Regulácia stability DeltaFosB fosforyláciou (2006)

J Neurosci. 2006 May 10;26(19):5131-42.

Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ.

zdroj

Katedra psychiatrie, Centrum pre základné neurovedy, University of Texas Southwestern Medical Center, Dallas, Texas 75390-9070, USA.

abstraktné

Transkripčný faktor DeltaFosB (tiež označovaný ako FosB2 alebo FosB [krátka forma]) je dôležitým mediátorom dlhodobej plasticity indukovanej v mozgu chronickým vystavením viacerým typom psychoaktívnych podnetov, vrátane drog zneužívania, stresu a elektrokonvulzívnych záchvatov , Odlišným znakom DeltaFosB je, že keď je raz indukovaný, pretrváva v mozgu relatívne dlhý čas v neprítomnosti ďalšej stimulácie. Mechanizmy, ktoré sú základom tejto zjavnej stability, však zostali neznáme. Tu demonštrujeme, že DeltaFosB je relatívne stabilný transkripčný faktor s polčasom približne 10 h v bunkovej kultúre. Ďalej sme ukázali, že DeltaFosB je fosfoproteín v mozgu a že fosforylácia vysoko konzervovaného serínového zvyšku (Ser27) v DeltaFosB ho chráni pred degradáciou proteazómov. Poskytujeme niekoľko línií dôkazov, ktoré naznačujú, že táto fosforylácia je sprostredkovaná kazeínkinázou 2. Tieto zistenia predstavujú prvý dôkaz, že DeltaFosB je fosforylovaný a dokazujú, že fosforylácia prispieva k jeho stabilite, ktorá je jadrom jeho schopnosti sprostredkovať dlhodobé adaptácie v mozgu.

úvod

Transkripčný faktor AFosB, označovaný tiež ako FosB2 alebo FosB [krátka forma], je variantom zostrihu zostrihu C-konca s okamžitým skorým génom fosb (Dobrazanski a kol., 1991; Nakabeppu a Nathans, 1991; Yen a kol., 1991). Podobne ako FosB s plnou dĺžkou, AFosB má DNA-väzbovú bázickú doménu a leucínový zips, cez ktorý dimerizuje s proteínmi Jun na vytvorenie aktivátora proteínového komplexu 1 (AP-1), ktorý reguluje expresiu mnohých génov (Morgan a Curran, 1995; Rylski a Kaczmarek, 2004). Napriek tomu, že chýba časť transaktivačnej domény nachádzajúcej sa na C-konci FosB, AFosB funguje ako silný aktivátor transkripcie a represor v kultivovaných bunkách av mozgu (Dobrazanski a kol., 1991; Nakabeppu a Nathans, 1991; Chen a kol., 1997; McClung a Nestler, 2003; Kumar a kol., 2005).

ΔFosB je indukovaný na vysoké hladiny spôsobom špecifickým pre daný región v mozgu po chronickej, ale nie akútnej expozícii rôznym psychoaktívnym stimulom, vrátane stresu, určitých lézií, antipsychotických a antidepresívnych liekov, drog zneužívania a prirodzených odmien. (Hope a kol., 1994b; Hiroi a Graybiel, 1996; Moratalla a kol., 1996; Bing a kol., 1997; Mandelzys a kol., 1997; Kelz a kol., 1999; Werme a spol., 2002; Andersson a kol., 2003; Colby a kol., 2003; Peakman a kol., 2003; Perrotti a kol., 2004; Zachariou a kol., 2006). Indukcia AFosB súvisí priamo s funkčnými účinkami niekoľkých týchto stimulov na mozog. Pretrvávanie AFosB aj v neprítomnosti dodatočnej stimulácie ho odlišuje od všetkých ostatných transkripčných faktorov rodiny Fos, ktoré sú rýchlo indukované v reakcii na akútne stimuly, rozkladajú sa späť na bazálne hladiny v priebehu niekoľkých hodín a všeobecne vykazujú desenzibilizáciu po chronickej stimulácii (Hope a kol., 1992; Daunais a kol., 1993; Persico a kol., 1993; Hiroi a Graybiel, 1996; Perrotti a kol., 2004). To robí AFosB atraktívnym kandidátom na sprostredkovanie niektorých dlhodobých zmien v génovej expresii, ktoré sú základom stabilných neuronálnych adaptácií spôsobených určitými chronickými stimulmi.

Pretože k predĺženej prítomnosti AFosB dochádza v neprítomnosti ďalšej indukcie jeho mRNA (Chen a kol., 1995) sme špekulovali, že na rozdiel od FosB plnej dĺžky a všetkých ostatných proteínov rodiny Fos, ktoré sú vnútorne nestabilné, môže byť AFosB neobvykle stabilným transkripčným faktorom (Hope a kol., 1994b; Chen a kol., 1997; Nestler a kol., 2001; McClung a kol., 2004). Okrem toho, imunoblotová analýza mozgového tkaniva akútneho versus chronického stimulovania naznačila, že AFosB sa posunie vo Mr (molekulová hmotnosť) od N33 kDa v akútnom stave k ∼35 – 37 kDa počas chronickej liečby (Hope a kol., 1994a; Chen a kol., 1995). Pretože neexistuje žiadny dôkaz o existencii ďalších mRNA, ktoré by mohli kódovať tieto rôzne izoformy, ďalej sme špekulovali, že AFosB je posttranslačne modifikovaný a že to možno prispieva k jeho nezvyčajnej stabilite. Doteraz však neboli publikované žiadne biochemické analýzy obratu alebo posttranslačných modifikácií AFosB. Cieľom tejto štúdie bolo stanoviť, či AFosB je fosfoproteín a či fosforylácia hrá úlohu v jeho stabilite.

Predchádzajúca sekciaĎalšia časť

Materiály a metódy

Cicavčie bunkové línie a DNA konštrukty.

Bunky PC12 (Clontech, Mountainview, CA) sa kultivovali v DMEM s vysokým obsahom glukózy obsahujúcom 1-glutamín (L-Gln) a doplnili sa o 5% fetálne bovinné sérum (FBS), konské sérum 10% (obe od Invitrogen, Carlsbad, CA). 100 U / ml penicilínu a 100 μg / ml streptomycínu (obidva od Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Bunky HeLa (American Type Culture Collection, Manassas, VA) sa kultivovali v DMEM s vysokým obsahom glukózy, ktorý obsahoval L-Gin a doplnili sa o 10% FBS, penicilín a streptomycín. Obidve bunkové línie boli udržiavané pri 37 ° C vo vlhkom 5% CO2 atmosféra.

Pre prechodné transfekcie s DNA boli bunky PC12 alebo HeLa naočkované na šesťjamkové doštičky (potiahnuté kolagénom I pre bunky PC12) tak, aby bol nasledujúci deň dosiahnutý konfluenčný účinok 90-100% a potom boli transfekované pomocou Lipofectamine 2000 (Invitrogen). V niektorých experimentoch (pozri Obr. 1-7), AFosB bol prechodne exprimovaný v bunkách PC12 prostredníctvom infekcie rekombinantným vírusom herpes simplex (HSV).

CDNA z AFosB a FosB boli získané z vlastných konštruktov pTetop (Chen a kol., 1997) a subklonovaný do pcDNA3.1 vektora (Invitrogen). Tieto konštrukty pcDNA3.1-AFosB / FosB sa použili na expresiu v cicavčích bunkách a ako templát pre miestne riadenú mutagenézu. Rekombinantný HSV-AFosB bol pripravený ako bolo opísané vyššie (Neve a kol., 1997) a prípravok mal titer XXUMXX18 PFU / ml.

Experimenty s pulznou cházou.

Približne 24 h po infekcii / transfekcii sa bunky (PC12 alebo HeLa) na doštičkách so šiestimi jamkami premyli dvakrát až trikrát s 2 ml PBS a inkubovali sa pri 37 ° C v x1 h v 2 ml Cys / Met-free DMEM (Invitrogen) doplnený 5% dialyzovaným FBS (Hyclone, Logan, UT) na depléciu intracelulárnych skupín Met a Cys. Na konci tohto obdobia „hladovania“ sa pridali lieky (ak sa bunky mali liečiť) a bunky sa označili (pulz) pomocou 12 – 25 μCi 35S proteínový značkovací mix (PerkinElmerWellesley, MA) pre -1 h pri 37 ° C na označenie všetkých novo syntetizovaných proteínov. Rádioaktívna značka sa potom odstránila premytím buniek dvakrát až trikrát s 2 ml PBS a 35Proteíny značené S sa sledovali (chase) nahradením média "studeným" (neradioaktívnym) médiom doplneným 5% FBS a zberom buniek v rôznych časových bodoch. Ošetrenia buniek sa udržiavali v priebehu prenasledovania. Všetky obrázky týchto experimentov ukazujú podobné počiatočné množstvá rôznych proteínov na optimalizáciu porovnania ich rýchlosti obratu.

Zvieratá a chronická elektrokonvulzívna liečba záchvatov.

Dospelé samce potkanov Sprague Dawley (200 – 300 g; Charles River Laboratories, Kingston, RI) sa liečili raz denne elektrokonvulzívnymi záchvatmi (ECS) pre 7 – 9 d. ECS sa uskutočnilo, ako je opísané vyššie (Hope a kol., 1994a) pomocou Ugo Basile (Comerio VA, Taliansko) Jednotka ECS s nasledujúcimi nastaveniami: frekvencia, 100 impulzy / s; pulz s, 0.5 ms; trvanie šoku, 1.0 s; a prúd, 75 mA. Zvieratá s falošnou kontrolou boli paralelne ošetrené aplikáciou elektród do ucha bez elektrického prúdu.

32 P metabolické značenie.

Na značenie rezov mozgu sa potkany dekapitovali, mozgy sa rýchlo rozrezali a pripravili sa predné kortikálne rezy 300 μm s DSK mikroskopom (Ted Pella, Redding, CA). Rezy sa inkubovali v plastových skúmavkách v 2 ml umelého CSF ​​(ACSF) s fosfátovým deficitom a udržovali pri 30 ° C za konštantného jemného prebublávania O.2/ CO2 zmes (Hemmings a kol., 1989). Rezy (dva rezy na skúmavku) boli označené 1.3 mCi pre 8 – 10 h v prítomnosti alebo neprítomnosti kyseliny okadaovej (100 ng / ml). Na konci tejto inkubácie sa rezy prepláchli aspoň trikrát studeným ACSF a potom sa homogenizovali sonikáciou v 250 μl tlmivého roztoku studeného rádioimunoprecipitačného testu (RIPA) [PBS, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1% (v / v ) Igepal, 0.5% (hmotn./obj.) Deoxycholát sodný, 0.1% (hmotn./obj.) SDS, 1 mm EDTA] doplnený pred použitím s SDS až 0.6%, kokteil inhibítora proteáz pre bunky cicavcov (použitý pri 5 μl / ml; Sigma-Aldrich), koktaily inhibítora fosfatázy I a II (používané pri 1: 100; Sigma-Aldrich), 1 mm PMSF a 2% glycerol. Homogenáty sa potom varili pre 15 min a vyčistili centrifugáciou pri 15,000 × g pre 15 min. Koncentrácia proteínu vo výsledných supernatantoch bola hodnotená pomocou BCA proteínového testu (Pierce, Holmdel, NJ).

Pre 32P značenie kultivovaných buniek, ∼24 h po infekcii / transfekcii, boli bunky dvakrát až trikrát premyté médiom bez fosfátov a inkubované v tomto médiu pre x1 h. Po tomto období hladovania, 0.2 – 0.3 mCi z 32PH3PO4 (PerkinElmer) boli pridané do každej jamky a bunky boli označené pre 4-12 h v závislosti od druhu experimentu (pozri obrázky 1 – 7 pre špecifikácie). Bunky sa potom trikrát premyli s PBS a lyzovali sa na lade pre 15 min s 50 μl doplneného RIPA pufra. Lyzáty sa zozbierali zoškrabaním a prešli 10 krát cez ihlu 25 ga na strihanie DNA, varili sa na 10 min a centrifugovali pri 15,000 rpm pre 15-30 min pri 4 ° C. Vyčistené lyzáty (supernatanty) sa preniesli do novej skúmavky a uskutočnil sa BCA proteínový test (Pierce). Všetky obrázky týchto experimentov ukazujú podobné množstvá proteínov divokého typu (WT) a S27A AFosB na optimalizáciu porovnania ich relatívnych hladín fosforylácie.

Chemikálie a ošetrenie bunkovej kultúry.

Kyselina okadaová (OA; Sigma-Aldrich) bola rozpustená v etanole a použitá v konečnej koncentrácii 100 ng / ml. 5,6-dichlór-1-p-d-ribofuranozylbenzimidazol (DRB; Biomol, Plymouth Meeting, PA) bol rozpustený v dimetylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich) a použitý v bunkovej kultúre pri konečnej koncentrácii 50 μm. Spermín (Sigma-Aldrich) sa rozpustí vo vode a použije sa v konečnej koncentrácii 200 μm. Calphostin-C (Biomol) bol rozpustený v DMSO a použitý v 0.2 μm, zatiaľ čo forbol 12-myristát 13-acetát (PMA; Promega, Madison, WI) bol rozpustený v DMSO a použitý v 0.1 μm. myristoylovaný autocamtid-2-inhibičný peptid (m-AIP; Biomol) sa rozpustil vo vode a použil v konečnej koncentrácii 1 a 10 μm. Širokospektrálne inhibítory proteínkinázy H-7 a H-8 (Biomol) sa rozpustili vo vode a použili pri konečnej koncentrácii 150 a 200 μm. MG132 (Calbiochem, San Diego, CA) a epoxomicín (Peptides International, Louisville, KY) boli rozpustené v DMSO a použité v konečnej koncentrácii 12.5 a 7.5 μm. Vo všetkých experimentoch sa k bunkám pridal DMSO (vehikulum) podľa potreby na udržanie konštantného množstva DMSO naprieč ošetreniami. pre 32Experimenty značenia P, liečivá sa pridali bezprostredne pred značku a uchovávali sa po zvyšok obdobia označovania. V prípade experimentov s pulzným chasom sa pridali lieky v čase Cys / Met „hladovania“, ktoré sa udržiavalo počas obdobia označovania, a potom sa pridali späť do chase média. Inhibítory proteazómu boli obohatené každým 3-4 h v priebehu naháňania, aby sa kompenzoval rýchly obrat týchto peptidov.

AFosB imunoprecipitácia, imunoblotovanie a autorádiografia.

Pre imunoprecipitácie sa lyzáty zriedili 1: 5 s obyčajným RIPA, aby sa koncentrácia SDS znížila na 0.1% pred pokračovaním imunoprecipitácie (IP). Aby sa obmedzila nešpecifická väzba, lyzáty sa najskôr odstránili imunoprecipitáciou s neimunitným IgG a proteín G-Sepharose (Sigma-Aldrich) počas aspoň 4 h. AFosB sa potom imunoprecipitoval z vyčistených lyzátov s použitím kozej polyklonálnej protilátky, ktorá rozpoznáva vnútorný epitop prítomný v oboch FosB a AFosB (SC-48G; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) pri 0.5-1 μg IgG na 10 μg lyzátového proteínu (50 – 300 μg celkového proteínu) v celkovom objeme 0.5 ml. IPs sa jemne miešali pri 4 ° C na rotore počas aspoň 8 h a potom sa pridalo 15 μl proteín G-Sepharose a IPs sa zmiešali aspoň na ďalší 4 h. IP boli peletované rotáciou pri 3000 × g pri 3 – 5 min pri 4 ° C, trikrát prepláchnite 0.5 ml studenej čistej RIPA a dvakrát studeným PBS obsahujúcim 0.1% Tween 20. IPs sa potom resuspendovali v 0.5 ml studeného PBS, preniesli, peletovali v novej skúmavke a imunoprecipitované proteíny sa potom eluovali pridaním 15-25 μl 2 × redukčného vzorkového pufra Laemmli redukujúceho proteínu. Výsledkom tohto protokolu IP bolo špecifické a účinné vyzrážanie prakticky všetkých AFosB v lyzáte. Imunoprecipitované proteíny sa podrobili SDS-PAGE nanesením celej IP na gél 12.5% Tris-HCl Criterion (Bio-Rad, Hercules, CA) a potom sa preniesli na PVDF alebo nitrocelulózu. Po prenose sa membrána vysušila na vzduchu a 32P- a 35S-rádioaktívne značené proteínové pásy boli pozorované autorádiografiou s použitím autorádiografického filmu Kodak (Rochester, NY), ako aj fosforimaging použitím Storm (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) PhosphorImager. Celkový (nefosforylovaný a fosforylovaný) AFosB v bunkových lyzátoch alebo v mozgových homogenátoch sa detegoval imunoblotovaním buď imunoprecipitovaného proteínu (použitím rovnakej membrány použitej na detekciu 32P-značený proteín) alebo rovnakých množstiev proteínu lyzátu / homogenátu, ktorý bol podrobený SDS-PAGE a prenesený na PVDF alebo nitrocelulózu. Membrána bola najskôr blokovaná inkubáciou s 1% (hmotn./obj.) Suchým mliekom bez tuku (Bio-Rad) v PBS doplnenom 0.1% (obj./obj.) Tween 20 (Sigma) pre 1 h pri 25 ° C. Membrána bola potom imunoblotovaná cez noc pri 4 ° C s našou vlastnou polyklonálnou protilátkou proti králikovi FosB, vytvorenou proti aminokyselinám 1-16 FosB / AFosB (použitá v 1: 10,000). Po primárnej inkubácii sa membrány premyli štyrikrát pre 5 min blokujúcim pufrom a potom sa inkubovali pri 25 ° C po dobu XXUMX h s kozou anti-králičou IgG konjugovanou s chrenovou peroxidázou (používanou v 1: 1 v blokujúcom pufri, od Vector Laboratories, Burlingame, CA). Membrány sa potom trikrát premyli s 5000 min blokujúcim pufrom a raz s 10 min s PBS. Celkové pruhy proteínu AFosB boli vizualizované na film Kodak MR zosilnenou chemiluminiscenciou (Pierce) a / alebo detekciou fluorescencie s použitím reagentov ECL-Plus (Amersham Biosciences) a Storm PhosphorImager.

Nadmerná expresia a purifikácia rekombinantného AFosB z hmyzích buniek.

AFosB bol nadmerne exprimovaný v hmyzích bunkách Sf9 ako N-terminálny hexa-His-značený proteín (N-His (6) AFosB) s použitím Bac-to-Bac bakulovírusového expresného systému (Invitrogen) a podľa inštrukcií výrobcu. Stručne povedané, cDNA FosB (zvyšky 2-237), pred ktorými je afinitná N-koncová značka MGHHHHHHAG, bola subklonovaná vo vektore pFASTBacTM1, ktorý bol použitý na vytvorenie rekombinantného bakulovírusu. Bunky Sf9 boli infikované rekombinantným vírusom a N-His (6) AFosB bol purifikovaný z bunkových lyzátov niekoľkými chromatografickými krokmi vrátane afinitnej chromatografie s použitím niklovej kolóny (Qiagen, Valencia, CA), výmeny aniónov s použitím kolóny mono-Q (Amersham Biosciences) a vylučovanie pomocou gélovej filtračnej kolóny (Amersham Biosciences).

In vitro štúdie fosforylácie.

In vitro fosforylačné reakcie pre časový priebeh a stechiometrickú analýzu sa uskutočnili v objeme 30 μl obsahujúceho substrát 10 μm (N-His (6) AFosB alebo pozitívny kontrolný substrát), 250 μm ATP a 1 μCi / μl [y-32P] ATP, tlmivý roztok dodávaný výrobcom kinázy a jednu z nasledujúcich kináz: CK2 (20 ng / ul; Upstate, Charlottesville, VA), CaMKII (10 ng / ul; Upstate), PKC (1.6 ng / ul; Calbiochem) alebo p70S6K (2.5 mU / ul; Upstate). Reakcie s časovým priebehom sa uskutočnili odstránením alikvotných podielov 5 μl z reakčného roztoku v určených časových bodoch a pridaním rovnakého objemu 4x redukujúceho Laemmli proteínového vzorkového pufra. Kinetické parametre Michaelis-Mentenovej reakcie pre CK2 reakciu boli stanovené za empiricky definovaných podmienok lineárneho rovnovážneho stavu. Tieto reakcie sa vykonali pre 15 min v objeme 10 μl obsahujúcom enzým 2 ng / μl, 250 μm ATP, 1 μCi / μl [γ-32P] ATP a koncentrácie N-His (6) AFosB v rozsahu od 2.5 – 30 μm. Všetky reakcie sa uskutočnili pri 30 ° C vo vodnom kúpeli. Po SDS-PAGE a vyfarbení gélu s Bio-Safe Coomassie (Bio-Rad) bol gél vysušený a 32Inkorporácia P-fosfátu bola hodnotená fosforimulačnou analýzou (pozri nižšie, Kvantifikácia dát, výpočty a štatistiky).

Dvojrozmerná mapa fosfopeptidov a analýza fosfoaminokyselín.

Obe tieto analýzy boli uskutočnené tak, ako je opísané v publikácii Ploegh a Dunn (2000), Stručne, suché gélové fragmenty obsahujúce 32P-značený AFosB (buď z in vitro reakcie alebo z imunoprecipitátov metabolicky značených buniek), boli vyrezané, rehydratované, premyté a podrobené tryptickému štiepeniu. Supernatant obsahujúci produkty tryptického štiepenia bol lyofilizovaný a lyofilizát bol niekoľkokrát premytý a resuspendovaný v 10 ul elektroforetického pufra, pH 1.9. Vzorka (3 μl) sa nanesie na doštičku s tenkovrstvovou chromatografiou na tenkej vrstve (TLC) (Analtech, Newark, DE) a oddelí sa v jednej dimenzii elektroforézou a iným rozmerom vzostupnou TLC. Výsledné fosfopeptidové mapy boli vizualizované autorádiografiou a fosforimagingom. Na analýzu fosfoaminokyselín sa 2 μl tryptických digestov, ktoré boli resuspendované v elektroforetickom pufri, ďalej štiepi hydrolýzou HCl pri 105 ° C pre 25 min.2 atmosféra. Reakcia bola zastavená šesťnásobným zriedením vo vode a zmes bola lyofilizovaná. Lyofilizát bol resuspendovaný v 5 μl elektroforetického pufra, pH 1.9, a nanesený na TLC platničku celulózy spolu s fosfo-Ser, -Thr a -Tyr štandardmi. Elektroforéza sa uskutočňovala cez jednu polovicu dĺžky TLC platne s použitím elektroforézneho pufra, pH 1.9, a potom sa platňa preniesla do pufra pH 3.5 a dokončila sa elektroforéza. Štandardy fosfoaminokyselín sa vizualizovali postrekom TLC platne roztokom 1% (obj./obj.) Ninhydrínu v acetóne a 32Vzorky aminokyselín značené P boli vizualizované autorádiografiou a fosforimagingom.

knock-down CK2α indukovaný siRNA.

Použili sme metódu RNA interferencie na selektívne potlačenie hladín CK2 (Di Maira a kol., 2005). Bunky PC12 boli naočkované na 6-jamkové doštičky potiahnuté kolagénom, aby bol nasledujúci deň dosiahnutý ∼70-80% konfluencie, keď boli prechodne transfekované s 20 nm (konečná koncentrácia) buď necieľujúcej siRNA alebo siRNA nasmerovanej na mRNA katalytického a podjednotka krysy CK2, s použitím 5 μl transfekčného činidla SilentFectin (Bio-Rad) a podľa inštrukcií výrobcu. Približne 24 h neskôr boli bunky prechodne transfekované plazmidom AFosB, ako je uvedené vyššie. Približne 24 h neskôr (-48 h po transfekcii siRNA) sa bunky podrobili buď 32P metabolické značenie alebo pulzno-chase analýza, ako je opísané vyššie. Nasledujúce štyri CK2α siRNA boli použité s podobnými výsledkami: 5'P-CAAACUAUAAUCGUACAUCUU3 ', 5'P-UCAAUCAU-GACAUUAUGCGUU3', 5'P-UAGUCAUAUAAAUCUUCCGUU3 ', 5'P-AAAUCCCUG ACAUCAUAUUUU3 "(Dharmacon, Lafayette, CO). Ako negatívna kontrola sme použili tlmič negatívna kontrola #3 siRNA od Ambion (Austin, TX). Rozsah CK2 knock-down bol monitorovaný imunoblotovaním s použitím anti-CK2 polyklonálnej protilátky (katalóg # 06-873 od firmy Upstate) cez noc pri riedení 1: 1000. P-tubulín sa použil ako kontrola plnenia a detegoval sa s monoklonálnou protilátkou (katalóg # 05-661 od firmy Upstate) cez noc pri zriedení 1: 20,000.

Miestne riadená mutagenéza.

Mutácia Ser27 na Ala alebo na Asp bola uskutočnená s použitím súpravy Quick Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA) a podľa inštrukcií výrobcu. Na zavedenie mutácií Ser27 do myšieho proteínu AFosB sa použili nasledujúce priméry mutagenézy. Ser27 na Ala: (reverzný primér) 5®GCCGAAGGAGTCCACCGAAGCCAGGTACTGAGACTCGGCGGAGGG3 ". Ser27 až Asp (predný primér) 5′CCCTCCGCCGAGTCTCAGTACCTGGATTCGGTGGACTCCTTCGGC3 ". Mutované bázy sú vyznačené hrubo a kodón Ser27 je kurzívou.

Bioinformatika.

Potenciálne fosforylačné miesta a kinázy pre AFosB boli prehľadávané predložením sekvencie myšieho proteínu špecializovaným databázam vrátane ProSite (http://www.expasy.org/prosite/), PredictProtein (Rost a kol., 2004) a NetPhosK (Blom a kol., 2004).

Kvantifikácia dát, výpočty a štatistiky.

Množstvo proteínu prítomného v PVDF alebo nitrocelulózovej membráne sa kvantifikovalo použitím Storm PhosphorImager a sprievodného ImageQuant softvéru (Amersham Biosciences / Molecular Dynamics). V štúdiách bunkovej kultúry a fosforylácie rezov v mozgu boli získané hodnoty pre. \ T 32P-značený proteín bol potom vydelený hodnotami získanými pre celkový AFosB a vyjadrený ako pomer. V in vitro štúdie fosforylácie, množstvo. \ t 32P-značený AFosB na mól AFosB (stechiometria) bol vypočítaný ako bolo opísané vyššie (Sahin a kol., 2004). Všetky merania boli uskutočnené v rozsahu linearity použitého prístroja. Kinetické parametre boli vypočítané s použitím Michaelis-Mentenovho modelu, pričom V = Vmax[S] / ([S]+KM) a Vmax = k2[ESpolu]. Polčas rozpadu (\ tt1/2) AFosB a FosB boli stanovené z grafov pulznej cházy (s použitím nelineárnej regresie, ktorá najlepšie vyhovovala dátovým bodom) a zodpovedajú času, v ktorom množstvo zvyšného proteínu je 50% originálu. Na všetkých obrázkoch sú uvedené výsledky reprezentatívne pre najmenej dva až tri nezávislé experimenty. Vo všetkých grafoch sú uvedené údaje priemery ± SEM (3 ≤ n ≤16). Štatistická významnosť rozdielov bola hodnotená pomocou nepárového testu t korigované na viacnásobné porovnania a hviezdičky označujú p ≤ 0.05.

Predchádzajúca sekciaĎalšia časť

výsledky

AFosB je neobvykle stabilný transkripčný faktor

Hoci sme už skôr špekulovali, že AFosB je relatívne stabilný transkripčný faktor (Nestler a kol., 2001), zatiaľ nebola vykonaná priama analýza profilu obratu proteínu. Na vyriešenie tejto otázky sme uskutočnili experimenty pulz-chase s použitím buniek PC12, ktoré sa široko používali ako bunková línia podobná neurónu, v ktorej bol AFosB prechodne exprimovaný prostredníctvom infekcie rekombinantným vírusom herpes simplex (HSV-AFosB). Novo syntetizované proteíny boli metabolicky označené s 35S-Met / Cys a vzor degradácie 35S-značený AFosB (35S-AFosB) sa monitoroval imunoprecipitáciou z bunkových lyzátov získaných v rôznych časových bodoch po odstránení rádioaktívne označených aminokyselín. Analýza imunoprecipitátov pomocou SDS-PAGE a autorádiografie ukázala, že polčas rozpadu AFosB v bunkách PC12 je ∼10 h (Obr. 1). Tieto zistenia ukazujú, že polčas AFosB je vyšší ako polčas väčšiny indukovateľných transkripčných faktorov (pozri Diskusia), vrátane FosB s plnou dĺžkou, ktorého polčas v bunkovej kultúre bol ∼90 min (Dobrazanski a kol., 1991; Carle a kol. 2004). Okrem toho je potrebné poznamenať, že degradácia AFosB nezodpovedá prvej exponenciálnej krivke rozpadu, ale skôr je dvojfázová, začínajúca pomalšou rýchlosťou degradácie. To svedčí o existencii viac ako jedného druhu AFosB a / alebo viac ako jednej dráhy degradácie.

Obrázok 1.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 1.

AFosB je neobvykle stabilný transkripčný faktor. Polčas rozpadu AFosB je x10 h v bunkovej kultúre. AFosB bol exprimovaný v bunkách PC12 buď infekciou s HSV-AFosB alebo prechodnou transfekciou s plazmidom obsahujúcim AFosB a bunky boli podrobené pulzným experimentom, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Ekvivalentné výsledky sa získali bez ohľadu na spôsob použitý na nadmernú expresiu AFosB. Obrázok znázorňuje časový priebeh (a reprezentatívny autorádiogram) degradácie AFosB. Vynesené dáta sú priemerom ± SEM aspoň 15 jednotlivých dátových bodov získaných z najmenej piatich nezávislých experimentov. Na porovnanie je uvedený uvádzaný polčas FosB plnej dĺžky.

AFosB je fosfoproteín v mozgu

Predpokladali sme, že posttranslačná modifikácia AFosB môže prispieť k jej zdanlivej stabilite. Pretože sa ukázalo, že fosforylácia moduluje aktivitu transkripčných faktorov v mnohých smeroch, vrátane ich stability (pozri prehľad Desterro a kol., 2000; Whitmarsh a Davis, 2000) sme skúmali, či AFosB je fosfoproteín. Na tento účel bola expresia AFosB indukovaná v mozgu potkana použitím chronickej ECS, čo je liečba, o ktorej je známe, že indukuje vysoké hladiny AFosB, najmä v frontálnom kortexe (Hope a kol., 1994a). Jeden deň po poslednej liečbe ECS, keď hladiny AFosB zostávajú vysoké, sa pripravili tenké čelné kortikálne rezy a metabolicky sa označili 32P-ortofosfáty. Paralelná sada rezov nebola rádioaktívne označená a tieto boli použité na detekciu celkových hladín AFosB. Po imunoprecipitácii so špecifickou protilátkou proti FosB / AFosB a separáciou imunoprecipitovaných proteínov pomocou SDS-PAGE, fosforylovaných 32P-značený AFosB bol detegovaný autorádiografiou, zatiaľ čo celkový AFosB bol detegovaný imunoblotovaním. Táto analýza ukázala, že AFosB je fosforylovaný v mozgu, čo dokazuje špecifický 32Pás označený P-35 kDa prítomný v chronicky spracovaných vzorkách mozgu, ale je prakticky nedetegovateľný v kontrolách s falošnou liečbou (Obr. 2A). To je v súlade so skutočnosťou, že v neprítomnosti chronickej stimulácie sú bazálne hladiny AFosB veľmi nízke. Špecifickosť imunoprecipitačnej reakcie je ilustrovaná nedostatkom signálu v zrazenine neimunitného IgG.

Obrázok 2.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 2.

AFosB je fosfoproteín v mozgu. A, AFosB je fosforylovaný v mozgu. Endogénny AFosB bol indukovaný v mozgu potkana chronickou ECS liečbou, ako je opísané v časti Materiály a metódy. Čelné kortikálne rezy boli metabolicky označené 32PH3PO4 niekoľko hodín. Po homogenizácii rezov bol AFosB imunoprecipitovaný a fosforylovaný AFosB (32P-AFosB) bol detegovaný autorádiografiou (horný panel). Celkový AFosB v neradioaktívnych imunoprecipitátoch sa detegoval imunoblotovaním (spodný panel). Ako negatívne kontroly sú znázornené imunoprecipitáty zvieraťa, ktoré bolo podrobené simulovaniu, a nonimunitného IgG. BKandidátne fosforylačné miesta a kinázy so zodpovedajúcimi predikčnými skóre pre myšaciu sekvenciu proteínu AFosB boli získané bioinformatickou analýzou. Kandidátske miesta s vyššími predikčnými skóre sú zvýraznené v proteínovej sekvencii a sú uvedené v tabuľke. DNA-väzbová (bázická) doména a leucínový zips sú vyznačené tučným písmom v proteínovej sekvencii. C, DFosforylácia AFosB je zvýšená inhibítorom Ser / Thr fosfatázy OA. C, 32Hladiny P-AFosB v imunoprecipitátoch z frontálnych kortikálnych rezov označených v neprítomnosti (Ctr) alebo prítomnosti 100 ng / ml OA (graf a horný panel) boli detegované autorádiografiou. Spodný panel ukazuje celkové AFosB detegované v imunoprecipitátoch z neznačených rezov imunoblotovaním. DBunky PC12 boli infikované HSV-AFosB alebo HSV-LacZ (vektor) a metabolicky označené 32PH3PO4 v neprítomnosti (Ctr) alebo prítomnosti 100 ng / ml OA. 32Hladiny P-AFosB v imunoprecipitátoch boli detegované autorádiografiou (graf, horný panel). Spodný panel ukazuje celkový AFosB detegovaný v bunkových lyzátoch imunoblotovaním.

Ako prvý krok smerom k objasneniu, ktoré kinázy (kinázy) a miesto (miesta) sa podieľajú na fosforylácii AFosB, sme podrobili jeho aminokyselinovú sekvenciu niekoľkým bioinformatickým analýzam. To ukázalo, že aj keď AFosB neobsahuje žiadne kandidátne miesta fosforylácie Tyr, obsahuje niekoľko konsenzných miest Ser / Thr kinázy, vrátane troch miest CaMKII, troch miest CK2 a dvoch miest PKC s veľmi vysokým skóre predikcie fosforylácie (Obr. 2B). Ak, ako je predpovedané prostredníctvom bioinformatiky, AFosB je fosforylovaný iba na Ser alebo Thr zvyškoch, potom by jeho fosforylácia mala byť významne modulovaná aktivitou Ser / Thr fosfatáz. Na testovanie tejto hypotézy sme označili frontálne kortikálne rezy 32P-ortofosfát v prítomnosti alebo neprítomnosti OA, inhibítora Ser / Thr proteín fosfatázy. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 2C, OA spôsobila zvýšenie (-2.5-násobku) zvýšenie v 32P-ΔFosB. To tiež spôsobilo malé zvýšenie celkových hladín AFosB, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami spájajúcimi karcinogénne účinky OA s jeho schopnosťou indukovať niekoľko bezprostredných skorých génov vrátane proteínov Fos (Miller a kol., 1998; Choe a kol., 2004). Čistým výsledkom je významné celkové zvýšenie (-60%) vo fosforylovaných hladinách AFosB.

Potom sme skúmali, či v bunkách PC12, ktoré sú viac prístupné experimentálnej manipulácii, AFosB vykazoval fosforylačný profil podobný tomu, ktorý bol pozorovaný v mozgu. Exprimovali sme AFosB v bunkách PC12 prostredníctvom infekcie s HSV-AFosB a metabolicky označili bunky s 32P-ortofosfát v prítomnosti alebo neprítomnosti OA. Úspešná expresia a imunoprecipitácia proteínu z buniek infikovaných HSV-AFosB je preukázaná prítomnosťou oboch v imunoblote (Obr. 2Da spodný panel) a autorádiograf (horný panel) ∼35 kDa pásu, neprítomného v bunkách infikovaných vektorom. Ako bolo pozorované v mozgu, OA spôsobila malé zvýšenie celkových hladín AFosB, ale oveľa vyššie (približne dvojnásobné) zvýšenie 32P-AFosB, čo má za následok významný (-50%) čistý nárast fosforylácie AFosB. Okrem toho, v súlade s bioinformatickými prognózami, liečba buniek PC12 inhibítorom Tyr fosfatázy neviedla k významným zmenám v 32Hladiny P-AFosB (údaje nie sú uvedené). Tieto zistenia spoločne odhalili, že AFosB je fosforylovaný na Ser a / alebo Thr zvyškoch v mozgu a v bunkách PC12 a potvrdil, že tieto sú dobrým systémom bunkovej kultúry, v ktorom sa ďalej študujú fosforylačné a degradačné profily AFosB.

CK2 ale nie PKC alebo CaMKII fosforyluje AFosB in vitro

Ako je opísané vyššie, analýza aminokyselinovej sekvencie AFosB odhalila vysoké predikčné skóre pre fosforylačné miesta CK2, PKC a CaMKII. Na určenie, ktorá z týchto kináz môže fosforylovať AFosB, sme uskutočnili sériu in vitro fosforylačné reakcie s použitím purifikovaných kináz a purifikovaného rekombinantného AFosB. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 3A, z troch kandidátskych kináz, iba CK2 fosforyloval AFosB významným spôsobom. Okrem toho sa testovalo niekoľko ďalších kináz (napr. GSK3 a p70S6K), ale nepodarilo sa významne fosforylovať AFosB (údaje nie sú uvedené). Ďalšia charakterizácia analýzy CK2 reakcie podľa času ukázala, že táto kináza môže katalyzovať inkorporáciu x0.5 mol fosfátu na mol AFosB (Obr. 3B). Skutočnosť, že CK2 môže fosforylovať AFosB in vitro do značnej stechiometrie (-50%) naznačuje fyziologicky relevantnú reakciu. Potom sme študovali kinetiku tejto reakcie inkubáciou CK2 v prítomnosti zvyšujúceho sa množstva purifikovaného AFosB a stanovili sme, že CK2 fosforyluje AFosB s Vmax 5.8 pmol · min-1 · Μg-1 enzýmu, a KM 18.4 μm a a kako z 0.2 / s (Obr. 3C). Hodnoty získané pre tieto kinetické parametre ďalej podporujú fyziologický význam tejto reakcie. Napríklad KM CK2 pre DARPP32, jeden z jeho najznámejších substrátov, je 3.4 μm a kako je ∼0.3 / s (Girault a kol., 1989); KM pre ATP sa pohybuje od ∼10 – 40 μm (Cochet a kol., 1983; Silva-Neto a kol., 2002) a kazeín sa pohybuje od from10 – 50 μm (Meggio a kol., 1977; Pyerin a kol., 1987). Tieto údaje spoločne ukazujú, že AFosB je bona fide substrát pre CK2 in vitro.

Obrázok 3.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 3.

CK2 ale nie PKC alebo CaMKII fosforyluje AFosB in vitro, Autorádiograf (horný panel) ukazuje fosforylovaný produkt a gél farbený Coomassie (spodný panel) ukazuje celkový AFosB prítomný v reakcii. APurifikovaný rekombinantný AFosB sa podrobil in vitro fosforyláciu rôznymi kandidátskymi kinázami (z ktorých tri sú ukázané). BČasový priebeh a stechiometrické analýzy ukazujú, že CK2 môže fosforylovať AFosB in vitro so stechiometriou ∼50%. CKinetická analýza CK2 reakcie ukázala, že AFosB je bona fide in vitro substrát. Linearizácia reakcie je znázornená v dvojitom recipročnom grafe (dno), ale kinetické parametre boli odvodené z Michaelis-Mentenovej krivky (hore).

CK2 moduluje fosforyláciu a stabilitu AFosB v intaktných bunkách

Na posúdenie fyziologickej relevancie fosforylácie AFOSB sprostredkovanej CK2 sme uskutočnili komparatívne mapovanie fosfopeptidov pomocou in vitro fosforylovaný a PC12-fosforylovaný AFosB. Po SDS-PAGE a gélovej elúcii 32P-AFosB (z. \ T in vitro alebo z imunoprecipitátu. \ t 32P-značené bunky), proteín bol štiepený trypsínom a výsledné fosfopeptidy boli podrobené dvojrozmernej separácii. Z tejto analýzy vyplynulo, že hlavný fosfopeptid z reakcie CK2 sa kombinoval s jedným z dvoch hlavných fosfopeptidov z AFosB fosforylovaných v bunkách PC12 (Obr. 4A), zatiaľ čo fosfopeptidy, ktoré sú výsledkom reakcie PKC alebo CaMKII (údaje nie sú uvedené), nie. V PC12 bunkách bol prítomný druhý AFosB fosfopeptid, ale kvôli neschopnosti ktorejkoľvek z kináz, ktoré sme testovali, sa vytvoril podobný fosfopeptid. in vitroV súčasnosti nepoznáme, či tento druhý fosfopeptid obsahuje fosforylačné miesto odlišné od iného fosfopeptidu alebo či predstavuje odlišný tryptický peptid obsahujúci rovnaké miesto fosforylácie.

Obrázok 4.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 4.

CK2 moduluje fosforyláciu a stabilitu AFosB v intaktných bunkách. AZdá sa, že CK2, ale nie PKC, fosforyluje AFosB v bunkách. Dvojrozmerné fosfopeptidové mapy AFosB fosforylované CK2 alebo PKC in vitro alebo intaktnými bunkami PC12. Šípky ukazujú comigráciu CK2-fosforylovaného peptidu, ale nie PKC-fosforylovaný peptid s jedným z AFosB fosfopeptidov získaných z PC12 buniek. B, Fosforylácia AFosB v bunkách PC12 je zvýšená ošetrením buniek silným aktivátorom spermínu CK2 (SP) a znížená liečbou inhibítorom CK2 DRB. Oproti tomu fosforylácia AFosB v bunkách PC12 nebola ovplyvnená liečbou buď PKC aktivátorom (PMA) alebo PKC-špecifickým inhibítorom calphostin-C (Calph). Sú znázornené reprezentatívne autorádiogramy (horný panel) a imunoblot (spodný panel). C-FÚčinok aktivity CK2 na stabilitu AFosB. Obrázky ukazujú časový priebeh (a reprezentatívny autorádiogram) degradácie AFosB. Bunky PC12 prechodne exprimujúce AFosB boli podrobené experimentom pulznej cházy uskutočňovaným v neprítomnosti alebo v prítomnosti inhibítora CK2 DRB (C), aktivátor spermínu CK2 (D), alebo širokospektrálneho inhibítora kinázy H-8 (E), ktorý sa použil na kontrolu nešpecifických účinkov DRB. FÚčinok zrážania katalytickej podjednotky CK2 na stabilitu AFosB. Bunky PC12 boli transfekované buď necieľujúcou siRNA (Ctr) alebo siRNA zacieleným krysím CK2a a 24 h neskôr transfekované s plazmidom AFosB. Vrchný panel znázorňuje imunobloty lyzátov celých buniek, ktoré ukazujú účinok CK2 siRNA na hladiny proteínov CK2 a AFosB. Zodpovedajúci imunoblot pre p-tubulín je znázornený ako kontrola plnenia.

Na ďalšie riešenie fyziologickej relevancie CK2 ako AFosB kinázy sme ošetrili bunky AFXB exprimujúce bunky PC12 dvoma liekmi, ktoré modulujú aktivitu CK2. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 4B, Fosforylácia AFosB bola znížená liečbou buniek PC12 s bunkovo ​​permeabilným inhibítorom CK2 DRB (Meggio a kol., 1990; Szyszka a kol., 1995) a zvýšená liečbou polyamínom spermínom, o ktorom je známe, že je účinným aktivátorom CK2 (Cochet a Chambaz, 1983; Meggio a kol., 1983). Oproti tomu liečba buniek PC12 inhibítorom PKC calphostin-C (Kobayashi a kol., 1989; Tamaoki a kol., 1990) alebo PKC aktivátor PMA (Schmidt a Hecker, 1975; Beh a kol., 1989) neviedli k významným zmenám fosforylácie AFosB. V prípade PMA došlo k miernemu (a nie významnému) zvýšeniu 32P-AFosB by mohol byť spôsobený zvýšením celkových hladín AFosB spôsobených týmto liečivom; v skutočnosti sa uvádza, že forbol estery indukujú expresiu niekoľkých proteínov rodiny Fos, vrátane FosB (Yoza a kol., 1992; Suh a kol., 2004). Okrem toho, liečba buniek špecifickým bunkovo ​​permeabilným inhibítorom CaMKII m-AIP (Ishida a Fujisawa, 1995; Stevens a kol., 1999) tiež nevedie k zníženej fosforylácii AFosB (údaje nie sú uvedené). Tieto výsledky sú v súlade s našimi in vitro zistenia a naznačujú, že v intaktných bunkách je AFosB pravdepodobne fosforylovaný CK2, ale nie PKC alebo CaMKII. Skutočnosť, že inhibícia CK2 úplne nezabraňuje fosforylácii AFosB, indikuje existenciu ďalších fosforylačných miest v proteíne.

Ďalej sme skúmali, či CK2 hrá úlohu v obrate AFosB a tým v jeho stabilite. Na tento účel sme uskutočnili experimenty pulznej cházy s použitím buniek AFXB exprimujúcich PC12 buniek ošetrených buď inhibítorom CK2 alebo aktivátorom CK2 použitým v štúdii fosforylácie. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 4Cliečba buniek s inhibítorom CK2 DRB mala významný vplyv na rýchlosť fluktuácie AFosB, čoho dôkazom je zmena tvaru jeho degradačnej krivky, od dvojfázovej po krivku, ktorá je bližšia krivke exponenciálneho rozpadu. Naopak, prítomnosť CK2 aktivátora spermínu spôsobila významné zníženie rýchlosti degradácie AFosB, čo viedlo k akumulácii proteínu počas prvých hodín chase (Obr. 4D).

Ako v prípade mnohých aktivátorov a inhibítorov kinázy, spermín a DRB môžu mať metabolické účinky mimo modulácie aktivity CK2. V skutočnosti sa ukázalo, že DRB inhibuje kinázu asociovanú s transkripčným faktorom IIH (TFIIH) (Yankulov a kol., 1995), čo vedie k inhibícii transkripcie sprostredkovanej RNA polymerázou II. Pretože tento účinok by mohol ovplyvniť stabilitu AFosB, analyzovali sme účinok širokospektrálneho inhibítora kinázy H-8 (Hidaka a Kobayashi, 1992) na fluóru AFosB pri koncentrácii (200 μm), o ktorej je známe, že inhibuje kinázu asociovanú s TFIIH, ale nie CK2 (Yankulov a kol., 1995). Ako je znázornené na obrázku Obrázok 4Eliečba H-8 neovplyvnila rýchlosť fluktuácie AFosB. Podobné výsledky sa získali s H-7, ďalším inhibítorom kinázy širokého spektra, ktorý sa použil v koncentrácii, ktorá inhibuje kinázu asociovanú s TFIIH, ale nie CK2 (údaje nie sú uvedené). Tieto údaje ďalej podporujú interpretáciu, že zníženie stability AFosB spôsobené DRB je s najväčšou pravdepodobnosťou možné pripísať inhibícii CK2.

Na ďalšie stanovenie úlohy CK2 pri fluktuácii AFosB sme skúmali následky klopania CK2 cez siRNA. Tieto experimenty sme uskutočnili s použitím buniek PC12, ktoré boli najprv transfekované kontrolnou (necieľujúcou) siRNA alebo siRNA, ktorá sa zameriava na mRNA katalytickej podjednotky potkanej CK2 (CK2a) a 24 h neskôr transfekovaných AFosB. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 4Ftransfekcia s CK2a siRNA účinne a špecificky zrazila hladiny proteínov CK2a bez ovplyvnenia hladín AFosB (horný panel). Analýza pulz-chase ukázala, že klopanie CK2 viedlo k významnému zvýšeniu rýchlosti fluktuácie AFosB, čoho dôkazom je rýchlejšia degradácia proteínu. Skutočnosť, že inhibícia aktivity CK2 (či už prostredníctvom liečby DRB alebo siRNA) zvyšuje obrat AFosB a vedie k vymiznutiu zložky pomalej rýchlosti bifázickej krivky, zatiaľ čo aktivácia CK2 zvyšuje pomalú fázu krivky, poskytuje silnú podporu pre myšlienka, že CK2 hrá úlohu pri regulácii stability AFosB.

CK2 fosforyluje AFosB na Ser27

Aby sme začali identifikovať miesto (miesta) na AFosB fosforylovanom CK2, uskutočnili sme fosfo-aminokyselinovú analýzu rekombinantného AFosB fosforylovaného CK2 in vitro a AFosB fosforylovaný v bunkách PC12. Tieto experimenty ukázali, že v obidvoch prípadoch bola jediná detegovaná fosfo-aminokyselina fosfo-Ser (Obr. 5A). Toto zistenie spolu so stechiometriou získanou pre CK2 in vitro fosforylačná reakcia (-50%) (Obr. 3B) a prítomnosť iba jedného významného miesta na mape fosfopeptidov CK2 (Obr. 4A), naznačuje, že fosforylácia CK2 AFosB je pravdepodobne obmedzená na jediný serínový zvyšok. Tento záver je v súlade s analýzou konsenzu fosforylácie (Obr. 2B), ktorý predpovedal iba jeden kandidátny serín, tj Ser27, pre CK2. Taxonomická analýza odhalila, že Ser27 je vysoko zachovaný prostredníctvom vývoja medzi členmi rodiny Fos (Obr. 5B), čo naznačuje, že môže niesť významnú fyziologickú funkciu.

Obrázok 5.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 5.

CK2 Fosforyluje AFosB na Ser27. A, Fosfoaminokyselinová analýza fosforylovaného CK2 (in vitro) a AFOSB fosforylovaných buniek PC12, čo ukazuje, že v oboch prípadoch je hlavným zvyškom fosforylovaný serín. BCross-druhová analýza aminokyselinovej sekvencie FosB / AFosB odhalila vysokú konzerváciu Ser27 medzi členmi rodiny Fos od človeka k zebrafish (tmavé zvýraznenie). Avšak kyslý zvyšok v polohe + 3, ktorý je potrebný pre CK2 konsenzuálne miesto, nie je konzervovaný (svetelný zvýraznený). C, HeLa bunky boli prechodne transfekované buď štandardným AFosB (WT) alebo AFosB obsahujúcim bodovú mutáciu, aby nahradili Ser27 za Ala (S27A). Bunky boli metabolicky označené s 32PH3PO4 a liečené vehikulom alebo spermínom (SP) na aktiváciu CK2. Sú znázornené reprezentatívne autorádiogramy (horný panel) a imunoblot (spodný panel) získaných imunoprecipitátov AFosB. Je ukázaná imunoprecipitácia falošne transfekovaných buniek (vektor).

Na určenie, či je Ser27 fosforylovaný v AFosB, sme tento zvyšok mutovali na Ala a analyzovali sme dôsledky na fosforylačný stav proteínu. Na tento účel sme použili HeLa bunky (ktoré môžu byť transfekované s vyššou účinnosťou) na prechodnú expresiu buď WT alebo S27A mutantu AFosB. Približne 24 h po transfekcii sa bunky metabolicky označili 32Boli pripravené P-ortofosforečnany a lyzáty celých buniek. Po imunoprecipitácii a SDS-PAGE, 32P-AFosB sa detegoval autorádiografiou a celkový AFosB imunoblotovaním. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 5C (spodný panel), AFosB nebol detegovaný v bunkách transfekovaných vektormi, zatiaľ čo bunky transfekované buď WT alebo S27A mutantom AFosB úspešne exprimovali proteín. Zistili sme, že mutácia S27A spôsobila významnú redukciu (∼30%) v 32Hladiny P-AFosB (Obr. 5C, horný panel a graf), čo ukazuje, že v živých bunkách je AFosB fosforylovaný na Ser27. V snahe zistiť, či je v bunkách Ser27 skutočne fosforylovaný CK2, sme porovnali schopnosť CK2 aktivátora spermínu modulovať fosforyláciu WT a S27A AFosB. Ako sme predtým pozorovali v bunkách PC12 (Obr. 4B), liečba HeLa buniek spermínom významne zvýšila fosforyláciu WT proteínu. Skutočnosť, že tento účinok sa významne zmenšil mutáciou S27A (\ tObr. 5C) podporuje interpretáciu, že Ser27 v AFosB je fyziologický substrát pre CK2.

Fosforylácia Ser27 reguluje stabilitu AFosB

Keď sa zistí, že stabilita AFosB je znížená, keď je CK2 inhibovaný a zosilnený, keď je aktivovaný CK2 (Obr. 4) a že CK2 fosforyluje AFosB na Ser27 (Obr. 5), predpokladali sme, že prevencia fosforylácie tohto miesta by mala destabilizovať proteín. Experimenty s pulznou cházou uskutočňované s HeLa bunkami prechodne exprimujúcimi buď WT alebo S27A mutant AFosB ukázali, že, ako bolo predpovedané, S27A mutácia viedla k významnému zvýšeniu rýchlosti degradácie AFosB a sprievodnému poklesu polčasu proteínu. (Obr. 6A). Potom sme skúmali, či sa tento regulačný mechanizmus vyskytuje aj vo viac neurónovej bunkovej línii PC12. Tieto experimenty ukázali, že, ako sme pozorovali v HeLa bunkách, S27A bodová mutácia spôsobuje dramatický pokles polčasu AFosB v bunkách PC12 (z ∼11 na ∼4 h) (Obr. 6B). Skutočnosť, že táto destabilizácia je podobná tej, ktorú spôsobuje CK2 inhibícia alebo knock-down (Obr. 4) poskytuje ďalšiu podporu pre myšlienku, že CK2-sprostredkovaná fosforylácia Ser27 reguluje stabilitu AFosB. Ďalší dôkaz regulačnej úlohy fosforylácie Ser27 na fluóre proteínu AFosB sa získal s použitím fosfomimetického Ser27 na Asp mutáciu (S27D). Mutácia S27D sa považuje za fosfomimetikum, pretože umiestňuje veľkú negatívne nabitú (karboxylovú) skupinu do aminokyseliny 27 a tým čiastočne napodobňuje fosforyláciu Ser27. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 6Cmutácia S27D spôsobila opačný účinok mutácie S27A a viedla k signifikantne stabilnejšiemu proteínu ako proteín WT. Podobne ako efekt získaný po aktivácii CK2 (Obr. 4D), mutácia S27D viedla k akumulácii a tým k zvýšeniu hladín AFosB počas prvých hodín chase.

Obrázok 6.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 6.

Fosforylácia Ser27 reguluje stabilitu AFosB. A, C, Pulse-chase analýza ukazujúca účinok Ser27 fosforylácie na rýchlosť fluktuácie AFosB. Profil degradácie a odhadované polčasy rozpadu divokého typu AFosB (WT), Ser27 na mutant Ala (S27A) a fosfomimetické Ser27 na Asp mutant (S27D) sú uvedené. Rovnaké nálezy boli získané v HeLa bunkách (A) a bunky PC12 (B, C).

Fosforylácia Ser27 stabilizuje AFosB zabránením jeho proteasomálnej degradácie

Aby sme začali objasňovať mechanizmus, ktorým fosforylácia Ser27 stabilizuje AFosB, skúmali sme schopnosť inhibítorov proteazómu MG132 (Palombella a kol., 1994; Tsubuki a kol., 1996) a epoxomicínu (\ tHanada a kol., 1992; Kim a kol., 1999) na moduláciu rýchlosti degradácie WT a S27A mutantného AFosB. Experimenty s pulznou cházou boli uskutočňované s použitím buniek PC12 infikovaných rekombinantným HSV exprimujúcim buď WT alebo S27A AFosB a ošetrené buď DMSO alebo jedným z dvoch inhibítorov proteazómu. Tieto experimenty ukázali, že hoci rýchlosť degradácie proteínu WT je relatívne necitlivá na prítomnosť jedného z dvoch inhibítorov proteazómu (Obr. 7A), je mutant S27A citlivý na tieto lieky (\ tObr. 7B). To naznačuje, že na rozdiel od proteínu WT je mutant S27A cieľom degradácie proteazómu. Ošetrenie buniek buď MG132 alebo epoxomicínom úplne zvrátilo účinok mutácie S27A na rýchlosť degradácie AFosB, čoho dôkazom je zvýšenie polčasu mutácie S27A z ∼4 na ∼9 h pre MG132 a to 12 h pre epoxomicín (Obr. 7B). Tieto zistenia spoločne ukazujú, že fosforylácia AFosB na Ser27 chráni proteín pred degradáciou proteazómu a je preto nevyhnutná pre jeho nezvyčajnú stabilitu.

Obrázok 7.

Zobraziť väčšiu verziu:

Obrázok 7.

Fosforylácia Ser27 stabilizuje AFosB zabránením jeho proteasomálnej degradácie. A, B, Pulse-chase analýza s HSV-infikovanými PC12 bunkami ukazujúcimi degradačný profil a odhadované polčasy divokého typu AFosB (A) alebo S27A AFosB (B) v neprítomnosti alebo prítomnosti dvoch inhibítorov proteazómu [MG132 a epoxomicín (Epoxo)]. Všimnite si skutočnosť, že ani jeden liek nemá významný vplyv na obrat AFosB divokého typu, zatiaľ čo liečba buniek ktorýmkoľvek inhibítorom proteazómu viedla k stabilizácii S27A AFosB. C, Model úlohy fosforylácie Ser27 v schopnosti AFosB sprostredkovať dlhodobú plasticitu mozgu. Akonáhle je indukovaná, časť AFosB je stabilizovaná v mozgu fosforyláciou S2 sprostredkovanou CK27. To má za následok jeho akumuláciu, čo vedie k dlhodobým zmenám v expresii génov. Tieto stabilné zmeny v génovej expresii prispievajú k stabilnej adaptácii správania. Naopak, defosforylácia S27 fosfatázami Ser / Thr PP1 a / alebo PP2A má za následok destabilizáciu proteínu a jeho spracovanie mechanizmom proteazómu.

Predchádzajúca sekciaĎalšia časť

Diskusia

V tejto štúdii sme ukázali, že AFosB má polčas rozpadu culture10 h v bunkovej kultúre, čo ho robí stabilným v porovnaní s FosB v plnej dĺžke a s väčšinou iných indukovateľných transkripčných faktorov, ktorých polčasy v bunkovej kultúre môžu byť rovnako krátke. niekoľko minút a zriedka presiahne 3 h (Hann a Eisenman, 1984; Dobrazanski a kol., 1991; Roberts a Whitelaw, 1999; Ferrara a kol., 2003; Hirata a kol., 2004). Okrem toho sme zistili, že AFosB je fosforylovaný v mozgu a že jeho fosforylácia je citlivá na inhibítor PP1 / PP2A kyseliny okadaovej. Naše štúdie na bunkových kultúrach ukazujú, že stabilita AFosB je modulovaná CK2, pričom vyššia aktivita CK2 stabilizuje proteín. Naše zistenia nakoniec naznačujú, že CK2 fosforyluje AFosB na vysoko konzervatívnom N-terminálnom seríne (S27) a demonštruje, že fosforylácia S27 chráni AFosB pred degradáciou proteazómov. Navrhujeme preto model, v ktorom je fosforylácia AFosB na S27 pomocou CK2 kritickým regulačným mechanizmom fluktuácie AFosB (Obr. 7C). Takáto fosforylácia sprostredkovaná stabilizácia AFosB je funkčne dôležitá, pretože sa ukázalo, že zvýšené hladiny AFosB v konkrétnych oblastiach mozgu priamo regulujú početné neurónové gény. in vivo a vyvinúť silné behaviorálne účinky na zvieracích modeloch niekoľkých neuropsychiatrických porúch (pozri Úvod).

Hoci fosforylácia je rýchly a reverzibilný spôsob regulácie transkripčnej aktivity určitých transkripčných faktorov, ako je napríklad CREB (väzbový proteín pre väzbový element cAMP) (Bohmann, 1990), modulácia degradácie transkripčných faktorov poskytuje ešte silnejšiu (menej reverzibilnú) formu regulácie (Desterro a kol., 2000). Medzi transkripčné faktory, ktorých funkčná aktivita je regulovaná na úrovni ich degradácie, patrí NFKB (Desterro a kol., 2000), c-Myc (Sears a kol., 1999) a c-Fos (Ferrara a kol., 2003), okrem iného. V mnohých prípadoch je fosforylácia kľúčovým regulátorom stability transkripčného faktora, ako sa ukázalo pre c-Fos (Okazaki a Sagata, 1995; Tsurumi a kol., 1995), Fos-príbuzný antigén-1 (Fra-1) (Vial a Marshall, 2003), Fra-2 (Manabe a kol., 2001), c-jún (Fuchs a kol., 1996), JunB (Fuchs a kol., 1997), ATF2 (Fuchs a kol., 2000) a p53 (Buschmann a kol., 2001). Naše štúdie teda pridávajú AFosB do tohto zoznamu transkripčných faktorov, ktorých funkčná aktivita je regulovaná prostredníctvom fosforylovanej stability.

CK2 je všadeprítomná a konštitutívne aktívna Ser / Thr kináza, ktorá má doposiaľ identifikovaných> 300 údajných substrátov a je zapojená do viacerých biologických procesov vrátane bunkovej smrti a prežitia (Litchfield, 2003; Unger a kol., 2004), reakcie bunkového stresu (Yanagawa a kol., 1997; Kato a kol., 2003), a opravy DNA a remodelácie chromatínu (Barz a kol., 2003; Krohn a kol., 2003). Viac ako tretina predpokladaných substrátov CK2 sú proteíny podieľajúce sa na regulácii génovej expresie (Meggio a Pinna, 2003). V skutočnosti sa ukázalo, že CK2 je prominentnou nukleárnou kinázou (Krek a kol., 1992) (pre posúdenie pozri Yu a kol., 2001) a interakciu s bZIP doménami niekoľkých transkripčných faktorov (Yamaguchi a kol., 1998). Ukázalo sa tiež, že fosforylácia sprostredkovaná CK2 moduluje degradáciu mnohých proteínov, vrátane IkB (buď jej zvýšenie alebo zníženie).Schwarz a kol., 1996), PTEN (Torres a Pulido, 2001), šošovkový konexín (Yin a kol., 2000), proteín chromogénu asociovaný s HMG1 (Wisniewski a kol., 1999) a niekoľko transkripčných faktorov, ako je HMGB (Stemmer a kol., 2002), Myf-5 (Winter a kol., 1997) a c-Myc (Channavajhala a Seldin, 2002). CK2 sa najčastejšie vyskytuje v mozgu (Alcazar a kol., 1988; Girault a kol., 1990) a jeho aktivita sa podieľa na mnohých aspektoch funkcie mozgu, vrátane prežívania neurónov (Boehning a kol., 2003), diferenciácia (Nuthall a kol., 2004), funkcia iónových kanálov (Jones a Yakel, 2003; Bildl a kol., 2004) a dlhodobej potenciácie a plasticity neurónov (Diaz-Nido a kol., 1992; Lieberman a Mody, 1999; Reikhardt a kol., 2003).

Napriek tomuto rastúcemu dôkazu o úlohe CK2 v regulácii neuronálnej funkcie je málo známe o tom, čo riadi jeho aktivitu. Predpokladá sa, že CK2 je konštitutívne aktívny, s reguláciou jeho schopnosti fosforylovať špecifické substráty, ktoré sa spoliehajú hlavne na zmeny v jeho intracelulárnej lokalizácii (napr. Cytozol vs jadro) (Ahmed a Tawfic, 1994; Yu a kol., 1999). Tieto informácie predstavujú dôležitú otázku týkajúcu sa toho, aké signály sú potrebné na vyvolanie akumulácie AFosB v mozgu po chronickej stimulácii (Obr. 7C). Jednou z požiadaviek je opakovaná aktivácia fosB gén a indukcia mRNA AFosB (Chen a kol., 1995). Naše údaje ukazujú, že fosforylácia AFKB CK2 je rozhodujúca pre jeho stabilitu, čo naznačuje, že druhý signál môže byť potrebný na dlhodobé účinky AFosB na génovú expresiu, a to signál, ktorý stimuluje fosforyláciu proteínu prostredníctvom CK2. To by mohlo zahŕňať aktiváciu CK2 nejakým neznámym mechanizmom alebo jeho translokáciu do jadra. Alternatívne môže byť CK2 fosforylácia AFosB konštitutívna, takže keď je AFosB proteín translatovaný ako odozva na každý stimul, časť z neho sa fosforyluje a tým stabilizuje, takže pri opakovanej stimulácii sa akumuluje na vysoké hladiny v postihnutých neurónoch.

Naše zistenia ukazujú, že CK2 a S27 pravdepodobne nie sú jedinou kinázou a miestom zodpovedným za fosforyláciu AFosB, pretože ani inhibícia CK2 ani mutácia S27A nedokázali úplne zabrániť fosforylácii AFosB. Skutočnosť, že mutácia S27A vedie k 30% redukcii fosfo-AFosB, tvrdí, že S27 je hlavným miestom fosforylácie proteínu. Napriek tomu skúmame iné predpokladané kinázy a miesta fosforylácie na AFosB. V konečnom dôsledku bude tiež dôležité analyzovať fosforyláciu S27 a akékoľvek iné fosforylačné miesta v AFosB v mozgu in vivo po rôznych typoch chronickej stimulácie, napríklad pomocou hmotnostnej spektrometrie alebo fosfospecifických protilátok.

Ako je uvedené vyššie, S27 v AFosB je vysoko konzervatívny počas evolúcie a medzi inými proteínmi rodiny Fos. Stránka konsenzu pre CK2 však nie je: ako je uvedené v Obrázok 5Biba FosB / AFosB (a xenológ Zebrafish), ale nie c-Fos alebo Fra-2, majú kyslý zvyšok na + 3, kľúčový determinant fosforylácie CK2 (Marin a kol., 1986; Meggio a kol., 1994). Nedostatok fosforylácie CK2 na S27 môže teda vysvetľovať, prečo iné proteíny rodiny Fos nie sú také stabilné ako AFosB. To však nevysvetľuje, prečo FosB s plnou dĺžkou, ktorý má rovnaké CK2 konsenzuálne miesto ako AFosB, nie je podobne stabilizovaný. Nevieme, či FosB s plnou dĺžkou je fosforylovaný CK2 na tomto konzervovanom zvyšku. Jediné správy FosB (Skinner a kol., 1997) a c-Fos (Okazaki a Sagata, 1995; Chen a kol., 1996) fosforylácia opisuje miesta v C-terminálnej oblasti týchto proteínov, ktoré nie sú prítomné v AFosB. Potenciálna fosforylácia FosB a iných proteínov rodiny Fos s plnou dĺžkou pomocou CK2 vyžaduje priame vyšetrenie. Avšak, aj keď sú fosforylované, je známe, že ostatné proteíny rodiny Fos obsahujú motívy na svojich C koncoch, ktoré sú zacielené na proteíny pre rýchlu degradáciu (Papavassiliou a kol., 1992; Jariel-Encontre a kol., 1997; Acquaviva a kol., 2002). Napríklad sa ukázalo, že úsek zvyškov X21 prítomných na C-konci všetkých proteínov rodiny Fos, ale neprítomný v AFosB, pôsobí ako destabilizujúca doména pre c-Fos (Acquaviva a kol., 2001). Zistili sme, že hoci táto sekvencia podobne destabilizuje FosB plnej dĺžky (Carle a kol., 2004), neprítomnosť tejto domény v AFosB úplne nezohľadňuje jeho stabilizáciu. Kombinácia neprítomnosti tejto C-terminálnej domény a fosforylácie Ser27 sa zdá byť plne zodpovedná za približne päťnásobný rozdiel v stabilite medzi AFosB a FosB.

Hoci degradácia proteínov rodiny Fos je komplexná a nie je úplne pochopená, zdá sa, že hlavnou cestou je proteasomálna degradácia (Salvat a kol., 1999; Acquaviva a kol., 2002; Ferrara a kol., 2003). Tu prezentované údaje, v ktorých proteazomálne inhibítory významne nemenia rýchlosť degradácie AFosB, tvrdia, že na rozdiel od iných proteínov rodiny Fos, AFosB uniká 26S proteazómu a toto hrá hlavnú úlohu v jeho stabilizácii. Preto navrhujeme schému, v ktorej je zvýšená stabilita AFosB spôsobená kombináciou dvoch hlavných faktorov: (1) neprítomnosti C-terminálnej destabilizujúcej domény a (2) fosforylácie S27 pomocou CK2.

Stručne povedané, táto štúdia poskytuje mechanický pohľad na to, prečo je AFosB, produkt bezprostredného skorého génu fosB, na rozdiel od všetkých ostatných členov rodiny Fos, proteín s dlhou životnosťou. Hoci sa predpokladá, že iné proteíny rodiny Fos sprostredkovávajú rýchlu, ale prechodnú väzbu stimulačného transkripcie (Morgan a Curran, 1995), relatívna stabilita AFosB mu dáva schopnosť sprostredkovať dlhšie trvajúce transkripčné zmeny indukované chronickou stimuláciou. To podporuje názor, že AFosB funguje ako trvalý molekulárny prepínač v mozgu, čím sa postupne menia akútne reakcie na chronické adaptácie. Identifikácia fosforylácie Ser27 ako centrálneho mechanizmu pre stabilitu AFosB otvára nové cesty pre vývoj prostriedkov na reguláciu funkcie AFosB a tým moduluje jeho dlhodobé účinky na neurálnu a behaviorálnu plasticitu.

Predchádzajúca sekciaĎalšia časť

poznámky pod čiarou

  • Prijaté november 21, 2005.
  • Revízia dostala február 21, 2006.
  • Prijaté apríl 2, 2006.
  • Táto práca bola podporená Národnou alianciou pre výskum schizofrénie a cenou Depresia mladých výskumníkov PGU, Národným inštitútom pre zneužívanie drog (NIDA), Národnou výskumnou službou pre PGU a grantmi od Národného inštitútu pre duševné zdravie a NIDA pre EJN Jamesovi Bibbovi za jeho pomoc s in vitro Ming-Hu Han za jeho pomoc pri príprave rezov mozgu používaných na metabolické značenie a Dr. Rachael Neve za pomoc s balením rekombinantných HSV.
  • Súčasná adresa G. Rudenka: Inštitút prírodných vied a oddelenie farmakológie, University of Michigan, 210 Washtenaw Avenue # 3163A, Ann Arbor, MI 48109-2216.
  • Korešpondencia by mala byť adresovaná Ericovi J. Nestlerovi, 5323 Harrymu Hinesovi Boulevardovi, Dallasovi, TX 75390-9070. e-mail: [chránené e-mailom]

Predchádzajúca sekcia

 

Referencie

Acquaviva C, Brockly F, Ferrara P, Bossis G, Salvat C, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2001) Identifikácia C-terminálneho tripeptidového motívu podieľajúceho sa na kontrole rýchlej proteasomálnej degradácie c-Fos proto-onkokoproteínu počas G (0) -to-S fázového prechodu. onkogén 20:7563-7572.

CrossRefMedline

Acquaviva C, Bossis G, Ferrara P, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2002) Viacnásobné cesty degradácie proteínov rodiny Fos. Ann NY Acad Sci 973:426-434.

Medline

Ahmed K, Tawfic S (1994) Mechanizmus vnútrobunkovej regulácie proteínkinázy CK2: úloha subjadrového spojenia sprostredkovaného stimulom. Cell Mol Biol Res 40:539-545.

Medline

Alcazar A, Martin E, Lopez-Fando J, Salinas M (1988) Zlepšený purifikačný postup a vlastnosti kazeínkinázy II z mozgu. Neurochem Res 13:829-836.

CrossRefMedline

Andersson M, Westin JE, Cenci MA (2003) Časový priebeh striatálnej imunoreaktivity typu deltaFosB a mRNA prodynorfínu po prerušení chronickej dopaminomimetickej liečby. Eur J Neurosci 17:661-666.

CrossRefMedline

Barz T, Ackermann K, Dubois G, Eils R, Pyerin W (2003) Obrazy expresie na celom genóme ukazujú globálnu úlohu proteínkinázy CK2 pri remodelovaní chromatínu. J Cell Sci 116:1563-1577.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Beh I, Schmidt R, Hecker E (1989) Dva izozýmy PKC nájdené v bunkách HL-60 vykazujú rozdiel v aktivácii forbol esterom TPA. FEBS Lett 249:264-266.

Medline

Bildl W, Strassmaier T, Thurm H, Andersen J, Eble S, Oliver D, Knipper M, Mann M, Schulte U, Adelman JP, Fakler B (2004) Proteínkináza CK2 je zostavená s malými vodivosťami Ca (2 +) - aktivovanými K + kanálmi a reguluje hradlové kanály. Neurón 43:847-858.

CrossRefMedline

Bing G, Wang W, Qi Q, Feng Z, Hudson P, Jin L, Zhang W, Bing R, Hong JS (1997) Dlhodobá expresia antigénu súvisiaceho s Fos a prechodná expresia delta FosB spojená so záchvatmi v hipokampuse potkana a striatu. J Neurochem 68:272-279.

Medline

Blom N, Sicheritz-Ponten T, Gupta R, Gammeltoft S, Brunak S (2004) Predikcia posttranslačnej glykozylácie a fosforylácie proteínov z aminokyselinovej sekvencie. proteomiky 4:1633-1649.

CrossRefMedline

Boehning D, Moon C, Sharma S, Hurt KJ, Hester LD, Ronnett GV, Shugar D, Snyder SH (2003) Neurotransmisia oxidu uhoľnatého aktivovaná fosforyláciou CK2 hemu oxygenázy-2. Neurón 40:129-137.

CrossRefMedline

Bohmann D (1990) Fosforylácia transkripčného faktora: spojenie medzi signálnou transdukciou a reguláciou génovej expresie. Rakovinové bunky 2:337-344.

Medline

Buschmann T, Potapova O, Bar-Shira A, Ivanov VN, Fuchs SY, Henderson S, Fried VA, Minamoto T, Alarcon-Vargas D, Pincus MR, Gaarde WA, Holbrook NJ, Shiloh Y, Ronai Z (2001) Jun NH2-terminálna fosforylácia kinázy p53 na Thr-81 je dôležitá pre stabilizáciu p53 a transkripčné aktivity ako odozvu na stres. Mol Cell Biol 21:2743-2754.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Carle TL, Ulery PG, Nestler EJ (2004) Absencia konzervatívnej C-terminálnej domény rodiny Fos prispieva k jedinečnej stabilite deltaFosB. Soc Neurosci Abstr 30: 692.2.

Channavajhala P, Seldin DC (2002) Funkčná interakcia proteínkinázy CK2 a c-Myc pri lymfomagenéze. onkogén 21:5280-5288.

CrossRefMedline

Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ (1995) Regulácia delta FosB a FosB-podobných proteínov elektrokonvulzívnou záchvatovou a kokaínovou liečbou. Mol Pharmacol 48:880-889.

abstraktné

Chen J, Kelz MB, Hope BT, Nakabeppu Y, Nestler EJ (1997) Chronické antigény súvisiace s Fos: stabilné varianty AFosB indukované v mozgu chronickými liečbami. J Neurosci 17:4933-4941.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Chen RH, Juo PC, Curran T, Blenis J (1996) Fosforylácia c-Fos na C-konci zvyšuje jeho transformačnú aktivitu. onkogén 12:1493-1502.

Medline

Choe ES, Parelkar NK, Kim JY, Cho HW, Kang HS, Mao L, Wang JQ (2004) Inhibítor proteínovej fosfatázy 1 / 2A okadaová zvyšuje fosforyláciu CREB a Elk-1 a expresiu c-fos v striatum potkana in vivo. J Neurochem 89:383-390.

CrossRefMedline

Cochet C, Chambaz EM (1983) Polyamínom sprostredkovaná fosforylácia proteínu: možný cieľ pre intracelulárny polyamínový účinok. Mol Cell Endocrinol 30:247-266.

CrossRefMedline

Cochet C, Feige JJ, Chambaz EM (1983) Katalytické a molekulárne vlastnosti vysoko purifikovaného kazeínkinázy G typu z bovinného pľúcneho tkaniva. Biochim Biophys Acta 743:1-12.

Medline

Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) Nadmerná expresia deltaFosB špecifická pre striatálny typ buniek zvyšuje stimuláciu kokaínu. J Neurosci 23:2488-2493.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Daunais JB, Roberts DC, McGinty JF (1993) Samopodanie kokaínu zvyšuje preprodynorfín, ale nie c-fos, mRNA v striatume potkana. NeuroReport 4:543-546.

Medline

Desterro JM, Rodriguez MS, Hay RT (2000) Regulácia transkripčných faktorov degradáciou proteínov. Cell Mol Life Sci 57:1207-1219.

CrossRefMedline

Diaz-Nido J, Armas-Portela R, Avila J (1992) Zvýšenie aktivity typu cytoplazmatického kazeínkinázy II sprevádza rast neuritov po inhibícii syntézy DNA v neuroblastómových bunkách NIA-103. J Neurochem 58:1820-1828.

Medline

Di Maira G, Salvi M, Arrigoni G, Marin O, Sarno S, Brustolon F, Pinna LA, Ruzzene M (2005) Proteínkináza CK2 fosforyluje a upreguluje Akt / PKB. Bunková smrť sa líši 12:668-677.

CrossRefMedline

Dobrazanski P, Noguchi T, Kovary K, Rizzo CA, Lazo PS, Bravo R (1991) Oba produkty génu fosB, FosB a jeho krátka forma, FosB / SF, sú transkripčné aktivátory vo fibroblastoch. Mol Cell Biol 11:5470-5478.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Ferrara P, Andermarcher E, Bossis G, Acquaviva C, Brockly F, Jariel-Encontre I, Piechaczyk M (2003) Štrukturálne determinanty zodpovedné za degradáciu proteáz c-Fos proteínu sa líšia podľa podmienok expresie. onkogén 22:1461-1474.

CrossRefMedline

Fuchs SY, Dolan L, Davis RJ, Ronai Z (1996) Fosforylačne závislé cielenie c-Jun ubikvitinácie Jun N-kinázou. onkogén 13:1531-1535.

Medline

Fuchs SY, Xie B, Adler V, Fried VA, Davis RJ, Ronai Z (1997) c-Jun NH2-terminálne kinázy sa zameriavajú na ubikvitináciu ich asociovaných transkripčných faktorov. J Biol Chem 272:32163-32168.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Fuchs SY, Tappin I, Ronai Z (2000) Stabilita transkripčného faktora ATF2 je regulovaná fosforyláciou a defosforyláciou. J Biol Chem 275:12560-12564.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Girault JA, Hemmings HC Jr, Williams KR, Nairn AC, Greengard P (1989) Fosforylácia DARPP-32, fosfoproteínu regulovaného dopamínom a cAMP, kazeínkinázou II. J Biol Chem 264:21748-21759.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Girault JA, Hemmings HC Jr, Zorn SH, Gustafson EL, Greengard P (1990) Charakterizácia v mozgu cicavcov serínkinázy DARPP-32 identickej s kazeínkinázou II. J Neurochem 55:1772-1783.

Medline

Hanada M, Sugawara K, Kaneta K, Toda S, Nishiyama Y, Tomita K, Yamamoto H, Konishi M, Oki T (1992) Epoxomicín, nové protinádorové činidlo mikrobiálneho pôvodu. J Antibiot (Tokio) 45:1746-1752.

Medline

Hann SR, Eisenman RN (1984) Proteíny kódované onkogénom ľudského c-myc: diferenciálna expresia v neoplastických bunkách. Mol Cell Biol 4:2486-2497.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Hemmings HC Jr, Girault JA, Williams KR, LoPresti MB, Greengard P (1989) ARPP-21, cyklický AMP-regulovaný fosfoproteín (Mr = 21,000) obohatený v mozgových oblastiach dopamínom inervovaných. Aminokyselinová sekvencia miesta fosforylovaného cyklickým AMP v intaktných bunkách a kinetické štúdie jeho fosforylácie in vitro. J. Biol. Chem 264:7726-7733.

Hidaka H, ​​Kobayashi R (1992) Farmakológia inhibítorov proteínkinázy. Annu Rev Pharmacol Toxicol 32:377-397.

CrossRefMedline

Hirata H, Bessho Y, Kokubu H, Masamizu Y, Yamada S, Lewis J, Kageyama R (2004) Nestabilita Hes7 proteínu je rozhodujúca pre somitové segmentačné hodiny. Nat Genet 36:750-754.

CrossRefMedline

Hiroi N, Graybiel AM (1996) Atypické a typické neuroleptické liečby indukujú odlišné programy expresie transkripčného faktora v striate. J Comp Neurol 374:70-83.

CrossRefMedline

Nádej B, Kosofsky B, Hyman SE, Nestler EJ (1992) Regulácia okamžitej skorej génovej expresie a väzby AP-1 v jadre potkana akumulovaného chronickým kokaínom. Proc Natl Acad Sci USA 89:5764-5768.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ (1994) Chronická liečba elektrokonvulzívnym záchvatom (ECS) vedie k expresii dlhodobo trvajúceho komplexu AP-1 v mozgu so zmeneným zložením a charakteristikami. J Neurosci 14:4318-4328.

abstraktné

Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ (1994b) Indukcia dlho trvajúceho komplexu AP-1 zloženého zo zmenených proteínov podobných Fos v mozgu chronickou kokaínom a inými chronickými liečbami. Neurón 13:1235-1244.

CrossRefMedline

Ishida A, Fujisawa H (1995) Stabilizácia proteínkinázy II závislej od kalmodulínu cez autoinhibičnú doménu. J Biol Chem 270:2163-2170.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Jariel-Encontre I, Salvat C, Steff AM, Pariat M, Acquaviva C, Furstoss O, Piechaczyk M (1997) Komplexné mechanizmy degradácie c-fos a c-jun. Mol Biol Rep 24:51-56.

CrossRefMedline

Jones S, Yakel JL (2003) Kazeínkináza ii (proteínkináza ck2) reguluje funkciu receptorového kanála serotonínu 5-ht (3) v bunkách ng108-15. Neurovedy 119:629-634.

CrossRefMedline

Kato T Jr, Delhase M, Hoffmann A, Karin M (2003) CK2 je C-terminálna IkappaB kináza zodpovedná za aktiváciu NF-kappaB počas UV reakcie. Mol Cell 12:829-839.

CrossRefMedline

Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L., Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR EJ (1999) Expresia transkripčného faktora deltaFosB v mozgu reguluje citlivosť na kokaín. príroda 401:272-276.

CrossRefMedline

Kim KB, Myung J, Sin N, Posádky CM (1999) Inhibícia proteazómu prírodnými produktmi epoxomicín a dihydroeponemycin: pohľady na špecifickosť a účinnosť. Bioorg Med Chem Lett 9:3335-3340.

CrossRefMedline

Kobayashi E, Nakano H, Morimoto M, Tamaoki T (1989) Kalphostín C (UCN-1028C), nová mikrobiálna zlúčenina, je vysoko účinný a špecifický inhibítor proteínkinázy C. Biochem Biophys Res Commun 159:548-553.

CrossRefMedline

Krek W, Maridor G, Nigg EA (1992) Kazeínkináza II je prevažne jadrový enzým. J Cell Biol 116:43-55.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Krohn NM, Stemmer C, Fojan P, Grimm R, Grasser KD (2003) Proteínkináza CK2 fosforyluje proteín s vysokou pohyblivosťou skupiny domén SSRP1, čo indukuje rozpoznávanie DNA poškodenej UV žiarením. J Biol Chem 278:12710-12715.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, Russo SJ, LaPlant Q, Whistler K, Neve RL, Self DW, Nestler EJ (2005) Remodelácia chromatínu je kľúčovým mechanizmom, ktorý je základom plasticity vyvolanej kokaínom v striate. Neurón 48:303-314.

CrossRefMedline

Lieberman DN, Mody I (1999) Kazeínkináza-II reguluje NMDA kanálovú funkciu v hipokampálnych neurónoch. Nat Neurosci 2:125-132.

CrossRefMedline

Litchfield DW (2003) Proteínkináza CK2: štruktúra, regulácia a úloha v bunkových rozhodnutiach života a smrti. Biochem J 369:1-15.

CrossRefMedline

Manabe T, Kuramoto N, Nakamichi N, Aramachi K, Baba K, Hirai T, Yoneyama M, Yoneda Y (2001) Degradácia proteínu c-Fos exprimovaného N-metyl-dkyselina asparágová v jadrových frakciách myšieho hipokampu. Brain Res 905:34-43.

Medline

Mandelzys A, Gruda MA, Bravo R, Morgan JI (1997) Absencia pretrvávajúceho zvýšeného antigénu príbuzného s 37 kDa fos a väzbovej aktivity podobnej AP-1 v mozgu myší fosB null liečených kyselinou kainovou. J Neurosci 17:5407-5415.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Marin O, Meggio F, Marchiori F, Borin G, Pinna LA (1986) Lokálna špecifickosť kazeínkinázy-2 (TS) z cytosolu pečene potkanov. Štúdia s modelovými peptidovými substrátmi. Eur J Biochem 160:239-244.

McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulácia génovej expresie a odmeňovania kokaínu CREB a DeltaFosB. Nat Neurosci 6:1208-1215.

CrossRefMedline

McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ (2004) DeltaFosB: molekulárny prepínač pre dlhodobú adaptáciu v mozgu. Brain Res Mol Brain Res 132:146-154.

Medline

Meggio F, Pinna LA (2003) Jeden tisíc a jeden substrát proteínkinázy CK2? FASEB J 17:349-368.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Meggio F, Donella-Deana A, Pinna LA, Moret V (1977) Fosforylácia kazeínových frakcií „fosvitínkinázou“ z pečene potkanov. FEBS Lett 75:192-196.

Medline

Meggio F, Brunati AM, Pinna LA (1983) Autofosforylácia TS kazeínkinázy typu 2 na oboch alfa-a beta-podjednotkách. Vplyv rôznych efektorov. FEBS Lett 160:203-208.

CrossRefMedline

Meggio F, Shugar D, Pinna LA (1990) Ribofuranozylbenzimidazolové deriváty ako inhibítory kazeínkinázy-2 a kazeínkinázy-1. Eur J Biochem 187:89-94.

Medline

Meggio F, Marin O, Pinna LA (1994) Substrátová špecificita proteínkinázy CK2. Cell Mol Biol Res 40:401-409.

Medline

Miller C, Zhang M, He Y, Zhao J, Pelletier JP, Martel-Pelletier J, Di Battista JA (1998) Transkripčná indukcia génu cyklooxygenázy-2 inhibíciou aktivity fosfatázy v humánnych chondrocytoch inhibíciou kyseliny okadaovej: ko-stimulácia AP-1 a CRE nukleárnych väzbových proteínov. J Cell Biochem 69:392-413.

CrossRefMedline

Moratalla R, Elibol B, Vallejo M, Graybiel AM (1996) Sieťové zmeny v expresii indukovateľných proteínov Fos-Jun v striate počas chronickej liečby a vysadenia kokaínu. Neurón 17:147-156.

CrossRefMedline

Morgan JI, Curran T (1995) Bezprostredne skoré gény: desať rokov. Trendy Neurosci 18:66-67.

CrossRefMedline

Nakabeppu Y, Nathans D (1991) Prirodzene sa vyskytujúca skrátená forma FosB, ktorá inhibuje transkripčnú aktivitu Fos / Jun. Bunka 64:751-759.

CrossRefMedline

Nestler EJ, Barrot M, Self DW (2001) Delta FosB: trvalý molekulárny prepínač pre závislosť. Proc Natl Acad Sci USA 98:11042-11046.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Neve RL, Howe JR, Hong S, Kalb RG (1997) Zavedenie podjednotky glutamátového receptora 1 do motorických neurónov in vitro a in vivo s použitím rekombinantného vírusu herpes simplex. Neurovedy 79:435-447.

CrossRefMedline

Nuthall HN, Joachim K, Stifani S (2004) Fosforylácia serínu 239 z Groucho / TLE1 proteínkinázou CK2 je dôležitá pre inhibíciu neuronálnej diferenciácie. Mol Cell Biol 24:8395-8407.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Okazaki K, Sagata N (1995) Mos / MAP kinázová dráha stabilizuje c-Fos fosforyláciou a zvyšuje jej transformačnú aktivitu v NIH 3T3 bunkách. EMBO J 14:5048-5059.

Medline

Palombella VJ, Rando OJ, Goldberg AL, Maniatis T (1994) Ubiquitín-proteazómová dráha je potrebná na spracovanie prekurzorového proteínu NF-kappa B1 a aktiváciu NF-kappa B. Bunka 78:773-785.

CrossRefMedline

Papavassiliou AG, Treier M, Chavrier C, Bohmann D (1992) Cielená degradácia c-Fos, ale nie v-Fos, signálom závislým od fosforylácie na c-Jun. veda 258:1941-1944.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ Schaeffer E (2003) Inducibilná expresia dominantného negatívneho mutanta c-Jun v transgénnych myšiach špecifická pre mozgovú oblasť znižuje citlivosť na kokaín. Brain Res 970:73-86.

CrossRefMedline

Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ (2004) Indukcia DeltaFosB v mozgových štruktúrach súvisiacich s odmenou po chronickom strese. J Neurosci 24:10594-10602.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Persico AM, Schindler CW, O'Hara BF, Brannock MT, Uhl GR (1993) Expresia faktora transkripcie mozgu: účinky akútneho a chronického amfetamínu a injekčného stresu. Brain Res Mol Brain Res 20:91-100.

Medline

Ploegh HL, Dunn BM (2000) Post-translačná modifikácia: fosforylácia a fosfatázy. V: Súčasné protokoly v oblasti proteínovej vedy (Dunn BM, ed.) Pp. 13.01-13.02. New York: Wiley a Sons.

Pyerin W, Burow E, Michaely K, Kubler D, Kinzel V (1987) Katalytické a molekulárne vlastnosti vysoko purifikovanej fosvitín / kazeínkinázy typu II z ľudských epitelových buniek v kultúre (HeLa) a vzťah k ekto proteínkináze. Biol Chem Hoppe Seyler 368:215-227.

Medline

Reikhardt BA, Kulikova OG, Borisova GY, Aleksandrova IY, Sapronov NS (2003) Stav systému „proteínkinázy CK2-HMG14“ vo veku závislej amnézie u potkanov. Neurosci Behav Physiol 33:799-804.

Medline

Roberts BJ, Whitelaw ML (1999) Degradácia základnej homológnej domény helix-loop-helix / Per-ARNT-Sim receptora dioxínu prostredníctvom dráhy ubikvitín / proteazóm. J Biol Chem 274:36351-36356.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Rost B, Yachdav G, Liu J (2004) Server PredictProtein. Nukleové kyseliny Res 32:W321-W326.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Rylski M, Kaczmarek L (2004) Ap-1 ciele v mozgu. Predné Biosci 9:8-23.

CrossRefMedline

Sahin B, Kansy JW, Nairn AC, Spychala J, Ealick SE, Fienberg AA, Greene RW, Bibb JA (2004) Molekulárna charakterizácia rekombinantnej myšej adenozínkinázy a vyhodnotenie ako cieľ fosforylácie proteínu. Eur J Biochem 271:3547-3555.

Medline

Salvat C, Aquaviva C, Jariel-Encontre I, Ferrara P, Pariat M, Steff AM, Carillo S, Piechaczyk M (1999) Existujú viaceré proteolytické dráhy, ktoré prispievajú k degradácii proteínu c-Fos, c-Jun a p53 in vivo? Mol Biol Rep 26:45-51.

CrossRefMedline

Schmidt R, Hecker E (1975) Automatická oxidácia forbolových esterov za normálnych skladovacích podmienok. Cancer Res 35:1375-1377.

ZADARMO plný text

Schwarz EM, Van Antverpy D, Verma IM (1996) Konštitutívna fosforylácia IkappaBalfa kazeínkinázou II sa prednostne vyskytuje na seríne 293: požiadavka na degradáciu voľnej IkappaBalfa. Mol Cell Biol 16:3554-3559.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Sears R, Leone G, DeGregori J, Nevins JR (1999) Ras zlepšuje stabilitu proteínu Myc. Mol Cell 3:169-179.

CrossRefMedline

Silva-Neto MA, Fialho E, Paes MC, Oliveira PL, Masuda H (2002) Fosforylácia vitelínu nezávislá od cyklického nukleotidu kazeínkinázou II purifikovaná z Rhodnius prolixus oocytes. Insect Biochem Mol Biol 32:847-857.

CrossRefMedline

Skinner M, Qu S, Moore C, múdrosť R (1997) Transkripčná aktivácia a transformácia proteínom FosB vyžadujú fosforyláciu domény aktivácie karboxylového konca. Mol Cell Biol 17:2372-2380.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Stemmer C, Schwander A, Bauw G, Fojan P, Grasser KD (2002) Proteínkináza CK2 diferenciálne fosforyluje proteíny skupiny B (HMGB) kukuričného chromozómu s vysokou pohyblivosťou modulujúce ich stabilitu a interakcie DNA. J Biol Chem 277:1092-1098.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Stevens I, Derua R, Rondelez E, Waelkens E, Merlevede W, Goris J (1999) Identifikácia cyk, cyklín B2 kinázy, ako novej vápnik / kalmodulín-dependentnej proteínkinázy II a jej úloha počas zrenia oocytov Xenopus laevis. Exp Cell Res 252:303-318.

CrossRefMedline

Suh HW, Choi SS, Lee JK, Lee HK, Han EJ, Lee J (2004) Regulácia expresie génu c-fos a c-jun lipopolysacharidom a cytokínmi v primárnych kultivovaných astrocytoch: účinok ciest PKA a PKC. Arch Pharm Res 27:396-401.

Medline

Szyszka R, Boguszewska A, Grankowski N, Ballesta JP (1995) Diferenciálna fosforylácia ribozomálnych kyslých proteínov z kvasinkovej bunky dvoma endogénnymi proteínkinázami: kazeínkinázou-2 a kinázou 60S. Acta Biochim Pol 42:357-362.

Medline

Tamaoki T, Takahashi I, Kobayashi E, Nakano H, Akinaga S, Suzuki K (1990) Calphostin (UCN1028) a zlúčeniny súvisiace s kalphostínom, nová trieda špecifických a účinných inhibítorov proteínkinázy C. Adv Second Messenger Phosphoprotein Res 24:497-501.

Medline

Torres J, Pulido R (2001) Tumorový supresor PTEN je fosforylovaný proteínovou kinázou CK2 na svojom C konci. Implikácie stability PTEN pri degradácii sprostredkovanej proteazómom. J Biol Chem 276:993-998.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Tsubuki S, Saito Y, Tomioka M, Ito H, Kawashima S (1996) Diferenciálna inhibícia aktivity calpainu a proteazómu peptidylaldehydmi di-leucínu a tri-leucínu. J Biochem (Tokio) 119:572-576.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Tsurumi C, Ishida N, Tamura T, Kakizuka A, Nishida E, Okumura E, Kishimoto T, Inagaki M, Okazaki K, Sagata N (1995) Degradácia c-Fos proteazómom 26S je urýchlená c-Jun a viacerými proteínkinázami. Mol Cell Biol 15:5682-5687.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Unger GM, Davis AT, Slaton JW, Ahmed K (2004) Proteínkináza CK2 ako regulátor prežitia buniek: implikácie pre terapiu rakoviny. Curr Cancer Drug Targets 4:77-84.

CrossRefMedline

Vial E, Marshall CJ (2003) Zvýšená aktivita kinázy ERK-MAP chráni člena rodiny FOS FRA-1 pred degradáciou proteazómov v bunkách karcinómu hrubého čreva. J Cell Sci 116:4957-4963.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S (2002) ΔFosB reguluje chod kolesa. J Neurosci 22:8133-8138.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Whitmarsh AJ, Davis RJ (2000) Regulácia funkcie transkripčného faktora fosforyláciou. Cell Mol Life Sci 57:1172-1183.

CrossRefMedline

Winter B, Kautzner I, Issinger OG, Arnold HH (1997) Pre doménu Myf-2 sú dôležité dve predpokladané fosforylačné miesta proteínkinázy CK5. Biol Chem 378:1445-1456.

Medline

Wisniewski JR, Szewczuk Z, Petry I, Schwanbeck R, Renner U (1999) Konštitutívna fosforylácia kyslých zvyškov proteínov s vysokou pohyblivosťou 1 proteínov kazeínkinázou II mení ich konformáciu, stabilitu a DNA väzbovú špecifickosť. J Biol Chem 274:20116-20122.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Yamaguchi Y, Wada T, Suzuki F, Takagi T, Hasegawa J, Handa H (1998) Kazeínkináza II interaguje s bZIP doménami niekoľkých transkripčných faktorov. Nukleové kyseliny Res 26:3854-3861.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Yanagawa T, Yuki K, Yoshida H, Bannai S, Ishii T (1997) Fosforylácia stresového proteínu A170 prostredníctvom aktivity kazeínkinázy II v makrofágoch. Biochem Biophys Res Commun 241:157-163.

CrossRefMedline

Yankulov K, Yamashita K, Roy R, Egly JM, Bentley DL (1995) Inhibítor transkripčného predĺženia 5,6-dichlór-1-beta-d-ribofuranozylbenzimidazol inhibuje proteínkinázu asociovanú s transkripčným faktorom IIH. J Biol Chem 270:23922-23925.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Yen J, Wisdom RM, Tratner I, Verma IM (1991) Alternatívna zostrihaná forma FosB je negatívnym regulátorom transkripčnej aktivácie a transformácie proteínmi Fos. Proc Natl Acad Sci USA 88:5077-5081.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Yin X, Jedrzejewski PT, Jiang JX (2000) Kazeínkináza II fosforyluje šošovku Conexin 45.6 a podieľa sa na jeho degradácii. J Biol Chem 275:6850-6856.

Abstrakt / ZADARMO plný text

Yoza BK, Brooks JW, Mizel SB (1992) Indukcia zložiek transkripčného faktora AP-1 počas aktivácie T-buniek interleukínom 1 a forbolových esterov. Cell Growth Differ 3:677-684.

abstraktné

Yu S, Wang H, Davis A, Ahmed K (2001) Dôsledky signalizácie CK2 do jadrovej matice. Mol Cell Biochem 227:67-71.

CrossRefMedline

Yu S, Davis AT, Guo C, Green JE, Ahmed K (1999) Diferenciálne zameranie proteínkinázy CK2 na jadrovú matricu po prechodnej nadmernej expresii jej podjednotiek. J Cell Biochem 74:127-134.

CrossRefMedline

Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ (2006) AFosB: základná úloha pre AFosB v nucleus accumbens pri účinku morfínu. Nat Neurosci 9:205-211.

CrossRefMedline

Články citujúce tento článok

  • Reakcie na behaviorálne a štrukturálne reakcie na chronický kokaín vyžadujú doprednú slučku obsahujúcu FosB a vápnik / kalmodulínom závislú proteínovú kinázu II v Nucleus Accumbens Shell Journal of Neuroscience, 6 March 2013, 33(10):4295-4307
  • Striatálna nadmerná expresia {Delta} FosB reprodukuje chronické nedobrovoľné pohyby vyvolané levodopou Journal of Neuroscience, 26 máj 2010, 30(21):7335-7343
  • abstraktné
  • Plný text
  • Plný text (PDF)
  • abstraktné
  • Plný text
  • Plný text (PDF)
  • abstraktné
  • Plný text
  • Plný text (PDF)
  • abstraktné
  • Plný text
  • Plný text (PDF)
  • Transkripčné mechanizmy závislosti: úloha {Delta} FosB Filozofickej transakcie kráľovskej spoločnosti B: Biological Sciences, 12 Október 2008, 363(1507):3245-3255
  • Trvalá zraniteľnosť voči opätovnému výskytu metamfetamínového správania u myší s mutantnými neurotrofickými faktormi odvodenými z gliálnej bunkovej línie FASEB Journal, 1 July 2007, 21(9):1994-2004
  • Transkripčný faktor aktivačného proteínu-1 v karcinogenéze respiračného epitelu Molecular Cancer Research, 1 Február 2007, 5(2):109-120