Dostatočnosť stimulácie mezolimbického dopamínového neurónu na progresiu závislostí (2015)

 

Vincent Pascoli3,Jean Terrier3,Agnès Hiver

,Christian Lüscher'Korešpondenčné informácie o autorovi Christian Lüscherhttp://www.cell.com/templates/jsp/_style2/_marlin/images/icon_email.pngPoslať autorovi Christian Lüscher

DOI: http://dx.doi.org/10.1016/j.neuron.2015.10.017

prednosti

• Samotimulácia dopamínových neurónov evokuje synaptickú plasticitu v NAc, ktorá vedie k relapsu

Dopamín je dostatočný na vyvolanie nutkavého užívania

• Neuróny v orbitofrontálnom kortexe sú hyperexcitučné u myší rezistentných na trest

• Chemogénna inhibícia OFC znižuje nutkavú samovoľnú stimuláciu

zhrnutie

Faktory spôsobujúce prechod od rekreačnej konzumácie drog k závislosti zostávajú do značnej miery neznáme. Nebolo testované, či je dopamín (DA) dostatočný na spustenie tohto procesu. Tu používame optogenetickú autostimuláciu DA neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) na selektívne napodobnenie určujúcej zhodnosti návykových liekov. Všetky myši ľahko získali samostimuláciu. Po týždňoch abstinencie bol paralelne pozorovaný cue-indukovaný relaps s potenciáciou excitačných aferentov na neuróny exprimujúce D1 receptory nucleus accumbens (NAc). Keď myši museli podstúpiť mierny elektrický šok nohou, aby získali stimuláciu, niektoré prestali, iné vytrvali. Odpor proti trestu bol spojený so zvýšenou nervovou aktivitou v orbitofrontálnom kortexe (OFC), zatiaľ čo chemogenetická inhibícia OFC znižovala kompulzivitu. Tieto výsledky dokazujú, že stimulácia neurónov VTA DA indukuje behaviorálne a bunkové znaky závislosti, čo naznačuje dostatok na vyvolanie a progresiu ochorenia.

úvod

Závislosť je choroba, ktorá sa vyvíja v niekoľkých krokoch (Everitt a kol., 2008, George a kol., 2014). Diagnóza sa stanoví, keď sa rekreačné použitie stane nutkavým a pretrváva napriek negatívnym následkom. Aj keď hlavná hypotéza o návykových látkach predpokladá, že nadmerné užívanie drog spôsobuje ochorenie, pretože nadmerne zvyšuje koncentráciu dopamínu (DA) v mozgu, nie je jasné, či je spustenie tohto systému dostatočné na uskutočnenie prechodu od rekreačného užívania k závislosti (Di Chiara a Bassareo, 2007, Volkow and Morales, 2015). Podporné dôkazy pre hypotézu DA na posilnenie liekov sa zhromažďujú počas niekoľkých desaťročí a spoliehajú sa na počiatočný účinok liekov. Napríklad návykové lieky znižujú prah pre intrakraniálnu autostimuláciu (ICSS) mediálneho zväzku predného mozgu, vláknového traktu, ktorý obsahuje okrem iného stúpajúcu DA projekciu zo stredného mozgu (Stein, 1964, Crow, 1970, Kornetsky a kol., 1979). Farmakologické a lézne štúdie potom identifikovali mezokortikolimbický DA systém ako pôvod tohto okruhu (Wise a Bozarth, 1982). Koncom 1980. rokov 1988. storočia priame meranie extracelulárnej koncentrácie DA s mikrodialýzou potvrdilo, že návykové lieky majú spoločnú vlastnosť vyvolávania DA nárastu NAc (Di Chiara a Imperato, 2006). To viedlo k návrhu mechanistickej klasifikácie návykových látok (Lüscher a Ungless, XNUMX).

O tom, ako tieto počiatočné účinky užívania drog uľahčujú prechod k závislosti, sa vie oveľa menej. Zvažovali sa mechanizmy nezávislé od DA, pretože návykové lieky majú ďalšie farmakologické ciele. Napríklad kokaín sa okrem inhibície DA transportéra (DAT) viaže aj na SERT (transportér serotonínu) a NET (transportér norepinefrínu), aby znížil spätné vychytávanie serotonínu a norepinefrínu, čím zvyšuje koncentráciu všetkých hlavných monoamínov (Han a Gu, 2006, Tassin, 2008). Podobné obavy môžu platiť aj pre iné psychostimulanty. Navyše existuje tvrdenie, že opiáty sú, prinajmenšom v počiatočnej fáze, nezávislé od DA (Badiani et al., 2011, Ting-A-Kee a van der Kooy, 2012). Hypotéza DA bola tiež spochybnená na základe genetických myších modelov, kde po interferencii so systémom DA boli stále zjavné niektoré formy drogovo adaptívneho správania. Napríklad myši s knockoutom DAT si samy podávajú kokaín (Rocha et al., 1998) a zrušenie syntézy DA buď farmakologicky (Pettit et al., 1984) alebo geneticky (Hnasko et al., 2007) nezabránilo samovoľnému podaniu lieku. alebo podmienené preferencie miesta. Aj keď lepšia charakterizácia týchto transgénnych myší a generovanie knockoutov transportérov dvojitých monoamínov vyriešili niektoré z týchto problémov (Rocha, 2003, Thomsen a kol., 2009), nie je dostatočná schopnosť DA na vyvolanie kardinálnych znakov závislosti známa. Aby sme obišli problémy s nešpecifickosťou, rozhodli sme sa preto umožniť myšiam samostimulovať neuróny VTA DA pomocou optogenetického prístupu.

Posledné štúdie ukazujú, že aktivácia DA neurónov v strednom mozgu môže vyvolať preferenciu miest (Tsai et al., 2009) alebo posilniť inštrumentálne správanie (Adamantidis et al., 2011, Witten et al., 2011, Kim et al., 2012, Rossi a kol., 2013, McDevitt a kol., 2014, Ilango a kol., 2014). Aj keď táto selektívna aktivácia DA ciest potvrdzuje štúdie intrakraniálnej autostimulácie (ICSS) uskutočnené pred viac ako 30 rokmi pri vymedzení systému odmien (Fouriezos et al., 1978), nedosahujú dostatočné výsledky pri preukazovaní indukcie adaptívneho správania v neskorom štádiu, ktoré definuje závislosť, ani neidentifikovali základné neurónové adaptácie. Tu sme použili optogenetickú manipuláciu nielen na umožnenie priameho testovania kritéria dostatočnosti pre fázovú signalizáciu DA pri iniciovaní zosilnenia, ale aj na testovanie prechodu na závislosť.

Pozoruhodným pozorovaním neskorších štádií ochorenia je, že aj pri návykových drogách sa stane závislým iba zlomok používateľov (Warner et al., 1995, O'Brien, 1997). Ľudia závislí na človeku budú pokračovať v konzumácii drog aj napriek negatívnym následkom (pozri Definíciu závislosti od Americkej spoločnosti pre závislosť na medicíne, DSM5, Americká psychiatrická asociácia, 2013), ktoré zvyčajne súvisia so sociálnymi a psychologickými porážkami, ktoré sú často oneskorené. Podobne je u hlodavcov zhruba jedno z piatich zvierat, ktoré si samo podá kokaín, nakoniec klasifikované ako závislé (Deroche-Gamonet a kol., 2004, Kasanetz a kol., 2010; ale pozri George a kol., 2014). Vytrvalosť v užívaní drog napriek negatívnym následkom možno modelovať aj u hlodavcov zavedením jednoduchého averzívneho stimulu do harmonogramu konzumácie. Aj keď je ľudská choroba zložitejšia, spájanie trestov a konzumácie je priamym modelom základnej zložky závislosti.

V tomto prípade sme použili mierny šok na vyhodnotenie jeho dôsledkov na samopodanie kokaínu, sacharózy a optogenetickej samo-stimulácie. Ďalej skúmame, či samovoľná stimulácia DA neurónov môže vyvolať dve návyky súvisiace s návykmi - hľadanie odmeny súvisiace s cue a kompulzívnosť spojenú so spotrebou napriek negatívnym dôsledkom - a charakterizovať neurálnu plasticitu spojenú s týmto správaním.

výsledky

Získavanie VTA DA Neuron Self-Stimulation

 

Na kontrolu aktivity DA neurónov sme injektovali Cre-indukovateľný adeno-asociovaný vírus (AAV) s dvojnásobným floxovaným otvoreným čítacím rámcom (DIO) obsahujúcim ChR2 fúzovaný so zosilneným žltým fluorescenčným proteínom (eYFP) (Atasoy a kol., 2008, Brown a kol., 2010) do VTA myší DAT-Cre. Ďalej bolo umiestnené optické vlákno na zameranie VTA (ChR2, Pozri Experimentálne procedúry). Špecifickosť. \ T ChR2 expresia bola potvrdená ko-lokalizáciou eYFP s tyrozínhydroxylázou (TH), enzýmom potrebným na syntézu DA (Obrázok 1A). 

Najskôr sa na stanovenie protokolu laserovej stimulácie myši umiestnili do operačného boxu, kde mohli stlačiť aktívnu páčku, ktorá spúšťala množstvo laserových stimulácií, ktoré sa menili (1, 2, 8, 32, 60 alebo 120 dávok) každých dve sedenia. Na napodobnenie fázového vzplanutia (Hyland a kol., 2002, Mameli-Engvall a kol., 2006, Zhang a kol., 2009) typicky vyvolaného prirodzenou odmenou (Schultz, 1998) sme použili stimuláciu výbuchom. Jeden výbuch pozostával z piatich laserových impulzov 4 ms pri 20 Hz a opakoval sa dvakrát za sekundu. Zistili sme, že myši prispôsobili svoje chovanie pri stlačení páky ako funkciu dávok na laserovú stimuláciu, čím kontrolovali celkový počet prijatých dávok (Obrázok 1B). Toto správanie pripomínalo samopodanie návykových liekov, keď sa menila dávka na infúziu (Piazza et al., 2000). Pre nasledujúce experimenty sme sa rozhodli podať 30 dávok na pákový lis, čím sa získal polovičný maximálny počet dávok (Obrázok 1B). Aby sme napodobnili oneskorenie nárastu DA, ktoré sa typicky pozoruje pri intravenóznom podaní liekov (Aragona et al., 2008), oddialili sme laserovú stimuláciu o 5 s a pridali sme blikajúce cue svetlo na 10 s (Obrázok 1C).

Počas 12 po sebe nasledujúcich dní sa myši nechali samostimulovať maximálne 80-krát za 2 hodiny. Myši rýchlo zvýšili rýchlosť laserovej stimulácie a dosiahli 80 laserových stimulácií (LS) pred koncom prvej hodiny sedenia (Obrázky 1D a 1E). Rozdiel medzi aktívnou a neaktívnou pákou sa rýchlo získal a počet aktívnych pákových lisov sa primerane zvýšil s narastajúcimi plánmi fixného pomeru (FR1, 2, 3) (Obrázky 1F a 1G). V kontrolných experimentoch s použitím DAT-Cre- myší alebo myší, ktoré exprimovali ChR2 v neurónoch kyseliny y-aminomaslovej (GABA) (GAD-Cre + myši, zacielenie na inhibičné neuróny VTA), boli miery samo-stimulácie nízke a kontinuálne sa znižovali naprieč sedenie. Toto sa tiež aplikovalo na dve zvieratá Cre +, kde post hoc validácia ukázala, že VTA nebola infikovaná ChR2-eYFP (nie je ukázané). Okrem toho nebola zistená žiadna diskriminácia medzi aktívnou a neaktívnou pákou (Obrázky S1A a S1B).

Zistili sme, že myši DAT-Cre + tlačili častejšie na aktívnu páku, ako je potrebné na laserovú stimuláciu. V skutočnosti takéto „zbytočné“ aktívne pákové lisy predstavovali viac ako 30% všetkých aktívnych pákových lisov (Obrázok S2A) a vyskytli sa - ako prebiehali relácie - väčšinou medzi začiatkom cue a laserovou stimuláciou (Obrázky S2B a S2C). Toto jedinečné správanie sa vyvinulo počas akvizície a môže odrážať impulzívne reakcie.

Celkovo vzaté, aktivita burstu v neurónoch VTA DA silne posilňuje reakciu páky.

 

Oklúzia VTA DA Neuron Self-Stimulácia kokaínom

Aby sme otestovali, či samostimulácia neurónov VTA DA závisí od rovnakých mozgových obvodov, ktoré sú zamerané na návykové látky, aby sa posilnilo správanie, injekciu sme vpichli intraperitoneálne (ip) bezprostredne pred samostimulačnými reláciami (voľný prístup k laseru po dobu 45 minút, Obrázok 2A). Na začiatku dobre trénované zvieratá lisovali asi 400-krát, aby získali 85 LS za 45 minút podľa rozvrhu FR3. Po injekcii kokaínu výkon významne poklesol v závislosti od dávky na asi 30 LS pre 100 pákových lisov s najvyššou dávkou (Obrázok 2B). Táto oklúzia bola najvýraznejšia počas prvých 30 minút relácie, čo odrážalo farmakokinetiku lieku (Obrázok 2C). Tento experiment naznačuje, že posilnenie optogenetickou samo-stimuláciou a posilnenie kokaínovým podielom, ktorý je základom neurálnych obvodov.

Synaptická plasticita spojená s hľadaním po stiahnutí

Na ďalšie porovnanie optogenetickej autostimulácie s návykovými liekmi sme sa ďalej pýtali, či by sa myši po niekoľkých týždňoch vysadenia relapsovali na samostimuláciu neurónov VTA DA. Pretože hľadanie drog spojené s tágom je zavedeným modelom relapsu (Epstein a kol., 2006, Soria a kol., 2008, Bossert a kol., 2013), umiestnili sme myši späť do operačnej komory 30 dní po poslednom stimulačná relácia, kde aktívne stlačenie páky teraz spustilo kontrolné svetlo bez laserová stimulácia (Obrázok 3A). Robustné vyhľadávacie správanie spojené s cue, preukázané vysokou rýchlosťou aktívnych pákových lisov, bolo zjavné len u myší s expresiou eYFP-ChR2 v neurónoch VTA DA (DAT-Cre +, ale nie DAT-Cre-myši, Obrázok 3B).

Predchádzajúce štúdie preukázali príčinnú súvislosť medzi relapsom súvisiacim s narážkou a synaptickou plasticitou vyvolanou kokaínom v podtype neurónov NAc exprimujúcich DA D1R (Pascoli, Terrier et al., 2014). Preto, aby sme vyhodnotili túto synaptickú plasticitu, vygenerovali sme DAT-Cre myši skrížené s Drd1a-tdTomato na identifikáciu subtypu stredne veľkých ostnatých neurónov (MSN) v NAc. Namiesto vyhľadávacieho testu sa pripravili plátky NAc, kde boli D1R-MSN červené, kontrastujúce so zelenými vláknami z VTA DA neurónov infikovaných flox-ChR2-eYFP (Obrázok 3C). Celočlánkové záznamy patch-clamp ex vivo odhalili vzťah usmerňovacieho prúdového napätia pre postsynaptické prúdy vyvolané AMPAR (AMPAR-EPSC) a zvýšený pomer AMPAR / NMDAR (Obrázky 3D a 3E), v D1R-MSN, ale nie v D2R-MSN. Ukázalo sa, že podobné nálezy, ktoré boli predtým získané po ukončení podávania kokaínu, naznačujú kombinovanú inzerciu chýbajúcich GluA2 a AMPAR obsahujúcich GluA2 na samostatných vstupoch do D1R-MSN (Pascoli, Terrier a kol., 2014).

 

 

 

Self-Stimulation napriek trestu

Užívanie látky napriek negatívnym následkom je dôležitejšou definičnou črtou závislosti (pozri definíciu DSM5, Americká psychiatrická asociácia, 2013). Boli zavedené modely na potkanoch (Deroche-Gamonet et al., 2004, Pelloux et al., 2007, Pelloux et al., 2015, Chen et al., 2013), kde elektrický šok zavedený do harmonogramu samopodania kokaínu potláča kokaín spotreba u niektorých zvierat. Po 12 dňoch počiatočnej expozície (akvizície) sa myšiam umožnilo absolvovať ďalšie tri sedenia pri FR3, ale so zníženým prerušením sedenia (maximum 60 minút alebo 40 odmien). Tieto tri sedenia slúžili ako základ pre nasledujúce štyri sedenia, kde bola každá tretia laserová stimulácia spárovaná s otrasom chodidla (500 ms; 0.2 mA) predpovedaným novou narážkou (Obrázok 4A). Intenzita a trvanie šoku do chodidla boli upravené tak, aby úplne potlačili stlačenie páky pre odmenu sacharózy (pozri tiež údaje nižšie). Program trestov viedol k dvom opačným reakciám na správanie (Obrázok 4B). Niektoré myši rýchlo prestali reagovať, keď bol zavedený trest (tzv. „Citlivý“), zatiaľ čo iné pokračovali v reakcii na dosiahnutie maximálneho počtu laserových stimulácií a môžu byť považované za „rezistentné“ voči trestu. Dva zhluky zvierat sa úplne objavili na konci štyroch trestných zasadnutí (Obrázok 4C). „Rezistentné myši“ udržiavali počet laserových stimulácií (menej ako 20% redukcia), zatiaľ čo „citlivé myši“ znížili samo-stimuláciu o viac ako 80%. S týmito kritériami nebolo možné priradiť len jedno zviera (sivé bodky). Toto pozorovanie demonštruje, že nútená burstová aktivita vyvolaná vlastnou stimuláciou neurónov VTA DA je dostatočná na vyvolanie pretrvávajúcej spotreby napriek negatívnym dôsledkom vo frakcii myší. Ako kontrola sa v nezávislej skupine myší, u ktorých sa zistila rezistencia alebo senzitivita voči trestu spojenému so samo-stimuláciou, hodnotila nocicepcia pomocou testu chvostového švihnutia. Nezistil sa žiadny rozdiel v latencii na stiahnutie chvosta ponoreného do horúcej vody medzi citlivou a rezistentnou (Obrázok S3).

Ďalej sme sa, post hoc, pýtali, či nejaký konkrétny znak počas akvizičnej fázy samo-stimulácie mohol predpovedať odpor voči trestu. Citlivé a rezistentné myši vytvorili rovnaký počet aktívnych a neaktívnych pákových lisov počas základnej línie a všetky myši dosiahli maximum 80 LS (Obrázky S4A a S4B) v podobnom čase (Obrázky S4A a S4C). Zatiaľ čo frakcia márneho aktívneho pákového lisu sa opäť nelíšila v dvoch subpopuláciách (Obrázky 4D a S4D), počet marných pákových lisov pred nástupom laserovej stimulácie sa významne zvýšil u rezistentných myší do konca akvizičnej relácie (Obrázky 4E a S4E). Pretože sa toto správanie vyvinulo počas akvizície, môže prispieť spolu s vrodenou impulzívnosťou (Economidou a kol., 2009, Broos a kol., 2012, Jentsch a kol., 2014) k vytvoreniu odolnosti proti trestu. Okrem toho sa v deň 11 uskutočnila štúdia progresívneho pomeru na kvantifikáciu motivácie k optogenetickej stimulácii (Richardson a Roberts, 1996). Rezistentné myši vykazovali bod zlomu, ktorý sa štatisticky nelíšil od citlivých myší (Obrázok S4F).

Odolnosť voči trestu za kokaín, ale nie za sacharózu

Aby sa otestovalo, či paradigma konzumácie napriek škodlivým následkom spolu s impulzným stlačením páky môže tiež predpovedať nutkavý príjem návykovej látky, podstúpila nová skupina myší 12 dní samopodania kokaínu. Experimentálne parametre pre získanie samopodania kokaínu boli stanovené na maximum 80 infúzií kokaínu do 4 hodín počas akvizície a na 40 infúzií do 2 hodín počas troch základných relácií predchádzajúcich štyrom trestným sedeniam (Obrázky 5A a S5A). Po párovaní kokaínovej odmeny s elektrickými šokmi sa opäť objavili dve skupiny. 5 z myší 22 bol klasifikovaný ako rezistentný (menej ako 20% pokles oproti východiskovej hodnote), zatiaľ čo 17 sa kvalifikoval ako citlivý (pokles o viac ako 80%) a jedno zviera spadalo medzi (infúzie 13 v deň 19) (Obrázok 5B). Potom sme hľadali behaviorálne prediktory odporu voči trestu. Medzi týmito dvoma skupinami sa počet infúzií, rýchlosť infúzie a počet aktívnych alebo neaktívnych pákových lisov nelíšili (Obrázky S5B – S5D) a body zlomu boli podobné (Obrázok S5E). Odlišoval sa vývoj distribúcie v čase zbytočných lisov na aktívnej páke. V prvých štyroch zasadnutiach sa marné pákové lisy pravidelne znižovali počas prestávok u rezistentných aj citlivých myší, zatiaľ čo na konci akvizície si toto správanie zachovali iba citlivé myši (Obrázky 5C a 5D a S5F). Naproti tomu rezistentné myši mali tendenciu zvyšovať svoj celkový počet marných pákových lisov (Obrázky 5C a S5D), najmä v poslednom štvrťroku časového limitu (Obrázok 5D). Kým kvalitatívne podobné pozorovaniu, ktoré sa predtým uskutočňovalo s optogenetickou stimuláciou DA neurónov (pozri vyššie), klastrovanie zbytočných lisov v časnom časovom limite nebolo pozorované u kokaínu, s najväčšou pravdepodobnosťou v dôsledku pomalšej kinetiky, s akou sa liek nachádzal. zvýšené hladiny DA. Podobné závery však možno vyvodiť z tohto jedinečného vývoja marnej distribúcie pákového lisu počas krátkeho časového obdobia, ktoré predchádzalo „vnútornej detekcii nárastu DA“. Naše pozorovania teda naznačujú, že distribúcia marných aktívnych pákových lisov predpovedá užívanie drog napriek negatívnym dôsledkom.

Nakoniec sme zopakovali experiment s myšami ad libitum kŕmenými myšou, ktoré by mohli tlačiť na získanie sacharózovej odmeny. Akonáhle bol zavedený trest, všetky myši prestali podávať sami sacharózu (Obrázok 5E), demonštrujúc, že ​​tento plán potláčal príjem nepodstatnej prirodzenej odmeny, ale umožnil detekciu nutkavého príjmu návykovej drogy alebo silnej stimulácie DA neurónov.

Zhrnuté, tieto výsledky ukazujú, že samo stimulácia VTA DA je dostatočná na vyvolanie kompulzivity, ako je ukázané rezistenciou voči trestu u podskupiny myší (68%). Podobne, po kokaíne SA, niektoré myši sa stali rezistentnými voči trestu (23%), čo nikdy nebolo prípadom po sacharóze SA (Obrázok 5F).

 

 

 

Bunkový korelát odporu k trestu  

Aby sme určili oblasť mozgu, ktorá môže riadiť rozhodnutie vytrvať v samopodávaní aj napriek negatívnym následkom, najskôr sme monitorovali generickú „neuronálnu aktivitu“ spočítaním počtu neurónov, v ktorých trestná relácia spustila expresiu okamžitého skorého génu cFos v 15 rôznych regiónoch. Myši boli intrakardiálne perfundované PFA 90 minút po skončení posledného trestu. Kontrolné skupiny zahŕňali naivné zvieratá, rovnako ako myši, ktoré sa pripájali k citlivým alebo rezistentným myšiam, aby sa kontroloval možný zmätočný efekt počtu prijatých šokov.

Zatiaľ čo vo väčšine vybraných oblastí bol počet cFos-pozitívnych neurónov najvyšší v rezoch rezistentných myší v porovnaní s plátkami naivných myší, objavili sa dva typy odpovedí, z ktorých prelimbický kortex (PL) a laterálny OFC sú príklady. V PL sme zistili podobný nárast cFos-pozitívnych buniek u rezistentných myší a ich jačiacich kontrol, zatiaľ čo v OFC bol tento nárast zrejmý len u rezistentných a nie zodpovedajúcich yoked myší (Obrázky 6A a 6B). Na kvantifikáciu tohto rozdielu sa všetky údaje najskôr normalizovali na hladiny expresie u naivných zvierat. Potom sa vypočítal pomer medzi rezistentným a citlivým deleným ťahom na rezistenciu voči citlivosti (pomerCFO = (R / S) / (YR / YS), Obrázok 6B). Tento postup identifikoval cingulárnu kôru, OFC a VTA ako oblasti, ktoré sa aktivujú u rezistentných, ale nie u citlivých myší, a kde bol malý rozdiel v obidvoch skupinách riadených jarmov (v skutočnosti podobné javy s nízkym cFos pozitívnym neurónom) . Nájdenie VTA nie je prekvapujúce, pretože ide o oblasť neurónov stimulovaných laserom. Je to v súlade s predchádzajúcou správou, ktorá ukazuje, že stimulácia ChR2 spúšťa aktiváciu cFos (Lobo a kol., 2010, Van den Oever a kol., 2013). Nízky pomerCFO bola nájdená v oblastiach, kde bola aktivácia podobná v citlivých a rezistentných (ako CeA a PAG). PomerCFO bola tiež nízka, keď aktivácia bola paralelná s vysokým rozdielom v ovládacích prvkoch (napr. PL, Obrázok 6C pre sumárny pomerCFO dáta). Podobná expresia cFos v rezistentných a rezistentných myšiach bola preto s najväčšou pravdepodobnosťou poháňaná počtom šokov v nohe a mala len málo spoločného s odolnosťou voči trestu. Celkovo vzaté, vysoký pomerCFO v OFC naznačuje, že nervová aktivita v tomto regióne je spojená s odporom voči trestu a môže tak podporiť prechod na závislosť.

 

 

 

Plasticita pre odpor voči trestu  

Aby sme identifikovali substrát zvýšenej neurónovej aktivity v OFC u myší odolávajúcich trestu, pripravili sme plátky PL a L-OFC 24 hodín po poslednej relácii trestu, aby sme otestovali vnútornú excitabilitu. Tieto dve oblasti boli vybrané z dôvodu ich veľmi zreteľného vzoru expresie c-Fos v predchádzajúcich experimentoch. Neuronálna excitabilita sa kvantifikovala spočítaním počtu akčných potenciálov (AP) vyvolaných injekciou zvyšujúceho sa množstva prúdu (od 0 do 600 pA) v záznamoch celej bunky. Tieto záznamy odhalili pretrvávajúcu hypo-excitabilitu v pyramidálnych neurónoch PL rezistentných myší (a ich jarmovú kontrolu) v porovnaní s citlivými alebo naivnými myšami (Obrázok 7A). Pokojový membránový potenciál (RMP) zaznamenaných neurónov sa medzi experimentálnymi skupinami nelíšil (Obrázok 7B). Tieto výsledky silne naznačujú, že excitabilita neurónov v PL priamo koreluje s počtom prijatých šokov a možno nie s rozhodnutím odolať trestu. Toto najpravdepodobnejšie odráža negatívnu spätnú väzbu, ktorá bola vyvolaná excitáciou neurónov vyvolanou šokmi nohy deň predtým. Naopak neuróny z L-OFC boli excitabilnejšie iba u rezistentných myší. Excitabilita neurónov z myších myší nebola iná ako excitabilita neurónov z naivných myší, čím sa vylúčil účinok samotného šoku nohy (Obrázky 7C a 7D). Táto zvýšená aktivita OFC neurónov je pravdepodobne základom expresie cFos a môže viesť k odporu voči trestu.

 

Zníženie kompulzívnosti s chemogénnou inhibíciou OFC 

Aby sme otestovali príčinnú súvislosť medzi zvýšenou excitabilitou neurónov OFC a odolnosťou proti trestu, vyjadrili sme inhibičný DREADD (návrhové receptory výlučne aktivované návrhovými liekmi: CamKIIα-hM4D) v pyramidálnych neurónoch OFC myší DAT-Cre + (Obrázok 8A). V akútnych rezoch z OFC indukovala aplikácia CNO (klozapín-N-oxid) v kúpeli pomalý vonkajší prúd, s najväčšou pravdepodobnosťou sprostredkovaný GIRK kanálmi, ktorý bol zvrátený bariom (Ba2+), nešpecifický blokátor draslíkových kanálov (Obrázok 8B). CNO tiež posunula vstupnú / výstupnú krivku doprava (Obrázok 8C). Myši DAT-Cre + infikované AAV1 / CamKIIa-hM4D-mCherry v OFC (Obrázok 8D) získaná paradigma autostimulácie neurónov DA, po ktorej nasledujú dva po sebe nasledujúce bloky s harmonogramom trestov, prvý v prítomnosti CNO a druhý bez CNO. Tieto dva bloky boli bez trestu prerušené o 6 dní (Obrázok 8E). Na konci prvého bloku trestu, v prítomnosti CNO, bolo rezistentné iba 5 myší 16 (Obrázok 8F, ľavý panel). Na rozdiel od toho, bez inhibície OFC, počas druhého trestného obdobia bol 14 z 16 klasifikovaný ako „rezistentný“ (Obrázky 8F, pravý panel a 8G). Inými slovami, frakcia rezistentných myší bola významne nižšia v prítomnosti CNO v porovnaní s prvou kohortou myší 34 predtým testovaných za rovnakých podmienok (porovnávanie medzi skupinami, Obrázok 8H) a stala sa podobnou prvej skupine bez CNO (v rámci skupiny). Nakoniec, pre deväť myší, ktoré sa zmenili z citlivých na rezistentné, CNO nemodifikovala latenciu švihnutia chvostom pri ponorení do horúcej vody (Obrázok 8I).

Celkovo tento experiment demonštruje, že aktivita pyramídových neurónov OFC poháňa rozhodnutie pokračovať v samo-stimulácii napriek negatívnym dôsledkom, ktoré predstavujú kľúčový znak prechodu na závislosť u hlodavcov.

Diskusia 

Nedávno navrhnutý model závislosti rozlišuje tri stupne progresie ochorenia: sporadické rekreačné užívanie drog, po ktorom nasleduje intenzívne, trvalé, stupňované užívanie drog a nakoniec nutkavé užívanie spojené so stratou kontroly (Piazza a Deroche-Gamonet, 2013; ale pozri George a kol., 2014). Naša štúdia ukazuje, že stimulácia neurónov VTA DA je dostatočná na zabezpečenie tejto progresie v relatívne rýchlom časovom priebehu.

Napodobňovaním prirodzene sa vyskytujúceho vzoru výboja sa efektívne uvoľnenie DA vyvoláva v cieľových oblastiach VTA, ako je napríklad NAc (Bass et al., 2010). Hladiny DA v NAc teda pravdepodobne riadia samostimuláciu, rovnako ako si hlodavce samy podávajú ďalšiu infúziu kokaínu alebo heroínu, akonáhle koncentrácia DA klesne pod prahovú hodnotu (Wise et al., 1995). Podporuje to aj naše pozorovanie, že kokaín, injekčne podaný ip, môže uzavrieť autostimuláciu. Autostimulácia neurónov DA sa teda veľmi podobá samoaplikácii liekov, aj keď jeho kinetika je určite rýchlejšia ako akákoľvek farmakologická látka vrátane kokaínu, čo naznačuje rozdielna miera reakcií pozorovaných v tejto štúdii.

Aj keď sme selektívne zacielili DA neuróny VTA, ich optogenetická samostimulácia mohla mať aktivované skupiny buniek s rôznymi fyziologickými funkciami. Napríklad sa nedávno navrhlo, že niektoré DA neuróny kódujú averzné stimuly (Lammel a kol., 2012, Gunaydin a kol., 2014). Tieto bunky sa premietajú do mPFC, zatiaľ čo neuróny VTA DA vyčnievajúce do bočného plášťa NAc sprostredkujú pozitívne zosilnenie (Lammel et al., 2012). Bolo by zaujímavé hodnotiť autostimuláciu a progresiu pomocou selektívneho zamerania (Gunaydin et al., 2014). Pretože naša manipulácia aktivovala všetky neuróny VTA DA, rovnako ako kokaín pôsobí na všetky neuróny vyjadrujúce DAT, je možné, že niektoré DA neuróny budú riadiť zosilňovacie učenie, zatiaľ čo iné DA neuróny budú riadiť averziu. Čistým efektom by stále bolo posilnenie správania; „averzie neurónov“ by však mohli prispieť k vyvolaniu oponentského procesu (Koob, 2013, Wise a Koob, 2014).

Po nútenej abstinencii, opätovnom vystavení kontextu vyvolanému hľadaniu autostimulácie, zavedeného modelu relapsu drog u hlodavcov. Je pozoruhodné, že základná nervová plasticita je nerozoznateľná od tej, ktorá sa pozorovala po prerušení užívania kokaínu (Pascoli, Terrier et al., 2014). Toto pridáva k štúdii, ktorá predtým uvádzala identickú synaptickú plasticitu v neurónoch VTA DA vyvolanú jedinou optickou stimuláciou alebo prvou injekciou návykovej látky (Brown et al., 2010). Objavuje sa vzor synaptických adaptácií, ktoré spôsobujú adaptívne správanie spoločné pre všetky návykové látky.

Pozoruhodnou vlastnosťou našej štúdie je dichotómia v reakcii na averzívny stimul, ktorý je dostatočne silný na to, aby narušil konzumáciu nepodstatnej prírodnej odmeny u všetkých zvierat. V našom prostredí rezistentné myši nepreukázali významne vyššiu motiváciu na dodanie odmeny za sebou, čo kontrastuje so štúdiou s kokaínom u potkanov (Pelloux et al., 2007). Prediktorom správania pre odolnosť voči trestu u myší však bolo márne stlačenie páky počas 5 s pred začiatkom stimulácie neurónov DA. Neschopnosť čakať na doručenie odmeny preto môžeme považovať za marker impulzivity (Dalley et al., 2011, Olmstead, 2006, Everitt et al., 2008, Winstanley, 2011, Leyton a Vezina, 2014). Zaujalo nás pozorovanie, že impulzívne užívanie sa vyvinulo až po niekoľkých sedeniach vlastnej stimulácie. To zvyšuje možnosť, že odpor proti trestu (a v širšom zmysle zraniteľnosť voči závislosti) nemusí byť úplne vrodený, ale vyvíja sa počas počiatočných fáz smerujúcich k závislosti. Ak je to tak, potom dichotómia pozorovaná nami a ďalšími (Deroche-Gamonet et al., 2004) nemusí byť určená iba genetickými faktormi. To by tiež vysvetľovalo, že podobná časť jednotlivcov sa stáva závislou na geneticky relatívne homogénnych kmeňoch myší a geneticky určite rozmanitejších ľudských populáciách.

Ak odpor proti trestu odhalí individuálnu zraniteľnosť voči závislosti, ktorá sa odhaduje na 20% u ľudí aj pri kokaíne (Warner a kol., 1995, O'Brien, 1997, George a kol., 2014), potom sa tu nachádza oveľa vyšší podiel môže odrážať silu priamej a selektívnej stimulácie neurónov DA. Inými slovami, selektívna stimulácia neurónov DA môže byť oveľa návykovejšia ako akékoľvek lieky. To sa dá vysvetliť neselektívnym účinkom farmakologických látok. Napríklad v prípade kokaínu môžu monoamíny iné ako DA skutočne oddialiť vznik závislosti. V skutočnosti môže serotonín pôsobiť proti adaptívnemu správaniu závislému od DA, ako je odpoveď na podmienenú odmenu, sebasimulácia a podmienené preferovanie miest (Wang a kol., 1995, Fletcher a Korth, 1999, Fletcher a kol., 2002) uľahčením asociácie. náznakov averzívnych stimulov (Bauer, 2015, Hindi Attar et al., 2012). Alternatívne môže rozdiel spočívať v rozdiele kinetiky medzi optogenetickou samostimuláciou a farmakologickou indukciou zvýšenia extracelulárneho DA. Takéto variácie návykovej potencie môžu existovať aj medzi rôznymi drogami proti zneužívaniu (George et al., 2014).

Hoci nemôžeme formálne vylúčiť rozdiely v uvoľňovaní DA a / alebo relatívnej signalizácii, aby sme prispeli k zavedeniu rezistencie voči trestu, tento scenár je nepravdepodobný, pretože histologická validácia infekcie zvierat zahrnutých v štúdii ukázala, že eYFP-ChR2 výraz v celej VTA. Okrem toho protokol optogenetickej stimulácie, určený na saturáciu uvoľňovania DA, viedol k samo-stimulácii, ktorá kulminovala v unimodálne distribuovaných hodnotách bodu zlomu, čo odráža motivačnú motiváciu.

Ďalším prekvapujúcim výsledkom je, že počet elektrických šokov chodidlami koreloval s excitabilitou neurónov v PL. U „závislých potkanov“ sa pozorovala znížená excitabilita pyramídových neurónov a zvýšený pomer AMPAR / NMDAR v pyramídových neurónoch rovnakých buniek, avšak tieto štúdie nekontrolovali účinok elektrických šokov ako takých (Kasanetz et al., 2010, Kasanetz a kol., 2013, Chen a kol., 2013). Nedisociáciu je preto možné vysvetliť dvojakou úlohou mPFC tak v rozhodovacích procesoch, ako aj v integrácii strachu (Peters et al., 2009). Naopak, zmena excitability pyramídových neurónov v infralimbickej kôre koreluje s šokmi chodidlami (Santini et al., 2008). Tento dôkaz nevylučuje možnosť, že mPFC hrá významnú úlohu pri rozhodovaní o prijímaní. Naša analýza cFos a pozorovania vnútornej excitability však ukazujú na OFC a cingulujú kôru. Ďalej inhibícia neuronálnej excitability v OFC pomocou DREADD zabránila odolnosti proti trestu. Táto príčinná súvislosť predstavuje dôležitý krok v porozumení bunkových mechanizmov zodpovedných za prechod k závislosti. Budú potrebné ďalšie štúdie, ktoré by otestovali, či to platí aj pre celú škálu návykových látok.

Naše zistenia sú v súlade s pozorovaniami, že dysfunkcia OFC môže narušiť rozhodovanie o nákladoch a výhodách (Seo a Lee, 2010, Walton et al., 2010, Fellows, 2011) a môže viesť k nutkavému správaniu (Burguière et al., 2013 ). U ľudí bolo zneužívanie drog spojené s narušeným rozhodovaním a zmenenou funkciou OFC (Lucantonio et al., 2012, Gowin et al., 2013). Dohromady sa aktivita neurónov OFC javí ako kľúčový determinant prechodu na kompulzívne užívanie drog (Everitt et al., 2007). To nevylučuje úlohu plastickosti vyvolanej liekmi pri excitačných aferentoch k MSN, ktorá sa tu a v iných štúdiách pozoruje (Kasanetz et al., 2010). Bude zaujímavé zhodnotiť, či manipulácie zamerané na riadenie excitability OFC ovplyvňujú motiváciu u závislých.

Tu navrhujeme autostimuláciu neurónov DA ako silný model na štúdium etáp vedúcich k závislosti. Reprodukujeme základné zložky drogovej závislosti, ako je relaps, synaptická plasticita a vytrvalosť v konzumácii napriek negatívnym následkom. Aj keď tento model určite nie je vhodný na štúdium účinkov špecifických pre daný liek (napr. Porovnanie opioidov s psychostimulanciami), má niekoľko výhod. Umožňuje presnú časovú kontrolu dodania odmeny, veľmi špecificky aktivuje iba neuróny VTA DA a v neposlednom rade poskytuje možnosť študovať myši oveľa dlhšie ako pri samopodávaní liekov. Zameraním sa na definovanie zhodnosti návykových drog je nádejou odhaliť nervové mechanizmy, ktoré sú základom aj pre formy závislostí, ktoré nie sú závislé od látky (Alavi et al., 2012, Robbins a Clark, 2015), a prispieť tak k všeobecnej teórii choroba. Modely optogenetickej choroby tak umožňujú rozhodujúci krok pre dôkladné pochopenie neuronálnej dysfunkcie, ktorá sa vyskytuje v neskorých štádiách závislosti, a povedú nové, racionálne spôsoby liečby choroby, ktorá v súčasnosti nie je liečiteľná.

Príspevky od autorov  

VP, JT a AH uskutočňovali behaviorálne experimenty, zatiaľ čo VP robili elektrofyziologické záznamy a koordinovali analýzu. Štúdiu navrhli a napísali všetci autori.

Poďakovanie  

Práca bola podporená grantmi švajčiarskej národnej nadácie a grantu ERC (MeSSI), Carigest SA, Akademickej spoločnosti Ženeva a Fondation Privée des Hopitaux Universitaires de Genève. JT je študent MD-PhD platený Švajčiarskou konfederáciou.

 

Doplňujúce informácie 

Dokument S1. Doplnkové experimentálne postupy a obrázky S1 – S6

Tabuľka S1. Štatistické analýzy