Periadolescentné myši ukazujú zvýšenú úpravu ΔFosB v reakcii na kokaín a amfetamín (2002)

J Neurosci. 2002 Nov 1;22(21):9155-9.
 

zdroj

Nathan Kline Institute, Orangeburg, New York, 10962, USA. [chránené e-mailom]

abstraktné

Deti a adolescenti sú čoraz viac vystavovaní psychostimulanciám, buď nezákonne alebo na liečbu bežných neuropsychiatrických stavov, ako je porucha pozornosti s hyperaktivitou alebo bez nej. Napriek širokému rozšíreniu psychomotorických stimulantov v mladších vekových skupinách je málo informácií o chronických molekulárnych neuroadaptívnych reakciách na tieto činidlá v nezrelom mozgu. Tu demonštrujeme, že po chronickom podávaní psychostimulancií kokaín a amfetamíntranskripčný faktor DeltaFosB je upregulovaný v. \ t periadolescent myši ale nie v období po odstavení alebo dospelých myši, Indukcia DeltaFosB tiež sa vyskytuje výlučne v. \ t periadolescent myši po amfetamín administrácie. Tieto výsledky demonštrujú jedinečnú plasticitu kritickej molekuly v adolescentnom mozgu, ktorá reguluje psychostimulačné pôsobenie a naznačujú, že tieto neuroadaptívne zmeny sa môžu podieľať na sprostredkovaní. rozšírené návykové tendencie u adolescentov vo vzťahu k dospelým.

úvod

Psychostimulanty sa používajú pri liečbe bežných detských porúch, ako je porucha pozornosti s hyperaktivitou. Okrem toho, zneužívanie stimulancií, vrátane amfetamínu a kokaínu, je bežné u adolescentov, veku, v ktorom existujú dôkazy o zvýšených návykových návykoch v porovnaní s dospelými (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991). Napriek údajom, ktoré naznačujú vývojovo regulované účinky na správanie, je málo známe, čo sa týka molekulárnych neuroadaptívnych reakcií v nezrelom mozgu, ktoré sa vyskytujú počas podávania týchto činidiel. Kokaín a amfetamín môžu ovplyvniť dlhodobé zmeny správania čiastočne prostredníctvom stimulácie dopamínu D1a zvýšenia hladín transkripčných faktorov, vrátane AFosB, v dorzálnom striate (tj kaudate putamen) a ventrálnom striate (tj. nucleus accumbens) (Chen a kol., 1997). Zvýšenie hladín AFosB, možno prostredníctvom stabilizácie proteínových produktov, pretrváva niekoľko týždňov po chronickom vystavení kokaínu alebo amfetamínu a je regulované aspoň čiastočne cestou prenosu signálu dopamínu (Chen a kol., 1997; Nestler a kol., 2001).

Centrálny dopamínergný systém mladých zvierat je veľmi premenlivý v dôsledku meniacich sa hladín kritických molekúl počas normálneho vývoja, vrátane dopamínu D1receptor DARPP-32 (fosfoproteín regulovaný dopamínom a cAMP; Mr 32 kDa) a cAMP (Ehrlich a kol., 1990;Teicher a kol., 1993; Perrone-Capano a kol., 1996; Tarazi a kol., 1999;Andersen, 2002). Expozícia počas tohto obdobia psychostimulanciám, ktoré zvyšujú dopaminergnú neurotransmisiu, môže preto viesť ku kvantitatívne a / alebo kvalitatívne odlišným molekulárnym reakciám, vrátane zmien expresie AFosB. Na testovanie hypotézy, že v priebehu chronickej expozície psychostimulanciám existujú neuroadaptívne odpovede závislé od veku, tri skupiny myší sa analyzovali v sériových experimentoch: dospelí (60 d starý pri nástupe injekcií), periadolescent (33 d starý pri nástupe injekcií), a po odstavení (24 d starý pri nástupe injekcie). Toto je prvé priame porovnanie molekulárnych neuroadaptívnych reakcií na chronickú psychostimulačnú expozíciu v týchto troch vekových skupinách. Zistili sme, že po identických liečebných paradigmách vykazujú periadolescentné myši zvýšenú reguláciu AFosB v reakcii na kokaín aj amfetamín.

MATERIÁLY A METÓDY

Zvieratá a podávanie liečiv. Samce CD-1 myší (Charles River Laboratories, Kingston, NY) boli umiestnené v cykle 12 hr svetlo / tma (6: 00 AM až 6: 00 PM) s podľa chutiprístup k potravinám a vode. Zvieratá sa nechali umiestniť do zvieracej miestnosti na minimálne 10 d pred začatím injekcií. Zvieratá boli ošetrené dvomi vyšetrovateľmi, ktorí vykonali všetky injekcie v tej istej miestnosti, v ktorej boli zvieratá umiestnené. Všetky zvieratá boli odstavené vo veku 21 d. Injekcie sa začali u 24 (post-odstavenie), 33 (periadolescent) alebo 60 (dospelý) vo veku. Zvieratá dostávali 20 mg / kg kokaínu (Sigma, St. Louis, MO), 5 mg / kg amfetamínu (Sigma) alebo intraperitoneálne rovnaký objem fyziologického roztoku medzi 4: 00 a 5: 00 PM denne pre 7 d. Zvieratá boli usmrtené dekapitáciou po krátkom vystavení CO2 10: 00 AM deň po poslednej injekcii. Mozgy boli okamžite odstránené z lebky a kaudátový putamen a nucleus accumbens boli rýchlo rozrezané na ľade. Všetky disekcie boli uskutočnené z koronálnych rezov mozgu jedným výskumníkom a proteínové extrakty boli pripravené z čerstvého tkaniva bez zmrazenia. Všetky postupy na zvieratách boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a použitie a boli v súlade s Národnými inštitútmi zdravia Sprievodca starostlivosťou a používaním laboratórnych zvierat.

Western blot analýza. Na analýzy Western blot sa rovnaké množstvá proteínu (40 μg pre kaudát putamen a 20 μg pre nucleus accumbens) z každej vzorky naložili do každej dráhy 10% SDS-polyakrylamidového gélu po meraní proteínových koncentrácií s BCA testom (Pierce, Rockford, IL). Rovnomerné nanesenie proteínu bolo tiež overené vizualizáciou celkového proteínu pomocou Ponceau Red po prenose na nitrocelulózu a / alebo blotovaním s anti-aktínovou protilátkou (1: 500; Sigma). Antisérum antigénu súvisiaceho s Fos (FRA), ktoré rozpoznáva izoformy AFosB, bolo veľkoryso poskytnuté Dr. M. Iadarolou (National Institutes of Health, Bethesda, MD) a použilo sa pri koncentrácii 1: 4000. Predchádzajúce štúdie (Chen a kol., 1997; Hiroi a kol., 1997), vrátane preadsorpcie FRA antiséra s M-peptidovým imunogénom, preukázala špecifickosť tohto antiséra. Monoklonálna protilátka DARPP-32 5a, ktorá sa používa v 1: 10,000, bola široko poskytovaná spoločnosťou Drs. Hugh Hemmings a Paul Greengard (Rockefellerova univerzita, New York, NY). Protilátka dopamínového transportéra (DAT) bola od Chemicon (Temecula, CA). Bloty reagovali s chemiluminiscenčným systémom NEN-DuPont (Boston, MA) a boli vystavené filmu. Denzitometrické hodnoty pre AForB imunoreaktivitu boli získané použitím ScanAnalysis pre Apple (Biosoft, Ferguson, MO). Štatistická významnosť sa stanovila pomocou jednosmernej ANOVA, po ktorej nasledovala post hoc Tukeyov viacnásobný porovnávací test alebo nepárový, obojstranný študentský test t skúšky, ako je uvedené na obrázkoch. Pre experimenty s liečbou liečivom sa uskutočnila analýza každej vekovej skupiny na oddelenom blote, a preto každej skupine s fyziologickým roztokom bola ľubovoľne priradená hodnota 100% na porovnanie medzi vekovými skupinami. Pre štúdie ontogenézy boli vzorky zo všetkých vekových skupín analyzované spoločne na jednom blote.

VÝSLEDKY

Indukcia AFosB po kokaíne a amfetamíne sa vyskytuje v jadre accumbens iba periadolescentných myší

Expresia AFosB sa merala v nucleus accumbens a caudate putamen post-odstavných, periadolescentných a dospelých myší po podaní 7 d amfetamínu alebo kokaínu. Jadro accumbens je oblasť mozgu, ktorá je považovaná za najkritickejšiu pre sprostredkovanie odmeňovacích účinkov psychostimulancií. Imunoreaktivita AFosB (35 kDa) bola selektívne indukovaná v jadre accumbens periadolescentných zvierat po chronickom podávaní amfetamínu (obr. 1). 1 A) alebo kokaínu (Obr. 1 B). Na rozdiel od toho hladiny AFosB (35 kDa) neboli významne zmenené v jadre accumbens post-odstavných alebo dospelých zvierat (obr. 1).1 A,B). V putaméne s kaudátom boli hladiny AFosB (35 kDa) tiež významne zvýšené po chronickom podávaní amfetamínu len u periadolescentných zvierat (obr. 1).2 A). Všetky tri vekové skupiny vykazovali signifikantné zvýšenie expresie AFosB (35 kDa) v kaudate putamen po chronickom podávaní kokaínu (obr. 1).2 B). Veľkosť indukcie však bola najväčšia u periadolescentných zvierat, najmä v porovnaní s post-weanlings (obr. 1). 2 B). Iné izoformy FRA a Fos boli nezmenené vo všetkých vekových skupinách (údaje nie sú uvedené).

Obr. 1.

Imunoreaktivita AFosB v nucleus accumbens po chronickom podávaní psychostimulantu. Myši CD-1 boli injikované jedenkrát denne fyziologickým roztokom, amfetamínom alebo kokaínom pre 7 d, počnúc dňom 24 (P24; po odstavení), deň 33 (P33; periadolescent) alebo deň 60 (Dospelý). Hladiny imunoreaktivity AFosB (35 kDa) v nucleus accumbens sú uvedené po chronickom amfetamíne (A) alebo kokaínu (B). Reprezentatívne imunobloty zo soľného roztoku (S), amfetamín- (A) a kokaínu (\ tC) injekčne po odstavení (P24), periadolescent (P33) a dospelé myši sú znázornené na horné panely. Spodné panely ukazujú priemer ± SEM percenta bazálnej expresie AFosB. n hodnoty pre každú skupinu sú uvedené v. \ t tyče, Signifikantné zvýšenia AFosB sa našli v nucleus accumbens len u periadolescentných myší. *p <0.05; **p <0.01 (študentské t test; fyziologický roztok vs liek).

Obr. 2.

Imunoreaktivita AFosB v kaudátovom putamene po chronickom psychostimulačnom podávaní. Myši CD-1 boli injikované jedenkrát denne fyziologickým roztokom, amfetamínom alebo kokaínom pre 7 d, počnúc dňom 24 (P24; po odstavení), deň 33 (P33; periadolescent) alebo deň 60 (Dospelý). Hladiny imunoreaktivity AFosB (35 kDa) v kaudátovom putamene sú uvedené po chronickom amfetamíne (A) alebo kokaínu (B). Reprezentatívne imunobloty zo soľného roztoku (S), amfetamín- (A) a kokaínu (\ tC) injikovaných periadolescentných myší (P33) sú zobrazené v. \ thorné panely. Spodné panely ukazujú priemer ± SEM percenta bazálnej expresie AFosB. n hodnoty pre každú skupinu sú uvedené v. \ t tyče, Signifikantné zvýšenie imunoreaktivity AFosB vyvolané amfetamínom sa zistilo u kaudátového putamenu len u periadolescentných myší (A). Chronické podávanie kokaínu spôsobilo zvýšenie AFosB vo všetkých troch vekových skupinách (B). *p <0.05; **p <0.01 (študentské t test; fyziologický roztok vs liek).

Hladiny DAT a DARPP-32 sa nemenia po chronickom kokaíne alebo amfetamíne

Niekoľko kľúčových molekúl exprimovaných dopaminergnými a / alebo dopaminoceptívnymi neurónmi, vrátane DARPP-32, D1 receptora dopamínu a DAT, prispievajú k akútnym a chronickým reakciám na psychostimulanciá (Moratalla a kol., 1996; Fienberg a kol., 1998; Sora a kol., 1998; Gainetdinov a kol., 2001). Dáta z DARPP-32, D1 myši a DAT null a DAT knock-down myši ukazujú komplikovaný vzťah medzi ich hladinami, reguláciou dopaminergnej aktivity a reakciami na psychostimulanty. V skutočnosti sa indukcia AFosB nevyskytuje u DARPP-32 nulových myší, ktoré dostávajú chronický kokaín (Fienberg a kol., 1998). U dospelých myší však expozícia 7 d 20 mg / kg kokaínu nemení celkové hladiny DARPP-32 (Fienberg a kol., 1998). Regulácia proteínov DAT nebola predtým pozorovaná u myší vystavených chronicky psychostimulanciám, hoci u niektorých druhov boli hlásené zmeny vo väzbe rádioligandu na transportér dopamínu po vystavení psychostimulanciám (Letchworth a kol., 2001). Tu sme zmerali hladiny proteínu DARPP-32 a DAT, aby sme zistili, či je expresia týchto proteínov zmenená po chronickom podávaní psychostimulantu v ktoromkoľvek z troch vekových kategórií myší. Naše zistenia naznačujú, že nedošlo k žiadnym významným zmenám v hladinách celkového DARPP-32 alebo DAT v celom putaméne caudate alebo nucleus accumbens po chronickom podaní kokaínu alebo amfetamínu v žiadnej z troch vekových skupín (tabuľka 1).

Zobraziť túto tabuľku:

Tabuľka 1.

Hodnoty relatívnej denzitometrie pre DARPP-32 a DAT v P24, P33 a dospelých myšiach liečených amfetamínom a kokaínom v porovnaní s kontrolnými hodnotami fyziologického roztoku, ľubovoľne stanovené na 100%

Východiskové hladiny AFosB sú vývojovo regulované

Skúmali sme ontogenézu AFosB, pretože dospelé myši s geneticky upravenou zvýšenou expresiou AFosB v striate majú zvýšenú behaviorálnu odpoveď na psychostimulanty (Kelz a kol., 1999). Zistili sme, že východiskové hladiny AFosB boli signifikantne nižšie u mladších zvierat v porovnaní s dospelými jedincami, a to ako u kaudate putamen, tak u nucleus accumbens (obr. 1).3 A). Hladiny funkčných markerov dopamínového systému, vrátane DARPP-32 (Ehrlich a kol., 1990), DAT (Perrone-Capano a kol., 1996) a receptory dopamínu (Teicher a kol., 1993; Tarazi a kol., 1999) sú tiež vývojovo regulované. Predchádzajúce správy u myší CD-1 ukazujú vrchol v striatálnom DARPP-32 v postnatálnom dni 28 (P28) (Ehrlich a kol., 1990). V potkaních kaudate putamen a nucleus accumbens, D1pík z P28 na P40 (Teicher a kol., 1993; Tarazi a kol., 1999), ale podobné štúdie sa u myší neuskutočnili. Na rozdiel od toho sme zistili, že hladiny DAT proteínu v caudate putamen a nucleus accumbens boli konštantné medzi postnatálnym dňom 24 a dospelosťou (obr. 1). 3 B). Relatívne pomery medzi D1 DAT, DARPP-32 a AFosB sa líšia medzi vekovými skupinami, čo môže viesť k rozdielom v D1 receptorovú aktivitu, ktorá by mohla ovplyvniť stupeň indukcie AFosB.

Obr. 3.

Vývojová expresia AFosB a DAT. A, ΔFosB (35-37 kDa) imunoreaktivita v caudate putamen a nucleus accumbens naivných myší CD-1 ako funkcia veku. Reprezentatívne imunobloty sú uvedené v horné panely.Spodné panely ukazujú priemer ± SEM troch myší na skupinu. *p <0.05, dospelý oproti P24; #p <0.05, dospelí oproti P36 (Tukeyov viacnásobný porovnávací test po ANOVA). BDenzitometrické hodnoty DAT imunoreaktivity v kaudate putamen a nucleus accumbens pre naivné CD-1 myši ako funkciu veku. Úrovne DAT sa medzi tromi vekovými skupinami nelíšili.

DISKUSIA

Behaviorálne účinky psychomotorických stimulancií závisia od veku. Návykové tendencie sú najvyššie v adolescencii, keď sa užívanie nelegálnych látok zvyšuje (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991). Mladšie deti sa často stávajú dysforickými, keď sú vystavené psychostimulanciám, zatiaľ čo dospievajúci a dospelí zažívajú eufóriu (Rapoport a kol., 1980). V modeloch hlodavcov niektoré štúdie naznačujú, že periadolescentné zvieratá majú vyššie východiskové hladiny aktivity (Oštep a brzda, 1983) a zmenené reakcie na psychostimulanciá v porovnaní s mladšími a staršími zvieratami. Teda vykazujú menšiu lokomotorickú stimuláciu a novinku pri odpovedi na akútne podávanie malých dávok psychostimulancií v porovnaní s odstavom a dospelými zvieratami, ale zvýšenú hyperaktivitu po liečbe vysokými dávkami. Pri chronickom podávaní je senzitizácia na lokomóciu indukovanú kokaínom väčšia u periadolescentných potkanov v porovnaní s dospelými, zatiaľ čo senzibilizácia na stereotypy je nižšia. Údaje o mikrodialýze tiež odhalili rozdiely medzi periadolescentnými a dospelými potkanmi, pokiaľ ide o senzibilizáciu na uvoľňovanie dopamínu vyvolaného amfetamínom (Laviola a kol., 1995; Adriani a kol., 1998; Adriani a Laviola, 2000;Laviola a kol., 2001). Existujú však protichodné štúdie o dlhodobej reaktivite na kokaín po podaní metylfenidátu u dospievajúcich potkanov (Brandon a kol., 2001; Andersen a kol., 2002). Tieto posledné dve správy poukazujú na ťažkosti pri porovnávaní štúdií pri použití rôznych experimentálnych paradigiem. Pokusy o porovnanie behaviorálnych štúdií u mladších zvierat sú ďalej zmätené použitím rôznych druhov a kmeňov.

Myš sa stáva stále dôležitejším zvieracím modelom v štúdii použitia a zneužívania psychostimulancií, a toto je prvá systematická analýza molekulárnych neuroadaptívnych reakcií v troch rôznych vývojových vekoch u myší alebo akéhokoľvek iného jednotlivého druhu. Predchádzajúce štúdie, z ktorých sme odvodili naše paradigmy liečby, preukázali zvýšenie AFosB v izolovanom chrbtovom a ventrálnom striatum dospelých dospelých potkanov divokého typu po chronickom podávaní kokaínu a amfetamínu (Hope a kol., 1994; Nye a kol., 1995; Turgeon a kol., 1997), ale len v kombinovanom dorzálnom a ventrálnom striatu alebo izolovanom chrbtovom striatu dospelých myší divokého typu po chronickom kokaíne (Fienberg a kol., 1998; Zachariou a kol., 2001).

Teraz sme demonštrovali priestorový a kvantitatívny rozdiel v AFosB indukovanom psychostimulantmi v post-odstavčiarskych, periadolescentných a dospelých myšiach. Pozorovanie zvýšenej reakcie u periadolescentných zvierat v porovnaní s dospelými a post-odstavčanmi je posilnené skutočnosťou, že odpoveď je podobná u myší liečených kokaínom a amfetamínom. Psychostimulanty kokaín a amfetamín zvyšujú synaptický dopamín, ako aj serotonín a norepinefrín, ale rôzne mechanizmy. Kokaín sa viaže na plazmidové transportéry pre dopamín, serotonín a norepinefrín a inhibuje ich opätovné vychytávanie do presynaptických terminálov. Naproti tomu amfetamín podporuje uvoľňovanie týchto vysielačov. Selektívna indukcia AFosB v nucleus accumbens iba periadolescentnej vekovej skupiny po podaní 7 d stimulantu a relatívne zvýšená indukcia AFosB v putaméne caudate môže byť neurobiologickou reprezentáciou alebo príčinou skôr zaznamenanej zvýšenej tendencie k zneužívaniu psychostimulancií v tejto oblasti. veková skupina (Estroff a kol., 1989; Myers a Anderson, 1991) a iné dlhodobé zmeny v expresii génov, ktoré sa líšia medzi vekovými skupinami (Andersen a kol., 2002). Okrem toho tieto rozdiely môžu byť vnútorne regulované vývojovými zmenami hladín kľúčových molekúl, vrátane samotného AFosB. Potenciálne dôsledky rozdielov v základných úrovniach ΔFosB medzi vekovými skupinami sú analogické s tými, ktoré sa navrhujú vzhľadom na rozdiely medzi kmeňmi potkanov (Haile a kol., 2001). V skutočnosti predpokladáme, že podobné rozdiely medzi kmeňmi budú nájdené u inbredných myší. Je tiež možné, že myši rôzneho veku budú vykazovať odlišné molekulárne adaptácie v oblastiach mozgu iných ako nucleus accumbens. Ďalšie analýzy s použitím periadolescentných myší s geneticky upravenými zmenami hladín kľúčových molekúl a súbežných pozorovaní správania budú ďalej testovať tieto hypotézy.

poznámky pod čiarou

    • Prijaté Apríl 8, 2002.
    • Prijatá revízia August 6, 2002.
    • prijatý August 8, 2002.
  • Táto práca bola podporená Národnými inštitútmi zdravia / Národným ústavom neurologických porúch a Mzdovým grantom NS41871 (MEE a EMU) a Národným inštitútom pre zneužívanie drog Grant P30-DA13429 (EMU).

  • Korešpondencia by mala byť adresovaná Dr. Michelle E. Ehrlich, Thomas Jefferson University, Curtis 310, 1025 Walnut Street, Philadelphia, PA 19107. E-mail: [chránené e-mailom].

REFERENCIE

Články citujúce tento článok