PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
zdroj
Laboratórium behaviorálnej fyziológie, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, Tokio, Japonsko.
abstraktné
Fyzické cvičenie zlepšuje viac aspektov hipokampálnej funkcie. V súlade s predstavou, že neuronálna aktivita je kľúčom k podpore neuronálnych funkcií, predchádzajúca literatúra konzistentne ukázala, že akútne záchvaty cvičenia vyvolávajú neuronálnu aktiváciu v hipokampuse. Opakované aktivačné stimuly vedú k akumulácii transkripčného faktora AFosB, ktorý sprostredkováva dlhodobú neurálnu plasticitu.
V tejto štúdii sme testovali hypotézu, že dlhodobý dobrovoľný chod kolesa indukuje expresiu AFosB v hipokampuse a skúmal akékoľvek potenciálne špecifické účinky v rámci hipokampálnych podpolí pozdĺž dorso-ventrálnej osi. Samce myší C57BL / 6 boli chované s alebo bez bežiaceho kolesa počas 4 týždňov. Dlhodobý chod kolesa významne zvýšil imunoreaktivitu FosB / ΔFosB vo všetkých hipokampálnych oblastiach meraných (tj v subpoliach DG, CA1 a CA3 oboch dorzálnych a ventrálnych hipokampov). Výsledky potvrdili, že kolesom indukovaná regionálna špecifická expresia imunoreaktivity FosB / AFosB v kortexe, čo naznačuje, že rovnomerné zvýšenie FosB / AFosB v rámci hipokampu nie je nešpecifickým dôsledkom behu. Údaje Western blot ukázali, že zvýšená imunoreaktivita hipokampálneho FosB / AFosB bola primárne spôsobená zvýšeným AFosB. Tieto výsledky naznačujú, že dlhodobé fyzické cvičenie je silným spúšťačom indukcie AFosB v celom hipokampuse, čo by vysvetľovalo, prečo môže cvičenie zlepšiť funkcie závislé od dorzálneho aj ventrálneho hipokampu. Zaujímavé bolo zistenie, že expresia FosB / AFosB v DG bola pozitívne korelovaná s počtom dvojkortín-imunoreaktívnych (tj nezrelých) neurónov.
Hoci mechanizmy, pomocou ktorých AFosB sprostredkováva neurogenézu vyvolanú cvičením, sú stále neisté, tieto údaje naznačujú, že neurogenéza vyvolaná cvičením je aspoň závislá od aktivity. Naše súčasné výsledky naznačujú, že AFosB je nový molekulárny cieľ, ktorý sa podieľa na regulácii plasticity hipokampu vyvolanej námahou.
úvod
Cvičenie prináša rôzne výhody na molekulárne, štrukturálne a funkčné aspekty hipokampu u hlodavcov [1,2], z ktorých niektoré boli podporované štúdiami u ľudí [3,4]. Mechanizmy, ktoré sú základom cvičením vyvolaných zmien v hipokampálnej plasticite, však nie sú dostatočne pochopené. Predchádzajúca literatúra neustále demonštrovala, že cvičenie vyvoláva aktiváciu hipokampálnych neurónov u hlodavcov. Imunohistochemické štúdie s použitím c-Fos, markera prechodnej neuronálnej aktivácie, preukázali, že tak nútený, ako aj dobrovoľný beh zvýšenej expresie c-Fos v subpole dentálneho gyrusu (DG), CA1 a CA3 hipokampu hlodavcov [5-7]. V predchádzajúcej štúdii s použitím laserovej Dopplerovej prietokomery (LDF) sa okrem toho ukázalo, že mierny bežecký pás so zvýšeným regionálnym cerebrálnym prietokom krvi (rCBF), alternatívnym markerom neuronálnej aktivácie, v podpole CA1 u potkanov [8]. Imunohistochemické štúdie umožňujú po ukončení cvičenia podrobnú analýzu špecifických oblastí, kým LDF umožňuje monitorovanie rCBF v reálnom čase v lokalizovanej oblasti počas cvičenia. Napriek výhodám a obmedzeniam každej štúdie tieto štúdie tiež preukázali účinok akútnych záchvatov cvičenia na hipokampálnu neuronálnu aktivitu. Tieto výsledky naznačujú mechanizmus, ktorým dlhodobé pravidelné cvičenie podporuje hipokampálnu plasticitu opakovaným spúšťaním aktivácie neurónov [9].
Transkripčný faktor AFosB, skrátená zostrihová izoforma FosB plnej dĺžky, je indukovaný rôznymi typmi opakovaných stimulov v špecifických oblastiach mozgu, kde sa postupne akumuluje kvôli svojej jedinečnej stabilite (polčas života v týždňoch) [10-12]. Rastúci počet dôkazov dokazuje, že zvýšené hladiny AFosB sprostredkovávajú dlhodobú neurálnu a behaviorálnu plasticitu spojenú s konkrétnymi stimulmi [11,13]. Napríklad chronické podávanie liekov na zneužívanie, ako je kokaín a morfín, bežne zvyšuje expresiu AFosB v nucleus accumbens, čo predstavuje jeden z molekulárnych mechanizmov, ktoré sú základom zvýšenej citlivosti na tieto lieky. [11,14,15]. Sk ostatným stimulom odmeňovania, vrátane stravy s vysokým obsahom tuku a sexuálneho zážitku [16,17], lDobrovoľná jazda na voľnom obehu tiež zvýšila imunoreaktivitu FosB / ΔFosB v nucleus accumbens potkanov, čo naznačuje, že dobrovoľný beh je prirodzenou odmenou pre hlodavce [18,19]. Avšak podľa našich najlepších vedomostí žiadna literatúra neskúmala, či opakované vystavenie fyzickému cvičeniu indukuje expresiu AFosB v hipokampuse. Pretože cvičenie spúšťa aktiváciu neurónov v hipokampuse, predpokladali sme, že dlhodobý dobrovoľný chod kolesa by tiež vyvolal expresiu AFosB v hipokampuse. Zatiaľ čo presné mechanizmy, ktorými AFosB reguluje hipokampálnu plasticitu, zostávajú neisté, štúdie preukázali, že myši, ktorým chýba fosB vykazujú zhoršenú hipokampálnu neurogenézu a zvýšené správanie podobné depresii [20,21]. jaJe známe, že cvičenie zvyšuje neurogenézu a má antidepresívne vlastnosti [22-25]. jaf naša hypotéza je správna, AFosB by bol novým potenciálnym molekulárnym cieľom sprostredkujúcim plasticitu hipokampu vyvolanú cvičením.
Hipokampus má anatomický a funkčný gradient pozdĺž svojej pozdĺžnej (dorso-ventrálnej) osi [26]. Dorzálny hipokampus hrá kľúčovú úlohu v priestorovom učení a pamäti [27,28], zatiaľ čo ventrálny hipokampus je prednostne zapojený do regulácie emocionálneho správania [29,30]. Okrem toho štúdie preukázali, že fyziologické stimuly indukujú rôzne vzory expresie c-Fos v dorzálnych a ventrálnych častiach hipokampu [31-33]. Pretože cvičenie zlepšuje dorzálnu [34-37] a funkcie závislé od ventrálneho hipokampu [24,25,38], je dôležité preskúmať, či dlhodobý dobrovoľný priebeh spôsobuje regionálnu expresiu AFosB v hipokampuse.
Primárnou hypotézou tejto štúdie bolo, že dlhodobý dobrovoľný chod kolesa by indukoval expresiu AFosB v myšom hipokampuse. Táto hypotéza bola skúmaná imunohistochémiou FosB / AFosB v dorzálnych a ventrálnych subpolohách hipokampu, DG, CA1 a CA3, s osobitným dôrazom na identifikáciu indukcie špecifickej pre daný región. Výsledky boli potvrdené Western blotom, ktorý bol použitý na identifikáciu izoformy fosB génových produktov indukovaných v hipokampuse. Tiež sme skúmali kortex pre indukciu špecifickú pre oblasť FosB / AFosB, aby sa vylúčila možnosť, že dlhodobé cvičenie nešpecificky zvýšenej imunoreaktivity FosB / AFosB v mozgu. Nakoniec bola skúmaná korelačná asociácia medzi expresiou FosB / AFosB a neurogenézou ako prvým krokom pri hľadaní funkčných dôsledkov indukcie indukcie indukcie AFosB pri regulácii hipokampálnej plasticity.
Materiály a metódy
1: Vyhlásenie o zvieratách a etike
Dvadsať samcov myší C57BL / 6 (vo veku 8 týždňov) bolo zakúpených od komerčného chovateľa (SLC, Shizuoka, Japonsko). Desať myší sa použilo pre experiment 1 a ďalších desať pre experiment 2. Myši boli umiestnené v kontrolovaných teplotných podmienkach (22-24 ° C) a svetle (cyklus 12 / 12-h svetlo / tma, svetlo na prístroji 0500) a boli poskytnuté jedlo a voda podľa chuti, Všetky experimentálne postupy boli schválené Výborom experimentálnej etiky zvierat na Tokijskej metropolitnej univerzite.
V každom experimente boli myši po príchode náhodne rozdelené do kontrolnej skupiny (kontrola, n = 5) alebo do bežiacej skupiny (Runner, n = 5). Počas prvého týždňa boli všetky myši umiestnené v štandardných plastových klietkach v skupinách (5 myši / klietka) na počiatočnú aklimatizáciu. Potom boli myši Runner prenesené do klietky vybavenej bežiacim kolesom (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Pretože je známe, že sociálna izolácia potláča záťaž vyvolanú neurogenézou v hipokampuse [39], Runner myši boli chované ako skupina (5 myši / klietka) počas ďalších 4 týždňov. Počet otáčok kolies sa zaznamenával každé ráno a telesná hmotnosť (g) sa merala týždenne.
2: Experiment 1. Imunohistochemické vyšetrenie expresie FosB / AFosB a hipokampálnej neurogenézy
2.1: Perfúzia a spracovanie tkanív
Ráno (0900 – 1100) po poslednom dni behu boli myši hlboko anestetizované sodnou soľou pentobarbitalu a transkardiálne perfundované studeným fyziologickým roztokom. Mozog bol rýchlo odstránený a post-fixovaný v 4% paraformaldehyde v fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátom 0.1 M (PBS, pH 7.4) cez noc. Mozog bol potom kryo-chránený v 30% sacharóze v PBS a zmrazený až do ďalšieho spracovania. Koronálne mozgové rezy (40 μm) hemisféry boli získané použitím zmrazovacieho mikrotómu a zhromaždené v PBS s 0.01% azidom sodným.
2.2: Imunohistochémia
Sériovo rezy v jednej zo šiestich sekcií boli náhodne vybrané pre FosB / AFosB imunoznačenie. Susedná séria bola použitá na značenie dvojkortínu (DCX), markera nezrelých neurónov overených na stanovenie neurogenézy [40,41]. Po ukončení reakcie endogénnej peroxidázy s 1% H2O2 v PBS boli voľne plávajúce rezy predinkubované s blokovacím roztokom obsahujúcim 10% normálne konské sérum v PBS pre 2 h. Po opláchnutí v PBS boli rezy inkubované s králičou polyklonálnou pan-FosB protilátkou (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) zriedené v PBS s 0.5% Triton X-100 a 0.5% BSA (PBST -BSA) pre 24 h pri 4 ° C. Ďalšia séria rezov bola inkubovaná s kozou polyklonálnou anti-DCX protilátkou (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) v PBST-BSA pre 48 h pri 4 ° C. Rezy sa ďalej inkubovali s vhodnou biotinylovanou sekundárnou protilátkou (anti-králičie IgG, 1: 1000, AP182B; anti-kozie IgG, 1: 1000, AP180B, obe protilátky od EMD Millipore, Billerica, MA, USA) v PBST-BSA pre 2 h pri teplote miestnosti. Rezy boli potom ošetrené komplexom avidín-biotín-peroxidáza (súprava Vectastain ABC peroxidáza, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, USA) pre 90 min podľa inštrukcií výrobcu. Antigény sa nakoniec vizualizovali s 0.02% 3,3-diaminobenzidínom (DAB) v 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6) obsahujúcom 0.01% H2O2, Pre imunofarbenie FosB / AFosB sa reakcia zintenzívnila síranom nikelnatým amónnym. Na farbenie DCX sa bunkové jadrá vyfarbili farbením Nissl. Rezy sa umiestnili na želatínou potiahnuté sklíčka a umiestnili sa krycie sklíčka.
2.3: Kvantifikácia imunoreaktivity FosB / AFosB s použitím prahovania obrazu
Protilátka pan-FosB použitá v tejto štúdii bola vznesená proti vnútornej oblasti zdieľanej FosB a AFosB N-koncovou oblasťou, takže nemôže rozlišovať medzi týmito dvoma izoformami. Preto boli imunofarbené štruktúry opísané ako FosB / AFosB imunoreaktívne jadrá (FosB / AFosB-ir). Pre objektívnu slepú kvantifikáciu boli sklíčka kódované pred analýzou. Atlas myšího mozgu [42] sa použila na identifikáciu umiestnenia nasledujúcich oblastí záujmu (ROI): vrstva granulových buniek (GCL) DG (rezy 3), vrstva pyramídových buniek CA1 (sekcie 3) a CA3 (rezy 2 – 3) v chrbtovom hipokampuse (uzavreté na -2.2 mm od bregma); DG (sekcie 2), CA1 (sekcie 2) a CA3 (sekcie 2) vo ventrálnom hipokampuse (uzavreté na -3.4 mm od bregmy) (Obrázok 4, vľavo). Kaudálne rezy obsahujú ako dorzálnu, tak ventrálnu časť hipokampu, ale cielená je ventrálna časť. V DG, suprapyramidových (DGsp) a infrapyramidálnych (DGip) lopatkách boli analyzované oddelene. Motorická kôra (2 – 3 rezy, uzavreté do -0.6 mm od bregma), somatosenzorická kôra (2 – 3 rezy, uzavreté do -0.6 mm od bregma), vizuálna kôra (3 sekcie, uzavreté do -2.9 mm od bregma), sluchová kôra (3 rezy, uzavreté na -2.9 mm od bregma) a olfaktorická žiarovka (rezy 3, uzavreté na + 4.3 mm od bregma) boli tiež analyzované (Obrázok 6, vľavo).
Digitálne obrazy (2070 × 1548 pixelov) každej ROI boli získané pomocou optického mikroskopu (BX-51, Olympus, Tokio, Japonsko) vybaveného CCD kamerou (DP-73, Olympus) a zobrazovacím softvérom (cellSens, Olympus). zväčšenie objektívu bolo 10 × pre hippokampálne ROI a 4 × pre kortikálne ROI. Aby sa identifikovala stredne silná až silná imunoreaktivita FosB / AFosB (Obrázok 1D – G), s použitím niekoľkých sekcií vopred, nastavenia snímania obrazu (intenzita svetla, veľkosť zastavenia poľa, doba expozície a vyváženie bielej) a prahové hodnoty pre každú z komponentov RGB boli optimalizované pre hipokampálne a kortikálne oblasti záujmu. Nasledujúca analýza sa potom uskutočnila za optimalizovaných podmienok (1). NI boli vybrané nepravidelne tvarovaným mnohouholníkom (Obrázok 1A, B) (2). Obraz bol prahový, ktorý konvertoval jadrá FosB / AFosB-ir na červenú farbu (Obrázok 1C-G) (3). % ROI sa potom automaticky vypočítalo takto:% ROI = (konvertovaná plocha (červená) / celková oblasť záujmu) × 100.
Na overenie tejto analýzy prahovej hodnoty obrazu boli oblasti 20 náhodne vybrané z rôznych oblastí mozgu s rôznymi veľkosťami oblastí. Okrem kvantifikácie prahovej hodnoty obrazu sa počet FosB / AFosB-ir jadier vo vybraných oblastiach manuálne spočítal a hustota FosB / AFosB-ir jadier sa získala vydelením počtu FosB / AFosB-ir jadier nameranými plocha (mm2).
2.4: Kvantifikácia DCX-ir nezrelých neurónov v zubnom gýrii
Nezrelé neuróny DCX-ir v DG Runnerových myšiach boli hojné a prekrývali sa, takže bolo ťažké presne spočítať diskrétny počet DCX-ir soma použitím optického mikroskopu. V predchádzajúcej štúdii však Shollova analýza morfologického hodnotenia ukázala, že každý DCX-ir neurón má v priemere jeden dendrit pri meraní v 40 μm soma [43]. Preto bola vyvinutá nasledujúca pôvodná analýza, aby sa umožnila regionálna špecifická kvantifikácia neurónov DCX-ir.
- (1) Obraz GCL sa premietal na počítačový displej pomocou zobrazovacieho softvéru a objektívu 40 × (2). Na živom obraze bol pozdĺž stredu GCL nakreslený úsečok (150 ± 0.1 μm)Obrázok 2) (3). Zmenou ohniskovej hĺbky sa spočítal počet dendritov DCX-ir prekrížených čiarových úsekov (4). ROI (dorzálne DGsp, dDGsp; dorzálne DGIP, dDGip; ventrálne DGsp, vDGsp; ventrálne DGip, vDGip) zodpovedali oblastiam, kde sa analyzovala imunoreaktivita FosB / AFosB (5). V každej oblasti záujmu boli nakreslené úsečky 2 – 3 na úseky a počet prechodov bol spriemerovaný na úsekoch 2 – 3 na myš. Keďže hrúbka GCL je približne 60 – 80 μm, počet prechodov by mal odrážať počet neurónov DCX-ir v analyzovanej obmedzenej oblasti.
Reprezentatívny obraz DCX-ir nezrelých neurónov a úsečky (150 ± 0.1 μm) prekryté pre počítanie počtu krížení s DCX-ir dendritmi.
3. Experiment 2. Identifikácia izoformy FosB / AFosB vyvolaná behom kolesa
3.1: Perfúzia a spracovanie tkanív
Ďalšia skupina myší sa spracovala ako je uvedené vyššie v experimente 1. Po 4 týždňoch prebiehajúcej intervencie boli myši transkardiálne perfundované studeným fyziologickým roztokom v hlbokej anestézii. Hipokampus sa rýchlo rozrezal a zmrazil s kvapalným dusíkom a uskladnil pri -80 ° C. Hipokampi každej myši boli homogenizované v RIPA pufri (150mM NaCl, 25mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% deoxycholát sodný, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA) obsahujúce proteázu inhibítory (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Nemecko). Lyzáty sa centrifugovali pri 15 min pri 5000 rpm pri 4 ° C a supernatanty sa zozbierali. Koncentrácie proteínov sa merali súpravou BCA Protein Assay kit (#23227, Thermo Scientific, IL, USA).
3.2: Western blotovanie
Rovnaké množstvá proteínu (30 μg / dráha) sa podrobili elektroforéze na 10% polyakrylamidovom géli, potom sa preniesli na PVDF membránu (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, USA). Nešpecifická väzba bola blokovaná preinkubáciou membrány pre 1 h v TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20) obsahujúcom 3% BSA. Membrána bola inkubovaná s pan-FosB protilátkou (1: 1000), ktorá bola použitá vyššie pre imunohistochémiu, rozpustená v TBST obsahujúcom 3% BSA. Po premytí TBST sa membrána inkubovala s HRP-konjugovanou anti-králičou IgG protilátkou (1: 5000 v TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) pre 1 h pri teplote miestnosti. Po premytí s TBST boli proteínové pásy vizualizované inkubáciou s Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, USA) a zachytené s použitím Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membrána sa potom znovu podrobila skúške anti-glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenázovou (GAPDH) protilátkou (#2275, 1: 5000 v TBS-T, Trevigen, MD, USA) ako kontrola plnenia. Optická hustota proteínových pásov bola kvantifikovaná s použitím Image-J a normalizovaná na úroveň GAPDH.
4: Štatistická analýza
Zmeny telesnej hmotnosti myši sa analyzovali dvojcestným opakovaným meraním ANOVA (skupina × čas). Na stanovenie štatistických rozdielov medzi skupinami (Control vs. Runner) sa použil nepárový t-test. Pearsonova korelačná analýza sa použila na overenie analýzy imunoreaktivity FosB / AFosB (manuálne počítanie vs. prahovanie obrazu) a na preskúmanie asociácie medzi úrovňou expresie FosB / AFosB a počtom krížení DCX v DG. Údaje boli prezentované ako priemer ± SEM. Prahová hodnota štatistickej významnosti bola stanovená na P <0.05.
výsledky
1: Telesná hmotnosť a jazdná vzdialenosť v experimentoch 1 a 2
Zmeny v telesnej hmotnosti ako kontrolnej, tak aj Runnerovej myši v experimentoch 1 a 2 sú spojené a ukázané v Obrázok 3, Obojsmerné opakované merania ANOVA ukázali významnú interakciu (skupina × čas, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) a hlavný účinok skupiny F(1, 18) = 6.07, P <0.05), čo naznačuje významne nižšiu telesnú hmotnosť u myší Runner. Ubehnutá vzdialenosť na klietku je uvedená v Tabuľka 1, Hoci presná prevádzková vzdialenosť každej myši bola neistá, pretože myši boli umiestnené spolu, pravidelné pozorovanie potvrdilo, že všetky myši často vykonávali beh kolesa. Myši Runner v experimente 2 bežali dlhšie ako v experimente 1, ale priemerná vzdialenosť (m / deň / klietka) bola konzistentná počas každého experimentu.
2: Validácia kvantifikácie FosB / AFosB imunoreaktivity s použitím prahovania obrazu
Bola signifikantná korelácia medzi oblasťou FosB / AFosB-ir získanou prahovaním obrazu a hustotou jadier FosB / AFosB-ir získaných manuálnym počítaním (r = 0.941, P <00001, Obrázok 4).
3: imunoreaktivita FosB / AFosB v hipokampuse
Reprezentatívne obrazy imunofarbenia FosB / AFosB v dorzálnych a ventrálnych subpolohách hipokampu boli ukázané na Obr. Obrázok 5, Vo všetkých analyzovaných ROI boli imunoreaktivita FosB / AFosB u myší Runner (Obrázok 5(vpravo) bola kvalitatívne vyššia ako u kontrolných myší (Obrázok 5, centrum). U myší Runner kvantitatívna analýza ukázala signifikantné zvýšenie plochy FosB / AFosB-ir v oboch dorzálnych (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) a ventrálne hipokampálne podpolia (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Obrázok 6).
4: imunoreaktivita FosB / AFosB v kortexe
Reprezentatívne obrazy imunoznačenia FosB / AFosB v kortikálnych ROI sú znázornené na obr Obrázok 7, Kvantitatívna analýza odhalila v regióne závislé zmeny imunoreaktivity FosB / AFosB pri dlhodobom behu (Obrázok 8). U myší Runner bola oblasť FosB / AFosB-ir významne vyššia v motorickej kôre (P <0.05) a somatosenzorická hlavná kôra (P <0.05), ale nie vo vizuálnej kôre (P = 0.662) alebo žiarovka čuchu (P = 0.523). V sluchovej kôre sa oblasť FosB / AFosB-ir prejavila na náraste u myší Runner (P = 0.105).
5: Neurogenéza
Reprezentatívne obrazy imunoznačenia DCX sú znázornené na Obr. \ T Obrázok 9, V dorzálnom hipokampuse je imunoreaktivita DCX u myší Runner (Obrázok 9, vpravo) bola kvalitatívne vyššia v porovnaní s kontrolnými myšami (Obrázok 9, vľavo). V porovnaní s dorzálnym hipokampom bola imunoreaktivita DCX vo ventrálnom hipokampuse slabšia u kontrolných myší aj u myší Runner. U myší Runner bol počet krížení významne vyšší v dDGsp (P <0.01) a dDGip (P <0.01; Obrázok 10). Vo ventrálnom hipokampuse sa počet krížení u myší Runner zvyšoval, ale medzi skupinami neboli významné rozdiely (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Obrázok 10).
6: Korelácia medzi expresiou FosB / AFosB a neurogenézou
Bola uskutočnená korelačná analýza medzi oblasťou FosB / AFosB-ir a počtom krížení DCX (Obrázok 11). Pretože každý súbor údajov (napr. Dorzálne DGsp v kontrolných myšiach) pozostáva len z párov 5, analýza sa najskôr uskutočnila so všetkými pármi 40. Zaujímavé bolo, že medzi oblasťou FosB / AFosB-ir a počtom krížení DCX bola významná korelácia (r = 0.885, P <0.0001). Okrem toho sa významná korelácia zistila aj pri dorzálnej DG (r = 0.762, P <0.05) a ventrálne DG (r = 0.816, P <0.01) sa analyzovali osobitne.
7: Identifikácia izoformy FosB / AFosB vyvolaná dlhodobým behom
Nakoniec identifikovať izoformu fosB génové produkty indukované v hipokampuse v reakcii na dlhodobý beh, hipokampi z ďalšej kohorty myší boli podrobení Western blotu s použitím rovnakej pan-FosB protilátky. Viacnásobné pásy 35 – 37 kDa, predstavujúce modifikované izoformy AFosB [44] boli významne zvýšené u myší Runner versus Control (Obrázok 12, P <0.01). Na druhej strane bola 48 kDa FosB izoforma nedetegovateľná v obidvoch skupinách. Ďalší pás slabo viditeľný nad 25 kDa pravdepodobne predstavuje izoformu A2FosB (27 kDa). Boli tu ďalšie dva pásy, nad 50 kDa a 37 kDa, ktoré boli s najväčšou pravdepodobnosťou spôsobené nešpecifickou väzbou. Po kvantifikácii sa v týchto pásmach iných ako AFOSB medzi skupinami nezistili žiadne rozdiely (údaje nie sú uvedené).
Diskusia
Stručne povedané, táto štúdia najskôr vykonala imunohistochemickú analýzu na skúmanie 1), či dlhodobý dobrovoľný chod kolesa indukuje expresiu FosB / AFosB v hipokampuse; a 2), či existuje regionálna špecifická reakcia pozdĺž jeho dorso-ventrálnej osi.
Štyri týždne dobrovoľného chodu kolesa vyvolali významné zvýšenie imunoreaktivity FosB / AFosB vo všetkých analyzovaných hipokampálnych oblastiach (tj podpole DG, CA1 a CA3 oboch dorzálnych a ventrálnych častí hipokampu). Potvrdili sme, že hlavná bola izoforma 35-37kDa AFosB fosB akumulovať génový produkt ako reakciu na dlhodobý beh. Tieto výsledky jasne podporujú hypotézu, že dlhodobé pravidelné cvičenie je silným spúšťačom indukcie AFosB v celom hipokampuse, a že jeho indukcia môže byť novým molekulárnym mechanizmom, ktorým cvičenie ovplyvňuje rôzne typy funkcií závislých od dorzálneho a / alebo ventrálneho hipokampu.
1: Validácia a obmedzenia kvantifikácie imunoreaktivity FosB / AFosB s použitím prahovania obrazu
V tejto štúdii sa použila technika thresholding obrazu, široko používaná v imunohistochemických štúdiách na počítanie počtu cieľových buniek a na vyhodnotenie morfológie buniek, pre špecifickú kvantifikáciu FosB / AFosB imunoreaktivity v regióne [15,45,46]. Bola preukázaná signifikantná korelácia medzi hladinami imunoreaktivity FosB / AFosB kvantifikovaná prahovaním obrazu a manuálnym počítaním (Obrázok 4). Pretože však hustota a prekrytie zabránili spočítaniu počtu jadier FosB / ΔFosB-ir vo vysoko hustých oblastiach, demonštrovaná korelácia naznačuje presnosť iba metódy prahovania obrazu, keď oblasti FosB / ΔFosB-ir predstavujú <~ 40% z celkovej ROI oblasti. Preto je potrebná starostlivá interpretácia pre oblasti FosB / ΔFosB-ir> 40% z celkovej plochy ROI.
Najmä na GR pre myši Runner (Obrázok 4), Expresia FosB / AFosB bola silne indukovaná behom kolesa a väčšina jadier FosB / AFosB-ir sa prekrývala. V týchto oblastiach vedie zvýšená indukcia expresie FosB / AFosB k väčšiemu podceneniu úrovne expresie bez ohľadu na použitú metódu kvantifikácie (prahovanie obrazu alebo manuálne počítanie). Napriek riziku podhodnotenia je však dôležité poznamenať, že táto štúdia úspešne demonštrovala významné zvýšenie plochy FosB / AFosB-ir v DG myší Runner. To naznačuje, že metodické obmedzenia neohrozujú naše zistenia. Namiesto toho potenciálne podhodnotenie zvyšuje spoľahlivosť zistenia, že dlhodobo sa zvyšujúca imunoreaktivita FosB / AFosB v hipokampuse.
2: Jednotná indukcia AFosB v rámci hipokampu dlhodobým behom
Hipokampus má anatomické a funkčné gradienty pozdĺž svojej pozdĺžnej osi [26], takže pre túto štúdiu sa FosB / AFosB imunoreaktivita v dorzálnych a ventrálnych častiach hipokampu analyzovala oddelene. Dáta ukázali, že dlhodobo meraná rovnomerne zvýšená expresia FosB / AFosB vo všetkých hipokampálnych ROI meraných. Táto jednotná indukcia imunoreaktivity FosB / AFosB môže byť nešpecificky spôsobená systémovými metabolickými zmenami spojenými s dlhodobým behom. Je však dôležité poznamenať, že v mozgovej kôre došlo k zvýšeniu imunoreaktivity FosB / AFosB v oblasti. Tento výsledok je podporený nedávnymi zisteniami, ktoré ukazujú, že akútny záchvat behu na bežiacom páse so zvýšeným regionálnym cerebrálnym prietokom krvi v hipokampe, ale nie v čuchovej žiarovke [8]. Ďalej Rhodes a kol. (2003) demonštrovali, že 7 dní dobrovoľnej indukcie expresie c-Fos indukovaného c-Fos v DG a CA2 / 3 hipokampu (CA1 nebol meraný) av senzorickej kôre, ale nie v zrakovej kôre [viz.47]. Celkovo tieto štúdie naznačujú, že jednotná indukcia expresie FosB / AFosB v hipokampuse nie je nešpecifickým dôsledkom dlhodobého chodu. Zaujímavé je, že Hawley a kol. nedávno uviedli, že chronický nepredvídateľný stres zvýšil expresiu FosB / AFosB v dorzálnom, ale nie v ventrálnom DG hipokampu potkana [48]. Pri ďalšom skúmaní budú zreteľné vzory indukcie FosB / AFosB, ako sú tie, ktoré sú vyvolané cvičením alebo stresom, poskytovaním pokračujúcich pohľadov na vplyvy závislé od stimulu na hipokampus.
Je známe, že primárna pan-FosB protilátka použitá v tejto štúdii rozpoznáva všetky izoformy FosB proteínov. Na základe analýzy Western blot sme zistili, že jedinými izoformami, ktoré sa zvýšili v hipokampuse po dlhodobom behu boli modifikované izoformy AFosB (35 – 37 kDa), jedinej stabilnej izoformy medzi proteínmi rodiny Fos [11]. Toto zistenie je v súlade s predchádzajúcou prácou s použitím pan-Fos protilátky na preukázanie, že 35 – 37 kDa ΔFosB je prevládajúcim proteínom rodiny Fos indukovaným v frontálnom kortexe chronickým stresom [44]. Zvýšenie imunoreaktivity hipokampálneho FosB / AFosB vyvolané dlhodobým priebehom najpravdepodobnejšie odráža hladinu AFosB.
Menej je známe o účinkoch cvičenia na molekulárne a štrukturálne aspekty hipokampu. Avšak mnohé behaviorálne štúdie naznačujú veľký potenciál pre zlepšenia v dorzálnej aj ventrálnej hippocampálnej funkcii. Preukázalo sa, že cvičenie zlepšuje priestorové učenie a pamäť [34-38] a priestorové a kontextové spracovanie závisí hlavne od dorzálneho hipokampu [27,28]. Na druhej strane je tiež známe, že cvičenie má anxiolytické a antidepresívne vlastnosti [24,25,38] a tieto emocionálne reakcie sú prevažne regulované ventrálnym hipokampom [29,30]. Rovnomerná indukcia AFosB dlhodobým priebehom pozorovaným v tejto štúdii naznačuje, že sa vyskytla určitá forma neuroplastických zmien v celom hipokampuse. To by vysvetľovalo, prečo môže cvičenie ovplyvniť dorzálne aj ventrálne funkcie závislé od hipokampu.
3: Regionálne špecifická analýza neurogenézy vyvolanej cvičením
Funkčná disociácia neurogenézy medzi dorzálnym a ventrálnym hipokampom tiež zvyšuje pozornosť [49]. V tejto štúdii sa využili morfologické charakteristiky nezrelých neurónov DCX-ir [43], spočítali sme počet priesečníkov medzi dendritami DCX-ir a úsečkou čiary nakreslenou pozdĺž stredu GCL. Toto meranie neposkytlo celkový počet neurónov DCX-ir v DG, ale umožnilo kvantifikáciu špecifickú pre oblasť potrebnú na vykonanie korelačnej analýzy s údajmi expresie FosB / AFosB (pozri nižšie). Po dlhodobom behu sa počet neurónov DCX-ir významne zvýšil v dorzálnom, ale nie v ventrálnom DG. To naznačuje, že cvičenie môže stimulovať neurogenézu výraznejšie v dorzálnej oblasti v porovnaní s ventrálnou časťou DG. Predchádzajúce štúdie však uvádzajú protichodné výsledky, pri ktorých koleso zvyšuje neurogenézu v dorzálnom aj ventrálnom DG [50,51]. V tejto štúdii počet prechodov DCX-ir v ventrálnom DG mal tendenciu zvyšovať sa pri behu, hoci malá veľkosť vzorky (myši 5 na skupinu) mohla obmedziť schopnosť detegovať štatisticky významný rozdiel medzi skupinami. Preto je pravdepodobne predčasné vylúčiť možnosť, že dobrovoľný chod kolesa môže stimulovať ventrálnu hippokampálnu neurogenézu. Ďalšie podrobné štúdie sú potrebné na pochopenie špecificity cvičenia indukovanej neurogenézy v súvislosti s jej viacstupňovým procesom (bunková proliferácia, diferenciácia, migrácia a prežitie).
4: Funkčné dôsledky indukcie indukcie indukcie ΔFosB pre reguláciu hipokampálnej plasticity
Nakoniec, ako prvý krok pri rozpoznávaní funkčných dôsledkov indukcie indukcie indukcie AFosB v hippocampuse, sme skúmali vzťah imunoreaktivity FosB / AFosB na kríženia DCX-ir v oboch dorzálnych a ventrálnych DG a zistili sme významnú pozitívnu koreláciu medzi dvoch premenných. Hoci presné mechanizmy, ktorými AFosB reguluje neurogenézu indukovanú záťažou, sú neisté, nedávna štúdia to dokázala fosB- myši, ktorým chýba FosB, AFosB a A2FosB (všetky fosB vykazovali deficity v bazálnej hippokampálnej neurogenéze, vrátane zníženej proliferácie neurónových progenitorových buniek, zvýšenej ektopickej migrácie novorodeneckých neurónov a abnormálnych DG štruktúr [20]. Tieto zmeny však neboli pozorované v fosB(d / d) myši, ktorým chýba FosB, ale nie AFosB / A2FosB. Zaujímavé je, v fosB- nulové myši, expresia niektorých génov súvisiacich s neurogenézou, vrátane VGF (VGF nervový rastový faktor indukovateľný) a. \ T gal (Galanin prepropeptid) boli downregulované [20]. Pretože VGF a GAL sú sekrečné molekuly, jeden návrh, ktorý sľubuje, sa domnieva, že neuróny exprimujúce AFosB môžu regulovať neurogenézu prostredníctvom autokrinnej / parakrinnej aktivity [20].
Okrem toho je potrebné poznamenať, že oblasť, v ktorej je AFosB indukovaný bežiacim priestorovým prekrývaním s oblasťou, kde je vysoká neurogénna aktivita. Toto zistenie naznačuje, že neurogenéza vyvolaná cvičením je na minimálnej závislosti od aktivity. Aktivácia neurónov je kľúčom k udržaniu a zlepšeniu funkcie centrálneho nervového systému [9], prostredníctvom mechanizmov vrátane expresie a uvoľnenia neurotrofického faktora odvodeného z mozgu (BDNF) [52,53], príjem sérového inzulínu podobného rastového faktora-1 (IGF-1) cez hematoencefalickú bariéru [54,55], potlačenie apoptózy [56] a regulácia mitochondriálnej motility [57]. Predkladaná štúdia teda naznačuje, že dlhodobé cvičenie vyvolalo opakovanú neuronálnu aktiváciu, evidentnú vo zvýšenej expresii AFosB, ktorá prispieva k zlepšeniu plasticity hipokampu, potenciálne prostredníctvom týchto viacnásobných mechanizmov opísaných vyššie.
Predkladaná štúdia hodnotila iba neurogenézu indukovanú záťažou a jej asociáciu s expresiou FosB / AFosB v DG. Imunoreaktivita FosB / AFosB sa však indukovala aj v podpole CA1 a CA3. Zatiaľ čo sú potrebné ďalšie štúdie na získanie lepšieho pochopenia funkčných úloh expresie indukovanej AFF v rámci týchto podpolí, predchádzajúca literatúra ponúka sľubnú možnosť. Guan a kol. (2011) demonštrovali, že špecifická ablácia cyklín-dependentnej kinázy 5 (Cdk5) v CA1 alebo CA3 pyramídových neurónoch zhoršila pamäťovú konsolidáciu, resp.58]. Zaujímavé je, že Cdk5 je downstream cieľom AFOSB [59] a je zapojený do regulácie synaptickej plasticity [60]. Expresia indukovaná námahou AFosB by sa preto mohla zúčastniť regulácie synaptickej plasticity prostredníctvom aktivácie Cdk5 v podpole CA1 a CA3.
záver
Hoci bolo známe, že akútne záchvaty cvičenia indukujú expresiu bezprostredne skorých génových proteínov v hipokampuse, táto štúdia poskytuje prvý dôkaz, že dlhodobé pravidelné cvičenie významne indukuje expresiu AFosB v celom hipokampuse. thje jednotná indukcia AFosB podporuje súčasné chápanie, že cvičenie je účinným nefarmakologickým zásahom schopným zlepšiť viac hipokampálnych funkcií. Spolu s významnou koreláciou medzi expresiou FosB / AFosB a neurogenézou sú tieto údaje provokatívne a naznačujú potrebu ďalších štúdií vymedzujúcich úlohu AFosB pri sprostredkovaní účinkov cvičenia na hipokampálnu funkciu vrátane neurogenézy.
Vyhlásenie o financovaní
Referencie
;
