Proc Natl Acad Sci US A. Apr 29, 2014; 111 (17): 6455 – 6460.
Publikované online Apr 15, 2014. doi: 10.1073 / pnas.1404323111
PMCID: PMC4036004
Neurovedy
Tento článok bol citované iné články v PMC.
Význam
Dopamínové (DA) neuróny vo ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) reagujú na averzívne stimuly väčšinou prechodným umlčaním. Zostáva nejasné, či táto reakcia priamo indukuje averzívne reakcie u myší, ktoré sa správajú. Túto otázku sme skúmali optogenetickým riadením DA neurónov vo VTA a zistili sme, že inaktivácia DA neurónov viedla k averzívnej reakcii a učeniu. Jadro accumbens (NAc), hlavné výstupné jadro neurónov VTA DA, bolo považované za zodpovedné za túto reakciu, preto sme skúmali, ktorá zo základných dráh v NAc bola kritická pre toto správanie použitím knockdown D1 alebo D2 receptora, a zistili, že dráha špecifická pre receptor D2 bola pre toto správanie kľúčová.
abstraktné
Dopamínový (DA) prenos z ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) je rozhodujúci pre kontrolu odmeňovania aj averzívneho správania. Prechodné umlčanie DA neurónov je jednou z reakcií na averzívne podnety, ale jeho dôsledky a nervové mechanizmy týkajúce sa averzívnych reakcií a učenia sa do značnej miery zachovali., Tu, uvádzame, že optogenetická inaktivácia neurónov VTA DA rýchlo down-regulovala hladiny DA a indukovala up-reguláciu nervovej aktivity v nucleus accumbens (NAc), ako bolo vyhodnotené expresiou Fos. Tjeho optogenetická supresia zapálenia DA neurónov okamžite vyvolala averzívne reakcie na predtým preferovanú tmavú miestnosť a viedla k averzívnemu učeniu smerom k optogeneticky podmienenému miestu. Dôležité je, že táto averzia bola zrušená knockdownom dopamínových D2 receptorov, ale nie receptormi D1 v NAc.. Tlmenie DA neurónov vo VTA bolo teda nevyhnutné na indukciu averzívnych reakcií a učenie sa prostredníctvom dopamínových D2 receptorov v NAc.
Mesolimbický dopaminergný systém zohráva nielen kľúčovú úlohu v širokom spektre motivácie a učenia (1-3), ale jeho dysfunkcia sa tiež podieľa na závažných neuropsychiatrických poruchách, ako je ilustrované v Parkinsonovej chorobe, schizofrénii a drogovej závislosti. Dopamínové (DA) neuróny vo ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) reagujú na odmeňovanie podnetov pomocou fázového pálenia a hlavnou funkciou tohto streľby je teoreticky zakódovať „chybu predikcie odmeny“, teda rozdiel v hodnote medzi predpokladanou odmenou a hodnotou. skutočná odmena (4). Na rozdiel od reakcie na odmeňovanie podnetov, ich reakcie na averzívne podnety nie sú ani zďaleka homológne; niektoré neuróny DA sú aktivované v reakcii na averzívne podnety, zatiaľ čo väčšina ostatných reaguje prechodným potlačovaním ich vypaľovania (5-9). Nedávne štúdie ukázali, že optogenetická aktivácia GABAergných neurónov a výsledná inaktivácia DA neurónov potláča spotrebu odmien a indukuje averzívnu odozvu (10, 11). Avšak do značnej miery zostala nepolapiteľná, pokiaľ ide o to, ktoré mechanizmy v neurálnych obvodoch sú nevyhnutné pre získanie averzívneho učenia po inaktivácii DA neurónov vo VTA a ako sú reakcie na správanie kontrolované smerom k potlačeniu konzumácie odmien a navodeniu averzívneho správania.
Nahromadené dôkazy ukázali, že motivačné a kognitívne učenie ako reakcia na pozitívne a negatívne stimuly je do značnej miery regulované nervovými obvodmi vrátane bazálnych ganglií (12), ktoré dostávajú veľké množstvo dopaminergnej projekcie zo stredného mozgu. V striate sú dva základné nervové obvody tvorené špecifikovanými stredne veľkými ostnatými neurónmi (MSN), z ktorých každý exprimuje odlišný typ DA receptora (13).
- Jeden okruh je priama cesta, pozostávajúca z MSN, ktoré priamo premietajú do výstupných jadier bazálnych ganglií, substantia nigra pars reticulata (SNr) a prevažne exprimujú dopamínové D1 receptory (D1R).
- Druhou je nepriama cesta, pozostávajúca z MSN, ktoré premietajú nepriamo cez globus pallidus na SNr a primárne exprimujú dopamínové D2 receptory (D2R).
Signály DA zo stredného mozgu dynamicky modulujú tieto dve paralelné dráhy opačným spôsobom prostredníctvom D1R a D2R a táto modulácia má uľahčiť motivačné učenie (3, 14).
- Čo sa týka podnetných stimulov, zvýšená úroveň DA indukovaná odmeňovaním signálov sa považuje za aktiváciu D1Rs a tým predovšetkým uľahčuje priamu dráhu v jadre accumbens (NAc).
- Na druhej strane supresia DA neurónov v reakcii na averzívne stimuly znižuje hladiny DA v NAc; a táto reakcia má špecificky podporovať prenos signálu v nepriamej dráhe prostredníctvom aktivovaných D2R.
Hoci štúdie využívajúce farmakologické stratégie a metódu reverzibilnej neurotransmisie (RNB) podporujú tento mechanizmus regulácie v NAc (15, 16), nie je známe, či potlačenie DA neurónov je dostatočné na podporu aktivity nepriamej dráhy a následne indukuje vyhýbavé správanie. V tejto štúdii sme sa touto problematikou zaoberali selektívnou inaktiváciou DA neurónov vo VTA optogeneticky manipulujúcim membránovo-hyperpolarizujúcim Arch proteínom (17) a explicitne preukázali, že supresia DA neurónov vo VTA následne znížila hladiny DA v NAc a indukovala averzívnu reakciu a učenie. Ďalej sme skúmali mechanizmy regulácie tejto reakcie a zistili, že táto averzívna reakcia bola špecificky kontrolovaná pomocou D2R v NAc.
výsledky
Optogenetická inaktivácia DA neurónov blokuje preferenciu temnej miestnosti.
Na selektívnu inaktiváciu vypaľovania DA neurónov sme injektovali Cre-indukovateľný adeno-asociovaný vírusový konštrukt kódujúci Arch-eGFP [AAV-dvojitý floxovaný otvorený čítací rámec (DIO) -Arch] (17) jednostranne do VTA dospelých myší tyrozínhydroxylázy (TH) -Cre (18) a divých (WT) súrodencov a umiestnili optické vlákno nad VTA (\ tObrázok S1 A a C). Dva týždne po operácii sa Arch-eGFP v VTA obmedzene detegoval (Obrázok S1B). Testovali sme hyperpolarizačný účinok proteínu Arch pomocou elektrofyziologického záznamu a merali sme účinok optickej stimulácie VTA u myší TH-Cre, ktorým bol injikovaný AAV-DIO-Arch. In vivo elektrofyziologické záznamy z VTA anestetizovaných myší TH-Cre odhalili, že optická stimulácia predpokladaných DA neurónov inhibovala ich vypaľovanie (Obrázok S2), čo ukazuje, že optická stimulácia dostatočne hyperpolarizovala membránový potenciál Arch-exprimujúcich DA buniek, a tým inhibovala ich spontánne pálenie.
Použitím týchto myší sme ďalej skúmali, či optická inaktivácia DA neurónov vo VTA by mohla slúžiť ako averzívny signál pre behaviorálne učenie. Myši majú vrodenú tendenciu uprednostňovať tmavé prostredie (19). Navrhli sme behaviorálny aparát, v ktorom myši mohli voľne preskúmať tmavú miestnosť a otvoriť svetlý priestor (Obr. 1A). Po habituácii myši WT zostali prednostne v tmavej miestnosti buď s alebo bez optickej stimulácie v tmavej miestnosti (Obrázok S1D), aby sa zabezpečilo, že samotná optická stimulácia nebude mať žiadny vplyv na ich správanie preferujúce tmavú miestnosť. Plánovali sme behaviorálny experiment zvierat na testovanie účinku optickej inaktivácie DA neurónov na ich správanie (Obrázok S1E). Po habituácii a predbežnom testovaní sa myši upravili optickou stimuláciou DA neurónov vo VTA, keď zostali v tmavej miestnosti. Dokonca aj počas prvého 5 min kondicionovania zostali myši TH-Cre mimo predtým preferovanej tmavej miestnosti a postupne sa vyhýbali tmavej miestnosti počas kondicionovania (Obr. 1B). Myši TH-Cre nezvrátili svoju elimináciu voči tmavej miestnosti, aj keď v posttestu nedostali žiadnu optickú stimuláciu (Obr. 1C). Tieto údaje ukazujú, že hyperpolarizácia DA neurónov nielen indukovala prechodné averzívne správanie, ale tiež slúžila ako signál pre averzívne učenie sa proti tmavej miestnosti a tiež demonštrovala, že inaktivácia DA neurónov zohrávala kauzálnu úlohu pri prechodnom averzívnom správaní a dlhodobom averzívnom učení.
Optogenetická down-regulácia hladín DA v NAc.
Ďalej sme skúmali, či inaktivácia DA neurónov vo VTA skutočne modifikovala koncentráciu DA v jeho hlavnej cieľovej oblasti, NAc. Merali sme hladiny DA v NAc pomocou cyklickej voltametrie s rýchlym skenovaním (FSCV) u myší s anestetizovanými TH-Cre, ktorým bol injikovaný AAV-DIO-Arch do ich VTA. Hladiny DA v NAc boli okamžite zvýšené elektrickou stimuláciou VTA a evokované uvoľnenie DA bolo významne znížené súčasnou optickou stimuláciou VTA (Obrázok S3). Potom sme testovali, či optická stimulácia VTA môže znížiť tonickú úroveň DA v NAc. V rovnakom experimentálnom prostredí sme pozorovali, že hladina DA v NAc bola prechodne znížená pomocou 20 s optickou stimuláciou VTA (Obr. 2), čo je v súlade s hlásenou FSCV reakciou proti averzívnym stimulom (20). Tieto údaje ukazujú, že optická stimulácia VTA bola dostatočne účinná na inaktiváciu neurónov VTA DA a na zníženie hladiny DA v NAc počas behaviorálneho experimentu.
Up-regulácia expresie génov Fos optickou inaktiváciou DA neurónov vo VTA.
Zmena správania spôsobená podmienenou inaktiváciou DA neurónov vo VTA naznačuje, že optická stimulácia priamo zmenila nervovú aktivitu a viedla k posunu behaviorálneho výkonu. Ďalej sme skúmali oblasti, v ktorých bola nervová aktivita zvýšená podmienenou inaktiváciou DA neurónov skúmaním expresie Fos, bezprostredného skorého génu. Čoskoro po vykonaní kondicionovania v teste tmavej miestnosti boli myši rýchlo spracované na stanovenie množstva expresie Fos kvantitatívnou analýzou hybridizácie in situ (Obr. 3 a Obrázok S4). NAc, oblasť, ktorá dostáva veľké množstvo dopaminergných projekcií z VTA, vykazovala významne zvýšené množstvo expresie Fos v myšiach TH-Cre (Obr. 3). Táto up-regulácia bola zistená aj na kontralaterálnej strane optickej stimulácie, ktorá bola údajne spôsobená malým množstvom vírusovej infekcie na tejto strane. Avšak up-regulácia bola omnoho vyššia na ipsilaterálnej strane ako na kontralaterálnej strane optickej stimulácie, čo naznačuje, že optická inaktivácia DA neurónov priamo up-regulovala nervovú aktivitu NAc. Zvýšená expresia Fos bola tiež pozorovaná v iných oblastiach mozgu, vrátane septum, periventrikulárnych oblastí striatum, basolaterálnej amygdaly (BLA) a laterálneho hypotalamu, ale nie v laterálnom habenula alebo mediálnom prefrontálnom kortexe (mPFC; Obrázok S4). Tieto výsledky ukazujú, že oblasti aktivované optickou inaktiváciou DA neurónov neboli obmedzené na priame cieľové oblasti neurónov VTA DA, ale skôr zahŕňali oblasti, ktoré mohli byť nepriamo aktivované spôsobom závislým od nervového obvodu. Toto pozorovanie naznačuje, že optická inaktivácia neurónov DA modifikovala neuronálnu aktivitu v celom obvode a mohla nielen vyvolať averzívnu reakciu, ale tiež spustiť niekoľko ďalších mozgových funkcií, ako sú úzkosť, strach a reakcie na stres (21).
DA signalizácia prostredníctvom D2R je kritická pre optogeneticky indukovanú averziu na upravenom mieste.
Väčšina dopaminergných signálov z VTA sa prenáša na MSN v NAc prostredníctvom DA receptorov, D1R a D2R. D1R je takmer výlučne exprimovaný v substancii P (kódovanej génom Tac1) -exprimujúcim MSN a D2R je exprimovaný prevažne v enkefalíne (kódovanom génom Penk) -exprimujúcim MSN; každý typ MSN predstavuje priame a nepriame cesty v NAc (3). Pretože afinita pre DA je oveľa vyššia pre D2R (poradie nM) ako pre D1R (uM poradie) (22, 23) sa predpokladá, že zníženie hladín DA vedie k inaktivácii Gi-pripojený D2R, ale nemá žiadny významný vplyv na D1R (3, 24), čím sa reguluje nervová aktivita špecificky v nepriamej dráhe. Okrem toho, Fos aktivácia bola výraznejšie pozorovaná v bunkách exprimujúcich Penk- alebo Drd2 (D2R) ako v bunkách exprimujúcich Tac1- alebo Drd1a (D1R) (Obrázok S5). Na základe týchto pozorovaní sme predpokladali, že DA signalizácia prostredníctvom D2R by mohla hrať hlavnú úlohu v pozorovanej averzívnej kondícii.
Na overenie tejto hypotézy sme vykonali trojkomorový test podmienenej averzie (CPA) (Obrázok S6). Pripravili sme behaviorálny prístroj obsahujúci dve komory s prakticky identickými okolnosťami a jednu malú chodbu. Tento nezvratný environmentálny stav v teste CPA nám umožnil ďalej skúmať, či inaktivácia neurónov VTA DA je schopná navodiť okrem blokovania preferencie tmavej miestnosti indukciu averzívnej reakcie a učenia. Keď sa zvieratám umožnilo voľne sa pohybovať po celom prístroji, väčšina z nich zostala v dvoch komorách bez akéhokoľvek typického rozdielu v správaní. Optická úprava sa potom uskutočnila spárovaním optickej stimulácie s jednou pevnou komorou. Dokonca aj keď sa jedna z komôr použila na kondicionovanie, myši TH-Cre trvalo a významne sa vyhýbali zostávaniu v opticky upravenej komore počas kondicionovania a v posttestu (Obrázok S6 B-E). Štatistická analýza potvrdila významné zníženie času zotrvania u myší TH-Cre v opticky upravenej komore v posttestu v porovnaní s časom zotrvania u myší WT (Obrázok S6F).
Potom sme sa pokúsili špecifikovať podtypy DA receptorov, ktoré sa podieľajú na tomto averzívnom správaní, špecifickým potlačením každého z DA receptorov v NAc (Obr. 4 a Obrázok S7). Navrhli sme a overili lentivírusové vektory obsahujúce krátku vlásenkovú RNA (shRNA) špecifickú pre každý DA receptor s konštitutívnou expresiou mCherry. Tri týždne po injektovaní lentivírusu do NAc bola v NAc lokalizovaná robustná expresia mCherry (Obr. 4B). Účinné zníženie expresie mRNA každého receptora bolo potvrdené kvantitatívnou PCR analýzou v reálnom čase (Obr. S7A). Meranie hladín proteínu pomocou Western blottingu tiež ukázalo, že injekcia každého z lentivírusov selektívne redukuje svoj cieľový proteínový produkt bez ovplyvnenia expresie iného subtypu DA receptora (Obr. 4C a Obrázok S7 B-G). Lentivírusy exprimujúce shD1R a shD2R znížili hladinu cieľového proteínu na 46.2 ± 1.1% a 38.4 ± 4.9% v porovnaní s hladinou kontrolného vírusu (Obr. 4C). Tieto výsledky overili, že lentivírusové vektory exprimujúce shRNA špecifickú pre D1R a D2R selektívne a dostatočne suprimujú svoje cieľové RNA a down-regulujú množstvo príslušných proteínových produktov. Tiež sme potvrdili, že expresia mCherry sprostredkovaná vírusom nebola detegovaná vo VTA, s vylúčením možnosti, že shRNA sprostredkovaná lentivírusom priamo ovplyvnila VTA.
Pomocou týchto lentivírusov obsahujúcich shRNA sme testovali, ktorý typ DA receptora je zodpovedný za averzívne správanie vyvolané optogenetickou inaktiváciou DA neurónov. Injektovali sme lentivírus alebo kontrolný lentivírus obsahujúci shRNA do bilaterálneho NAc spolu s AAV-DIO-Arch do ľavej VTA myší TH-Cre. Optické vlákno bolo tiež vložené nad VTA (Obr. 4A). Keď sa uskutočnil trojkomorový CPA test tri týždne po chirurgickom zákroku, myši TH-Cre, ktorým sa injikovalo lenti: shD1R-mCherry, stále vykazovali explicitnú CPA proti komore s optickou stimulačnou párou porovnateľnej s TH-Cre myšami, ktorým sa injekčne podala injekcia. control lentivirus (lenti: mCherry). Na rozdiel od toho, myši TH-Cre injikované lenti: shD2R-mCherry nedokázali preukázať zrejmú CPA počas kondicionovania (Obr. 4D). Exkluzívny deficit učenia myší TH-Cre injikovaných lenti: shD2R-mCherry bol ďalej doložený analýzou averzívneho učenia v posttestu (Obr. 4E). Tieto výsledky demonštrujú, že averzívne správanie k miestu podmienenému inaktiváciou DA neurónov bolo špecificky vyvolané prostredníctvom D2R, a nie prostredníctvom D1R, v NAc.
Diskusia
Štúdie v striate ukázali, že aktivácia Gs-pripojený D1R uľahčuje jeho vypaľovanie, zatiaľ čo aktivácia Gi-pripojený D2R má za následok potlačenie účinnosti vypaľovania (25). AcVzhľadom na špecifickosť expresie DA receptora, fázové vypaľovanie DA neurónov aktivuje hlavne priamu cestu cez D1R, zatiaľ čo prechodné zníženie počtu DA neurónov podporuje predovšetkým nepriamu kompetenciu prostredníctvom D2R (3, 26). Na základe tohto mechanizmu regulácie sa navrhlo, že umlčanie DA neurónov v reakcii na averzívne stimuly sa spracováva hlavne prostredníctvom nepriamej dráhy a vedie k averzívnemu správaniu. (3). Nedávne štúdie ukázali, že blokáda synaptického prenosu nepriamej dráhy zhoršuje získavanie averzívneho správania vyvolaného elektrickým šokom (15) a že toto zhoršenie je spôsobené inhibíciou prenosu signálu sprostredkovaného D2R (16). jaOkrem toho optogenetická up-regulácia D2R-exprimujúcich MSN v nepriamej dráhe evokuje vyhnutie sa správaniu (27). Pretože však DA neuróny vykazujú ako zvýšené, tak aj potlačené pálenie v reakcii na averzívne podnety a pretože v mozgu sa súčasne spracúvajú aj iné senzorické informácie súvisiace so šokom, stále je potrebné objasniť, či by umlčanie DA neurónov mohlo priamo spúšťať averzívnu reakciu a učenie, a či je táto reakcia regulovaná prostredníctvom D2R-exprimujúcich MSN v nepriamej dráhe.
V tejto štúdii sme použili optogenetickú kontrolu zápalov DA neurónov v dvoch behaviorálnych testoch: test preferencie tmavej miestnosti a trojkomorový test CPA. Naša optogenetická manipulácia ukázala efektívnu potlačenie DA neurónov v VTA a down-reguláciu DA hladín v NAc, Naša presná optogenetická inaktivácia paľby neurónov DA iba v období, keď zvieratá zostali v kondicionovanej komore, vyvolala averzívnu reakciu a učenie sa, čo dokazuje, že prechodné umlčanie DA priamo spôsobilo pasívne vyhýbanie sa správaniu. Ďalej toto vyšetrovanie objasnilo, že spracovanie signálu sprostredkované D2R je kľúčovým determinantom vyvolania tejto averzívnej reakcie a učenia sa.
Aj keď naše údaje preukázali, že D1R nemal žiadny účinok na behaviorálne experimenty na vyvolanie CPA, niekoľko štúdií preukázalo, že na reakciu strachu a averzívne učenie sa vyžaduje fázové vypaľovanie neurónov DA (28, 29). Tento rozdiel je spôsobený experimentálnym nastavením; tj náš optogénny prístup vylučoval možnosť signalizácie prostredníctvom aktivovaných DA neurónov vyvolať averzívne správanie, čo naznačuje, že inaktivujúce DA neuróny boli dostatočné na vyvolanie averzívneho správania a učenia sa. Spracovanie funkcií a signálov aktivovaného paľby DA vyvolané averzívnymi stimulmi by malo odlišné príspevky k averzívnym správaním, ako sú tie, ktoré sa tu študovali, a bude potrebné ich v budúcnosti objasniť.
DA neuróny tiež premietajú do rôznych ďalších oblastí, vrátane mPFC, amygdaly a hippocampu. Nedávna štúdia naznačila, že optogenetická aktivácia laterálnych habenula neurónov premietajúcich do DA neurónov vo VTA je schopná indukovať averzívne správanie a tieto DA neuróny sa hlavne a špecificky zameriavajú na mPFC (30), hoci ich optogenetické kondicionovanie bolo iné ako v našej súčasnej štúdii, pretože ich optogenetická stimulácia bola predĺžená na celé kondičné kondicionovanie. Pretože sa uvádza, že dopaminergný vstup do mPFC je aktivovaný nielen averzívnymi stimulmi, ale aj chronickým stresom (31, 32) je možné, že ich nepretržitá aktivácia DA neurónov projektujúcich mPFC by sa vnímala ako signály z vysoko stresového prostredia; a ako výsledok akumulácie stresového kondicionovania by zvieratá vykazovali averzívne správanie v podmienenej komore. Naopak, inhibovali sme vystrelenie DA neurónov iba vtedy, keď zvieratá zostali v kondicionovanej komore. Výsledky našich behaviorálnych experimentov využívajúcich časovo prispôsobené kondicionovanie naznačili, že náhle potlačenie signálu DA by sa vnímalo ako náhly averzívny vstup, čo malo za následok ich rýchlu averzívnu reakciu.
DA neuróny tiež projektujú amygdalu, región, ktorý do značnej miery prispieva k reakcii na strach. Signalizácia DA pre amygdalu sa skutočne podieľa na reakcii na strach a získaní pamäte strachu (33, 34). V našej štúdii označovanie DA neurónov vo VTA identifikovalo súbor DA neurónov premietajúcich do BLA, ale rozsah týchto projekcií bol oveľa nižší ako rozsah projekcií na NAc. Aj keď sme nemohli vylúčiť jemný účinok amygdala projektovanej DA signalizácie na naše pozorované averzívne správanie, hlavný účinok našej optogenetickej inaktivácie DA neurónov by mal byť na NAc, pretože naše experimenty so špecifickým potlačením D2R v NAc dramaticky poklesli averzívne správanie. Budúce výskumy zamerané na cieľovo špecifickú DA signalizáciu sú potrebné na objasnenie účinkov modifikácie DA neurónov v celom obvode na averzívne stimuly a úpravu strachu.
Materiály a metódy
Predmety.
Tyrozínhydroxyláza :: knock-in myši IRES-Cre (TH-Cre) (EM: 00254) (18) boli získané z Európskeho archívu mutantov myši. Všetky pokusné zvieratá boli krížené s kmeňom C57BL / 6J už viac ako 10 generácie. Myši sa spárili s myšami C57BL / 6J WT a chovali sa štandardným cyklom 12-h svetlo / 12-h v tme a dostávali potravu a vodu podľa potreby. Cre+ a Cre- na experimenty sa použili myši z tých istých vrstiev (vek 3 - 6). Všetky pokusy na zvieratách boli schválené komisiou pre zvieratá v Osaka Bioscience Institute na základe pokynov pre pokusy na zvieratách.
Testy správania.
Počas všetkých behaviorálnych testov boli myši spojené optickým vláknom a nechali sa pohybovať po celom prístroji. Pohyb myší sa monitoroval tak, aby sa mohli pohybovať bez akýchkoľvek prekážok, aj keď boli na svojich hlavách spojené optickým vláknom. Poloha myši sa detegovala videokamerou zavesenou na prístroji na behaviorálne vyšetrenie a analyzovala sa na mieru vyrobeným programom pomocou softvéru Labview.
Test preferencie v tmavej miestnosti.
Behaviorálny aparát na mieru používaný v teste sa skladal z tmavej miestnosti (15 x 9.5 cm) a svetlého otvoreného priestoru (15 × 11 cm). Tmavá miestnosť mala steny, podlahu a strechu, ktoré boli všetky zafarbené čiernou farbou a mali vchod (dlhý 4.5 cm) do otvoreného svetlého priestoru. Otvorený svetlý priestor bol tvarovaný ako elipsa a mal kovovú mriežkovú podlahu a jasné steny bez strechy. Pred testom boli všetky myši v prístroji navyknuté 10 min. Test pozostával z troch sedení: na začiatku polovice dňa 1 (pred skúškou: 5 min.) Sa myšiam umožnilo preskúmať celý prístroj. Od konca polovice dňa 1 do dňa 4 (kondicionovanie: celkom 35 min.) Dostali myši optickú stimuláciu, keď zostali v tmavej miestnosti. V deň 5 sa preferencia tmavej miestnosti testovala bez optickej stimulácie (posttest: 5 min .; Obrázok S1E).
Trojkomorový test CPA.
Prístroj na preferované miesto s trojkomorovým kondicionovaným miestom / CPA použitý v teste sa skladal z dvoch komôr (10 × 17 cm) a spojovacej chodby. Test pozostával z troch sedení. Deň 1 (test: 15 min): Myši mohli voľne skúmať celý prístroj. Myši, ktoré zostali 1.5-krát dlhšie v jednej komore ako v druhej, boli z testu vylúčené. Dni 2 a 3 (kondicionovanie: každý 15 min): Myši dostali optickú stimuláciu, keď zostali v komore spárovanej svetlom. Výber komory spárovanej svetlom bol vyvážený. Deň 4 (po teste: 15 min): Test sa uskutočnil za rovnakých podmienok ako v teste (Obrázok S6A).
V kondicionovacej relácii bola optická stimulácia zastavená pre 30 s, keď myši nepretržite zostávali nad 30 s v tmavej miestnosti alebo v komore spárovanej svetlom, aby sa zabránilo prehriatiu. Vo všetkých testoch správania sa výkon lasera reguloval tak, aby bol približne 5 mW na špičke optického vlákna.
Cyklická voltametria Vivo Fast-Scan.
Experimenty FSCV sa uskutočňovali s použitím metódy opísanej v predchádzajúcich štúdiách (35-37). Myši sa anestetizovali zmesou ketamínu / xylazínu, ako je opísané v časti 4.2 SI Materiály a metódy a umiestnená do stereotaxického rámu. Optické vlákno použité na stimuláciu Arch-exprimujúcich DA neurónov bolo umiestnené blízko stimulačnej elektródy. Stimulačná optróda sa potom umiestnila do VTA (z bregma: predný-zadný, -3.2 mm; bočný, 0.5 mm; a dorzálny-ventrálny, 3.5 mm) a znížil sa v intervaloch 0.25-mm. Mikroelektróda z uhlíkových vlákien (dĺžka 300 µm) na voltametrické zaznamenávanie bola znížená do NAc (z bregma: predný-zadný, 1.0 mm; laterálny, 1.0 mm; a dorzálno-ventrálny, 3.5 mm). Voltametrické merania sa uskutočňovali každých 100 ms použitím trojuholníkového tvaru vlny (-0.4 V až + 1.3 V až -0.4 V oproti Ag / AgCl, pri 400 V / s) na mikroelektródu z uhlíkových vlákien. Na izoláciu tvaru vlny a amplifikáciu prúdu sa použil potenciostat vyrobený na mieru. Uvoľňovanie DA bolo vyvolané elektrickou stimuláciou neurónov DA pomocou pulznej stimulácie 24 (100 uA, doba trvania 5 ms, 30 Hz). Optická stimulácia DA neurónov (532 nm, ∼5 mW výkon na špičke vlákna) sa aplikovala na 10 s počiatočným 5 s pred začiatkom elektrickej stimulácie. Mikroelektródy z uhlíkových vlákien boli kalibrované v roztoku so známymi koncentráciami DA (0.2 uM, 0.5 uM a 1.0 uM). Všetky voltametrické údaje boli analyzované na mieru vyrobenými programami pomocou softvéru Labview a Matlab. Zníženie hladín DA optickou stimuláciou bolo vyriešené pomocou analýzy hlavných komponentov pomocou šablón DA kriviek získaných z elektrických stimulov VTA na oddelenie dopamínových signálov (35, 36).
Štatistická analýza.
Štatistická analýza sa uskutočňovala pomocou GraphPad PRISM 5.0 (GraphPad Software). Dáta boli analyzované opakovanými meraniami ANOVA (Obr. 1B, , 4D,4Da Obrázok S6 D a E) alebo jednosmerná ANOVA (Obr. 1C, , 3D,3D, 4 C a Ea Obr. S4 K-M, S6Fa S7A) a post hoc analýzy sa vykonali pomocou Bonferroniho testu. Všetky značky / stĺpce a stĺpce predstavovali stredný priemer a ± SEM.
Ďalšie experimentálne postupy vrátane prípravy a injekcie vírusu, elektrofyziologického záznamu a imunohistochemickej analýzy a analýzy mRNA sú podrobne opísané v SI Materiály a metódy.
Poďakovanie
Ďakujeme E. Boydenovi za konštrukciu Arch, R. Matsuimu za technické poradenstvo pri výrobe a čistení lentivírusu a Y. Hayashimu za technické poradenstvo pri programovaní analýzy údajov. Túto prácu podporili výskumné granty v rámci pomoci 22220005 (do SN), 23120011 (do SY a SN), 24700339 (do TD) a 25871080 (do SY) z ministerstva školstva, kultúry, športu, vedy a Technológia Japonska a grant od Takeda Science Foundation (SN).
poznámky pod čiarou
Autori neuvádzajú žiadny konflikt záujmov.
Tento článok obsahuje podporné informácie online na adrese www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1404323111/-/DCSupplemental.
Referencie
;
