulery a Nestler, 2007; Ulery-Reynolds a kol., 2009). Budúca práca sa bude teraz zameriavať na identifikáciu a funkčné dôsledky nových miest fosforylácie AFosB indikovanej v tejto štúdii.

Tu opísaná slučka spätnej väzby poskytuje prijateľný nový mechanizmus, ktorým opakované podávanie kokaínu vedie k progresívnym abnormalitám v NAc. Táto biochemická dráha ako taká môže byť dôležitým cieľom pre budúcu terapeutickú intervenciu pri návykových poruchách. Pretože CaMKII je všadeprítomný a vyžaduje sa pre mnoho bazálnych neuronálnych a behaviorálnych funkcií, priame použitie inhibítorov CaMKII sa zabránilo liečbe závislosti. Naše údaje naznačujú, že jemnejšie zacielenie mechanizmu indukcie CaMKII, ktorý je špecifický pre individuálny typ buniek a subregión odmeňovania obvodov mozgu, by mohol poskytnúť terapeutický cieľ, ktorý by zabránil komplikáciám systémovej inhibície CaMKII.

Prejsť na:

Poďakovanie

Táto práca bola podporená grantmi z Národného inštitútu pre zneužívanie drog (EJN), NIDA-Yale Proteomics Center DA018343 (AJR a EJN) a Hartwell Foundation (AJR). Autori by chceli poďakovať Gabbymu Rundenkovi za veľkorysý dar purifikovaných AFosB a Rogera Colbrana za veľkorysý dar purifikovaného CaMKIIa.

Prejsť na:

Referencie

  1. Ahmed SH, Koob GF. Prechod z mierneho na nadmerný príjem liekov: zmena hedonickej požadovanej hodnoty. Science. 1998, 282: 298-300. [PubMed]
  2. Anderson SM, slávny KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biochemický most spájajúci akumulátory dopamínu a glutamátu v kokaíne. Nat Neurosci. 2008, 11: 344-353. [PubMed]
  3. Boudreau AC, Wolf ME. Senzibilizácia správania na kokaín je spojená so zvýšenou expresiou povrchu AMPA receptora v nucleus accumbens. J Neurosci. 2005, 25: 9144-9151. [PubMed]
  4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Expresia a charakterizácia alfa-podjednotky Ca2 + / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II použitím bakulovírusového expresného systému. Biochem Biophys Res Commun. 1990, 173: 578-584. [PubMed]
  5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Úloha dopamínových receptorov podobných D2 pri samopodávaní kokaínu: štúdie s mutantnými myšami D2 receptora a novým D2 receptorom antagonisti. J Neurosci. 2002, 22: 2977-2988. [PubMed]
  6. Caine SB, Thomsen M., Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Nedostatok vlastného podávania kokaínu v myšiach s knock-outovým receptorom dopamínu D1. J Neurosci. 2007, 27: 13140-13150. [Článok bez PMC] [PubMed]
  7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Mechanizmy závislé na proteazóme a nezávislé na destabilizácii FosB: identifikácia FosB degron domén a dôsledky pre stabilitu DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007, 25: 3009-3019. [PubMed]
  8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgénne zvieratá s indukovateľnou, cielenou expresiou génu v mozgu. Mol Pharmacol. 1998, 54: 495-503. [PubMed]
  9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH Russo SJ. IkappaB kináza reguluje sociálnu porážku indukovanú synaptickú a behaviorálnu plasticitu. J Neurosci. 2011, 31: 314-321. [Článok bez PMC] [PubMed]
  10. Colbran RJ. Inaktivácia Ca2 + / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II bazálnou autofosforyláciou. J. Biol. Chem. 1993, 268: 7163-7170. [PubMed]
  11. Colbran RJ. Proteínové fosfatázy a synaptická plasticita závislá od vápnika / kalmodulínu závislého od proteínkinázy II. J Neurosci. 2004, 24: 8404-8409. [PubMed]
  12. Colbran RJ, Brown AM. Vápenatá / kalmodulín-dependentná proteínkináza II a synaptická plasticita. Curr Opin Neurobiol. 2004, 14: 318-327. [PubMed]
  13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Nadmerná expresia DeltaFosB špecifického pre špecifický typ buniek zvyšuje motiváciu kokaínu. J Neurosci. 2003, 23: 2488-2493. [PubMed]
  14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepresívne účinky inhibítorov histón deacetylázy. J Neurosci. 2009, 29: 11451-11460. [Článok bez PMC] [PubMed]
  15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitatívna proteomika proteínov regulovaných kaveolín-1: charakterizácia polymerázy i a faktoru uvoľňujúceho transkript / CAVIN-1 IN endotelových buniek. Mol Cell Proteomics. 2010, 9: 2109-2124. [Článok bez PMC] [PubMed]
  16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Rizikové faktory pre dokončenie samovraždy pri veľkej depresii: štúdia prípadu kontroly impulzívneho a agresívneho správania v muži. Am J Psychiatry. 2005, 162: 2116-2124. [PubMed]
  17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. AFosB diferenciálne moduluje nukleus accumbens priamu a nepriamu funkciu dráhy. Proc Natl Acad Sci USA. 2013 v tlači. [Článok bez PMC] [PubMed]
  18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Väzba CaMKII na GluN2B je kritická počas konsolidácie pamäte. EMBO J. 2012, 31: 1203 – 1216. [Článok bez PMC] [PubMed]
  19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. FosB mutantné myši: strata chronickej kokaínovej indukcie proteínov príbuzných Fos a zvýšená citlivosť na psychomotorické a obohacujúce účinky kokaínu. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [Článok bez PMC] [PubMed]
  20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Diferenciálna kontrola nad správaním kokaínu pri hľadaní jadra a shell. Nat Neurosci. 2004, 7: 389-397. [PubMed]
  21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizácia a DNA-väzbové vlastnosti transkripčného faktora DeltaFosB. Biochémie. 2007, 46: 8360-8372. [PubMed]
  22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. Proteínkináza II závislá od vápnika / kalmodulínu prispieva k rastu závislému od aktivity a tvorbe chrbtice. J Neurosci. 2003, 23: 10645-10649. [PubMed]
  23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Nestler EJ. Expresia transkripčného faktora deltaFosB v mozgu riadi citlivosť na kokaín. Nature. 1999, 401: 272-276. [PubMed]
  24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genetická inhibícia CaMKII v dorzálnych striatálnych stredných ostnatých neurónoch znižuje funkčnú excitačnú synapsiu a zlepšuje vnútornú excitabilitu. PLoS One. 2012, 7: e45323. [Článok bez PMC] [PubMed]
  25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Tréning po zániku po samoobsluhe kokaínu indukuje glutamátergickú plasticitu na inhibíciu hľadania kokaínu. J Neurosci. 2010, 30: 7984-7992. [Článok bez PMC] [PubMed]
  26. Kourrich S, Thomas MJ. Podobné neuróny, opačné adaptácie: psychostimulačné skúsenosti odlišne menia vlastnosti vypaľovania v jadre akumulovaného jadra versus shell. J Neurosci. 2009, 29: 12275-12283. [Článok bez PMC] [PubMed]
  27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. Nezávislý vplyv striatálneho alfaCaMKII na AMPAR Podporuje senzibilizáciu odmeňovania kokaínu. J Neurosci. 2012, 32: 6578-6586. [Článok bez PMC] [PubMed]
  28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ , Úloha nukleárneho faktora kappaB pri hypersenzitivite vyvolanej ovariálnym hormónom u samíc myší. Biol Psychiatria. 2009, 65: 874-880. [Článok bez PMC] [PubMed]
  29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Tvorba dendritickej chrbtice vyvolaná kokaínom v stredných spinálnych neurónoch obsahujúcich dopamínový receptor D1 a D2 v nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006: 103: 3399 – 3404. [Článok bez PMC] [PubMed]
  30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekulárny základ CaMKII funguje v synaptickej a behaviorálnej pamäti. Nat Rev Neurosci. 2002, 3: 175-190. [PubMed]
  31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Strata BDNF špecifickej pre bunkový typ napodobňuje optogenetickú kontrolu odmeňovania kokaínu. Science. 2010, 330: 385-390. [Článok bez PMC] [PubMed]
  32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibícia CaMKII v jadre nucleus accumbens znižuje zvýšený príjem amfetamínu u senzitizovaných potkanov. Neurosci Lett. 2008, 444: 157-160. [Článok bez PMC] [PubMed]
  33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Prechodná nadmerná expresia alfa-Ca2 + / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II v jadre nucleus accumbens zvyšuje reakciu na amfetamín. J Neurosci. 2010, 30: 939-949. [Článok bez PMC] [PubMed]
  34. Malinow R, Malenka RC. Prenos AMPA receptora a synaptická plasticita. Annu Rev Neurosci. 2002, 25: 103-126. [PubMed]
  35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Štruktúrny základ dlhodobej potenciácie v jednotlivých dendritických spinoch. Nature. 2004, 429: 761-766. [PubMed]
  36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Riadenie tvorby pamäte prostredníctvom regulovanej expresie transgénu CaMKII. Science. 1996, 274: 1678-1683. [PubMed]
  37. Maze I, Covington HE, XPUMXrd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mechanic M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schaefer A, Nestler EJ. Podstatná úloha histon metyltransferázy G3a v kokaínom indukovanej plasticite. Science. 9, 2010: 327-213. [Článok bez PMC] [PubMed]
  38. McClung CA, Nestler EJ. Regulácia génovej expresie a odmeňovania kokaínom CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208-1215. [PubMed]
  39. Nestler EJ. Preskúmanie. Transkripčné mechanizmy závislosti: úloha spoločnosti DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245-3255. [Článok bez PMC] [PubMed]
  40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakologické štúdie regulácie chronickej indukcie antigénu súvisiacej s FOS kokaínom v striate a nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995, 275: 1671-1680. [PubMed]
  41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Úlohy CaMKII a F-aktínu v štruktúrnej plasticite dendritických spinov: potenciálna molekulárna identita synaptickej značky? Fyziológia (Bethesda) 2009, 24: 357 – 366. [PubMed]
  42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB v nucleus accumbens reguluje inštrumentálne správanie a motiváciu posilňovanú potravinami. J Neurosci. 2006, 26: 9196-9204. [PubMed]
  43. Paxinos G, Watson C. Mozog potkana v stereotaxických súradniciach. 6th Edition. Amsterdam; Boston: Akademická tlač / Elsevier; 2007.
  44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Indukovateľná expresia dominantného negatívneho mutantu c-Jun v transgénnych myšiach špecifických pre mozgovú oblasť znižuje citlivosť na kokaín. Brain Res. 2003, 970: 73-86. [PubMed]
  45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergentné CaMK a RacGEF signály riadia dendritickú štruktúru a funkciu. Trends Cell Biol. 2008, 18: 405-413. [PubMed]
  46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukcia deltaFosB v mozgových štruktúrach súvisiacich s odmenou po chronickom strese. J Neurosci. 2004, 24: 10594-10602. [PubMed]
  47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Výrazné vzory indukcie DeltaFosB v mozgu drogami zneužívania. Synapsie. 2008, 62: 358-369. [Článok bez PMC] [PubMed]
  48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Neurobiológia inkubácie drogovej túžby. Trends Neurosci. 2011, 34: 411-420. [Článok bez PMC] [PubMed]
  49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Vápnikom sprostredkovaný druhý posol moduluje expresiu behaviorálnej senzibilizácie na kokaín. J. Pharmacol Exp Ther. 1998, 286: 1171-1176. [PubMed]
  50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Autorádiografia ľudského mozgového receptora s použitím sekcií celej hemisféry: všeobecná metóda, ktorá minimalizuje tkanivové artefakty. Synapsie. 1987, 1: 446-454. [PubMed]
  51. Robinson TE, Kolb B. Štruktúrna plasticita spojená s expozíciou drog. Neuropharmacology. 2004; 47 (Suppl 1): 33-46. [PubMed]
  52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripčné a epigenetické mechanizmy závislosti. Nat Rev Neurosci. 2011, 12: 623-637. [Článok bez PMC] [PubMed]
  53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentné interakcie proteínkinázy II závislej od vápnika / kalmodulínu II s proteínmi postsynaptickej hustoty NR2B, densin-180 a alfa-aktinínom-2. J. Biol. Chem. 2005, 280: 35329-35336. [PubMed]
  54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Kvantifikácia multiplexných proteínov v Saccharomyces cerevisiae s použitím amínovo reaktívnych izobarických značkovacích činidiel. Mol Cell Proteomics. 2004, 3: 1154-1169. [PubMed]
  55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Závislá synapsia: mechanizmy synaptickej a štrukturálnej plasticity v nucleus accumbens. Trends Neurosci. 2010, 33: 267-276. [Článok bez PMC] [PubMed]
  56. Self DW. V: Dopamínové receptory. Neve KA, editor. New York: Humana Press; 2010. s. 479 – 524.
  57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Prechodná vírusová sprostredkovaná nadmerná expresia alfa-kalcium / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II v jadre nucleus accumbens vedie k dlhodobej funkčnej upregulácii alfa-amino-3-hydroxy-5 -metyl-4-izoxazol-propionátové receptory: receptor dopamínového typu-1 a závislosť od proteínkinázy A. Eur J Neurosci. 2010, 31: 1243-1251. [Článok bez PMC] [PubMed]
  58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mechanizmus a regulácia vápnik / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II zacielenej na NR2B podjednotku N-metyl-D-aspartátového receptora. J. Biol. Chem. 2000, 275: 23798-23806. [PubMed]
  59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforylácia DeltaFosB sprostredkováva jeho stabilitu in vivo. Neuroscience. 2009, 158: 369-372. [Článok bez PMC] [PubMed]
  60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulácia transkripčnej aktivity DeltaFosB fosforyláciou Ser27. Eur J Neurosci. 2007, 25: 224-230. [PubMed]
  61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulácia stability DeltaFosB fosforyláciou. J Neurosci. 2006, 26: 5131-5142. [PubMed]
  62. Vialou V a kol. DeltaFosB v okruhoch odmeňovania mozgu sprostredkováva odolnosť voči stresu a antidepresívnym reakciám. Nat Neurosci. 2010, 13: 745-752. [Článok bez PMC] [PubMed]
  63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Chronická kokaínom indukovaná acetylácia H3 a transkripčná aktivácia CaMKIIalfa v nucleus accumbens je kritická pre motiváciu na posilnenie liečiva. Neuropsychofarmakologie. 2010, 35: 913-928. [Článok bez PMC] [PubMed]
  64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB reguluje chod motocyklov. J Neurosci. 2002, 22: 8133-8138. [PubMed]
  65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Indukcia DeltaFosB v orbitofronálnej kôre sprostredkováva toleranciu k kokaínom indukovanej kognitívnej dysfunkcii. J Neurosci. 2007, 27: 10497-10507. [PubMed]
  66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Podstatná úloha DeltaFosB v nucleus accumbens pri morfínových akciách. Nat Neurosci. 2006, 9: 205-211. [PubMed]
  67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, cena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Inhibícia kalmodulínkinázy II chráni pred štrukturálnym srdcovým ochorením. Nat Med. 2005, 11: 409-417. [PubMed]