Dopamín posilňuje snahu o odmenu tým, že podporuje excitáciu vyvolanú cudzími príznakmi v nucleus accumbens (2014)

úvod

Projekcia dopamínu z ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) na NAc je základnou zložkou nervového obvodu, ktorá podporuje správanie hľadajúce odmenu (Nicola, 2007). Ak je experimentálna redukcia funkcie NAc dopamínu, zvieratá majú menej pravdepodobnosti vyvinúť úsilie na získanie odmeny (Salamone a Correa, 2012) a často nedokážu reagovať na predvídateľné odozvy (Di Ciano a kol., 2001; Yun a kol., 2004; Nicola, 2007, 2010; Saunders a Robinson, 2012). Tieto nedostatky sú spôsobené zhoršením špecifickej zložky odmeňovania: latencia iniciovania prístupu k správaniu sa zvyšuje, zatiaľ čo rýchlosť prístupu, schopnosť nájsť cieľ a vykonať potrebné správanie operantov, ktoré sú potrebné na získanie odmeny, a schopnosť spotreba nie sú ovplyvnené (Nicola, 2010). Dopamín musí podporovať prístup tým, že ovplyvňuje aktivitu NAc neurónov, ale povaha tohto vplyvu zostáva nejasná. Veľké podiely neuronov NAc sú excitované alebo inhibované odhalenými prediktívnymi znameniami (Nicola a spol., 2004a; Roitman a kol., 2005; Ambroggi a kol., 2008, 2011; McGinty a kol., 2013) a excitácie začínajú pred nástupom správania s priamym prístupom a predpovedajú latenciu na iniciáciu lokomotívy (McGinty a kol., 2013). Preto táto aktivita má charakteristiky požadované pre signál závislý od dopamínu, ktorý podporuje prístup cued, ale či to tak nie je známe.

Neuróny v dvoch štruktúrach, ktoré vysielajú glutamátergické aferenty do NAc, BLA a dorzálnej mediálnej PFC (Brog a kol., 1993), sú vzrušené prediktívnymi podnetmi (Schoenbaum a spol., 1998; Ambroggi a kol., 2008) a reverzibilná inaktivácia jednej z týchto štruktúr (\ tAmbroggi a kol., 2008; Ishikawa a kol., 2008) alebo VTA (\ tYun a kol., 2004) redukuje veľkosť cue vyvolaných excitácií v NAc. Tieto pozorovania naznačujú, že excitácie vyvolané NAc sú riadené glutamátergickými vstupmi, ale bez NAc dopamínu, dokonca ani tieto silné excitačné vstupy nie sú dostatočné na to, aby poháňali zvyšovanie počtu vyvolaných cue. Tento záver je však slabý. Mnohé NAc neuróny sú inhibované podnetmi (Nicola a spol., 2004a; Ambroggi a kol., 2011) a nie je známe, či sú excitácie alebo inhibície dôležitejšie pre aktiváciu prístupového správania. Okrem toho, inaktivácia VTA by mohla znížiť diskriminačné excitácie vyvolané stimuláciou (DS) niekoľkými mechanizmami nezávislými od dopamínu: redukované kódovanie cue v BLA a PFC, ktoré prijímajú projekcie z VTA (Swanson, 1982); znížené vypaľovanie neurónov GABAergic VTA, ktoré sa premietajú do NAc (Van Bockstaele a Pickel, 1995); alebo znížené uvoľňovanie glutamátu z dopaminergných neurónov (Stuber a kol., 2010). Nakoniec, pretože inaktivácia VTA znižuje nielen vypaľovanie vyvolané NAc DS, ale aj prístup DS vyvolaný DS (Yun a kol., 2004), Excitácia DS môže byť druhoradá skôr ako nevyhnutná podmienka pre cielený pohyb.

Aby sme priamo otestovali úlohu NAc dopamínu pri vypaľovaní vyvolanom cue, navrhli sme novú sondu na použitie pri správaní hlodavcov: kruhové elektródové pole obklopujúce centrálnu injekčnú kanylu, ktorá umožňuje simultánne zaznamenávanie aktivity aktivácie jednotky a infúzie antagonistov dopamínových receptorov. do extracelulárneho priestoru obklopujúceho zaznamenané neuróny (du Hoffmann a kol., 2011). Toto usporiadanie nám umožňuje vytvoriť väzby medzi aktiváciou dopamínových receptorov, zápalom neurónov NAc a správaním zameraným na odmenu: ak blokáda receptorov dopamínu NAc inhibuje signály vyvolané cue a iniciáciu prístupu, to by poskytlo silný dôkaz, že odpoveď neurónov závisí od endogénneho dopamínu a že tento signál je potrebný na prístupové správanie.

Materiály a metódy

Zvieratá.

Pätnásť samcov potkanov Long – Evan (275 – 300 g pri príchode) bolo získaných z Charles River a jednotlivo umiestnených. Jeden týždeň po ich príchode sa potkanom manipulovalo niekoľko minút denne, aby sa im 3 d zvykli na experimentátora. Po návyku sa potkany umiestnili na obmedzenú diétu 13 g potkanieho krmiva za deň. Podľa chuti Po operácii sa poskytla potrava 7 d, po ktorej sa zvieratá umiestnili späť na obmedzenú diétu. Postupy na zvieratách boli v súlade s National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals a boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a používanie medicíny College of Medicine Einstein College of Medicine.

Prevádzkové komory.

Všetky behaviorálne experimenty a behaviorálny tréning sa konali v na mieru vyrobených komorách Plexiglas (40 cm štvorcový, výška 60 cm). Tie boli umiestnené vo vnútri kovových skríň, ktoré slúžili ako Faradayove klietky; skrinky boli potiahnuté akustickou penou a biely šum bol nepretržite prehrávaný cez vyhradený reproduktor, aby sa minimalizovala počuteľnosť vonkajšieho hluku vo vnútri komory. Pracovné komory boli na jednej stene vybavené zásuvkou na odmenu, na ktorej sa nachádzali výsuvné páky. Na meranie vstupných a výstupných časov nádoby sa použil fotobeam cez prednú časť nádoby. Časové rozlíšenie systému kontroly správania (Med Associates) bolo 1 ms.

Úloha DS.

Zvieratá boli vyškolené na úlohu DS podľa postupov podobných tým, ktoré boli použité predtým (Nicola a spol., 2004a,b; Ambroggi a kol., 2008, 2011; Nicola, 2010; McGinty a kol., 2013). Boli prezentované dve signály naraz, buď DS predikujúca odmenu, alebo neutrálny stimul (NS). Sluchové signály pozostávali z tónu sirény (ktorý cykloval na frekvencii od 4 do 8 kHz po dobu 400 ms) a prerušovaného tónu (tón 6 kHz zapnutý po dobu 40 ms, vypnutý po dobu 50 ms); priradenie konkrétneho tónu k DS alebo NS bolo randomizované medzi potkanmi. Intertriálne intervaly (ITI) sa vybrali náhodne zo skráteného exponenciálneho rozdelenia s priemerom 30 s a maximálne 150 s. NS bol prezentovaný vždy na 10 s; boli zaznamenané pákové lisy počas NS, ale nemali programované následky. „Aktívne“ a „neaktívne“ páky boli náhodne priradené k ľavej a pravej páke pre každú krysu na začiatku tréningu a následne sa nelíšili. Reakcia páky na aktívnej páke počas DS ukončila narážku a prvý nasledujúci vstup do nádoby spôsobil dodanie 10% odmeny za sacharózu do jamky umiestnenej v nádobe. Prezentácie DS, počas ktorých zviera nereagovalo, boli ukončené po 10 s. Boli zaznamenané odpovede počas ITI (medzi prezentáciami tága) a odpovede na neaktívnej páke, ktoré však nemali za následok doručenie odmeny. Zvieratá boli trénované na úlohu DS, kým nezodpovedali> 80% DS a <20% NS počas 2 hodín tréningu.

Kanylované mikroelektródové polia.

Po počiatočnom tréningu boli potkany implantované kanylovanými mikročipmi, ktoré pozostávali z ôsmich volfrámových mikrovodičových elektród obklopujúcich centrálnu mikroinjekčnú vodiacu kanylu. Tieto boli skonštruované a namontované v mikrodrive vyrobenom na mieru, ako bolo opísané vyššie (du Hoffmann a kol., 2011). Úplné otáčanie hnacej skrutky v smere hodinových ručičiek posunulo elektródy a kanylu ako jednotku ventrálne 300 μm (bez otáčania sond), čo nám umožnilo zaznamenať z niekoľkých jedinečných populácií neurónov u toho istého zvieraťa.

Na implantáciu kanylovaných polí boli potkany pripravené na chirurgický zákrok a umiestnené do stereotaxického prístroja, ako bolo opísané vyššie (du Hoffmann a kol., 2011; McGinty a kol., 2013). Anestézia bola indukovaná a udržovaná izofluránom (0.5-3%). Zvieratá dostávali antibiotikum (Baytril) bezprostredne pred operáciou a 24 h po operácii. Kanylované polia sa implantovali bilaterálne do dorzálneho NAc jadra (1.4 mm anterior a 1.5 mm laterálne od bregma a 6.5 mm ventrálne od lebky). Elektródy a mikrodrive boli pripevnené k lebke kostnými skrutkami a zubným akrylom a do vodiacej kanyly boli vložené uzávery drôtov tak, že konce uzáverov boli v jednej rovine s koncami vodiacej kanyly. Po chirurgickom zákroku sa pokožka hlavy ošetrila Neo-Predef, aby sa zabránilo infekcii, a zvieratám sa nechal 1 týždeň zotavenia pred pokračovaním experimentov. Pre analgéziu po chirurgickom zákroku boli zvieratám podávané 10 mg / kg nesteroidného protizápalového liečiva ketoprofénu.

Drogy.

SCH23390 a racloprid boli zakúpené od Sigma. V testovacích dňoch boli lieky čerstvo pripravené rozpustením v 0.9% sterilnom fyziologickom roztoku. Lieky boli podávané v dávkach 1.1 μg SCH233390 v 0.55 μl fyziologického roztoku na stranu a 6.4 μg raclopridu v 0.8 μl fyziologickom roztoku na stranu. SCH233390 a racloprid boli podávané infúziou cez 12 a 17.5 min. V pilotných experimentoch sme zistili, že bilaterálne infúzie raclopridu trvajúceho 12 min mali signifikantné, ale prechodné účinky na pomer DS odpovede. Na predĺženie účinku sme teda predĺžili trvanie infúzie raclopridu tak, že časový profil jeho farmakologických účinkov bol podobný profilu SCH23390. Na jednu záznamovú reláciu sa uskutočnila iba jedna bilaterálna alebo jednostranná injekcia (jedna relácia za deň). Všetky zvieratá dostali aspoň jednu bilaterálnu injekciu jedného antagonistu a jednu (alebo niekoľko) jednostranných antagonistických injekcií. Počas niektorých experimentov s jednostranným antagonistom sa súčasne podával fyziologický roztok ako kontrola s vehikulom kontralaterálna k hemisfére, ktorá dostala antagonistu.

Mikroinjekčný a záznamový postup.

Zariadenie na simultánnu mikroinjekciu a záznam bolo opísané vyššie (\ tdu Hoffmann a kol., 2011). Záznamový kábel vedúci z predného stupňa bol ukončený v 24-kanálovom elektrickom komutátore s centrálnym otvorom (Moog), ktorý prenášal signály do elektrofyziologického záznamového systému. Dve injekčné striekačky boli namontované v jednej pumpe na injekčné striekačky umiestnenej mimo komory; vedenia tekutiny zo striekačiek viedli k dvojkanálovému otočnému systému kvapaliny (Instech Laboratories) namontovanému nad komutátorom. Kvapalné vedenia zostupovali z obratlíka cez vrtný otvor komutátora, prechádzali pozdĺž záznamového kábla a boli zakončené dvoma mikroinjektormi s veľkosťou 33 gauge.

Pred záznamom boli mikroinjektory znovu naplnené roztokom liečiva a potom vložené do vodiacich kanyl zvieraťa. Špičky mikroinjektora vyčnievali 0.5 mm za vodiace kanyly tak, aby špička mikroinjektora bola pod hrotmi elektród a - 670 μm od stredu každej elektródy. Pred zasypaním liekom sa tekutinové potrubia a mikroinjektory naplnili minerálnym olejom a hladina olejo-vodného rozhrania sa označila, aby sa uľahčilo. post hoc potvrdenie, že liek bol injikovaný. Nakoniec bol hlavový stupeň pripojený k zvieraťu a kvapalinové vedenia boli pevne pripevnené k záznamovému káblu, aby sa mikroinjektory udržali na mieste počas trvania experimentu. Zvieratá pripravené týmto spôsobom sa nechali vykonávať úlohu DS počas základného obdobia aspoň 45 min, počas ktorého sa zaznamenala nervová aktivita; potom bola injekčná pumpa zapnutá na diaľku na infúziu liekov do mozgu. Injekcia nevyžadovala manipuláciu so zvieraťom alebo otvorenie dvierok komory a relácia správania pokračovala neprerušovane počas periódy základnej línie, infúzie a poinfúzii.

Signály neurálneho napätia sa zaznamenávali zosilňovačom v hlavnom stupni (zisk jednoty), zosilňovanými časmi 10,000 a digitalizovali sa pomocou komerčného hardvéru a softvéru (Plexon). Z 379 neurónov sme zaznamenávali 38 záznam / injekciu v 15 potkanoch. Z 38 sedení boli 7 vyradené z dôvodu zlého správania počas predinjektážneho obdobia alebo preto, že nemohli byť spoľahlivo izolované žiadne neuróny. Preto sa naša neurálna analýza zamerala na 31 záznamové / injekčné sedenia, v ktorých sme zaznamenávali z 322 dobre izolovaných neurónov u 12 potkanov. Po každom zázname / injekcii sa mikrodrive nesúce elektródové polia posunuli o 150 μm (jedna polovica otáčky mikrodrive skrutky), aby sa elektródy ventrálne posunuli, aby sa zaznamenali z novej populácie neurónov. Ak sa pozorovalo málo (alebo žiadne) neuróny, pole sa pokročilo každý druhý deň, až kým sa neuróny neurónov nezistili.

Analýza.

Údaje boli rozdelené do časových úsekov pred injekciou, po injekcii a zotavení, ktoré boli definované ako 45 min pred infúziou antagonistov, 40 min, začínajúc koncom injekcie, a posledným 33 min (2000 s). každú reláciu (ktorá trvala celkovo 2 – 3 h). Doba po injekcii zodpovedá dobe, počas ktorej majú lieky najväčší vplyv na správanie, keď sa injekčne podávajú bilaterálne (Obr. 1C).

 

Obrázok 1.

Účinky antagonistov dopamínových receptorov na DS-cued prístup. ASchematické znázornenie úlohy DS. B, Medián (bodka) a stredné kvartily (vertikálne čiary) pomerov odozvy DS (oranžová) a NS (modrá) v období pred injekciou pre všetky relácie správania ...

Izolácia jednotlivých jednotiek sa uskutočňovala off-line pomocou zariadenia Offline Sorter (Plexon) s použitím analýzy hlavných komponentov. Do následných analýz boli zahrnuté iba jednotky s dobre definovanými vlnovými formami (> 100 μV), ktoré sa zreteľne odlišovali od hladín hluku (<20–50 μV). Interspike intervalové distribúcie a krížové korelogramy sa použili na zabezpečenie toho, že jednotlivé jednotky boli dobre izolované od seba navzájom a od šumu v pozadí (softvér Neural Explorer; Nex-Tech). Časové značky overených hrotov sa analyzovali pomocou vlastných rutín v softvérovom prostredí R. Histogramy peristimulového času skonštruované okolo DS a NS v časových schránkach 50 ms sa použili na kvantifikáciu a detekciu excitácií vyvolaných cue v Obrázky 2A, , 3,3, , 4,4, , 55A, , 66A, , 77A, , 88Aa and1010A-C, Na určenie, či neurón vykazoval významnú excitáciu vyvolanú DS, bola vypočítaná Poissonova funkcia distribúcie pravdepodobnosti pre základnú periódu 10 pred každým cue. Neurón sa považoval za DS excitovaný, ak vykazoval priemerné počty hrotov nad horným 99% intervalom spoľahlivosti distribúcie základných frekvencií streľby v jednom alebo viacerých 50 ms bins medzi 50 a 200 ms po nástupe cue. Pre neuróny s významnými excitáciami vyvolanými DS v základnom období pred injekciou sa priemerná rýchlosť paľby v časoch 50 ms bins uzamknutých na DS a NS na začiatku každej periódy v každej relácii získala a priemer a medián (Obr. 2C-E, , 55A, , 66A, , 77A, , 88A, , 1010B,C) boli porovnávané rýchlosti vypaľovania v neurónoch. Pretože neuróny so štatisticky detegovateľnou excitáciou NS boli takmer vždy tiež excitované DS [nie je ukázané, ale uvedené skôr (Ambroggi a kol., 2011)], analyzovali sme NS odpovede pre všetky neuróny s významnou DS reakciou. Pokiaľ nie je uvedené inak, všetky štatistické porovnania používané v rámci neurónových Wilcoxonových testov.

 

Obrázok 2.

DS-vyvolané excitácie predpovedajú následné správanie pri hľadaní odmeny a kódujú blízkosť k páke. A, Priemerné histogramy peri-periálnych udalostí pred injekciou zarovnané na začiatku DS (oranžová stopa) alebo NS (modrá stopa) pre neuróny 145 s významným excitačným ...

 

Obrázok 3.

Príkladné neuróny ukazujú, že antagonisty D1 a D2 redukujú excitáciu vyvolanú DS. Rastery a zodpovedajúce histogramy ukazujú vypaľovanie štyroch rôznych neurónov excitovaných DS. Údaje pochádzajú z posledných pokusov 40 bezprostredne pred začiatkom štartu ...

 

Obrázok 4.

Účinky bilaterálnej injekcie dopamínového antagonistu na excitáciu vyvolanú cue predpovedajú behaviorálne účinky na základe pokusu. A, C„Analýza pokusu o pokus neurónu kódujúca latenciu potkana na dosiahnutie páky pre rovnaké neuróny“ ...

 

Obrázok 5.

Aktivácia D1 receptora je potrebná pre excitáciu vyvolanú DS. AHistogramy času peri-udalosti sú v súlade s nástupom DS pre neuróny s významnou excitáciou vyvolanou DS v období pred injekciou. Stopy a mraky udávajú priemernú rýchlosť streľby ± SEM ...

 

Obrázok 6.

Aktivácia D2 receptora je nevyhnutná pre excitáciu vyvolanú DS. AČasové histogramy Peri-eventu sú v súlade s nástupom DS pre neuróny s významnou excitáciou vyvolanou DS v období pred injekciou raclopridu. Excitácie vyvolané DS boli redukované bilaterálnymi ...

 

Obrázok 7.

Aktivácia D1 receptora nie je potrebná pre excitáciu vyvolanú NS. AČasové histogramy Peri-udalosti sú v súlade s nástupom NS pre neuróny s významnou excitáciou vyvolanou DS v období pred injekciou. Tieto populácie sa úplne prekrývajú, teda rovnaké neuróny ...

 

Obrázok 8.

Aktivácia D2 receptora je nevyhnutná pre excitáciu vyvolanú NS. AČasové histogramy Peri-udalosti sú v súlade s nástupom NS pre neuróny s významnou excitáciou vyvolanou DS v období pred injekciou. Excitácia NS bola znížená v bilaterálnych a ipsilaterálnych podmienkach ...

 

Obrázok 10.

Infúzia fyziologického roztoku neovplyvňuje excitáciu vyvolanú DS alebo NS a ani aktivácia D1 ani D2 receptora nie je potrebná na udržanie základných frekvencií streľby. A, Single DS-excitovaný neurón zaznamenaný počas infúzie fyziologického roztoku. Dohovory sú totožné s dohovormi ...

pre Obrázok 4, sme určili, či účinky bilaterálnej injekcie antagonistu na latenciu dosiahnutia páky korelovali s účinkami antagonistov na veľkosť excitácie vyvolanej DS na základe pokusu po skúške. Najprv sme vypočítali priemernú rýchlosť streľby od 100 do 400 ms po nástupe DS v každej štúdii pre všetky zaznamenané neuróny, ktoré vykazovali významnú excitáciu DS pred bilaterálnou infúziou antagonistov. Ďalej sme pre každý neurón vypočítali Spearmanov korelačný koeficient poradia porovnaním veľkosti excitácie vyvolanej DS podľa pokusu a latencie potkana pri dosiahnutí páky pri zodpovedajúcich pokusoch. Tieto korelácie boli zakreslené do histogramov v roku Obrázok 4B,D, Všetky DS štúdie boli zahrnuté do tejto analýzy; ak zviera nestlačilo páku, bola tomuto pokusu priradená latencia 10 s (maximálna dĺžka prezentácie cue). Tieto korelačné koeficienty sme vypočítali pre obdobie pred injekciou, ako je definované vyššie; predĺžili sme obdobie po injekcii od spoločnosti 1000 s cieľom získať širší odber vzoriek latencií na pokusoch, pri ktorých zvieratá reagovali po bilaterálnej infúzii. Na posúdenie významnosti jednotlivých korelácií sme použili asymptotiku t- priblíženie, pretože presné p hodnota nemôže byť vypočítaná, keď sú v údajoch o hodnosti prítomné väzby. Potom sme použili párové Wilcoxonove testy na porovnanie mediánov distribúcií korelačných koeficientov pred a po infúzii antagonistu.

Pretože NAc neuróny majú nízke východiskové rýchlosti streľby s nižšími hranicami intervalu spoľahlivosti veľmi často prekračujúcimi nulu, inhibície sú oveľa ťažšie detekovať a kvantifikovať ako excitácie. Okrem vyššie uvedeného postupu, ktorý sa použil na detekciu excitácie, sme tiež použili analýzu prevádzkovej charakteristiky prijímača (ROC), citlivejšiu metódu, na kvantifikovanie pravdepodobnosti, že rýchlosť vypaľovania v po sebe idúcich časových zásobníkoch 50 ms po nástupe cue sa líšila od rýchlosti vypaľovania v základnej línii prednosti 10. Táto analýza sa uskutočňovala oddelene pre obdobie pred injekciou a po injekcii. Pre každý zásobník sme vypočítali plochu pod krivkou ROC (AUC); Hodnoty AUC 0.5 neindikujú žiadny rozdiel od presného vypaľovania, zatiaľ čo hodnoty bližšie k 0 alebo 1 indikujú väčšiu pravdepodobnosť, že neurón je inhibovaný alebo excitovaný. Aby sa objektívne znázornila pooperačná neurálna aktivita v celej populácii zaznamenaných neurónov, vypočítala sa rýchlosť vypaľovania a hodnoty AUC pre 50 ms biny; na vyhladenie údajov boli zásobníky posunuté o 10 ms pre postupné výpočty AUC. Hladké hodnoty AUC sa potom vyniesli ako tepelné mapy s rozlíšením 10 ms (s každou hodnotou reprezentujúcou AUC v nasledujúcich 50 ms) v Obrázky 5B, , 66B, , 77B, , 88Ba and1010D,E.

Ďalej sme kvantifikovali, či hodnoty AUC, vypočítané v neprekrývajúcich sa 50 ms zásobníkoch, odrážajú významný rozdiel v streľbe. Pre každý zásobník sme najskôr vygenerovali 10,000 0.05 bootstrapovaných hodnôt AUC z náhodných premiešaní presnej základnej rýchlosti streľby a rýchlosti streľby v zodpovedajúcom poštovom koši. Potom sme určili obojstrannú pravdepodobnosť, že skutočná hodnota AUC bola čerpaná z distribúcie bootstrapovaných hodnôt; ak bola pravdepodobnosť <XNUMX, považovali sme streľbu v zásobníku za výrazne odlišnú od presnej základnej čiary. Nakoniec sme spočítali počet neurónov s rýchlosťou streľby v každom zásobníku, ktorý bol významne väčší alebo menší ako presná východisková hodnota streľby, a vyniesli sme tieto hodnoty ako zlomky z celkovej populácie (Obr. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 99B,D, , 1010F,G).

 

Obrázok 9.

Neurálna aktivita, ktorá je prispôsobená na odmenenie vstupu do nádoby, nie je ovplyvnená ipsilaterálnou alebo kontralaterálnou injekciou antagonistu D1 alebo D2. A, CHodnoty ROC AUC sú vypočítané a zobrazené tak, ako je opísané v Obrázok 5B, okrem časových košov sú dlhšie (200 ms) a zarovnané ...

Na porovnanie pomerov neurónov excitovaných alebo inhibovaných v období pred injekciou a po injekcii sme použili prístup redukcie údajov. Najprv sme vypočítali frakciu 50 ms bínov medzi 0 a 1 s po nástupe cue, v ktorom každý neurón vykazoval významnú excitáciu alebo inhibíciu. Ďalej sme tieto frakcie porovnávali v periódach pred injekciou a po injekcii s párovaným Wilcoxonovým testom. Z tejto analýzy boli vylúčené neuróny, ktoré nevykazovali významnú moduláciu v žiadnom zásobníku v období pred injekciou a po injektovaní, a neboli zahrnuté do grafov znázorňujúcich stredný zlomok signifikantných zásobníkov (grafy bodiek a fúzy na pravej strane každej časti v jednotlivých častiach). Obr. 5C, , 66C, , 77C, , 88C, , 1010F,G). Tento postup eliminoval vplyv veľkej populácie neurónov bez rozdielu v aktivite medzi oknom post-DS a základňou pred DS; táto populácia má malý záujem, ale prispieva k veľkému množstvu nulových hodnôt, ktoré ovplyvňujú stredný počet významných zásobníkov smerom k 0 a po infúzii zatemňujú ako pokles, tak zvýšenie podielu významných zásobníkov.

Podobné analýzy sa uskutočňovali pri streľbe súvisiacej so spotrebou, ku ktorej došlo po vstupe do nádoby s odmenou. Zvieratá mali tendenciu zostať v nádobe> 5 s; preto, aby sme zachytili tieto relatívne dlhé časové intervaly, ukážeme výsledky pomocou 200 ms zásobníkov (Obr. 9). Časové okno na porovnanie pomerov neurónov, ktoré boli excitované v období pred injekciou a po injektovaní, bolo od 0 k 1.5 s, zatiaľ čo od 0 do 5 s pre inhibície; kratšie analytické okno sa použilo na excitácie, pretože mali tendenciu byť prechodnejšie. Analýzy ROC sa uskutočnili na vysoko výkonnom výpočtovom klastri Albert Einstein College of Medicine s použitím balíka pROC pre R.

Na porovnanie „základných“ frekvencií streľby, vyskytujúcich sa mimo udalostí, sme porovnávali priemernú rýchlosť streľby v zásobníkoch 10 s pred každou injekciou DS a po injektovaní antagonistov. Tento postup je funkčne ekvivalentný náhodnému vzorkovaniu základných frekvencií streľby, pretože DS sú prezentované s takmer rovnakou pravdepodobnosťou kedykoľvek počas behaviorálnej relácie. Neuróny boli klasifikované ako vykazujúce významnú excitáciu vyvolanú DS (pred infúziou liečiva) alebo nie, a potom boli v týchto skupinách porovnávané východiskové miery prepaľovania v období pred injekciou a po injektovaní s párovaným Wilcoxonovým testom (Obr. 10H,I). Tiež sme vykonali lineárne prispôsobenie pre neuróny excitované DS a porovnali sklon tejto čiary s čiarou jednoty (sklon 1).

Ak sa vykonalo viacnásobné porovnávanie na podmnožinách údajov pochádzajúcich z rovnakého subjektu (Obr. 2C-E, , 55A,C, , 66A,C, , 77A,C, , 88A,C, , 99B,D, , 1010B,C,F,G), p hodnoty boli Bonferroni korigované; tj p hodnota bola vynásobená počtom vykonaných porovnaní. opravené p hodnoty boli považované za významné, ak p <0.05. Všetky opravy boli vykonané s faktorom 3 okrem Obrázok 2C-E, v ktorom bol faktor 2.

Sledovanie videa.

V podskupine experimentov sa poloha potkana merala pomocou spätnej kamery (30 snímok / s) a počítačového sledovacieho systému (Cineplex; Plexon). Systém sledoval x a y polohy dvoch odlišne sfarbených LED pripojených k stupňu záznamovej hlavy. Ako už bolo opísané (McGinty a kol., 2013), vypočítali sme ťažisko, ktoré popisuje stredový bod medzi pozíciami LED pre každý videozáznam. Chýbajúce dátové body až do 10 po sebe nasledujúcich snímok boli vyplnené lineárnou interpoláciou; v zriedkavých prípadoch, keď chýbalo viac ako 10 snímok, boli údaje zahodené. Pre každý videozáznam sme vypočítali SD vzdialeností medzi polohou ťažiska v tomto rámci a v časovom okne ± 200 ms. Tieto SD merania tvoria lokomotorický index (LI) pre túto snímku videa. Log transformované LI boli bimodálne distribuované, s dolným vrcholom predstavujúcim epochy malého alebo žiadneho pohybu a horným vrcholom predstavujúcim lokomóciu (Drai a kol., 2000). Potom rozdeľujeme dve Gaussove funkcie na distribúciu LI a určujeme prah pohybu ako bod, kde sa tieto funkcie prekrývali najmenej.

Pohyby boli definované ako najmenej osem po sebe idúcich rámcov s LI nad lokomotorickým prahom. Aby sme určili čas nástupu pohybu, obmedzili sme analýzu na štúdie DS, v ktorých bolo zviera stále na začiatku cue a potom vypočítalo latenciu medzi nástupom cue a prvým rámcom, v ktorom LI prekročila prah pohybu (Obr. 1D-F, , 22B,D). Ak nebol na skúške nameraný žiadny viditeľný pohyb, bola latencia na tejto skúške definovaná ako> 10 s (dĺžka predstavenia tága, Obr. 1D). Podobné výsledky sa získali, keď sa takéto pokusy vynechali z analýzy (údaje nie sú uvedené). Distribúcie DS-cued pohybovej latencie sa potom spojili cez potkany a medián sa porovnal s Wilcoxonovým testom. Na kvantifikáciu latencie k maximálnej rýchlosti a priemernej rýchlosti pohybov riadených pákou DS-cued sme použili všetky štúdie, ktoré skončili pákovým stlačením, aj keď sa krysa pohybovala na začiatku DS (Obr. 1E,F).

Histológie.

Zvieratá boli hlboko anestetizované Euthasolom a intrakardiálne perfundované fyziologickým roztokom a 4% formalínom. Jednosmerný prúd (15 μA) prechádzal cez každú z elektród v poliach pre 30 s, aby sa generovali lézie. Mozgy sa odstránili a uskladnili vo formalíne až do spracovania. Pred krájaním kryostatom sa mozgy nechali kryoprotekciou ponorením do 30% sacharózy na niekoľko dní. Rezy (50 μm) boli zafarbené na látku Nissl, aby sa zviditeľnili dráhy kanyly a elektród a lézie (Obr. 11).

 

Obrázok 11.

Histologická rekonštrukcia miest vpichu antagonistov. Obrázok znázorňuje dva koronálne rezy mozgu potkana, ktoré zahŕňajú väčšinu predno-zadného rozsahu NAc (0.8 mm – 2.8 mm pred bregma). Čierne bodky predstavujú ...

výsledky

Predstavili sme potkany s dvomi sluchovými stimulmi v premenlivých intervaloch v priemere 30 s: prediktívna DS a NS (odmena)Obr. 1A; Nicola a spol., 2004a,b; Ambroggi a kol., 2008, 2011; McGinty a kol., 2013). Pákový lis počas DS ukončil tágo a kvapka sacharózy sa priviedla po vstupe do nádobky s odmenou; ak zvieratá neodpovedali v rámci 10 s, tágo bolo ukončené bez odplaty a začal sa intertrial interval. Reakcie počas tohto intervalu a počas NS nemali naprogramovaný dôsledok. NS boli vždy 10 s. Vyškolené zvieratá, ktoré reagovali na väčšinu DS, ale málo NS (Obr. 1B), boli implantované kanylovanými poliami zacielenými na NAc jadro. Počas experimentov zvieratá najskôr vykonali úlohu pre 45 min predinjekčné obdobie, počas ktorého sa zaznamenala NAc nervová aktivita. Antagonista receptora D1 SCH23390 alebo antagonista D2 / 3 racloprid sa infúziou bilaterálne alebo jednostranne podávali do NAc; zvieratá zostali v komore s úlohami, ktoré boli účinné počas celej infúzie a potom aspoň 75 min.

V súlade s predchádzajúcimi štúdiami (Yun a kol., 2004; Nicola, 2010), bilaterálne infúzie jedného alebo druhého antagonistu do jadra NAc významne znížili podiel DS, na ktoré zviera reagovalo (Obr. 1Ctmavé sivé stopy) a zvýšená latencia na spustenie lokomócie meranej sledovaním videa na podmnožine relácií (Obr. 1D, sivé prerušované stopy). Naproti tomu jednostranné infúzie rovnakých dávok nemali žiadny vplyv na pomer odpovede DS (Obr. 1C, svetlosivé stopy), latencia na začatie pohybu po nástupe DS (Obr. 1D, prerušované svetlooranžové stopy) a latencia na dosiahnutie páky alebo rýchlosti pohybu počas priblíženia páky (Obr. 1E,F). Tieto údaje o správaní ukazujú, že NAc dopamín v jednej hemisfére je dostatočný na udržanie správania, aj keď blokáda receptorov D1 alebo D2 / 3 v oboch hemisférach výrazne zhoršuje reakciu. Táto disociácia ponúka kritickú experimentálnu výhodu, pretože nám umožňuje testovať účinky antagonistov dopamínu na neurálnu aktivitu, keď je správanie narušené (bilaterálna injekcia) a keď nie je (jednostranná injekcia), čím sa vylučuje potenciálny zmätok, že akékoľvek pozorované zmeny v nervovej aktivite po infúzii antagonistu sú sekundárne k zmenám v správaní.

Zaznamenali sme z 322 NAc neurónov v 31 zázname / injekciách v 12 potkanoch. Približne 45% zaznamenaných neurónov bolo signifikantne excitovaných DS prezentáciou. Tieto excitácie vykazovali vlastnosti podobné tým, ktoré boli uvedené vyššie (Yun a kol., 2004; Nicola a spol., 2004a; Ambroggi a kol., 2011; McGinty a kol., 2013; Morrison a Nicola, 2014): boli väčšie ako tie, ktoré vyvolali NS (Obr. 2A); začali pri krátkej latencii po nástupe cue (∼120 ms) a vyskytli sa pred začatím pohybu riadeného pákou (Obr. 2B); a ich veľkosť korelovala s pravdepodobnosťou behaviorálnej odozvy, latencie iniciácie pohybu a blízkosti páky (McGinty a kol., 2013; Obr. 2C-E).

Dvojstranná infúzia antagonistu D1or D2 / D3 spôsobila prudké zníženie veľkosti excitácie vyvolanej DS. Ako je ukázané v dvoch príkladoch neurónov (Obr. 3A,C), tento účinok bol najvýraznejší v minútach bezprostredne po infúzii, čo zodpovedá maximálnemu zníženiu správania vyvolaného cue vyvolaným injekciami (Obr. 3A,C, modrých rastrov a histogramov). Keď sa obnovil behaviorálny účinok, obnovila sa aj reakcia na pálenie (Obr. 3A,C, čierne rastry a histogramy). Tento model výsledkov bol konzistentný v cue-excitovaných neurónoch (Obr. 5A, , 66A, Bilaterálne histogramy a grafy fúzií). Podporujúc hypotézu, že tieto excitácie určujú intenzitu pohybu priblíženia páky, veľkosť citu vyvolaného excitáciou počas obdobia predinjekcie predpovedala latenciu zvieraťa dosiahnuť páku (Obr. 4A,C, vľavo). Po dvojstrannej injekcii antagonistu D1 alebo D2 boli tieto latencie výrazne posunuté na vyššie hodnoty, často tak vysoké, že v prezentácii cue 10 nebola vôbec žiadna odpoveď (Obr. 4A,C, distribúcia ľavej a pravej latencie). Napriek tomu, že antagonisti dokázali, že aj keď vypaľovanie vyvolané cue bolo znížené, pokračovalo sa v predikcii intenzity behaviorálnej odozvy počas obdobia po injekcii a zotavovaní (Obr. 4A,Cpravých rastrových grafov). Toto pozorovanie naznačuje, že behaviorálne a nervové účinky liečiva boli korelované na základe pokusu: čím väčšie je zníženie pálenia spôsobené antagonistom dopamínu, tým väčšia je latencia na dosiahnutie páky a čím nižšia je pravdepodobnosť, že sa u nich dosiahne zviera vôbec dosiahlo páku.

Na posúdenie konzistentnosti tejto korelácie pokus-po-skúške sme pre každý cue-excitovaný neurón vypočítali Spearmanovu koreláciu medzi veľkosťou excitácie a latenciou na stlačenie páky. Priradili sme latenciu 10 s k pokusom, v ktorých nebola žiadna odpoveď; latencia v týchto pokusoch bola preto viazaná na najvyššiu hodnosť. (Podobné výsledky sa získali, ak sa z analýzy vynechali pokusy bez odozvy páky s DS); údaje sa neuvádzajú. Keď sme porovnávali korelačné koeficienty v období pred injekciou s koeficientmi v kombinovanom období po injekcii / regenerácii, zistili sme, že takmer všetky koeficientov boli záporné v oboch obdobiach. Antagonisti navyše nemali žiadny významný vplyv na stredný koeficient alebo posunuli distribúciu smerom k ešte negatívnejším hodnotám (Obr. 4B,D). Preto nielen populácia neurónov excitovaných cue spoľahlivo predpovedá latenciu behaviorálnej odozvy, ale aj zvýšenie latencie odozvy spôsobené antagonistom v danom teste je robustne predpovedané účinkami antagonistu na excitáciu vyvolanú tágom v tomto teste. Tieto výsledky poskytujú silný dôkaz o kauzálnej úlohe endogénneho dopamínu pri určovaní ráznosti odpovede hľadajúcej odmenu na tágo: dopamín zvyšuje excitáciu vyvolávanú neurónmi NAc vyvolanú tágami, čo zase spôsobuje prístup k páke s krátkou latenciou.

Alternatívnou interpretáciou týchto výsledkov je, že znížená excitácia vyvolaná cue je dôsledkom zníženej reakcie na správanie - možno preto, že excitácia iba sleduje (alebo predpokladá) reakciu na správanie, ale nie je kauzálna. Ak by tomu tak bolo, potom by aplikácia antagonistov takým spôsobom, aby neovplyvňovali správanie, nemala viesť k zníženej excitácii vyvolanej cue. Ako sa však ukázalo v dvoch príkladoch neurónov (Obr. 3B,D), jednostranná injekcia antagonistu D1or D2 / D3 výrazne znížila veľkosť excitácie vyvolanej cue, aj keď jednostranné injekcie nezmenili správanie. Podobné výsledky sa získali pri priemerovaní cez excitácie vyvolané cue, zaznamenané v injekčnom NAc (Obr. 5A, , 66AIpsilaterálne histogramy); priemerné údaje navyše ukazujú, že excitácie vyvolané cue v neurónoch zaznamenaných v kontralaterálnom podaní NAc k injekcii neboli ovplyvnené (Obr. 5A, , 66A, Kontralaterálne histogramy). Aby sa vylúčila možnosť, že zníženie cue-evokovanej excitácie ipsilaterálne na injekcie bolo spôsobené malými rozdielmi v pravdepodobnosti behaviorálnej odozvy, zopakovali sme analýzu po vylúčení všetkých pokusov, v ktorých zviera nevykonalo žiadnu reakciu na pákový lis; boli získané podobné výsledky (údaje nie sú uvedené; p <0.05 pre antagonistov Dl aj D1, Wilcoxon). Tieto výsledky naznačujú, že zníženie antagonizmu vyvolaného excitáciou vyvolané antagonistom pravdepodobne nebude dôsledkom zhoršeného správania.

Aj keď časové vlastnosti excitácie vyvolanej cue boli v neurónoch dosť podobné, inhibície po nástupe cue boli rôznorodejšie, typicky vykazovali neskorší nástup a menej stereotypné časové priebehy ako excitácie (Obr. 5B, , 66B). Analýzy inhibícií (a do určitej miery aj excitácií), ktoré sa zameriavajú na jedno časové okno, môžu preto vynechať významnú časť signálu. Okrem toho, štandardné štatistické detekčné metódy nedokážu konzistentne identifikovať poklesy z veľmi nízkych bazálnych frekvencií streľby, vrátane mnohých neurónov NAc. Aby sme tieto problémy obišli, zaujali sme inkluzívnejší prístup, v ktorom sme kvantifikovali pre 50 ms poštové záchytné časy v každom zaznamenanom neuróne, ROC AUC predstavujúci rozdiel medzi vystrelením v koši a základnou čiarou. Tepelné mapy hodnôt AUC v časových zásobníkoch sú zoradené podľa nástupu DS (Obr. 5B, , 66B) demonštrujú, že redukcia excitácie vyvolanej DS po bilaterálnych a ipsilaterálnych (ale nie kontralaterálnych) injekciách antagonistov D1 a D2 bola vyslovená v takmer každom cue-excitovanom neuróne a vyskytovala sa počas celého časového priebehu excitácie. Naopak, inhibície po nástupe DS neboli redukované. Na kvantifikáciu týchto účinkov sme určili, či každá hodnota AUC indikuje významný rozdiel od základnej hodnoty výpočtom hodnoty p bootstrap p, ktorá predstavuje pravdepodobnosť, že vzorka AUC bola odobratá z distribúcie AUC generovaných z náhodne náhodne namiešaných základných a pochodňových rýchlostí pálenia (pozri materiály a metódy). Ako ukazujú grafy podielu neurónov vykazujúcich významné (p Excitácia alebo inhibícia v každom zásobníku zosúladená s nástupom DS (Obr. 5C, , 66C, ľavý graf v každom stĺpci), frakcia excitácií, ale nie inhibície, bola znížená bilaterálnymi a ipsilaterálnymi injekciami antagonistov. Táto interpretácia bola štatisticky potvrdená porovnaním pomerov významne vzrušených a inhibovaných zásobníkov v celom okne 1 s post-DS (Obr. 5C, , 66Cbodkované grafy). Takže excitácie po nástupe DS boli znížené injekciou D1 a D2 antagonistu, ale inhibície neboli.

Počet neurónov vykazujúcich významnú inhibíciu sa skutočne zvýšil po niektorých typoch injekcií (Obr. 5B,C, , 66B,C). Je nepravdepodobné, že by tieto vznikajúce inhibície prispeli k behaviorálnym účinkom bilaterálnych infúzií antagonistov, pretože neboli konzistentné (napr. Po dvojstrannej a kontralaterálnej, ale nie ipsilaterálnej injekcii antagonistu D1 a po ipsilaterálnej, ale nie bilaterálnej injekcii antagonistu D2) a preto nevysvetľujú behaviorálne účinky antagonistov. Okrem toho, tieto neskoré inhibície boli najvýznamnejšie ∼600 ms po nástupe DS, čo je čas, v ktorom v kontrolnom stave už bolo iniciované ∼50% správania s cieleným prístupom (Obr. 2B). V dôsledku toho je nepravdepodobné, že by vznikajúce inhibície prispeli k zvýšeniu latencie iniciačnej inicializácie vyvolanej antagonistom alebo zníženiu pravdepodobnosti odpovede. Prekvapivo, veľká väčšina vznikajúcich inhibícií sa vyskytovala v neurónoch excitovaných DS, zvyčajne ku koncu excitácie (bilaterálny antagonista D1: 14 / 17 neuróny, 82%; ipsilaterálny antagonista D2: 11 / 16 neuróny, 69%; Obr. 5B,C, , 66B,C), čo je v súlade s možnosťou, že boli odhalené redukciou excitačnej reakcie indukovanej antagonistom a podporujúc hypotézu, že vypaľovanie neurónov excitovaných DS je príčinou začatia prístupového správania.

Prezentácie NS, ktoré len zriedka vyvolali reakcie pákového \ tObr. 1B), vyvolala malú, ale konzistentnú excitáciu v tých istých neurónoch, ktoré boli excitované DS (Obr. 2A). Prekvapivo, excitácie vyvolané NS neboli redukované antagonistom D1, buď v rozsahu (Obr. 7A) alebo v počte excitovaných neurónov (Obr. 7B,C). Na rozdiel od toho, injekcia antagonistu D2 znížila tak veľkosť, ako aj počet excitácií vyvolaných NS (Obr. 8). Inhibície vyvolané NS neboli redukované žiadnym antagonistom (Obr. 7B,C, , 88B,C). Preto je za týchto podmienok aktivácia receptora D1 potrebná pre neuróny NAc, aby produkovali excitácie veľkého rozsahu v reakcii na výrazné stimulačné prediktívne stimuly, zatiaľ čo aktivácia receptora D2 je potrebná pre reakcie na prediktívne aj neutrálne stimuly.

Uvažovali sme o možnosti, že znížené správanie pri hľadaní odmeny po bilaterálnych infúziách mohlo byť spôsobené prerušením nervového procesu súvisiaceho s posilnením alebo hedonickým spracovaním odmeny. Takéto procesy môžu zahŕňať subpopulácie neurónov NAc, ktoré sú inhibované alebo excitované počas konzumácie sacharózy (Nicola a kol., 2004b; Roitman a kol., 2005; Taha a Fields, 2005). Pretože zvieratá pokračovali v získavaní odmeny po jednostrannej infúzii antagonistu, boli sme schopní určiť, či neurónová aktivita súvisiaca s konzumáciou odmeny závisí od aktivácie dopamínového receptora. Skúšali sme streľbu počas 5 s po vstupe zvieraťa do nádoby s odmenou, čo je časové obdobie, počas ktorého sa konzumácia odmeny zvyčajne vyskytuje (Nicola, 2010). Pomocou ROC analýzy sme porovnávali vypaľovanie v 200 ms bins v tomto okne so základnou čiarou 10 s prefixom; Tepelné mapy výsledných hodnôt AUC ukazujú malý účinok injekcie antagonistu buď ipsilaterálnej alebo kontralaterálnej na injekciu (Obr. 9A,C). Antagonisty neovplyvnili proporcie excitovaných a inhibovaných neurónov (Obr. 9B,D), čo silne naznačuje, že excitácie a inhibície súvisiace so spotrebou nezávisia od dopamínu. Podobné výsledky sa získali, keď sme vykonali rovnakú analýzu s použitím 50 ms bins (dáta nie sú uvedené).

Aby sme vylúčili možnosť, že pozorované výsledky boli spôsobené iným faktorom, ako je antagonista (napr. Fyzická porucha spôsobená injekciou alebo niektorou zložkou liečiva), v niektorých experimentoch sme vstrekli fyziologický roztok. Ako ukazuje príklad neurónu (Obr. 10A) a priemernou excitáciou cez cue-excitované neuróny (Obr. 10B), Excitácie vyvolané DS neboli zmenené injekciou fyziologického roztoku; Neboli tiež ovplyvnené excitácie vyvolané NS (Obr. 10C). Injekcia fyziologického roztoku okrem toho neovplyvnila podiel neurónov vykazujúcich významnú excitáciu a inhibíciu po nástupe DS alebo NS (Obr. 10D-G).

Nakoniec sme sa pýtali, či aktivácia dopamínového receptora by mohla byť permisívna pre správanie s cued prístupom tým, že by prispela k základným hodnotám streľby NAc neurónov. V rozpore s touto hypotézou nebol pozorovaný signifikantný účinok ani D1 ani D2 antagonistu na východiskové rýchlosti streľby buď DS-excitovaných alebo iných NAc neurónov (Obr. 10H,I).

Diskusia

Tieto zistenia naznačujú mechanizmus, pomocou ktorého NAc dopamín podporuje správanie zamerané na odmenu vyvolané environmentálnymi stimulmi: aktivácia dopamínových receptorov uľahčuje excitácie vyvolané cue, čo zasa podporuje krátkodobú inicializáciu prístupu k objektom spojeným s odmenou. Tento záver je silne podporený pozorovaním, že obojstranná injekcia antagonistu dopamínu zvýšila latenciu na začatie pohybu (Obr. 1D) a znížila veľkosť excitácií vyvolaných cue (Obr. 33​-6). Redukovaná excitácia vyvolaná cue nemohla byť dôsledkom zhoršeného správania, pretože jednostranné injekcie nezmenili správanie DS-cued (Obr. 1C-F), ale hlboko znížila excitáciu vyvolanú DS v injekčnom tkanive (Obr. 3B,D, , 5,5, , 6) .6). Tieto excitácie boli prevládajúcou nervovou odozvou v NAc (vyskytujú sa v 45% zaznamenaných neurónov) a obidva tieto typy predchádzali nástupu pohybu (Obr. 2B) a predpovedanú latenciu iniciácie pohybu s väčšou streľbou na skúšky s kratšou latenciou (Obr. 2D) (McGinty a kol., 2013; Morrison a Nicola, 2014). Preto je cue-evokovaná excitácia závislá od dopamínu a nevyhnutná pre intenzívne hľadanie odmeny.

Naše výsledky ukazujú, že excitácia vyvolaná cue a žiadna iná forma neurálnej aktivity v NAc, je pravdepodobne kritickým signálom v nervovom obvode, ktorý určuje latenciu cielených pohybov. Tento záver vyplýva z pozorovania, že antagonisti zmenšili excitáciu vyvolanú cue bez toho, aby znížili inhibície vyvolané cue, odmenou odpaľovania spojenými so spotrebou alebo základnou mierou streľby. Okrem toho štúdie, v ktorých boli bilaterálne injekcie antagonistov najúčinnejšie pri znižovaní excitácie, boli tie, v ktorých spôsobili najväčšie poškodenie správania (Obr. 4), silne argumentujúci proti možnosti, že za účinky na správanie bola zodpovedná iná nezistená zmena v kódovaní neurónov. Naše údaje preto pevne spájajú aktiváciu dopamínového receptora v NAc, veľkosť excitácie vyvolanej tágom a latenciu zvieraťa iniciovať hľadanie odmeny.

Predchádzajúca práca ukázala, že inaktivácia VTA, ktorá znížila excitácie a inhibície vyvolané NAc cue, tiež zabraňovala zvieratám vykazovať správanie s cued prístupom (Yun a kol., 2004). Táto štúdia však neodstránila možnosť, že tieto zmeny boli nepriamym účinkom. Tu demonštrujeme, že receptory dopamínu lokálne k zaznamenaným neurónom sú nevyhnutné pre excitáciu vyvolanú cue, čím sa eliminuje možnosť, že antagonistické účinky sú spôsobené účinkom dopamínu v protismere NAc. Na rozdiel od toho, hoci inhibície vyvolané cue boli znížené inaktiváciou VTA (Yun a kol., 2004), neboli redukované lokálnou injekciou antagonistu dopamínu, a preto tieto inhibície pravdepodobne nie sú výsledkom priameho účinku dopamínu v NAc.

Účinky D1 a D2 antagonistov na DS-evokované prístupové správanie a DS-evokované vypaľovanie boli pozoruhodne podobné. Tieto pozorovania sú v súlade s dlhou líniou mikroinjekčných experimentov NAc, v ktorých antagonisti D1 a D2 produkovali takmer nerozoznateľné účinky na správanie pri dávkach podobných našim (Hiroi a White, 1991; Ozer a kol., 1997; Koch a spol., 2000; Eiler a kol., 2006; Pezze a kol., 2007; Lex a Hauber, 2008; Liao, 2008; Nicola, 2010; Shin a kol., 2010; Haghparast a kol., 2012). Tieto výsledky spolu s kontrastom medzi koncentráciou antagonistu v injektáte, ktorá je potrebná na pozorovanie účinkov (mm) a afinitou liekov na ich ciele (nm), spochybňujú, či sú účinky lieku špecifické. Aj keď je účinná koncentrácia na receptore pravdepodobne podstatne nižšia ako injektovaná koncentrácia v dôsledku difúzie, metabolizmu a oxidácie liečiv, kombinovaná účinnosť a časový priebeh týchto procesov nie je známa. Jednou z formálnych možností je preto, že tak behaviorálne, ako aj elektrofyziologické účinky SCH23390u a raclopridu sú výsledkom oboch liekov, ktoré viažu jeden alebo viac receptorov, ktoré nie sú viazané dopamínom vôbec. Proti tejto možnosti namieta niekoľko faktorov. Chovanie vyvolané cue je blokované nielen SCH23390om a raclopridom, ale aj injekciou širokospektrálneho antagonistu dopamínového receptora flupentixolu do NAc (Di Ciano a kol., 2001; Saunders a Robinson, 2012) inaktiváciou VTA (\ tYun a kol., 2004) a léziou NAc s 6-hydroxydopamínom (Parkinson a kol., 2002), ktoré selektívne zabíja katecholaminergné vlákna. Okrem toho NAc injekcia blokátora spätného vychytávania dopamínu, agonistu receptora D1 alebo receptora D2 alebo amfetamínu uvoľňujúceho dopamín zvyšuje pravdepodobnosť cued prístupu (Wyvell a Berridge, 2000; Nicola a kol., 2005; du Hoffmann a Nicola, 2013). Nakoniec, optogenetická samostimulácia neurónov neurónov VTA (správanie nepochybne udržiavaná aktiváciou dopamínových neurónov) je oslabená injekciou SCH23390 alebo raclopridu do NAc v dávkach podobných tým, ktoré sa tu používajú (Steinberg a kol., 2014). Je ťažké predstaviť si jednoduchý mechanizmus, ktorý by mohol zodpovedať za každý z týchto výsledkov bez toho, aby sa predpokladalo, že SCH23390 a racloprid blokujú prístup blokovaním účinkov endogénneho dopamínu.

Alternatívnou možnosťou je, že antagonisti sa viažu nielen na svoje cieľové receptory, ale aj na cieľové receptory dopamínu. Pri koncentráciách 10 μm alebo nižších sa racloprid neviaže na receptory podobné D1 (Hall a kol., 1986); vyššie koncentrácie neboli testované. Preto by mohol byť racloprid špecifický pre receptory D2 / D3 dokonca aj v koncentráciách injektovaných v mm, ktoré používame my a iní, najmä po difúzii, metabolizme a oxidácii. Odhady väzbovej konštanty SCH23390 na receptory podobné D2 sa pohybujú medzi 1 a 5 μm (Bourne, 2001; Mottola a kol., 2002); hoci tieto hodnoty naznačujú, že SCH23390 viaže receptory D2 / D3 v injekčných koncentráciách, funkčná účinnosť SCH23390 pri blokovaní aktivácie receptorov podobných D2 dopamínom nie je známa. Naše pozorovanie, že racloprid znižuje excitáciu vyvolanú NS, zatiaľ čo SCH23390 nepodporuje myšlienku, že lieky pôsobia na rôznych receptoroch, ale s konečnou platnosťou nepreukazuje ich špecifickosť. Napriek tomu, aj keď jeden alebo oba lieky blokujú obidva typy receptorov, aby sa znížila excitácia vyvolaná DS, bolo by to úplne v súlade s naším záverom, že aktivácia aspoň jednej formy dopamínového receptora je potrebná pre excitáciu vyvolanú DS. Teda, hoci otázka špecifickosti liekov zostáva nezodpovedaná, táto otázka len okrajovo oslabuje náš hlavný záver, že dopamín uľahčuje cued prístup zvýšením excitácie vyvolanej cue.

Ak v skutočnosti lieky pôsobili špecificky, naše zistenia, že antagonisti D1 a D2 / D3 každý redukovaný cue-evokovaný výboj vo väčšine cue-excitovaných neurónov, naznačujú, že aktivácia týchto receptorov vedie synergicky k excitácii v tých istých neurónoch. Zatiaľ čo receptory D1 a D2 sa nachádzajú vo veľmi segregovaných populáciách neurónov v NAc (Albin a kol., 1989; Gerfen a kol., 1990), podstatné podiely NAc jadra a shell neurónov, ktoré exprimujú D1 receptory, tiež obsahujú mRNA pre D3 receptory (Le Moine a Bloch, 1996), ktoré sú blokované antagonistami D2, vrátane raclopridu. Koexpresia receptorov D1 a D3 poskytuje potenciálny mechanizmus, ktorým by dopamín mohol podporovať excitáciu v neurónoch NAc synergickým účinkom, ktorý by bol blokovaný antagonistami D1 alebo D2 / 3 (Schwartz a kol., 1998). Alternatívne (alebo navyše), interakcia medzi receptormi D1 a D2 (a / alebo D3) sa môže vyskytnúť na úrovni lokálneho obvodu (Goto a Grace, 2005; Gerfen a Surmeier, 2011). Napríklad dopamín pôsobí na receptory D1 na zníženie uvoľňovania GABA na neuróny NAc (Nicola a Malenka, 1997; Hjelmstad, 2004), účinok, ktorý by mohol podporiť excitáciu v zhode s aktiváciou receptorov D2 / D3 na ostnatých neurónoch (Hopf a kol., 2003). Pozoruhodné je, že tieto mechanizmy predpokladajú, že dopamín neimituje NAc neuróny priamo, ale skôr zvyšuje ich excitabilitu v odozve na glutamátergický vstup; mohli teda vysvetliť, prečo sú excitácie vyvolané cue blokované nielen antagonistami dopamínu, ale aj inaktiváciou bazolaterálnej amygdaly a prefrontálneho kortexu (Ambroggi a kol., 2008; Ishikawa a kol., 2008), z ktorých obe posielajú glutamátergické projekcie pre NAc (Brog a kol., 1993).

Podobnosti a rozdiely medzi účinkami SCH23390U a raclopridu môžu byť výsledkom dvoch kontrastných nervových mechanizmov zahŕňajúcich fázové a tonické dopamíny. Pretože antagonisti D1 aj D2 / D3 znižovali excitáciu vyvolanú DS, ale menšie excitácie vyvolané NS, ktoré sa vyskytujú v rovnakých neurónoch, boli redukované len antagonistom D2 / D3 (Obr. 8, , 9), 9), zdá sa, že dopamín podporuje kódovanie hodnoty stimulu prostredníctvom aktivácie receptorov D1, ale uľahčuje vypaľovanie odpovedí na všetky podnety (či už sú alebo nie sú spojené s hodnotným výsledkom) prostredníctvom receptorov D2 / D3. Mohlo by to byť spôsobené tým, že väčšie fázové dopamínové tranzienty vyvolané v NAc vyvolané prediktívnou odmenou sú neutrálnejšie.Phillips a kol., 2003; Roitman a kol., 2004). Pretože receptory D2 / 3 majú vyššiu afinitu k dopamínu ako receptory D1, malé prekurzory dopamínu vyvolané NS môžu byť dostatočné na aktiváciu iba receptorov D2 / 3, zatiaľ čo prediktívne DS na odmeňovanie môžu zvýšiť koncentráciu dopamínu na hladiny dostatočne vysoké na aktiváciu receptorov D1 (Grace, 1991).

Alternatívne môže byť veľkosť excitácie vyvolanej cue regulovaná skôr tonickým ako fázovým dopamínom. Hladiny tonického dopamínu môžu odrážať náklady na nečinnosť (Niv a kol., 2007), čím sa nastavuje intenzita operatívneho výkonu. Ak sa teda dosiahnu dostatočne vysoké tonické hladiny dopamínu, mohlo by sa aktivovať dostatočné množstvo dopamínových receptorov, aby sa uľahčila excitácia vyvolaná cue a znížila latencia prístupu, ktorý hľadá odmenu. Podobný mechanizmus môže byť tiež základom dobre známeho prínosu NAc dopamínu k vykonávaniu neobsadených operatívnych úloh, ktoré vyžadujú vysokú úroveň úsilia (Salamone a Correa, 2012), v ktorom narušenie dopamínu zvyšuje latencie na priblíženie operandu (Nicola, 2010). Implicitné externé podnety (napr. Pohľad na páku) alebo vnútorné podnety (napr. Vznikajúce z načasovania alebo hladu) by mohli spúšťať prístup excitáciou NAc neurónov vo väčšej miere, keď sú náklady príležitostí a hladiny dopamínu vysoké.

Stručne povedané, bez ohľadu na špecifický farmakologický mechanizmus, naše výsledky ukazujú, že NAc dopamín podporuje správanie hľadajúcu odmenu zvýšením excitácie NAc neurónov na výrazné environmentálne stimuly. Veľkosť tejto excitácie nastavuje latenciu subjektu na iniciáciu prístupovej odpovede. Prostredníctvom tohto mechanizmu dopamín reguluje tak energiu, ako aj pravdepodobnosť získania odmeňovania.

poznámky pod čiarou

Referencie