Cdk5 fosforyluje dopamínový receptor D2 a znižuje signalizáciu nadol (2013)

citácie: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y a kol. (2013) Cdk5 Fosforylácia Dopamínový receptor D2 a zoslabenie následného signalizovania. PLoS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, University of North Dakota, Spojené štáty americké

obdržal: Máj 20, 2013; Prijatý: November 14, 2013; Publikované: Decembra 31, 2013

Copyright: © 2013 Jeong a kol. Toto je článok s otvoreným prístupom distribuovaný podľa podmienok Creative Commons Attribution License, ktoré umožňujú neobmedzené používanie, distribúciu a reprodukciu v akomkoľvek médiu za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané.

financovania: Táto práca bola podporená grantmi (NRF-2012R1A2A2A01012923 a NRF-2012R1A4A1028200) kórejskej vlády (MSIP) a podporované aj v rámci programu medzinárodnej spolupráce pod vedením Kórey NRF (2012K2A1A2033117) a Kórejského inštitútu pre výskum mozgu (KBRI) Základný výskumný program MSIP (2031-415). SKP bola príjemcom Národnej aliancie 2004 a 2006 pre výskum schizofrénie a depresie (NARSAD) Young Investigator Awards. Poskytovatelia nemali žiadnu úlohu pri navrhovaní štúdií, zbere údajov a analýze, rozhodnutí o publikovaní alebo príprave rukopisu.

Konkurenčné záujmy: Autori vyhlásili, že neexistujú konkurenčné záujmy.

úvod

Dopamínová signalizácia je zapojená do rôznych mozgových funkcií vrátane koordinácie motoriky, kontroly nálady a mechanizmov odmeňovania [1]. Hlavnú zložku dopamínovej signalizácie u stavovcov využívajú striatálne stredne ostnaté neuróny (MSN), ktoré selektívne exprimujú podmnožinu dopamínových receptorov a dostávajú dopaminergný vstup hlavne z ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) a substantia nigra (SN) [2], Dopamínové receptory sú receptory spojené s G proteínom (GPCR) so siedmimi transmembránovými doménami a pozostávajú z dvoch podtypov, D1-like a D2-podobné receptory, ktoré sprostredkovávajú recipročné účinky v dopamínovej signalizácii [1]. Napríklad receptory podobné dopamínu D1 (D1, D5) aktivujú adenylyl cyklázu prostredníctvom G_aS a zvýšenie intracelulárnej hladiny cAMP, ale dopamínové receptory podobné D2 (D2, D3, D4) inhibujú adenylyl cyklázu prostredníctvom G_αi a zníženie intracelulárnej hladiny cAMP [1], [3].

Medzi receptormi dopamínu sa receptor D2 (DRD2) podieľa na patofyziológii viacerých veľkých psychiatrických porúch vrátane schizofrénie a drogovej závislosti [4]tak, že mnohé antipsychotické liečivá aspoň čiastočne cielia DRD2. Je tiež známe, že aktivita DRD2 dobre koreluje s behaviorálnymi dôsledkami drog zneužívania na zvieracích modeloch [5], Antidepresíva a účinnosť stabilizátora nálady sú tiež spojené so zmenami expresie DRD2 na povrchu bunky alebo intracelulárnej signalizácie v smere toku sprostredkovanej PKA, ERK a GSK3. [1], [4], [6], Napriek týmto kritickým úlohám DRD2 v mozgu nie sú podrobne pochopené podrobné regulačné mechanizmy, ktoré dodávajú vlastnosti DRD2 rôznorodosť a komplexnosť.

Konvergujúce línie dôkazov naznačujú, že do jemného doladenia aktivity DRD2 je zapojených viac posttranslačných modifikácií. Rozsiahla glykozylácia DRD2 bola odhalená v časných štúdiách označovania foto afinity [7]a tvorba disulfidovej väzby v DRD2 bola tiež identifikovaná ako dôležitá modifikácia pre väzbu ligandu [8], Okrem toho boli fosforylačné miesta DRD2 pôvodne identifikované in vitro test s rádioizotopmi, poskytujúci cesty pre rôzne regulačné dráhy sprostredkované rôznymi kinázami [9], Proteínkináza C (PKC) skutočne reguluje mobilizáciu intracelulárneho vápnika sprostredkovanú DRD2 a moduluje interakciu DRD2 s cytoskeletálnymi proteínmi. [10], Fosforylácia prostredníctvom GPCR kinázy 2 (GRK2) reguluje agonistom indukované resenzitizačné vzory DRD2 [11].

Cyklín-dependentná kináza 5 (Cdk5) je prolínom riadená serín / treonínkináza, ktorá má preferenčnú aktivitu v dôsledku mozgovo špecifickej expresie jej esenciálnych aktivátorov, p35 a p39 [12], Cdk5 sa podieľa na rôznych neuronálnych procesoch vrátane neuronálnej migrácie a vedenia axónov a myši Cdk5 a p35 null vykazujú defekty v kortikálnom vrstvení [13], Nedávno sa ukázalo, že fosforylácia WAVE1 a efexínu pomocou Cdk5 reguluje morfogenézu dendritickej chrbtice [14], Okrem toho Cdk5 tiež reguluje hladiny povrchovej expresie NMDA receptora, NR2B a NR2A sprostredkovaných NMDA prúdov [15], [16], Je pozoruhodné, že viaceré dôkazy naznačujú intímny vzťah medzi Cdk5 a dopamínovým systémom. Cdk5 fosforyluje tyrozínhydroxylázu (TH), reguluje jej stabilitu, a tým udržuje dopaminergnú homeostázu [17], V postsynaptických neurónoch, keď je T75 zvyšok dopamínu a cyklicko-AMP regulovaného fosfoproteínu-32kD (DARPP-32) fosforylovaný Cdk5, môže inhibovať PKA aktivitu a teda antagonizovať dopamínovú DRD1-sprostredkovanú PKA signalizáciu [18]. Je zaujímavé, že keď je kokaín, nepriamy agonista dopamínových receptorov, podávaný chronicky u potkanov, zvyšuje sa hladina mRNA a proteínu Cdk5 v stredných ostnatých neurónoch. [19]. Zdá sa, že Cdk5 sa podieľa na synaptických adaptáciách indukovaných liečivom. V tejto štúdii sme ukázali funkčnú interakciu DRD2 a Cdk5, ktorá ďalej rozširuje úlohu Cdk5 pri dopamínovej signalizácii.

Materiály a metódy

protilátky

Anti-králičie séra boli zvýšené proti peptidom obsahujúcim fosfo-serín 321 (pS321) tretej intracelulárnej slučky DRD2 (D2i3). Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON) sa použil na prípravu peptid-konjugovanej kolóny na afinitnú purifikáciu (20401, PIERCE). Protilátka anti-pS321 bola obohatená systémom afinitnej purifikácie podľa inštrukcií výrobcu. Purifikovaná fosfo-protilátka bola skladovaná v PBS s 0.1% azidom sodným a 0.1% želatínou. Anti-myšacia anti-Cdk5 protilátka (sc-249) a anti-králičia anti-p35 protilátka (sc-820) sa použili na Western blotovanie a imunocytochémiu Cdk5 / p35. Anti-myšacia anti-GFP protilátka (sc-9996) sa použila na imunoprecipitáciu a Western blotovanie DRD2-GFP. Anti-králičia anti-FLAG protilátka (sc-807), anti-králičia anti-HA protilátka (sc-805), anti-myšacia anti-GST protilátka (sc-138) a anti-myšacia anti-GAPDH protilátka (sc- 32293) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnologies.

zver

Myš p35 knockout bola láskavým darom od Dr. Katsuhiko Mikoshiba v RIKEN Brain Science Institute v Japonsku a používa sa na primárnu neurónovú kultúru. Súpravy primérov na genotypizáciu boli 5-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5®-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC a 5-TCCATCT GCACGAGACTAGT, ako bolo opísané vyššie. [20], ICR myši a potkany Sprague Dawley sa použili na prípravu lyzátu mozgu. Všetky postupy na zvieratách boli schválené Inštitútom Pohang University of Science and Technology Institutional Animal Care and Use Committee.

Konštrukty plazmidov

Bola použitá ľudská DRD2 dlhá izoforma v EGFP-N1 plazmidovom vektore a tretia intracelulárna slučka DRD2 (212-373 aminokyselinové zvyšky vrátane 29 dodatočných aminokyselinových zvyškov unikátnych pre DRD2 dlhú izoformu) v pFLAG-CMV-2 plazmidovom vektore. Ľudský Cdk5 sa vložil do plazmidu pCMV-HA a ľudský p35 sa vložil do pcDNA plazmidu 3.1. Ľudský Cdk5 bol vložený pod promótorom cytomegalovírusu (CMV) spolu s ľudským p35 do pcDNA 3.1 vektora, aby sa vytvoril duálny expresný konštrukt (Cdk5 / p35) na imunocytochémiu, test internalizácie receptora, [³⁵S] -GTP_γS väzbový test, rádioligandový väzbový test a cAMP enzýmový imunotest.

In vitro Test kinázy

IP-viazaná in vitro Skúška kinázy sa uskutočnila nasledujúcim spôsobom. Jeden celý myšací mozog sa lyzoval v 3 ml erytrocytových lýznych pufroch (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) pomocou 20 ťahov Dounce homogenizátora, aby sa získali homogenizované mozgové lyzáty. , Lyzáty boli inkubované na lade pre 30 min, sonikované a centrifugované pri 16,000 × g pre 10 min. Supernatanty sa imunoprecipitovali s anti-králičou anti-p35 protilátkou, aby sa získal aktívny komplex Cdk5 / p35. Komplex Cdk5 / p35 a purifikovaný fúzny proteín GST sa zmiešali s adenozín 5-triposfátom, [y-³²P] (NEG-502H, PerkinElmer) a inkubuje sa v kinázovom pufri (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl₂, 0.2 mM DTT) pre 1 h pri teplote miestnosti [18], [21], Vyčistený komplex Cdk5 / p25 (14 – 516, Millipore) bol tiež použitý na in vitro test kinázy, ako je opísané vyššie. Do reakčnej zmesi sa pridal 2 x tlmivý roztok vzorky a zmes sa varila pri 100 ° C. Vzorky sa potom podrobili SDS-PAGE a vysušený gél sa vyhodnotil autorádiografiou.

Kvapalinová chromatografia (LC) -Masová spektrometria (MS) / MS analýza

Rekombinantný proteín GST-D2i3 sa analyzoval pomocou LC-MS / MS po IP-väzbe in vitro test kinázy. Uskutočnili sme peptidovú identifikáciu LC-MS / MS dát pomocou X !! Tandem (verzia Dec-01-2008). Každý dátový súbor RAW sa najprv konvertoval na mzXML pomocou trans-proteomického potrubia (TPP; verzia 4.3). Skeny MS / MS v konvertovaných mzXML sa potom podrobili vyhľadávaniu proti databáze UniProt myšej proteínovej sekvencie (uvoľňovanie 2010_07) vrátane sekvencie GST-D2i3 s použitím X. Tandem. Tolerancia bola nastavená na 3 Da pre prekurzorové ióny a 2 Da pre fragmentové ióny. Použila sa enzymatická špecificita pre trypsín. Možnosti variabilnej modifikácie sa použili na karbamidometyláciu cysteínu (57.021 Da), oxidáciu metionínu (15.995 Da), hydrolýzu asparagínu (0.987 Da) a fosforyláciu serínu (79.966 Da).

Imunoprecipitácia

Imunoprecipitácia sa uskutočňovala na bunkových lyzátoch v ELB lyzačnom pufri. Anti-GFP protilátka bola pridaná k lyzátom a inkubovaná pre 3 h pri 4 ° C. Imunokomplexy boli purifikované s použitím agarózy proteín-A. Precipitáty sa inkubovali s pufrom na nanášanie vzorky SDS pre 30 min pri 37 ° C a podrobili sa SDS-PAGE a Western blotom.

GST Pull-down test

10 μg purifikovaného GST a GST – D2i3 boli inkubované s lyzátom potkana pre 1.5 h pri 4 ° C. Pridalo sa 30 ul glutatiónových (GSH) -konjugovaných Sepharose 4B guľôčok (17-0756-01, GE Healthcare) ekvilibrovaných s lyzačným pufrom a inkubovalo sa pre ďalšie 1 h. Perličky sa zhromaždili centrifugáciou pri 2,000 ×g a prepláchnuté lyzačným pufrom 4 krát [22], [23], Precipitáty sa analyzovali Western blotom s použitím anti-Cdk5 a anti-p35 protilátok.

imunocytochémia

Transfekované HEK 293 bunky a striatálne neuróny kultivované na krycích sklíčkach boli raz premyté fosfátom pufrovaným fyziologickým roztokom (PBS) a fixované ponorením do studeného 4% paraformaldehydu / PBS pre 30 min. Primárna protilátka bola zriedená v blokovacom roztoku (2% konské sérum a 1% Triton X-100 v PBS). Ako sekundárne protilátky boli použité anti-myšacia protilátka konjugovaná s Alexafluor-647 (A20990, Invitrogen) a anti-králičia protilátka (A568, Invitrogen) konjugovaná s Alexafluor-11011. Hoechst boli použité na farbenie jadra. Obrázky boli získané konfokálnou mikroskopiou (Olympus, FluoView-1000).

Test internalizácie receptora

24 h po transfekcii boli bunky ošetrené 1 uM chinpirolom (Q102, Sigma) pre 30 min a 90 min pri 37 ° C. Bunky boli resuspendované v 2 ml studeného PBS a pre každú reakciu boli použité alikvóty 200 ul. Liečenie liečivami sa uskutočnilo pri teplote miestnosti pre 3 h pri nasledujúcich koncentráciách; 3 nM [³H] -spiperón (NET-565, PerkinElmer), 3 uM sulpirid (895, TOCRIS), 10 uM haloperidol (H1512, Sigma). Hydrofóbne [³H] -spiperón sa použil na označenie celkových exprimovaných receptorov a hydrofilný sulpirid sa použil ako náhrada membránového receptora viazaného [³H] -spiperónové signály. Receptorové signály asociované s membránou boli vypočítané odčítaním hodnôt intracelulárneho receptora od celkových exprimovaných receptorových hodnôt. Bunky boli filtrované cez filter GF / B (Millipore) a premyté 3 krát premývacím pufrom (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtre sa vysušili a zvyšková rádioaktivita sa merala s použitím kvapalinového scintilačného počítača [24].

Príprava bunkovej membrány

Konfluentné bunky v kultivačných miskách 100 mm po transfekcii boli premyté ľadovo studeným PBS a zozbierané v 1 mL HME pufri (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl.₂, 1 mM EDTA). Homogenizované lyzáty sa centrifugovali s 500 x g pre 15 min a supernatanty sa následne centrifugovali s 36,000 x g pre 30 min. Na skúšky sa použili pelety resuspendované v HME pufri.

[³⁵S] -GTP_γSkúška viazania S

Frakcie bunkových membrán sa vopred inkubovali s 1 uM chinpirolom (Q102, Sigma) v testovacom pufri (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl.₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA a 0.01 mM GDP) pre 10 min. [³⁵S] -GTP_γS (NET-030H, PerkinElmer) bol pridaný do konečnej koncentrácie 3 nM v 30 ul a ďalej inkubovaný pre 90 min. 170 ul ľadovo studeného pufra (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl₂a 0.1 mM GTP), aby sa reakcia zastavila. Membrány sa prefiltrovali cez GF / B filter (Millipore) a premyli sa 3 krát premývacím pufrom (50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtre sa vysušili a rádioaktivita sa merala scintilačným počítačom [25], [26].

Test viazania rádioligandu

Pripravené bunkové membrány sa inkubovali s 0.01 nM [³H] -spiperón (NET-565, PerkinElmer) a zvyšujúce sa koncentrácie chinpirolu (Q102, Sigma) pre 30 min v testovacom pufri (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl₂100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrány sa prefiltrovali cez GF / B filter (Millipore) a premyli sa 3 krát premývacím pufrom (50 mM Tris-HCI (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakcia bola ukončená rýchlou filtráciou cez GF / C filtre. Zvyšková rádioaktivita sa merala s použitím kvapalinového scintilačného počítača [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Transfekované HEK 293 bunky boli vopred ošetrené 10 uM rolipramom (R6520, Sigma) pre 1 h, a potom boli ošetrené 0.1 uM forskolínom (F6886, Sigma) a zvyšujúcimi sa koncentráciami chinpirolu (Q102, Sigma) pre 30 min. Primárne kultivované striatálne neuróny boli ošetrené 10 uM rolipramom pre 1 h a potom 1 uM dopamínu pre 1 h [22], Bunkové lyzáty sa pripravili s 0.1 M HCI a hladiny cAMP sa detegovali pomocou cAMP enzýmového imunotestu (Sapphire Bioscience) podľa inštrukcií výrobcu.

Primárny kultivovaný striatálny neurón

Striatálna oblasť bola izolovaná z myšieho embryonálneho mozgu (E15). Rozštiepené tkanivo bolo disociované v minimálnom esenciálnom médiu (MEM) (11095, Invitrogen) obsahujúcom 0.25% trypsín (T4549-100, Sigma) a 0.1% DNáza I pre 6 min pri 37 ° C. Bunky boli resuspendované v platničkovom médiu (MEM s 0.01 M HEPES (pH 7.4) a 10% (obj./obj.) Konským sérom (16050-122, GIBCO)). Neuróny sa kultivovali počas 7 dní in vitro (DIV 7) v MEM s doplnkom B27 (17504-044, Invitrogen) pred aplikáciou na cAMP enzýmové imunotesty.

výsledky

Cdk5 fosforyluje serín 321 v tretej intracelulárnej slučke DRD2 in vitro

Na identifikáciu nových substrátov Cdk5 sme uskutočnili systematické vyhľadávanie pomocou (S / T) PX (K / H / R) ako konsenzus sekvencií Cdk5. [30] a identifikoval DRD2 ako kandidátsky substrát. Konsenzuálna sekvencia, vrátane serínu 321, je umiestnená v tretej intracelulárnej slučke DRD2 (D2i3), kde sú implikované rôzne regulačné mechanizmy. [3], [10], [11], Sekvencia je evolučne konzervovaná v DRD2 u stavovcov, čo znamená funkčný význam zvyšku (Obrázok 1A).

Na stiahnutie:   

• PPT

  Slideshow PowerPoint

• PNG

  zväčšiť obrázok (2.08MB)

• TIFF

  pôvodný obrázok (4.36MB)

Obrázok 1. Cdk5 fosforyluje serín 321 v tretej intracelulárnej slučke DRD2 in vitro.

(A) Zosúladenie aminokyselinových sekvencií znázorňujúce konzervované oblasti DRD2 z rôznych druhov (tieňované). Potenciálne miesto fosforylácie Cdk5 je označené hviezdičkou. (B) IP-spojené in vitro Skúška kinázy s rekombinantnými GST-D2i3 a GST-D2i3 mutantnými proteínmi. Komplex Cdk5 / p35 obohatený o extrakt myšieho mozgu anti-p35 imunoprecipitáciou sa použil na kinázové reakcie. Ukazuje sa autorádiograf fosforylovaných proteínov spolu s brilantným modrým farbivom Coomassie rovnakého gelu. Šípka označuje rádioaktívny signál zodpovedajúci GST-D2i3 a otvorený šípka označuje rádioaktívne signály z p35. (C) MS / MS spektrum fosforylovaného peptidového fragmentu D2i3. Teoretické fragmentačné vzory sú znázornené pod spektrom. Zo všetkých fragmentových iónov sa detegované y- a b-ióny označujú v spektre. Y₆ a y₇ ióny silne indikujú fosforyláciu serínu 321. (D) In vitro kinázový test s purifikovaným komplexom Cdk5 / GST-p25 s použitím mutantných proteínov GST-D2i3 a GST-D2i3. Fosforylované proteíny sa ukázali v autorádiografe spolu s brilantným modrom Coomassie. Šípka označuje rádioaktívny signál zodpovedajúci GST-D2i3 a otvorená šípka označuje rádioaktívne signály z GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Na posúdenie kapacity Cdk5 na fosforyláciu D2i3 sme vykonali IP-link in vitro kinázové testy s použitím aktívneho komplexu Cdk5 / p35 obohateného o lyzát myšacieho mozgu pomocou imunoprecipitácie p35 s čistenými rekombinantnými proteínmi GST-D2i3 (aminokyselinové zvyšky 212-373) ako substrátmi. Pozorovali sme fosforylačné signály v purifikovaných proteínoch GST-D2i3 a GST-D2i3 S297A, ale signifikantne sa znížil signál pomocou GST-D2i3 S321A (Obrázok 1B). Na ďalšie overenie fosforylácie serínu 321 v GST-D2i3 sme vykonali LC-MS / MS analýzu vzoriek z IP-viazaných in vitro kinázové testy s použitím hmotnostnej spektrometrie LTQ XL. Dôsledne boli získané fosfo-peptidy zodpovedajúce hmotnosti fosfo-serínových 321 peptidov (Obrázok 1C). Berúc do úvahy, že získavanie údajov závislé počas analýzy LC-MS / MS má tendenciu detegovať bohaté proteíny vo vzorke [31]tieto údaje naznačujú, že serínový 321 zvyšok je dominantným fosforylačným miestom Cdk5 v oblasti D2i3. Dokázať priamu fosforyláciu serínu 321 v GST-D2i3 pomocou Cdk5, in vitro Uskutočnil sa test kinázy s použitím purifikovaného komplexu Cdk5 / GST-p25 s purifikovanými rekombinantnými proteínmi GST-D2i3. Identifikovali sme signifikantný fosforylačný signál v GST-D2i3, ktorý nebol prítomný v GST-D2i3 S321A (Obrázok 1D). Tieto výsledky spolu ukazujú, že zvyšok D2i3 S321 je preferenčným cieľom pre fosforyláciu sprostredkovanú Cdk5.

Cdk5 fosforyluje serín 321 v tretej intracelulárnej slučke DRD2 v bunkách

Na identifikáciu fosforylácie serínu 321 sme vytvorili protilátku špecifickú pre fosfo-serín 321 (pS321). Vzorky z prepojeného protokolu IP in vitro Test kinázovej kinázy sa analyzoval Western blotom s použitím anti-pS321 protilátky. Bloty vykazovali odlišný pás v kinázovej reakcii, ktorý bol závislý na GST-D2i3 (Obrázok 2A). Na overenie potenciálnej fosforylácie serínu 321 v DRD2 pomocou Cdk5 v bunkách boli anti-GFP imunoprecipitáty z HEK 293 buniek exprimujúcich DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s HA-Cdk5 a p35 alebo bez nich analyzované pomocou Western blottingu s použitím anti-GFP a anti-pS321 protilátky. Charakteristické signály rozmazaného pásu anti-GFP protilátkou, o ktorých je známe, že sú spôsobené nadmernou glykozyláciou DRD2, sa pozorujú len v prítomnosti DRD2-GFP a protilátka proti pS321 detegovala podobné signály DRD2 len s Cdk5 / p35 co expresiou (Obrázok 2B) [7], Na ďalšie overenie fosforylácie serínu 321 pomocou Cdk5, D2i3 (FLAG-D2i3) a mutantnej formy D2i3 (FLAG-D2i3 S321A) boli vytvorené. FLAG-D2i3 a FLAG-D2i3 S321A exprimované s alebo bez HA-Cdk5 a p35 v bunkách HEK 293 boli analyzované SDS-gélovou mobilitou. Pre FLAG-D5i2 bol pozorovaný významný posun mobility závislý od Cdk3, ale nie pre FLAG-D2i3 S321A (Obrázok 2C). Tiež sme hodnotili fosforylačnú hladinu DRD2 na Ser321 po stimulácii agonistom. Bunky HEK 293 exprimujúce komplex DRD2-GFP a Cdk5 / p35 boli stimulované chinpirolom a anti-GFP imunoprecipitáty z bunkových lyzátov boli analyzované pomocou Western blotov s použitím anti-GFP a anti-pS321 protilátok. Zistili sme, že fosforylácia DRD5 sprostredkovaná Cdk2 na Ser321 nebola ovplyvnená stimuláciou agonistami, ktorá sa líši od fosforylácie sprostredkovanej GRK a PKC (Obrázok 2D) [32], [33], Tieto výsledky spoločne ukazujú, že Cdk5 môže fosforylovať serínový 321 zvyšok DRD2 v bunkovom prostredí.

Na stiahnutie:   

• PPT

  Slideshow PowerPoint

• PNG

  zväčšiť obrázok (1.92MB)

• TIFF

  pôvodný obrázok (3.5MB)

Obrázok 2. Cdk5 fosforyluje serín 321 v tretej intracelulárnej slučke DRD2 v bunkách.

Fosforylácia serínu 5 sprostredkovaná Cdk321 bola analyzovaná s použitím protilátky anti-pS321. (A) Vzorky z prepojenia IP in vitro Skúška kinázy s použitím proteínov GST-D2i3 sa analyzovala Western blotom (WB) s uvedenými protilátkami. Šípky označujú GST-D2i3s. (B) DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP sa exprimovali s alebo bez HA-Cdk5 a p35 v bunkách HEK 293. Anti-GFP imunoprecipitáty sa analyzovali Western blotom s použitím anti-GFP a anti-pS321 protilátok. Závorka označuje signály DRD2 a otvorená šípka označuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátov. „% vstupu“ je% objemu celkového lyzátu pre IP reakciu. Slabé endogénne Cdk5 signály boli označené hviezdičkami. (C) Test posunu gélu. Bunky HEK 293 transfekované, ako je uvedené, sa analyzovali Western blotom. (D) Transfekované HEK 293 bunky boli ošetrené chinpirolom a anti-GFP imunoprecipitáty boli analyzované Western blotom s anti-GFP a anti-pS321 protilátkami. Otvorená šípka označuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Cdk5 / p35 Complex a DRD2 sú fyzicky asociované

Skúmali sme potenciálnu fyzickú interakciu medzi komplexom Cdk5 / p35 a DRD2, pretože je známe, že mnohé substráty Cdk5 sú fyzicky spojené s komplexom Cdk5 / p35 [23], [34], [35], Najprv sa uskutočnil GST pull-down experiment. Purifikovaný rekombinantný proteín GST-D2i3 bol inkubovaný s potkaním mozgovým lyzátom a GST pull-down precipitáty boli analyzované na Western blotovanie. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 3Aendogénne Cdk5 a p35 boli identifikované v pull-down precipitátoch, čo indikuje fyzikálnu interakciu medzi DRD2 a komplexom Cdk5 / p35 (Obrázok 3A). Okrem toho boli HA-Cdk5 a p35 detegované v anti-GFP imunoprecipitátoch z bunkových lyzátov HEK 293 exprimujúcich DRD2-GFP a Cdk5 / p35 (Obrázok 3B). Okrem toho sme uskutočnili imunocytochemické analýzy a pozorovali, že DRD2-GFP, HA-Cdk5 a p35 vykazujú signifikantné ko-lokalizačné signály v membránovej oblasti buniek HEK 293 (Obrázok 3C, horné panely). Skúmali sme aj spoločnú lokalizáciu DRD2 a Cdk5 / p35 v neuronálnom kontexte. Konzistentne, DRD2-GFP tiež vykazoval významnú ko-lokalizáciu s endogénnymi Cdk5 a p35 v kultivovaných striatálnych neurónoch (DIV7), čo ďalej podporuje funkčné väzby medzi DRD2 a Cdk5 / p35 (Obrázok 3C, spodné panely). Výsledky ukazujú, že DRD2 a Cdk5 / p35 môžu tvoriť komplex, a teda podporujú názor, že DRD2 je fyziologický substrát Cdk5.

Na stiahnutie:   

• PPT

  Slideshow PowerPoint

• PNG

  zväčšiť obrázok (3.91MB)

• TIFF

  pôvodný obrázok (5.35MB)

Obrázok 3. Cdk5 / p35 môže vytvoriť komplex s DRD2.

(A) GST pull-down test s použitím purifikovaného rekombinantného GST-D2i3 proteínu s potkaním mozgovým extraktom. GST pull-down precipitáty sa podrobili Western blotting analýzam. 'Bead' označuje vytiahnutú zrazeninu bez GST proteínov. (B) Imunoprecipitácia komplexu DRD2 a Cdk5 / p35. Anti-GFP IP z lyzátov z transfekovaných buniek sa podrobili Western blotting analýzam. Závorka označuje signály DRD2 a otvorená šípka označuje nešpecifické signály z anti-GFP imunoprecipitátov. Vpravo je tiež znázornená preexponovaná blot pre vstupy. (C) Imunocytochemické analýzy DRD2 a Cdk5 / p35. Bunky HEK 293 exprimujúce DRD2-GFP a Cdk5 / p35 boli zafarbené protilátkami anti-Cdk5 a anti-p35 (Horné panely). DRD2-GFP sa exprimoval samostatne v kultivovaných striatálnych neurónoch a farbil sa s anti-Cdk5 a anti-p35 protilátkami (spodné panely). Hoechst boli použité na farbenie jadra. Stupnica je 5 µm. Všetky snímky boli získané pomocou konfokálnej mikroskopie (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Fosforylácia DRD5 sprostredkovaná Cdk2 Zosilňuje aktivitu receptora

Bolo publikované, že fosforylácia moduluje kritické vlastnosti GPCR, ako je G proteínová väzba, internalizácia receptora, intracelulárna lokalizácia a asociácia s modulátorovými proteínmi. [9], [11], [24]. Gonistom indukovaná internalizácia receptora je kritický regulačný proces prenosu signálu. Skúmali sme Cdk5-sprostredkovanú moduláciu internalizácie DRD2. Bunky HEK 293 exprimujúce DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s alebo bez Cdk5 / p35 boli inkubované s 1 uM chinpirolom na indukciu agonistom stimulovanej internalizácie DRD2 (Obrázok 4A). [³Signály H] -spiperónu u buniek exprimujúcich DRD2-GFP boli signifikantne znížené pri liečbe 30 min quinpirolom a získané pri 90 min. Je zaujímavé, že [³Signály H] -spiperónu u buniek exprimujúcich DRD2-GFP a Cdk5 / p35 boli tiež znížené pri liečbe 30 min quinpirolom, ale neboli získané pri 90 min (Obrázok 4A, druhá časť). Na druhej strane, [³Signály H] -spiperónu u buniek exprimujúcich DRD2 S321A-GFP boli redukované v 30 min a získané pri 90 min, bez ohľadu na koexpresiu s Cdk5 / p35. Predchádzajúce štúdie ukázali, že internalizovaný DRD2 sa recykluje späť do plazmatickej membrány po dlhšej stimulácii agonistom [11]. TZdá sa, že Cdk5-sprostredkovaná fosforylácia DRD2 sa podieľa na resenzitizačných procesoch po agonistom indukovanej internalizácii DRD2.

Na stiahnutie:   

• PPT

  Slideshow PowerPoint

• PNG

  zväčšiť obrázok (387KB)

• TIFF

  pôvodný obrázok (1.31MB)

Obrázok 4. Fosforylácia sprostredkovaná Cdk5 zoslabuje povrchovú expresiu DRD2 a signalizáciu po prúde.

(A) Povrchová expresia DRD2 meraná pomocou [³H] -spiperónový väzbový test. Transfekované bunky HEK293 boli stimulované 1 uM chinpirolom počas uvedeného času a zozbierané, nasledované 3 nM [³Spracovanie H] -spiperónom počas 3 hodín. Zmerala sa rádioaktivita a vypočítali sa povrchové signály. Chybové stĺpce predstavujú priemer ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; jednosmerná ANOVA s postnetovým testom Dunnett: porovnajte všetky stĺpce oproti kontrolnému stĺpcu). (B) [³⁵S] -GTP_γS väzbový test. Bunkové membrány boli pripravené z buniek transfekovaných, ako je uvedené. Membránové preparáty boli inkubované s 1 uM quinpirole nasledovaným 3 nM [³⁵S] -GTP_γS po dobu 90 min. Chybové stĺpce predstavujú priemer ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; jednosmerná ANOVA s postferickým testom Bonferroni: porovnajte všetky páry stĺpcov). (C) Chinpirol konkurujúci [³H] -spiperónový väzbový test. Membránové prípravky z transfekovaných buniek boli inkubované s 0.01 nM [³H] -spiperón a zvyšujúce sa koncentrácie chinpirolu počas 30 minút. Nelineárnu regresiu získala GraphPad. Chybové pruhy označujú priemer ± SE (n = 3). (D) enzýmové imunotesty cAMP v transfekovaných bunkách HEK 293. Transfekované bunky boli vopred ošetrené 10 uM rolipramu po dobu 1 hodiny a potom boli spolu ošetrené 0.1 uM forskolínu a zvyšovaním koncentrácií chinpirolu po dobu 30 minút. Nelineárnu regresiu získala GraphPad. Chybové stĺpce predstavujú priemer ± SE (n = 4; ** p <0.01; obojstranný t-tests). (E) Kultivované striatálne neuróny zo štandardných a p35 knockout embryí (DIV 7) sa ošetrili s 10 uM rolipramom pre 1 h, za ktorým nasledoval 1 uM dopamín pre 1 h. Chybové úsečky predstavujú priemer ± SE (n = 4; **p<0.01; dvojchvostý t-tests).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Ďalej sme vyhodnotili potenciálnu zmenu väzby G proteínov stimulovaných agonistom na DRD2 asociovanú s fosforyláciou sprostredkovanou Cdk5 pomocou [³⁵S] -GTP_γS väzbový test [25], [26], DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s alebo bez Cdk5 / p35 boli exprimované v bunkách HEK 293. Membrány boli pripravené a stimulované 1 uM chinpirolom a ďalej povolené [.³⁵S] -GTP_γS inkorporácia. Bunková membrána exprimujúca DRD2-GFP a Cdk5 / p35 vykazovala signifikantne zhoršené [³⁵S] -GTP_γVäzba S v porovnaní so všetkými ostatnými bunkovými membránami (Obrázok 4B). Tieto výsledky ukazujú, že fosforylácia sprostredkovaná Cdk5 down-reguluje väzbu G proteínu stimulovanú agonistom na DRD2.

Okrem toho, quinpirol-konkurenčný [³Skúšky viazania H] -spiperónu sa uskutočnili na zistenie akejkoľvek potenciálnej zmeny afinity agonistu na DRD2 fosforyláciou sprostredkovanou Cdk5. Konkurenčné viazanie [³H] -spiperón po ošetrení rastúcich koncentrácií chinpirolu na membránový preparát z transfekovaného bol meraný. Konkurenčná väzba chinpirolu a [³H] -spiperón v DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP vytvoril podobný logK_i hodnoty (−9.789 pre DRD2-GFP; −9.691 pre DRD2 S321A-GFP), čo ukazuje, že afinita ligandu k DRD2 nie je významne ovplyvnená fosforyláciou sprostredkovanou Cdk5 na DRD2 (Obrázok 4C).

Cdk5-sprostredkovaná fosforylácia down-reguluje signalizačnú dráhu DRD2-cAMP

Ďalej sme skúmali, či modifikácia DRD2 pomocou Cdk5 ovplyvňuje signálne dráhy downstream. Sledovali sme DRD2-sprostredkovanú inhibíciu produkcie cAMP stimulovanej forskolínom adenylylcyklázou v bunkách exprimujúcich DRD2-GFP a DRD2 S321A-GFP s použitím imunoanalýzy enzýmu cAMP. Bunky exprimujúce DRD2 vykazovali znížené hladiny cAMP v odozve na chinpirol spôsobom závislým od dávky. Je pozoruhodné, že spoločná expresia Cdk5 / p35 významne znižuje maximálnu inhibíciu tvorby cAMP (Obr. 4D, ľavý panel). Na druhej strane v bunkách exprimujúcich DRD2 S321A-GFP boli cAMP formácie účinne inhibované ako odpoveď na liečbu chinpirolom bez ohľadu na expresiu Cdk5 / p35 (Obr. 4D, pravý panel). Tieto výsledky ukazujú, že fosforylácia DRD5 sprostredkovaná Cdk2 zoslabuje inhibičnú aktivitu DRD2 na downstream signálnu dráhu cAMP. Na ďalšie potvrdenie javov vo fyziologicky relevantnejšom nastavení sme použili primárne kultivované neuróny z knockoutových embryí s nedostatkom p35, esenciálneho aktivátora Cdk5. Primárne kultivované striatálne neuróny boli ošetrené 1 uM dopamínom a analyzované pomocou cAMP enzýmového imunotestu. Neuróny z p35 knockoutovaných myší vykazovali znížené hladiny cAMP v porovnaní s neurónmi divokého typu, keď boli stimulované dopamínom (Obrázok 4E). Tdospeli sme k záveru, že Cdk5-sprostredkovaná fosforylácia DRD2 má za následok zníženie inhibičného tónu na dráhe cAMP vyvolanej DRD2.

Diskusia

Identifikovali sme DRD2 ako nový substrát Cdk5. Zdá sa, že fosforylácia znižuje povrchovú expresiu DRD2 tým, že ovplyvňuje osud DRD2 po internalizácii receptora, čím sa redukuje DRD2 G._i-pripojenie a downstream cAMP dráha. Keďže fosforylačný zvyšok S321 existuje ako v dlhých, tak aj krátkych izoformách DRD2, mechanizmus navrhnutý v tejto štúdii môže byť všeobecným spôsobom regulácie v signalizácii sprostredkovanej DRD2.

DRD2 v stredne ostnatých neurónoch nebol považovaný len za hlavný podtyp dopamínového receptora, ale bol tiež rozpoznaný pre jeho citlivosť na zmeny dostupnosti v reakcii na environmentálne stimuly. Agonistom indukovaná desenzibilizácia a resenzibilizácia DRD2 sa podrobne študovala [11], [24]. Mnohé štúdie preukázali, že účinky chronickej psychostimulačnej expozície, ako je kokaín a amfetamín, ktoré zvyšujú extracelulárnu úroveň dopamínu v striatálnej synapsii, sú sprevádzané dynamickými zmenami postsynaptického DRD2 [36]. Je známe, že chronickí užívatelia kokaínu majú znížené hladiny DRD2 v striatálnej oblasti a dostupnosť DRD2 v nucleus accumbens (NAcc) vykazuje negatívnu koreláciu s vyhľadávaním liekov a posilňovaním správania u myší a primátov. [37]-[39]. Tieto zistenia naznačujú, že funkčnosť DRD2 je vysoko citlivá na adaptívnu alebo kompenzačnú reguláciu v reakcii na rôzne podnety vrátane chronickej expozície liečiva. Naše výsledky ukazujú, že zvyšok S321 v tretej intracelulárnej slučke DRD2 môže byť fosforylovaný Cdk5, čo vedie k zníženiu inhibičného vplyvu DRD2 na dráhu cAMP. Táto interakcia navrhuje nový regulačný mechanizmus spojený s Cdk5 v dopaminoceptívnych neurónoch, ktorý by mohol byť spojený s dynamickou povahou povrchovej dostupnosti DRD2.

Je potrebné poznamenať, že je známe, že Cdk5 je kľúčovou zložkou pri sprostredkovaní adaptívnych zmien neurónového prostredia. Napríklad štrukturálne a funkčné zmeny dendritických spinov v neurónoch limbického okruhu sú jedným z dôsledkov opakovanej psychostimulačnej expozície. [40]. Tieto zmeny sú sprevádzané rôznymi molekulárnymi zmenami, vrátane indukcie cAMP väzbového proteínu viažuceho element (CREB) a AFosB, transkripčných faktorov, ktoré vykazujú trvalú up-reguláciu v reakcii na chronické podávanie kokaínu. [41], [42]. Dôležité je, že Cdk5 je cieľom AFosB [19], a mnohé kritické zložky, ktoré sa podieľajú na dynamike dendritickej chrbtice, ako je PSD-95, kináza p21-aktivovaná (PAK), p-katenín a spinofilín, boli uvedené ako substráty Cdk5 [43]-[46]. Dôsledne genetické alebo farmakologické manipulácie aktivity Cdk5 vyvolávajú zmeny morfológie dendritickej chrbtice a behaviorálnych reakcií na kokaín, čo znamená kritické úlohy Cdk5 v molekulárnych a morfologických zmenách mezolimbických dopamínových obvodov [47], [48]. Naše výsledky ukazujú, že DRD2 je nový cieľ Cdk5 poskytuje ďalší pohľad na adaptívne zmeny dopamínového systému v reakcii na chronické vystavenie liečivám v dôsledku následnej FosB-sprostredkovanej up-regulácie Cdk5 môže indukovať tonické zvýšenie fosforylácie DRD2 , Okrem toho je známe, že DRD2 ovplyvňuje mnohé bunkové procesy, vrátane regulácie cAMP a MAP kinázových dráh a následných transkripčných udalostí. [42], [49]. Takže zistenia v tejto štúdii by mohli zobrazovať nielen priamu reguláciu DRD2 pomocou Cdk5, ale tiež poskytnúť nový pohľad na adaptívne reakcie dopamínového systému na chronickú expozíciu lieku.

Príspevky od autorov

Koncipované a navrhnuté experimenty: JJ YUP DH SKP. Vykonali sa experimenty: JJ YUP DKK YK. Analyzované údaje: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Prispievané reagencie / materiály / nástroje analýzy: YHS. Napísal príspevok: JJ SKP.