PSMC5, proteínová ATPáza 19S, reguluje činnosť kokaínu v Nucleus Accumbens (2015)

PLoS One. 2015 11 mája, 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M.4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Neve R8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

abstraktné

ΔFosB je stabilný transkripčný faktor, ktorý sa hromadí v nucleus accumbens (NAc), kľúčovej časti obvodov odmien v mozgu, v reakcii na chronické vystavenie kokaínu alebo iným návykovým látkam. Aj keď je známe, že ΔFosB sa s členom rodiny Jun heterodimerizuje za vzniku komplexu aktívnych transkripčných faktorov, doposiaľ nedošlo k otvorenému prieskumu ďalších možných väzobných partnerov pre ΔFosB v mozgu. Tu pomocou kvasinkových dvojhybridných testov identifikujeme PSMC5 - tiež známy ako SUG1, podjednotku proteasomálneho komplexu 19S obsahujúcu ATPázu - ako nový interagujúci proteín s AFosB. Overujeme také interakcie medzi endogénnymi ΔFosB a PSMC5 v NAc a preukazujeme, že obidva proteíny tvoria komplexy aj s inými regulačnými proteínmi chromatínu spojenými s aktiváciou génu. Ďalej ukážeme, že chronický kokaín zvyšuje nukleárne, ale nie cytoplazmatické, hladiny PSMC5 v NAc a že nadmerná expresia PSMC5 v tejto oblasti mozgu podporuje lokomočné reakcie na kokaín. Tieto objavy spoločne popisujú nový mechanizmus, ktorý prispieva k pôsobeniu ΔFosB, a po prvý raz implikuje PSMC5 v molekulárnej a behaviorálnej plasticite vyvolanej kokaínom.

citácie: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, a kol. (2015) PSMC5, proteazomálna ATPáza 19S, reguluje pôsobenie kokaínu v Nucleus Accumbens. PLYS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademický redaktor: James Edgar McCutcheon, Univerzita v Leicesteri, SPOJENÉ KRÁĽOVSTVO

obdržal: December 10, 2014; Prijatý: Apríl 7, 2015; Publikované: Môže 11, 2015

Copyright: © 2015 Ohnishi a kol. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok Creative Commons Attribution License, ktoré umožňujú neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupnosť údajov: Všetky relevantné údaje sú uvedené v dokumente.

financovania: Táto práca bola podporená grantmi od Národných ústavov zdravia, Národného inštitútu pre zneužívanie drog a Nadácie Ishibashi a Japonskej spoločnosti na podporu vedy (čísla KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010). Poskytovatelia finančných prostriedkov nemali žiadnu rolu pri návrhu štúdie, zbere a analýze údajov, rozhodovaní o uverejnení alebo príprave rukopisu.

Konkurenčné záujmy: Autori vyhlásili, že neexistujú konkurenčné záujmy.

úvod

ΔFosB, skrátený produkt z FosB Génový gén patrí do rodiny transkripčných faktorov Fos, ktoré tiež zahŕňajú c-Fos, FosB s plnou dĺžkou, Fra-1 a Fra-2. FosB, podobne ako iné proteíny Fos, heterodimerizuje s proteínom rodiny Jun - c-Jun, JunB alebo JunD - za vzniku aktívneho komplexu transkripčného faktora AP-1 (aktivátorový proteín-1), ktorý indukuje alebo potláča expresiu špecifických cieľových génov. [1,2].

Ukázalo sa, že AFOS hrá kľúčovú úlohu v drogovej závislosti [2]. Jedine medzi proteínmi rodiny Fos sa po opakovanom podaní liečiva akumuluje v nucleus accumbens (NAc) a ďalších mozgových oblastiach súvisiacich s odmenou kvôli vysokej stabilite [3,4], ktorý je sprostredkovaný nedostatkom C-terminálnych degron domén a fosforyláciou niekoľkými proteínkinázami [5-7]. Takáto indukcia AFosB v NAc sprostredkuje zvýšené behaviorálne reakcie na zneužívané lieky. Nadmerná expresia AFos v tejto oblasti mozgu dospelých zvierat, buď s použitím vírusových vektorov alebo indukovateľných bitransgénnych myší, teda zvyšuje citlivosť zvieraťa na lokomotoricky aktivujúce a odmeňujúce účinky kokaínu a opiátov, ako aj motiváciu zvieraťa na samopodávanie. kokaín [7-11]. Naopak, nadmerná expresia dominantných negatívnych antagonistov AFosB spôsobuje opačné behaviorálne fenotypy [10-12].

My a iní sme predtým potvrdili pomocou testov na gelovom posune, že JunD a možno aj ďalšie proteíny Jun rodiny sú hlavnými väzobnými partnermi AFosB v mozgu in vivo [13-15]. Doposiaľ však nebolo otvorené, objektívne hodnotenie väzobných partnerov AFOSB v mozgu. Tu sme sa snažili identifikovať nových väzobných partnerov pre AFosB pomocou kvasinkového dvojhybridného testu [16,17]. Naše údaje odhalili, že PSMC5, tiež známy ako SUG1, je robustným partnerom AFOSB in vitro aj v NAc in vivo, kde sa pripája k AFOSB ako súčasť kokaínom indukovaného transkripčného aktivačného komplexu, ktorý tiež obsahuje CBP (CREB viažuci proteín). ) a p300 - histónové acetyltransferázy (HAT) - rovnako ako BRG1 (proteín rematelujúci chromatín). Ďalej ukážeme, že chronická expozícia kokaínu mení jadrové hladiny PSMC5, podjednotky proteazomálneho komplexu 19S obsahujúceho ATPázu, v NAc a že PSMC5 zase riadi behaviorálne reakcie na kokaín.

Materiál a metódy

Kvasinkový dvojhybridný skríning

Kvasinkové bunky MaV203 (Invitrogen Life Technologies) sa kotransfekovali s pDBLeu poháňajúcim rôzne fragmenty AFOSB proteínu a myšacia mozgová knižnica sa subklonovala do pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformované bunky boli pestované na SC-médiu bez leucínu, tryptofánu a histidínu a obsahujúcich 10 mM 3-aminotriazolu. Väzba medzi fragmentmi FosB a kandidátnym partnerom indukuje tri reportérové ​​gény (His3, Ura3a LacZ) a indukcia umožňuje transformantom prežiť za použitých kultivovaných podmienok. Pozitívne klony sa znova testovali s čerstvými pDBLeu-AFOSB fragmentmi pomocou retransformačných testov v MaV203 bunkách.

Bunkové línie

Myšie neuroblastómové bunky 2A (ATCC) sa udržiavali v minimálnom základnom médiu Eagle (EMEM) (ATCC) doplnenom 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) pri 37 ° C a 5% CO2, Bunky potkana 1A boli darom od Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonsko) [18] a udržiavané v Dulbeccovom MEM (DMEM) (Life Technologies), doplnené 10% FBS pri 37 ° C a 5% CO2, Transfekcia buniek plazmidovou DNA bola uskutočnená pomocou Effectene (Qiagen) podľa pokynov výrobcu.

Konštrukty PSMC5 a AFOS

Bolo vygenerovaných niekoľko mutantných foriem PSMC5, z ktorých každá bola označená FLAG na svojom N-konci, na použitie v imunoprecipitačných alebo vírusom sprostredkovaných pokusoch o génový prenos. Patria medzi ne: PSMC5-K196M, PSMC5-Acoiled-coil doména (PSMC5-ACC, bez aminokyselín 27 – 68), PSMC5-NT (skladajúci sa z N-koncového fragmentu proteínu, aminokyseliny 1 – 151) a PSMC5 -CT (pozostávajúce z C-terminálneho fragmentu proteínu, 172 aminokyselín) (pozri obr 1). Použili sme tiež N-terminálne MYC-značené formy divokého typu AFosB a FosB s mutáciou v doméne leucín-zips (mutácia aminokyselín 182 na 205, o ktorej je známe, že vylučuje heterodimerizáciu proteínmi Jun rodiny [6].

thumbnail
Obr. 1. FosB sa viaže na PSMC5 in vitro.

 

A. Schéma AFOSB, AFOSB-LZM, v ktorých je doména leucínového zipsu mutovaná, aby eliminovala heterodimerizáciu AFOSB s Jun proteínmi, a A2AFosB, ktorému chýbajú prvé 78 aminokyseliny AFosB N-konca. B. Schéma PSMC5, PSMC5-NT, ktorá obsahuje prvé 151 aminokyseliny PSMC5, PSMC5-CT, ktorému chýbajú prvé 235 aminokyseliny PSMC5, a PSMC5-ACC, ktoré postrádajú stočenú cievkovú doménu (aminokyseliny 28 – XNUM) , AAA doména zodpovedá motívu ATPázy asociovanému s rôznymi bunkovými aktivitami prítomnými v mnohých ATPázach. C. 68 μg pcDNA2.4-ΔFosB (dráhy 3.1 – 1) alebo AFOSB-LZM (dráha 4) sa ko-transfekovalo 5 μg z FLAG-označených PSMC2.4 alebo rôznych delečných mutantov do buniek Neuro5a. Dva dni po transfekcii boli bunky lýzované a podrobené imunoprecipitácii s anti-FLAG protilátkou a potom westernovým prenosom s anti-AFosB alebo anti-FLAG protilátkou. Všimnite si, že AFOSB, ale nie AFOSB-LZM, sa silne viaže na PSMC2 alebo PSMC5-NT, ale nie na PSMC5-CT alebo PSMC5-ACC. Dáta uvedené na obrázku sa replikovali trojmo v každom z troch samostatných experimentov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

zver

Na všetky experimenty sa použilo samcov myší C11BL / 57J vo veku deväť až 6 týždňov (The Jackson Laboratory). Zvieratá boli chované v cykle 12-h svetlo-tma s prístupom k potrave a vode podľa chuti a boli zvyknutí 1 týždeň pred experimentom. Boli použité dva režimy liečby kokaínom. Na štúdium biochemických účinkov kokaínu dostali zvieratá denné dávky kokaínu (7 mg / kg) alebo fyziologický roztok a usmrtili sa dekapitáciou 20 hodinu po poslednej injekcii. Toto je štandardný protokol, o ktorom sa preukázalo, že spôsobuje početné molekulárne a bunkové reakcie na liečivo [7]. Na štúdium vplyvu PSMC5 v jadre accumbens na behaviorálne reakcie na kokaín sme použili podprahovú dávku liečiva (7.5 mg / kg; pozri lokomotorickú senzibilizáciu nižšie) na základe hypotézy, že PSMC5, podobne ako AFos, zvýši citlivosť zvieraťa na kokaín [8]. Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Výborom pre ústavnú starostlivosť o zvieratá a ich využitie v Mount Sinai.

Imunoprecipitácia a Western blot

Bunky Neuro 2A boli transfekované divým typom alebo mutantnými formami PSMC5. Dva dni po transfekcii boli bunky premyté v PBS, lyzované v pufri RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% deoxycholát sodný, 10 mM butyrát sodný, koktail inhibítora proteázy). , Lyzáty sa rozdelili a inkubovali sa s neimunitnými IgG (Sigma) alebo anti-FLAG protilátkami (Sigma) počas 3 h pri 4 ° C. Imunoprecipitácia sa uskutočňovala s guľôčkami proteínu G (Invitrogen), ako je opísané [19]. V stručnosti, imunoprecipitované proteíny boli podrobené SDS-PAGE a analyzované pomocou Western blottingu s použitím anti-FosB / AFos protilátky (Cell Signaling Technology) na základe publikovaných protokolov [7]. Na testy väzby proteínov in vivo sme použili vyčistené jadrové frakcie z NAc disekovaných myší po chronickom ošetrení kokaínom (20 mg / kg IP denne počas 7 dní, myši použili 24 hodinu po poslednej injekcii). Koimunoprecipitácia z jadrových frakcií sa uskutočňovala s použitím súpravy Co-IP Nuclear Complex (Active Motif) podľa pokynov výrobcu. Boli použité nasledujúce protilátky: MYC alebo ß-aktín, Cell Signaling Technology (Danvers, MA), PSMC5 a histón H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 a BRG1, Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) a FLAG M2, Sigma.

imunohistochémia

Imunohistochémia sa uskutočňovala podľa publikovaných postupov [20]. Myši sa anestetizovali a intrakardiálne perfundovali 4% paraformaldehydom v PBS. Mozog sa kryoochránil 30% sacharózou a potom sa zmrazil a uložil pri -80 ° C až do použitia. Koronálne rezy (40 um) boli narezané na kryostate a spracované na imunohistochémiu. Voľne plávajúce rezy sa preinkubovali v blokovacom tlmivom roztoku obsahujúcom 0.3% Triton a 3% normálne somárske sérum. FosB sa detegoval pomocou kozej polyklonálnej protilátky vypestovanej proti N-koncovej časti proteínu (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 sa detegoval pomocou králičej polyklonálnej protilátky (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Snímky boli snímané konfokálnym mikroskopom (zväčšenie 60x; Zeiss).

Lokomotorická senzibilizácia

Všetky myši dostávali denne IP injekcie fyziologického roztoku po dobu 3 dní, aby ich navykli na stres injekcií. Nasledujúci deň sa myšiam injektovala IP fyziologický roztok alebo podlimitná dávka kokaínu (7.5 mg / kg; pozri časť Zvieratá vyššie) a okamžite sa umiestnili do nových lokomotorických boxov. Lokomotorická aktivita myší sa zaznamenala s použitím systému fotobeamov ako zlomov ambulantného lúča počas 30 min. Tieto ošetrenia sa opakovali denne po dobu 3 dní.

Prenos génov sprostredkovaný vírusmi

Na prenos vírusu sprostredkovaného génu sme použili rozsiahle publikované metódy [7,8,11,19]. V stručnosti, expresné plazmidy pre PSMC5 alebo pre niektoré z jeho mutantov (pozri konštrukty PSMC5 a AFOSB vyššie) boli subklonované do plazmidu bicistronického p1005 (+) HSV exprimujúceho GFP pod kontrolou promótora CMV a PSMC5 alebo jeho mutanty pod mutáciou Promótor IE4 / 5. V anestézii ketamínom (100 mg / kg) / xylazín (10 mg / kg) sa myši umiestnili do stereotaxického prístroja pre malé zvieratá a odhalil sa kraniálny povrch. Na bilaterálne infúzie 0.5 μl HSV vektora do NAc boli pod uhlom 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) rýchlosťou 0.1 μl / min. Použité ihly tridsaťtri kalibrov. Zvieratá dostávajúce injekcie HSV sa nechali zotaviť počas 2 dní po chirurgickom zákroku pred experimentom.

štatistika

Použili sa ANOVA a t-testy študentov, korigované na viacnásobné porovnania, s významnosťou nastavenou na p <0.05.

výsledky

PSMC5: nový väzobný partner AFosB

Uskutočnili sme predbežné experimenty na identifikáciu vhodného fragmentu AFosB, ktorý slúžil ako návnada v kvasinkovom dvojhybridnom teste bez autoaktivácie systému. Holo-ΔFosB indukoval aktivitu reportérového génu samostatne, rovnako ako N-koncový 1 – 78 aminokyselinový fragment proteínu. N-terminál však skrátil AFosB (Obr. 1A), označovaný ako A2AFosB, ktorému chýbajú prvé 78 aminokyseliny proteínu, nemal tento účinok. Preto sme ako návnadový proteín použili A2AFosB.

Na skríning potenciálnych väzbových partnerov sme použili knižnicu myšieho mozgu subklonovanú v pPC86. Identifikovali sme kandidátov na 11 pre záväzných partnerov. Aj keď tieto proteíny zahrnovali známe heterodimerizačné partnery AFOSB, c-Jun a JunD (Tabuľka 1), najbežnejším kandidátom zďaleka bol PSMC5. Aj keď to bolo prekvapujúce, bolo to zaujímavé zistenie, pretože sa ukázalo, že PSMC5 sa v jednej správe spred niekoľkých rokov viazal na c-Fos in vitro [21]. Neexistujú však žiadne predchádzajúce správy o účasti PSMC5 na kokaínovom pôsobení. Avšak z dôvodu sily signálu PSMC5 v kvasinkovom dvojhybridnom teste sme sa rozhodli ďalej študovať možné interakcie AFosB-PSMC5.

thumbnail
Tabuľka 1. Výsledky kvasinkového dvojhybridného skríningu s A2AFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Najprv sme na potvrdenie fyzickej interakcie medzi AFOS a PSMC5 uskutočnili in vitro koimunoprecipitačné experimenty. Zistili sme, že PSMC5 s označením FLAG (Obr. 1B), transfekované do buniek Neuro 2A, efektívne stiahnuté ΔFosB (Obr. 1C). Po druhé, na identifikáciu oblasti v PSMC5, ktorá je zodpovedná za jej väzbu na AFosB, sme vygenerovali niekoľko mutantov PSMC5 označených FLAG (Obr. 1B) a zopakovali koimunoprecipitačný experiment. FOSB bol účinne potlačený N-koncovými 151 aminokyselinami PSMC5 (PSMC5-NT), ale nie C-koncovými 172 aminokyselinovými fragmentmi proteínu (PSMC5-CT) (Obr. 1C). PSMC5, ktorý nemá svoju stočenú cievkovú doménu (PSMC5-ACC), bol pri precipitácii AFB tiež neúčinný. Tieto zistenia naznačujú, že PSMC5 viaže ΔFosB prostredníctvom svojej domény stočenej cievky (aminokyseliny 27 – 68). Navyše, PSMC5 označený FLAG nezrážal mutantnú formu AFosB s mutovanou doménou leucínového zipsu (AFB-LZM) (Obr. 1C), čo naznačuje, že AFosB sa buď viaže na PSMC5 prostredníctvom tejto domény, alebo je pravdepodobnejšie, že na väzbu PSMC5 sa vyžaduje heterodimerizácia AFosB.

Viazanie PSMC5-AFOSB v NAc po chronickom podaní kokaínu

Na základe týchto zistení in vitro sme študovali, či sa hladiny PSMC5 v NAc menia v reakcii na chronické podávanie kokaínu. Subcelulárnou frakcionáciou a westernovým prenosom sme zistili, že chronický kokaín zvyšuje jadrové hladiny PSMC5 v tejto oblasti mozgu bez zmeny hladín cytoplazmy (Obr. 2A). Tento účinok sa nepozoroval po jednorazových dávkach kokaínu (údaje nie sú uvedené). Ďalej sme skúmali lokalizáciu PSMC5 a AFOSB v NAc pomocou konfokálnej imunofluorescenčnej mikroskopie. Myši sme analyzovali 24 h po poslednej opakovanej dávke kokaínu, čo je čas, keď je FOSB jediným zistiteľným FosB génový produkt (pozri Nestler 2008). Našli sme silnú imunoreaktivitu PSMC5 v NAc, vrátane silného jadrového signálu. ~ 85% AFOSB + jadier spoločne vyfarbených na PSMC5 (Obr. 2B). Ďalej sme uskutočňovali koimunoprecipitačné experimenty na extraktoch NAc a zistili sme, že po chronickej liečbe kokaínom bol ΔFosB efektívne potlačený anti-PSMC5 protilátkou (Obr. 2C). Na rozdiel od toho analýza NAC naivnej na liečivo (po opakovaných injekciách do fyziologického roztoku) neodhalila žiadne detegovateľné AFOSB ťahanie nadol (údaje nie sú uvedené). Tieto údaje sú v súlade s našimi zisteniami v bunkovej kultúre a potvrdzujú, že AFosB a PSMC5 interagujú v NAc in vivo.

thumbnail
Obr. 2. Regulácia PSMC5 v myšiach NAc.

 

A. Western blotovanie jadrových a cytosolických frakcií NAc myší liečených denne soľným roztokom alebo kokaínom (20 mg / kg) počas 7 dní, pričom zvieratá boli analyzované 24 hodín po poslednej injekcii. Kokaín zvyšuje hladinu PSMC5 v jadre, ale nie v cytosóle. Ako kontrola naplnenia sa použil histón H3 a ß-aktín, ktoré neboli ovplyvnené kokaínom. Údaje sú priemerom ± SEM (n = 8–10 / skupina, * p <0.05). B. Spoločná lokalizácia endogénneho PSMC5 (zelená) a ΔFosB (modrá) v NAc myší liečených chronicky kokaínom ako v AC Jadrové lyzáty myšej NAc po chronickej liečbe kokaínom boli podrobené imunoprecipitácii protilátkou anti-PSMC5 alebo myšacím IgG ako kontrolou a potom Western blotované s anti-FosB / AFosB protilátkou. Obrázok demonštruje interakcie PSMC5-ΔFosB v NAc in vivo. Údaje v B a C sa replikovali trikrát v každom z troch samostatných experimentov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 zvyšuje expresiu AFosB in vitro

Pretože PSMC5 je známym členom proteazómového komplexu, testovali sme, či reguluje hladiny FosB pomocou buniek 1A potkana. Nadmerná expresia PSMC5 nemala žiadny vplyv na bazálne hladiny AFOSB, ale spôsobila malé, ale významné zvýšenie indukcie AFOSB po stimulácii buniek v sére (Obr. 3A). Podobný trend sa pozoroval pre FosB s plnou dĺžkou, ale účinok nedosiahol štatistickú významnosť. Naopak, supresia endogénnej expresie PSMC5 v potkaních 1A bunkách, dosiahnutá použitím siRNA, ktoré sú zamerané na PSMC5, neovplyvnila bazálne hladiny AFOS, ale silne inhibovala indukciu AFOS pomocou stimulácie sérom (Obr. 3B). Podobné účinky boli pozorované pre FosB s plnou dĺžkou. Tieto údaje naznačujú, že PSMC5 nepodporuje proteazomálnu degradáciu AFosB, ako by sa dalo očakávať ako jadrová podjednotka proteazómu, ale namiesto toho sa vyžaduje na maximálnu akumuláciu FosB génové produkty in vitro, pravdepodobne stabilizáciou proteínov.

thumbnail
Obr. 3. PSMC5 regulácia expresie FosB / AFosB v krysích 1A bunkách.

 

A. Bunky potkana 1A boli transfekované 4 ug PSMC5 alebo kontrolnej DNA. Nadmerná expresia PSMC5 nemala žiadny vplyv na bazálne hladiny expresie FosB alebo ΔFosB proteínu, ako sa stanovilo metódou Western blot, ale spôsobila malý, ale významný nárast indukcie ΔFosB stimuláciou séra (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Bunky potkana 1A boli transfekované 5 pmol buď z dvoch siRNA, alebo zmiešanej RNA (kontrola). Obe siRNA účinne znížili hladiny proteínu PSMC5 v porovnaní s kontrolnými podmienkami (siRNA # 1, 23 ± 5% kontroly; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Porážka PSMC5 nemala žiadny vplyv na bazálne hladiny FosB alebo ΔFosB, ale zoslabila indukciu FosB aj ΔFosB stimuláciou séra (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 , p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

FOSB a PSMC5 tvoria komplexy s CBP, p300 a BRG1 v NAc

Aby sme lepšie porozumeli transkripčným mechanizmom, ktorými môže PSMC5 ovplyvňovať funkciu FosB, skúmali sme možných ďalších väzobných partnerov pre dva proteíny v NAc v podmienkach chronického kokaínu. Existuje jedna správa, že PSMC5 sa viaže na CBP - HAT - a zvyšuje acetyláciu histónu H3 na proximálnom promótore MHC-II v HeLa bunkách [22]. Okrem toho myši, ktoré majú nedostatok CBP, vykazujú zníženú behaviorálnu citlivosť na kokaín, ako aj zníženú acetyláciu histónu na FosB promotér [23]. Testovali sme teda, či sa PSMC5 môže viazať na AFosB ako súčasť komplexov, ktoré tiež obsahujú CBP a možno aj iné transkripčné aktivátory.

Najprv sme demonštrovali, že AFOS účinne potlačil CBP aj p300, súvisiaci HAT, v bunkách Neuro2A (Obr. 4A). Naopak mutantná forma AFOSB leucínového zipsu nevykazovala túto aktivitu. Podobne PSMC5 efektívne stiahol CBP a p300 (Obr. 4B). Je zaujímavé, že tento účinok sa pozoroval aj pre PSMC5-ACC, ktorý netiahol dole FosB, čo naznačuje, že PSMC5 interaguje s CBP a p300 prostredníctvom iných domén proteínu a nezávisle od jeho väzby na AFOS.

thumbnail
Obr. 4. FOSB a PSMC5 interagujú s CBP, p300 a BRG1 in vitro a in vivo.

 

A. Neuro2A bunky boli transfekované 2.4 ug IgAFosB-značeného MYC alebo Afos-LZM značeného MYC. Bunkové extrakty sa imunoprecipitovali s anti-CBP alebo anti-p300 protilátkou a precipitáty sa Western blotovali s rovnakou protilátkou alebo s anti-MYC protilátkou. CBP aj p300 interagujú s AFOSB a takéto interakcie vyžadujú intaktný leucínový zips. B. Neuro2A bunky sa transfekovali s 2.4 μg FLAG-označeného PSMC5 alebo FLAG-označeného PSMC5-ACC. Bunkové extrakty sa imunoprecipitovali s anti-CBP alebo anti-p300 protilátkou a precipitáty sa Western blotovali s rovnakou protilátkou alebo s anti-FLAG protilátkou. CBP aj p300 interagujú s PSMC5 a takéto interakcie nevyžadujú doménu CC. C. Jadrové lyzáty myší NAc po chronickom ošetrení kokaínom boli imunoprecipitované s anti-CBP alebo anti-p300 protilátkou. Následné Western blotovanie výsledných precipitátov s anti-FosB / AFosB protilátkou ukázalo endogénne interakcie medzi AFosB a CBP / p300. D. Alikvóty tých istých jadrových lyzátov sa podrobili imunoprecipitácii s anti-BRG1 alebo anti-PSMC5 protilátkou, nasledovalo Western blotovanie precipitátov s anti-FosB / AFOS alebo anti-BRG1 protilátkou. Výsledky ukazujú endogénne interakcie medzi AFOS a BRG1 a BRG1 a PSMC5. E. Schematické znázornenie transkripčného aktivačného komplexu zloženého z AfosB: JunD heterodimérov interagujúcich s CBP / p300, BRG1 a PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Aby sa potvrdilo, že tieto interakcie sa vyskytujú aj in vivo, podávali sme kokaín chronicky, aby sme vyvolali hladiny AFOS a jadrového PSMC5, a potom sme imunoprecipitovali extrakty NAc s anti-CBP alebo anti-p300 protilátkami. V súlade s našimi údajmi o bunkovej kultúre imunoprecipitácia CBP alebo p300 účinne potlačila ΔFosB (Obr. 4C). Testovali sme, či sa BRG1, hlavná podjednotka remodelujúceho chromatínového komplexu SWI-SNF, môže tiež viazať na AFosB a PSMC5 na základe nášho skoršieho zistenia, že BRG1 je rekrutovaný k určitým cieľovým génom AFosB po ich aktivácii v NAc po chronickom kokaíne [24]. Zistili sme, že imunoprecipitácia BRG1 potlačila ΔFosB v extraktoch NAc a že imunoprecipitácia PSMC5 podobne koprecipitovala endogénny BRG1 (Obr. 4D). Celkovo tieto výsledky naznačujú, že AFosB-PSMC5 tvorí komplexy v NAc, ktoré tiež zahŕňajú CBP / p300 a BRG1 (Obr. 4E).

Nadmerná expresia PSMC5 zvyšuje lokomotorické reakcie na kokaín

Prominentná väzba PSMC5 s AFOSB v NAc nás viedla k tomu, aby sme preskúmali, či zvýšenie hladiny PSMC5 v tejto oblasti mozgu reguluje behaviorálne reakcie na kokaín. Vytvorili sme vektor vírusu herpes simplex (HSV), ktorý nadmerne exprimuje buď divoký typ PSMC5 alebo jeden z jeho mutantov a vektory sme validovali v NAc in vivo (Obr. 5A). Vírusom sprostredkovaná expresia PSMC5 prevláda v bunkovom jadre (Obr. 5B). Myši nadmerne exprimujúce divoký typ PSMC5 nevykazovali zmenené reakcie na počiatočné dávky kokaínu, ale vykazovali zvýšenú lokomotorickú aktiváciu v reakcii na opakované dávky kokaínu v porovnaní s kontrolnými myšami exprimujúcimi GFP. Naopak myši, ktoré nadmerne exprimujú mutantnú formu PSMC5, ktorá nemá svoju doménu stočenej cievky (PSMC5-ACC), tento účinok nevykazovali (Obr. 5B). Je zaujímavé, že nadmerná expresia PSMC5-K196M, ktorá nemá ATPázovú aktivitu proteínu divého typu, tiež zosilnila lokomotorické reakcie kokaínu.

thumbnail
Obr. 5. Nadmerná expresia PSMC5 v NAc zvyšuje lokomotorické reakcie na kokaín.

 

A. Reprezentatívna expresia transgénu sprostredkovaná HSV v mediálnej NAc. AC, predná komisia. Na obrázku sú znázornené podoblasti jadra a plášťa NAc. B. Reprezentatívne väčšie zväčšenie (60x) imunohistochemického farbenia PSMC5 v neurónoch NAc po injekcii HSV-PSMC5, ktoré ukazuje, že proteín je prevažne nukleárny, čo je označené značením DAPI. C. Myši dostávali bilaterálne HSV injekcie do NAc, po ktorých nasledovali denné IP injekcie podprahových dávok kokaínu (7.5 mg / kg). Lokomotorické reakcie sú zobrazené ako odpoveď na prvú a poslednú z 3 denných dávok lieku. Nadexpresia PSMC5 alebo PSMC5-K196M zvyšuje lokomočné reakcie na opakovaný kokaín, čo sa pri PSMC5-ACC nepozoruje. Nezistil sa žiadny signifikantný účinok transgénov na lokomočné reakcie na počiatočné dávky kokaínu. ANOVA F (3,125 4.163) = 0.05, * p <XNUMX podľa Dunnettovho posthoc testu.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Diskusia

Výsledky tejto štúdie odhaľujú nový mechanizmus, ktorým AFOS sprostredkuje jeho účinky na mozog a nový mechanizmus zapojený do pôsobenia kokaínu. Použitím nezaujatého prístupu, kvasinkového dvojhybridného testu, sme identifikovali PSMC5 ako nového väzobného partnera pre AFosB. Tento nález sme potvrdili tak v kultivovaných bunkách in vitro, ako aj v NAc in vivo demonštrovaním robustnej väzby PSMC5-AFOSB. Dôležité je, že jadrové hladiny PSMC5 sú indukované v NAc chronickým podávaním kokaínu. Ďalej sme ukázali, že väzba PSMC5-AFOSB nastáva v zhode s niekoľkými ďalšími transkripčnými aktivačnými proteínmi, konkrétne CBP a p300 (dva HAT) a BRG1 (kľúčová zložka remodelačných komplexov SWI-SNF chromatínu). Naše zistenia spoločne podporujú hypotézu, že PSMC5 je súčasťou transkripčného aktivačného komplexu, ktorý sa prijíma v priebehu chronického podávania kokaínu aspoň do určitých génov indukovaných FosB (Obr. 4E). V súlade s touto hypotézou je ďalšie zistenie, že nadmerná expresia PSMC5 v NAc, rovnako ako nadmerná expresia AFOS samotného, ​​podporuje behaviorálne reakcie na kokaín. V budúcich štúdiách by bolo zaujímavé sledovať tieto in vivo pozorovania charakterizáciou interakcií PSMC5-AFOSB-HAT-BRG1 pomocou reportérových testov in vitro.

Účasť PSMC5 na kokaínovom pôsobení je úplne nová. PSMC5, identifikovaný pôvodne ako člen veľkej rodiny ATPáz, ktoré obsahujú proteazóm, sa v priebehu rokov vzájomne ovplyvňuje s niekoľkými transkripčnými faktormi, vrátane c-Fos, p53, jadrových receptorov hormónov a zložiek bazálneho transkripčného komplexu [25], v priebehu rokov sa však vykonalo málo funkčných štúdií [26]. Jeho najlepším ustanoveným účinkom je podpora aktivity transkripčných faktorov MYC v kultivovaných bunkách [27]. Účasť PSMC5 v transkripčných mechanizmoch naznačila potenciálnu úlohu pre ubikvitinačno-proteazomálnu aktivitu pri regulácii génovej transkripcie, ale účasť PSMC5 na takejto regulácii je doteraz dosiaľ netestovaná [28,29].

O funkcii PSMC5 v mozgu je známe len veľmi málo. Predchádzajúca štúdia preukázala rozsiahlu expresiu mRNA PSMC5 v mozgu [30], ale jeho funkčná aktivita zostala nepotvrdená. Naše zistenia teraz podnecujú ďalšie skúmanie tohto zaujímavého proteínu, aby sa lepšie porozumelo jeho úlohe pri regulácii transkripcie génu a jeho vzťahu k ubikvitinácii-proteazomálnej funkcii v mozgu. Väzba PSMC5 na AFosB je sprostredkovaná doménou PSMC5-coiled-coil. Okrem toho schopnosť PSMC5 podporovať lokomotorické reakcie na kokaín, zatiaľ čo vyžaduje doménu so stočenou cievkou, nevyžaduje aktivitu ATPázy, ktorá je vnútorná pre proteín. Tieto výsledky zvyšujú možnosť, že aspoň v našom systéme môže byť hlavná aktivita PSMC5 sprostredkovaná väzbou na AFos a ďalšie transkripčné regulačné proteíny, a nie prostredníctvom svojej proteazomálnej aktivity ako takej. Na priame testovanie tohto a alternatívnych možností je potrebná ďalšia práca. Hypotéza, že vírusom sprostredkovaná nadmerná expresia PSMC5 zvýšila lokomotorické odpovede na kokaín prostredníctvom interakcií s AFOSB, je reálna, napriek použitiu denného režimu liečby kokaínom 3, pretože je známe, že v tomto časovom rámci sa akumulujú značné hladiny AFOSB v mozgu [3].

Tieto zistenia ďalej zdôvodňujú užitočnosť použitia nezaujatých, otvorených experimentálnych prístupov pri štúdiu molekulárnej základne regulácie mozgu. Naša počiatočná pozornosť na PSMC5 bola založená výlučne na jeho prominentnej väzbe na AFosB v kvasinkovom dvojhybridnom teste, zdá sa však, že je dôležitou súčasťou transkripčných zmien, ktoré sa získavajú v NAc opakovaným podávaním kokaínu. Súčasné výskumy sa zameriavajú na lepšie pochopenie podrobných mechanizmov, ktorými sú kokaínmi indukované jadrové hladiny PSMC5, a tým aj PSMC5 potom prispieva k kokaínom indukovaným komplexom transkripčnej aktivácie. Medzitým náš kvasinkový dvojhybridný test odhalil niekoľko ďalších predpokladaných väzobných partnerov ΔFosB (Tabuľka 1), ktoré teraz zaručujú priame preskúmanie v modeloch kokaínu. Spoločne táto práca prispieva k zvýšenému porozumeniu komplexných molekulárnych mechanizmov, prostredníctvom ktorých kokaín mení funkciu NAc.

Poďakovanie

Túto prácu podporili granty Národného inštitútu pre zneužívanie drog a Nadácie Ishibashi a Japonskej spoločnosti na podporu vedy (čísla KAKENHI: 24591735, 26290064, 25116010).

Príspevky od autorov

Koncipované a navrhnuté experimenty: YHO YNO EJN. Vykonané experimenty: YHO YNO PJK RN. Analyzované údaje: YHO YNO EJN. Prispievané činidlá / materiály / analytické nástroje: TN MO OY AN RN TT. Napísal článok: YHO EJN.

Referencie

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Okamžité gény: o desať rokov neskôr. Trendy Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripčné mechanizmy závislosti: úloha deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. PMID: 18640924
  3. Zobraziť článok
  4. PubMed / NCBI
  5. Študovňa Google
  6. Zobraziť článok
  7. PubMed / NCBI
  8. Študovňa Google
  9. Zobraziť článok
  10. PubMed / NCBI
  11. Študovňa Google
  12. Zobraziť článok
  13. PubMed / NCBI
  14. Študovňa Google
  15. Zobraziť článok
  16. PubMed / NCBI
  17. Študovňa Google
  18. Zobraziť článok
  19. PubMed / NCBI
  20. Študovňa Google
  21. Zobraziť článok
  22. PubMed / NCBI
  23. Študovňa Google
  24. Zobraziť článok
  25. PubMed / NCBI
  26. Študovňa Google
  27. Zobraziť článok
  28. PubMed / NCBI
  29. Študovňa Google
  30. Zobraziť článok
  31. PubMed / NCBI
  32. Študovňa Google
  33. Zobraziť článok
  34. PubMed / NCBI
  35. Študovňa Google
  36. Zobraziť článok
  37. PubMed / NCBI
  38. Študovňa Google
  39. Zobraziť článok
  40. PubMed / NCBI
  41. Študovňa Google
  42. Zobraziť článok
  43. PubMed / NCBI
  44. Študovňa Google
  45. Zobraziť článok
  46. PubMed / NCBI
  47. Študovňa Google
  48. Zobraziť článok
  49. PubMed / NCBI
  50. Študovňa Google
  51. Zobraziť článok
  52. PubMed / NCBI
  53. Študovňa Google
  54. Zobraziť článok
  55. PubMed / NCBI
  56. Študovňa Google
  57. Zobraziť článok
  58. PubMed / NCBI
  59. Študovňa Google
  60. Zobraziť článok
  61. PubMed / NCBI
  62. Študovňa Google
  63. Zobraziť článok
  64. PubMed / NCBI
  65. Študovňa Google
  66. Zobraziť článok
  67. PubMed / NCBI
  68. Študovňa Google
  69. Zobraziť článok
  70. PubMed / NCBI
  71. Študovňa Google
  72. Zobraziť článok
  73. PubMed / NCBI
  74. Študovňa Google
  75. Zobraziť článok
  76. PubMed / NCBI
  77. Študovňa Google
  78. Zobraziť článok
  79. PubMed / NCBI
  80. Študovňa Google
  81. Zobraziť článok
  82. PubMed / NCBI
  83. Študovňa Google
  84. Zobraziť článok
  85. PubMed / NCBI
  86. Študovňa Google
  87. Zobraziť článok
  88. PubMed / NCBI
  89. Študovňa Google
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, a kol. (1994) Indukcia dlhodobého komplexu AP-1 zloženého zo zmenených proteínov podobných Fos v mozgu pomocou chronického kokaínu a iných chronických ošetrení. Neuron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutantné myši: Strata chronickej kokaínovej indukcie proteínov súvisiacich s Fos a zvýšená citlivosť na psychomotorické a obohacujúce účinky kokaínu. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulácia stability AFos fosforyláciou. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, a kol. (2007) Absencia konzervovanej degronovej domény C-konca prispieva k jedinečnej stabilite AFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. PMID: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, a kol. (2013) Behaviorálne a štrukturálne reakcie na chronický kokaín si vyžadujú spätnú väzbu zahŕňajúcu AfosB a CaMKII v jadre accumbens. J Neurosci 33: 4295 – 4307 doi: 10.1523 / JNEUROSCI.5192-12.2013. PMID: 23467346
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L., Beckmann AM, a kol. (1999) Expresia transkripčného faktoru AFosB v mozgu riadi citlivosť na kokaín. Príroda 401: 272 – 276. PMID: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB zvyšuje motiváciu pre kokaín. J Neurosci 23: 2488 – 2493. PMID: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulácia génovej expresie a kokaínovej odmeny pomocou CREB a DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, a kol. (2006) ΔFosB: Podstatná úloha ΔFosB v jadre accumbens pri morfínovom pôsobení. Nature Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, a kol. (2003) Indukovateľná expresia dominantného negatívneho mutanta c-Jun v mozgovej oblasti u transgénnych myší znižuje citlivosť na kokaín. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, a kol. (1995) Regulácia delta FosB a proteínov podobných FosB pomocou elektrokonvulzívnej liečby záchvatov a kokaínu. Mol Pharmacol 48: 880 – 889. PMID: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, YeH, Saudou F, Vaidya VA, a kol. (1998) Základná úloha génu fosB pri molekulárnych, bunkových a behaviorálnych akciách elektrokonvulzívnych záchvatov. J Neurosci 18: 6952 – 6962. PMID: 9712664
  102. 15. Parkinsonizmus MPTP Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP je sprevádzaný pretrvávajúcou expresiou proteínu podobného D-FosB v dopaminergných dráhach. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Premena eukaryotického transkripčného inhibítora na aktivátor. Bunka 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Dvojhybridný systém: metóda na identifikáciu a klonovanie génov pre proteíny, ktoré interagujú s požadovaným proteínom. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferatívna aktivácia pokojných buniek Rat-1A pomocou delta FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. PMID: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, a kol. (2014) Zásadná úloha poly (ADP-ribozylovej) zlúčeniny pri kokaínovom pôsobení. Proc Natl Acad Sci USA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. PMID: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S., a kol. (2008) Odlišné vzorce indukcie AFosB v mozgu pomocou drog zneužívajúcich. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. PMID: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Cicavčí Sug1 a c-Fos v proteazóme jadrového 26S. Proc Natl Acad Sci USA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, a kol. (2008) Regulácia acetylácie na proximálnom promótore komplexu histokompatibility triedy II proximálnym promótorom 19S proteazomálnej ATPázy Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. PMID: 18662994
  110. 23. Levín AA, Guan Z, Barco A, XuS, Kandel ER, Schwartz JH (2005) proteín viažuci CREB kontroluje reakciu na kokaín acetyláciou histónov na promótori fosB v myšom striate. Proc Natl Acad Sci USA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, a kol. (2005) Prestavba chromatínu je kľúčovým mechanizmom, ktorý je základom plasticity vyvolanej kokaínom v striatu. Neuron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Duálne funkcie pre transkripčné regulátory: mýtus alebo realita. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Interakcie regulačných podjednotiek proteazómu 26S, komplexný problém. Trendy Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr, Johansson S., Larson LG (2003). Implikácia systému ubiquitín / proteazóm v transkripcii regulovanej myc. Bunkový cyklus 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubikvitín a proteazómy v transkripcii. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochemický-052110-120012. PMID: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteazóm: užitočný nástroj na prepis? Curr Op Genet Dev 16: 197 – 202. PMID: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifikácia fylogeneticky konzervovaného člena rodiny Sug1 CAD, ktorý je rozdielne exprimovaný v myšom nervovom systéme. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5