Optogenetika odhaľuje úlohu akumulovaných stredných ostnatých neurónov exprimujúcich dopamínové D2 receptory pri kokaínom indukovanej behaviorálnej senzibilizácii (2014)

Prejsť na:

abstraktné

Navrhli sa dlhotrvajúce, liekmi indukované adaptácie v nucleus accumbens (NAc), ktoré prispievajú k návykovým návykom sprostredkovaným drogami. Tu sme použili optogenetický prístup na skúmanie úlohy NAc stredne ostnatých neurónov (MSN) exprimujúcich dopamínové D2 receptory (D2R) v kokaínmi indukovanej senzibilizácii správania. Adeno-asociované vírusové vektory kódujúce kanálrhodopsín-2 (ChR2) boli dodané do NAc transgénnych myší D2R-Cre. To nám umožnilo selektívne fotostimulovať D2R-MSN v NAc. D2R-MSN tvoria lokálne inhibičné obvody, pretože fotostimulácia D2R-MSN vyvolala inhibičné postsynaptické prúdy (IPSC) v susedných MSN. Fotostimulácia NAc D2R-MSN in vivo neovplyvnil ani iniciovanie ani expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom. Fotostimulácia počas obdobia vysadenia lieku však oslabila expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom. Tieto výsledky ukazujú, že D2R-MSN NAc hrajú kľúčovú úlohu pri stiahnutí vyvolanom plasticite a môžu prispieť k relapsu po ukončení zneužívania drog.

Kľúčové slová: optogenetika, stredne ostnaté neuróny, dopamínové D2 receptory, kokaín, drogová závislosť

úvod

Dopamínová (DA) signalizácia je spojená s očakávaním odmien a správaním zameraným na cieľ (Wise, 2004; Goto a Grace, 2005; Berridge, 2007). Jednou zo známych patológií dopaminergných porúch je drogová závislosť (Robinson a Berridge, 1993, 2003). Po opakovanej expozícii návykovým látkam sa v mezolimbickej dráhe DA vyskytujú adaptívne zmeny na molekulárnej a bunkovej úrovni; tieto môžu viesť k drogovej závislosti, ktorá je chronickou relapsujúcou poruchou, pri ktorej pretrváva nutkavé správanie pri hľadaní a užívaní drog napriek ich závažným negatívnym dôsledkom (Thomas a kol., 2008; Baik, 2013). Charakterizácia modifikácií, ktoré sa uskutočňujú v mezolimbickom dopaminergnom systéme, je preto kľúčom k pochopeniu drogovej závislosti.

Dopamínové D1 receptory (D1R) a D2 receptory (D2R) sa vysoko exprimujú v stredne ostnatých neurónoch (MSNs) striata. Bolo navrhnuté, že dlhodobé liekmi vyvolané adaptácie vo ventrálnom striatu, lepšie známe ako nucleus accumbens (NAc), prispievajú k rozvoju závislosti, ako aj k správaniu pri hľadaní drog a relapsu (Lobo a Nestler, 2011; Smith a kol., 2013). Dopaminergné bunkové telieska z ventrálnej tegmentálnej oblasti väčšinou inervujú NAc. Viac ako 95% buniek v NAc sú MSN, ktoré prijímajú excitačné vstupy zo štyroch hlavných oblastí mozgu: prefrontálna kôra, ventrálne subikulum hipokampu, bazolaterálny amygdala a talamus (Sesack a Grace, 2010; Lüscher a Malenka, 2011). MSN v rámci NAc možno rozdeliť na dve hlavné subpopulácie: priame dráhy MSN, ktoré exprimujú D1R a premietajú sa priamo do oblastí DA stredného mozgu, a nepriame cesty MSN, ktoré exprimujú D2R a premietajú sa do ventrálneho pallidum (Kreitzer a Malenka, 2008; Sesack and Grace, 2010; Lüscher a Malenka, 2011; Smith a kol., 2013). Pretože MSN sú GABAergické, aktivácia neurónov MSN bude inhibovať ich downstream ciele, ktoré sú tiež GABAergické (Chevalier a Deniau, 1990). Preto aktivácia D1R-MSN excituje DA neuróny midbrain, čo potom prispieva k regulácii správania súvisiaceho s odmeňovaním (Lüscher a Malenka, 2011; Bocklisch a kol., 2013).

Nedávne štúdie, ktoré používali geneticky upravené myši, ktoré exprimujú Cre rekombinázu špecifickým spôsobom pre bunkový typ, odhalili rôzne úlohy D1R-MSN a D2R-MSN v návykoch na závislosť od kokaínu. Takéto myši umožňujú genetické zacielenie špecifických toxínov, optogenetických sond alebo DREADD (značkové receptory aktivované výhradne značkovým liečivom) na selektívnu manipuláciu s D1R-MSN alebo D2R-MSN. Tento prístup viedol k určitému konsenzu o úlohe MSN v návykových návykoch: D1R-MSN zjavne podporujú návykové návyky, zatiaľ čo v prípade návykových návykov D2R-MSN sa nenavrhovala žiadna špecifická úloha (alebo inhibičná úloha). (Hikida a kol., 2010; Lobo a kol., 2010; Ferguson a kol., 2011; Bock a kol., 2013). Expozícia kokaínu zjavne vyvoláva synaptickú modifikáciu a zmeny v génovej expresii v oboch populáciách MSN (Lobo et al., 2010; Lobo a Nestler, 2011; Grueter a kol., 2013). Aj keď sa zdá, že D1R-MSN a D2R-MSN hrajú protichodné úlohy v návykových návykoch sprostredkovaných kokaínom, presná úloha D2R-MSN nie je jasná.

Predtým sa ukázalo, že myši s knockoutom D2R (KO) vykazujú normálnu kokaínmi sprostredkovanú senzibilizáciu správania a správanie sa pri vyhľadávaní kokaínu, s miernym poklesom citlivosti spôsobeným neprítomnosťou D2R (Baik a kol., 1995; Chausmer a kol., 2002; Sim a kol., 2013). Vystavenie stresu počas vysadenia lieku však potláča expresiu kokaínom indukovanej senzibilizácie správania, ako aj správania pri hľadaní a relapsu kokaínu u myší D2R KO (Sim a kol., 2013). Špecifické knock-down D2R v NAc neovplyvňuje bazálnu lokomotorickú aktivitu ani kokaínmi indukovanú behaviorálnu senzibilizáciu, ale udeľuje schopnosť stresu inhibovať expresiu kokaínom indukovanej senzibilizácie správania (Sim et al., 2013). Tieto zistenia silne naznačujú, že blokáda D2R v NAc nebráni kokaínmi sprostredkovanej senzibilizácii správania. Skôr sa zdá, že D2R v NAc zohráva zreteľnú úlohu pri regulácii synaptických modifikácií vyvolaných stresom počas sťahovania, ktoré vedú k zvýšeniu správania pri hľadaní a relapse kokaínu (Sim a kol., 2013).

Tu sme použili optogenetiku na ďalšie hodnotenie úlohy NAc D2R-MSN pri kokaínmi indukovanej senzibilizácii správania. Pomocou mozgových rezov sme zistili, že fotostimulácia D2R-MSN aktivuje lokálne inhibičné obvody v NAc zahŕňajúce susedné MSN. Fotostimulácia NAc D2R-MSN in vivo neovplyvňuje ani iniciovanie ani expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom. Opakovaná aktivácia NAc D2R-MSN počas obdobia vysadenia lieku však tlmí návykové správanie vyvolané kokaínom. Naše výsledky ukazujú, že D2R-MSNs NAc hrajú kľúčovú úlohu pri plasticite vyvolanej stiahnutím a môžu prispieť k relapsu po ukončení užívania drog.

Materiály a metódy

Myši

Transgénne myši D2-Cre BAC na pozadí C57Bl / 6 sa získali z MMRRC (Mutant Mouse Regional Resource Centers, B6.FVB (Cg) -Tg (Drd2-cre) ER44Gsat / Mmucd). V behaviorálnych experimentoch boli použité kontrolné skupiny pre myši D2-Cre transgén, ktorým chýba transgén D2-Cre. Myši sa udržiavali v špecifickej bariére bez patogénov za konštantných podmienok teploty a vlhkosti a na tmavom rozvrhu 12-h, 12-h. Starostlivosť o zvieratá a zaobchádzanie s nimi sa uskutočňovali v súlade s normami schválenými Inštitucionálnymi výbormi pre starostlivosť o zvieratá a ich používanie na Kórejskej univerzite a KIST.

Príprava vírusového vektora

pAAV-EF1a-DIO-hChR2 (H134R) -EYFP-WPRE štedro poskytol Karl Deisseroth (Stanford Univ.). Na prípravu AAV sa bunky HEK293T pestovali v médiu DMEM s antibiotikami a FBS. Deň pred transfekciou sa štyri platne nad 90% konfluencia z 10-cm misiek umiestnili na päť misiek 15-cm a inkubovali sa 18-22 h alebo do 60 do 70% konfluencie. Bunky HEK293T boli transfekované pAAV-DIO-ChR2-EYFP, pAAV-DJ a pHelperom s použitím transfekčného činidla JetPEI (QBiogene). Koktejl DNA / DMEM / PEI bol vírený a inkubovaný pri izbovej teplote 20 min. Po inkubácii bola transfekčná zmes pridaná do každej misky 15 cm. Transfekované bunky boli zozbierané 48 h po transfekcii a inkubované s 0.5% deoxycholátom sodným (Sigma; D6750) a 50 jednotkami / ml benzonázovej nukleázy (Sigma; E1014) pri 37 ° C počas 1 h. Po odstránení bunkových zvyškov odstreďovaním pri 3000xg počas 15 min. Bol supernatant filtrovaný cez 0.45 mm PVDF filter (Millipore). Čistenie častíc AAV-DJ sa uskutočňovalo s použitím HiTrap heparínových afinitných kolón (GE Healthcare). Na koncentráciu AAV sa použili odstredivé filtračné jednotky Amicon ultra-15 s medznou hodnotou molekulovej hmotnosti 100,000. Koncentrovaný vírus rozdelený na alikvóty a zmrazený na uchovávanie pri -80 ° C. Konečná vírusová koncentrácia bola 3 ~ 6 x 1012 vírusové častice na ml pre každý AAV.

Stereotaxické vstrekovanie a umiestnenie optických vlákien

Zvieratá sa anestetizovali ip injekciami 1.6 ul Zoletilu a 0.05 ul xylazínu (Rompun, Bayer) na gram telesnej hmotnosti a umiestnili sa do stereotaxického prístroja (David Kopf Instruments, Tujunga, CA). Na injekciu vírusov sa použila injekčná ihla s mierkou 31 na obojstrannú infúziu 2 ul vírusu do NAc v uhle 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.3; DV -4.5) rýchlosťou 0.1 ul / min. Ihla sa nechala na mieste 10 minút po injekcii a potom sa pomaly vytiahla. Kanyla z optických vlákien na implantáciu pozostávala zo zirkónovej objímky (priemer 1.25 mm a dlhý 4.5 mm) a plochý hrot optického vlákna (priemer 200 um). Ihneď po injekcii vírusov sa uskutočnila implantácia kanyly z optických vlákien do NAc na osvetlenie D2-MSN. Súradnice pre implantáciu kanyly z optických vlákien boli pre zameranie NAc uhol 0 ° (AP +1.7; ML ± 1.35; DV -4.2). Na uľahčenie ukotvenia optického vlákna boli do lebky ukotvené dve skrutky zozadu od miesta implantácie kanyly z optických vlákien. Na zafixovanie kanyly z optických vlákien na lebku sa na povrch lebky okolo spodnej časti kanyly aplikoval C&B Superbond (Sun Medical). Po vytvrdnutí C&B Superbond sa kanyla uvoľnila z držiaka a okolo kanyly a skrutiek sa naniesol zubný cement (Poly-F, Dentsply). Na uzatvorenie rezu okolo kanylačného miesta sa použilo tkanivové lepidlo Vetbond (3 M, 7003449). Po implantácii sa myšiam podávala subkutánna injekcia antibiotík (Enrofloxacín, 5 mg / kg, q 12 h) a analgézie (Carprofen, 5 mg / kg, q 24 h) po dobu 3 po sebe nasledujúcich dní.

In vivo fotostimulace

Náplasťový kábel 200 um bol pripojený k vonkajšej časti chronicky implantovateľného optického vlákna pomocou objímky. Optické vlákna boli pripojené pomocou adaptéra FC / PC k modrej laserovej dióde (473 nm, MBL-III 473-150 mW) a svetelné impulzy boli generované stimulátorom (BNC 575). Pre fotostimuláciu neurónov exprimujúcich ChR2 bola stimulačnou paradigmou frekvencia 20 Hz, doba trvania impulzu 5 ms a mW svetelnej energie 2 – 5. Svetelný výkon emitovaný z prepojovacieho kábla sa meral pomocou merača výkonu (PM100D) so svetelným senzorom S121C.

Behaviorálna analýza

Behaviorálne experimenty sa uskutočňovali na samcoch myší D2-Cre vo veku 11-13, s výnimkou myší podrobených elektrofyziologickej analýze, ktoré boli 5-6 týždňov staré. Myši s negatívnou kontrolou D2-Cre a Cre s vekovou zhodou sa injikovali vírusom a umiestnili sa jednotlivo a nechali sa aklimatizovať do klietky až do testu správania. Pre každú manipuláciu boli myši premiestnené do experimentálnej miestnosti 60 min. Pred začiatkom experimentu, aby sa umožnil návyk a aby sa znížil stres (jas experimentálnej miestnosti bol 70 lux). Každý experimentálny prístroj bol medzi experimentmi vyčistený pomocou 70% etanolu, aby sa odstránili akékoľvek potenciálne zápachové podnety.

Senzibilizácia kokaínu

Na zahájenie senzibilizácie na kokaín boli myši navyknuté na injekcie fyziologického roztoku (ip) počas 3 po sebe nasledujúcich dní a potom boli injikované fyziologickým roztokom alebo kokaínom (15 mg kg).-1, ip) po sebe nasledujúce dni 5. Myšiam sa injikovala intraperitoneálne (ip) buď hydrochlorid kokaínu (Johnson Mattney, Edinburgh, UK) rozpustený v soľnom roztoku (0.9% NaCl) alebo fyziologický roztok s ihlou 30 G. Ihneď po každej injekcii boli myši testované na horizontálnu lokomotorickú aktivitu v komore s otvoreným poľom po dobu 30 min. Na meranie účinku fotostimulácie na iniciáciu a expresiu senzibilizácie (obrázok č (Obrázok​​​5), 5), myšiam sa počas osemminútových minút 3 v domácich klietkach bilaterálne osvetľovalo modré svetlo pomocou dvojitých optických patch káblov na NAc počas štyroch 30-minútových periód. Patchové šnúry z kanyly z optických vlákien umiestnené na lebke myši sa odstránili a myšiam sa poskytol aspoň 10 min. Odpočinok. Myšiam sa potom injektoval kokaín alebo fyziologický roztok (coc 1d-coc 5d). Po začatí senzibilizácie bol kokaín stiahnutý na 14 dni bez injekcie fyziologického roztoku. Počas tohto ochranného obdobia sa nepoužila žiadna fotostimulácia. Expresia behaviorálnej senzibilizácie na kokaín sa potom stanovila injekciou provokačnej dávky lieku (10 mg kg-1, ip) po fotostimulácii NAc, ako je znázornené na obr Figure5A.5A, Na meranie účinku fotostimulácie počas periódy vysadenia kokaínu (obrázok 1) (Figure6), 6), myši boli podrobené rovnakému protokolu pre senzibilizáciu, ako je opísané vyššie (pre obrázok 5) Figure5) 5) s výnimkou fotostimulácie. Po začatí senzibilizácie na kokaín sa fotostimulácia aplikovala na NAc denne po dobu 1 h počas celej doby vysadenia 14 dní. Po 14 dňoch od vysadenia sa všetkým skupinám myší injekčne podala provokačná dávka kokaínu (10 mg kg).-1).

Obrázok 1 

Selektívna fotostimulácia stredne ostnatých neurónov v nucleus accumbens. (A) Selektívna expresia ChR2 v NAc D2R neurónoch dodaním vírusových vektorov AAV-DIO-ChR2-EYFP. stupnice mierky: obrázok na pozadí, 1 mm: vložka, 200 µm. (B) Konfokálne obrázky ...
Obrázok 2 

Fotostimulácia D2RCre-MSN riadi lokálne inhibičné obvody. (A) Konfokálny obraz živého plátku NAc, zobrazujúci farbivo-naplnený neurón, ktorý neexprimuje ChR2 a susednú bunku (šípka), ktorá exprimovala ChR2 a ktorý mohol byť fotostimulovaný. (B) IPSC ...
Obrázok 3 

Vlastnosti NAc buniek. (A) Dvojfónový fluorescenčný obraz neurónov naplnených Alexou 594. (A1) ukazuje neurón zo skupiny ChR2 + / AP, zatiaľ čo (A3) znázorňuje neurón zo skupiny ChR2- / IPSC. (A2) a (A4) sú obrázky s vysokým zväčšením z ...
Obrázok 4 

Účinky optogenetickej aktivácie D2-MSN in vivo na NAc na bazálnu lokomotorickú aktivitu. (A) Sagitálny pohľad na myši D2 Cre, ktorým bol injekčne podaný na NAc AAV-DIO-ChR2-EYFP, nasledovaná bilaterálnou implantáciou kanyly z optických vlákien. Stimulácia modrého svetla 473 nm ...
Obrázok 5 

Účinky aktivácie D2-MSN počas senzibilizácie na kokaín. (A) Experimentálna schéma pre fotostimuláciu D2-MSN počas iniciácie a expresie senzibilizácie na kokaín. Osvetlenie modrého svetla (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) bolo dodané pre štyri ...
Obrázok 6 

Účinky aktivácie D2-MSN počas vysadenia po opakovanej expozícii kokaínu. (A) Experimentálna schéma pre fotostimuláciu D2-MSN počas stiahnutia z kokaínu. Osvetlenie modrého svetla (2 ~ 5 mW, 5 ms, 20 Hz) bolo dodané na osem periód 3-min ...

Imunofluorescenčná a konfokálna laserová mikroskopia

Na imunofluorescenciu sa myši anestetizovali Zoletilom (Virbac, 1.6 ul / g, intraperitoneálne) a 0.05 ul / g Rompun (Bayer) a perfúzovali sa pomocou filtra-sterilizovaného roztoku 0.1 M PBS a fixácie použitím roztoku 4% paraformaldehyd / PBS (Sigma). Mozog sa potom odstránil a dodatočne fixoval na 4 h pomocou ľadovo chladného fixačného prostriedku, ako je uvedené vyššie. Mozgy sa potom dehydratovali v 30% sacharóze / 0.1 M PBS počas 2 dní. Mozgy sa potom zmrazili a na kryostate (Leica CM 40, Nemecko) sa pripravili po sebe idúce koronálne rezy hrubé 1900-um. Rezy (40 um) boli blokované počas 1 h v 0.1 M PBS obsahujúcom 5% normálne kozie sérum a 0.2% Triton X-100 a inkubované s králičím polyklonálnym anti-D2R (1: 500, Millipore, AB5084P) cez noc. Po premytí PBS obsahujúcom 4% Triton X-0.2 sa vzorky inkubovali pri RT po dobu 100 hs kozím anti-králičím IgG Alexa Fluor 1 (568: 1; Molecular Probes, Eugene, OR, USA) a 500 ul / ml 0.2, 4-diamidino-6-fenyl-indol HCI (DAPI; Sigma, St. Louis, MO, USA) v PBS obsahujúcom 2% normálne kozie sérum a 1% Triton X-0.2. Ako negatívna kontrola boli vzorky inkubované iba s DAPI a sekundárnou protilátkou. Rezy sa skúmali na vodnom konfokálnom laserovom skenovacom systéme C100 Plan Apo x 1 / 40 (LSM 1.4, Zeiss, Berlín, Nemecko).

Elektrofyziológia a fotostimulácia v plátkoch jadra accumbens

Myši sa použili na experimenty 4 týždne po injekcii vírusu, aby sa dosiahla optimálna expresia ChR2-EYFP. Myši sa potom anestetizovali a dekapitovali na prípravu akútnych mozgových rezov. Mozog sa rýchlo odstránil a okamžite umiestnil do ľadovo chladného rezacieho roztoku obsahujúceho (v mM) 250 sacharózu, 26 NaHCO3, 10 D-glukóza, 3 Myo-inozitol, 2.5 KCl, 2 Na-pyruvát, 1.25 NaH2PO4, 0.5 kyselina askorbová, 1 kyselina kynurénová a 7 MgCl2 ktorý bol prebublávaný 95% O2/ 5% CO2 (pH = 7.4). Rezy koronálneho mozgu (hrúbka 250 um) obsahujúce NAc sa pripravili s použitím vibratómu (Leica VT 1200 S) a potom sa inkubovali v umelej mozgovej miechovej tekutine (ACSF) obsahujúcej (v mM): 11 D-glukóza, 125 NaCl, 25 NaHCO3, 1.25 NaH2PO42.5 KCl, 1.25 MgCl2 a 2.5 CaCl2 pred nahrávaním pri teplote 34 ° C počas 1 h. Plátky sa potom preniesli do ponornej záznamovej komory, v ktorej O2- nasýtený roztok ACSF bol neustále nadávkovaný. Bunky v NAc a VTA sa vizualizovali s použitím fotónového mikroskopu 2 (Olympus FV1000 MPE, Tokio, Japonsko) vybaveného vodnou ponornou šošovkou 25X a infračervenou DIC optikou. Záznamy z celulárnych záplatových svoriek sa získali z buniek NAc pomocou zosilňovača Multiclamp 700B a digitizéra Digidata 1440A (Molecular Devices, LLC). Dáta sa odobrali pomocou softvéru pCLAMP 10.2 a ďalej sa analyzovali pomocou softvéru Clampfit 10.2 (Molecular Devices, LLC). Náplasťové elektródy s odpormi medzi 3 – 5 MΩ boli naplnené vnútorným roztokom obsahujúcim (v mM): 130 K-glukonát, 2 NaCl, 2 MgCl2, 20 HEPES, 4 Na2ATP, 0.4 Na3GTP, 0.5 EGTA a 10 Na2- fosfokreatín s pH upraveným na 7.3 pomocou 1 N KOH. Bikulín (10 uM) sa aplikoval kúpeľom na výrez mozgu, aby sa blokovali receptory GABA v podskupine experimentov.

Bunky NAc exprimujúce ChR2-EYFP boli fotostimulované pomocou zdroja svetla LED (460 ± 27 nm, UHP-Mic-LED-460, Prizmatix). Modré svetlo z LED bolo ďalej filtrované a zoslabené filtračnou kockou vybavenou excitačným filtrom (470 – 495 nm); záblesky svetla (doba trvania 10 ms, 0.0366 – 0.354 mW / mm)2) boli dodané do mozgového rezu cez objektív 25X pri frekvenciách 5-40 Hz. V podskupine experimentov boli zmerané fotoprúdy v bunkách exprimujúcich ChR2 v reakcii na svetelné záblesky trvajúce 2.

Štatistická analýza

Dáta sú uvedené ako stredné hodnoty ± sem a boli analyzované pomocou dvojstranných študentov t- test alebo s obojsmernou analýzou rozptylu, po ktorej nasledujú Bonferroniho post hoc test. P-hodnota <0.05 sa považovala za štatisticky významnú.

výsledky

Selektívna fotostimulácia stredne ostnatých neurónov v nucleus accumbens

Na určenie úlohy NAc D2R-MSN v kokaínom sprostredkovanom návykovom správaní sme použili optogenetický prístup na stimuláciu NAc D2R neurónov. Na selektívnu kontrolu aktivity D2R-MSN v NAc svetlom boli vírusové vektory kódujúce AAV-DIO-ChR2-EYFP stereotaxicky injikované do NAc transgénnych myší D2R-Cre BAC. 4 týždne po vírusovej injekcii bola pozorovaná robustná expresia ChR2-EYFP v NAc (obrázok) (Figure1A) .1A). Špecifickosť expresie ChR2 v D2R-MSN sa potvrdila imunofluorescenčnou konfokálnou analýzou: expresia YFP-označeného ChR2 bola ko-lokalizovaná s D2R v NAc (obrázok) (Figure1B), 1B), čo ukazuje, že ChR2 bol exprimovaný v neurónoch exprimujúcich D2R v NAc.

Aj keď sa takýto prístup použil v iných štúdiách (napr. Lobo et al., 2010), podrobnosti o postupoch injekcie vírusu sa budú v jednotlivých laboratóriách líšiť, takže je dôležité zdokumentovať optogenetickú kontrolu za našich špecifických experimentálnych podmienok. Funkčnú expresiu ChR2 sme hodnotili vytvorením celobunkových záznamových svoriek z MSN v plátkoch NAc. MSN boli identifikované: (1) relatívne hyperpolarizovaným pokojovým membránovým potenciálom (RMP), zvyčajne negatívnejším ako -80 mV; (2) pravidelný obrazec paľby AP v reakcii na aplikované prúdové impulzy; (3) dlhá latencia na spustenie prvého AP počas aktuálneho impulzu; (4) absencia napäťového „poklesnutia“ počas hyperpolarizácie spôsobeného hyperpolarizáciou aktivovaným katiónovým prúdom (Ih); a (5) relatívne malá veľkosť ich bunkových tiel (Chang a Kitai, 1985; O'Donnell a Grace, 1993; Le Moine a Bloch, 1996; Taverna a kol., 2008). Modré svetlo (470 nm) bolo aplikované na celé zorné pole (0.78 mm)2), zatiaľ čo napätie-upínanie MSN na udržiavacom potenciáli -69 mV. Niektoré MSN exprimovali ChR2, čo je evidentné ako fluorescencia YFP v ich somatách (šípky na obrázkoch 1C1, C3). Takéto neuróny vykazovali podstatné fotoprúdy, pričom jasnejšie svetelné podnety vyvolávali väčšie fotoprúdy (obrázok č (Figure1D) .1D). Vzťah medzi špičkovou amplitúdou fotoprúdu a intenzitou svetla (obrázok 1) (Figure1E) 1) mali polovičnú maximálnu citlivosť na svetlo 0.054 ± 0.0023 mW / mm2 a maximálna maximálna amplitúda 1.16 ± 0.16 nA (priemer ± sem, n = 4).

Za súčasných podmienok svorky MSN, ktoré exprimujú ChR2, spoľahlivo vystrelili prístupové body v reakcii na vlaky svetelných impulzov (doba trvania 10 ms; obrázok); Figure1F) .1F). Za týchto podmienok sú intenzity svetla väčšie ako 0.1 mW / mm2 boli dostatočné na vyvolanie AP (obrázok č (Figure1G, 1G, n = 5). AP boli spoľahlivo vyvolané pri fotostimulačných frekvenciách až do 20 Hz, zatiaľ čo pri 40 Hz sa odozvy indukované svetlom zhrnuli, aby spôsobili trvalú depolarizáciu, ktorá bola pri evokovaní AP menej účinná (obrázky) 1F, G).

Fotostimulácia D2R-MSN riadi lokálne inhibičné obvody

Aby sme preskúmali dôsledky aktivity D2R-MSN na lokálnych obvodoch v NAc, fotostimulovali sme presynaptickú MSN exprimujúcu ChR2 pri meraní postsynaptických odpovedí v ChR2 negatívnych MSN (obrázok) (Figure2A) .2A). Neurón znázornený na obr Figure2A2A neexprimuje ChR2, ako naznačuje neprítomnosť fluorescencie EYFP, ako aj neprítomnosť fotoprúdov s krátkou latenciou, ako sú znázornené na obrázku Figure1D.1D, Keď sa však postsynaptické MSN považovali za potenciál –69 mV, svetlo 10 ms trvanie blikania vyvolalo vonkajšie prúdy po latencii 9.0 ± 0.42 ms (obrázok) (Figure2B, 2B, n = 15). Aby sa určil charakter týchto reakcií, postsynaptický membránový potenciál sa menil medzi -99 mV až -39 mV, zatiaľ čo sa použil svetelný záblesk (obrázok) (Figure2C) .2C). Svetlo indukované reakcie sa menili s membránovým potenciálom (obrázok č (Figure2D, 2D, n = 6) a obrátili svoju polaritu pri -81 ± 3.4 mV. Vzhľadom na to, že rovnovážny potenciál pre chloridové ióny je –80 mV v našich iónových podmienkach, svetelné indukované vonkajšie prúdy by mohli byť spôsobené tokom chloridu sprostredkovaným postsynaptickou GABA.A receptory. Ak chcete otestovať túto možnosť, GABAA K externému roztoku sa pridal antagonista receptora bicuulín (10 uM). Toto liečivo úplne blokovalo svetlo indukované reakcie (obrázok č (Figure2B), 2B), čo potvrdzuje, že odpoveďami indukovanými svetlom boli GABAergické inhibičné postsynaptické prúdy (IPSC).

Na základe svojich odpovedí na fotostimuláciu sa MSN, z ktorých sme zaznamenali, mohli klasifikovať do jednej zo skupín 4: (1) bunky exprimujúce dostatočné množstvo ChR2 na oheň AP v reakcii na fotostimuláciu (ChR2 + / AP), ktoré boli opísané vyššie; (2) bunky exprimujúce malé množstvo ChR2, ktoré vykazovali subprahovú depolarizáciu v reakcii na svetlo (ChR2 + / bez AP); (3) tiché bunky, ktoré nemali žiadnu expresiu ChR2, ale dostali svetlo indukované IPSC z presynaptických MSN exprimujúcich ChR2 (ChR2- / IPSC); a (4) ChR2-negatívne bunky, ktoré nevykazovali IPSC v reakcii na fotostimuláciu iných MSN (ChR2- / No IPSC). Relatívny pomer buniek v každej z týchto kategórií je znázornený na obrázku č Figure2E2E (n = 53). Celkovo takmer polovica buniek (45.3%) exprimovala ChR2 (súčet skupín (1) a (2)). Žiadna z MSN, ktoré sme zaznamenali, nevykazovala ako fotoprúd, tak IPSC v reakcii na fotostimuláciu; to naznačuje, že D2R-pozitívne MSN neinervujú ďalších členov tej istej bunkovej populácie v NAc.

Táto klasifikácia odpovedí na svetlo naznačuje, že fotostimulácia buniek ChR2 + / No AP (skupina 2) a buniek IPSC ChR2- / No (skupina 4) nebude generovať žiadne elektrické signály, ktoré by mohli prispievať k aktivite obvodu. Preto sme na definovanie účinkov fotostimulácie na funkciu obvodu podrobne charakterizovali vlastnosti ChR2 + / AP MSN (skupina 1), ktoré budú generovať AP, keď je NAc fotostimulovaná, a ChR2- / IPSC bunky (skupina 3), ktoré sú postsynaptické na MSR ChR2 + / AP, pretože prijímajú IPSC indukované svetlom. Bunky ChR2 + / AP a ChR2− / IPSC v NAc boli identifikované ako ostnaté neuróny (obrázok (Figure3A) .3A). V týchto dvoch skupinách neboli žiadne významné rozdiely v morfologických alebo elektrofyziologických vlastnostiach neurónov. Napríklad somata neurónov v týchto dvoch skupinách mala podobnú veľkosť (obrázok č (Figure3B) .3B). Okrem toho ich RMP (-83.0 ± 1.7 vs. -85.0 ± 1.8 mV; priemer ± sem; n = 10, obrázok Figure3C) 3C) a vstupné odpory (113 ± 15 vs. 133 ± 13 MΩ, n = 6, obrázok Figure3D) 3D) sa tiež nelíšili (p > 0.05 obojstranných študentov t-test), zatiaľ čo ich AP paľba vzory v reakcii na aktuálne impulzy (obrázky 3, F) boli tiež podobné (p > 0.05 obojstranných študentov t-test, n = 6). Stručne povedané, fotostimulácia D2R-MSN v NAc aktivuje lokálne inhibičné obvody s postsynaptickými neurónmi, ktoré sú veľmi podobné D2R-MSN, ale neexprimujú D2R.

Optogenetická stimulácia NAc D2R-MSN pri kokaínmi indukovanej senzibilizácii správania

Ďalej sme skúmali dôsledky na správanie in vivo fotostimulácia NAc D2R-MSN. Pretože fotostimulácia D2R-MSN v dorzálnom striatu znižuje lokomotorickú aktivitu (Kravitz et al., 2010), začali sme charakterizovať účinky aktivácie accumbens D2R-MSN na bazálnu lokomotorickú aktivitu. Za týmto účelom sa myšiam D2R-Cre injektoval bilaterálne vírus DIO-AAV-ChR2-EYFP do NAc (D2-Cre (+) NAc-ChR2). D2R-MSN sa potom fotostimulovali modrým svetlom (473 nm, 5 ms trvanie impulzu, 20 Hz) dodávaného do NAc cez optické vlákno. Fotostimuly sa aplikovali počas štyroch periód 3-min v rámci relácie 50 min, keď sa myši držali v komore na zaznamenávanie lokomotorickej aktivity (obrázok) (Figure4A) .4A). Paralelne sa ako kontrola myšiam bez vrstiev WT do vrhu podobne injektoval vírus a dostali podobné osvetlenie modrým svetlom. Myši D2-Cre (+) NAc-ChR2 vykazovali porovnateľnú alebo mierne zvýšenú hladinu bazálnej lokomotorickej aktivity v porovnaní s kontrolnými myšami D2R-Cre (-) NAc-ChR2 (obrázky). 4B, C). Fotostimulácia D2R-MSN u D2-Cre (+) NAc-ChR2 myší spôsobila významné zníženie lokomotorickej aktivity, ktorá sa obnovila po zastavení svetelného stimulu (obrázok) (Figure4B) .4B). U kontrolných myší D2R-Cre (-) NAc-ChR2 neboli pozorované žiadne také účinky (obrázky). 4B, C), čo naznačuje, že účinky fotostimulácie boli spôsobené skôr aktiváciou ChR2, ako možné nešpecifické účinky, ako je napríklad zahrievanie mozgového tkaniva. Naše dáta preto naznačujú, že fotostimulácia D2R-MSN v NAc vyvolala zníženie lokomotorickej aktivity.

Tieto výsledky potvrdili našu schopnosť kontrolovať aktivitu D2R-MSN v NAc in vivo, Ďalej sme túto schopnosť využili na preskúmanie vplyvu aktivity D2R-MSN na behaviorálnu senzibilizáciu na opakované podávanie kokaínu. Senzibilizácia správania sa týka procesu, ktorý umožňuje počiatočnú expozíciu psychostimulantom, ako je napríklad kokaín, aby sa zvýšila schopnosť následných expozícií liečivom stimulovať lokomotorickú aktivitu. Tento proces možno rozdeliť na iniciačné a expresné fázy: iniciácia popisuje okamžité nervové udalosti, ktoré vyvolávajú behaviorálnu senzibilizáciu (Vanderschuren a Kalivas, 2000; Sim a kol., 2013), zatiaľ čo výraz je známy ako dlhodobá forma behaviorálnej plasticity, ktorá pretrváva aj po vysadení drogy (Vanderschuren a Kalivas, 2000; Sim a kol., 2013). Preto sme skúmali behaviorálnu senzibilizáciu spôsobenú kokaínom počas opakovaných intraperitoneálnych (ip) injekcií kokaínu, zatiaľ čo pomocou optogenetiky sme kontrolovali aktivitu D2R-MSN v NAc počas každej z týchto fáz.

Po návyku na injekciu fyziologického roztoku počas 3 dní sa myšiam injikovalo kokaín (15 mg / kg) v 5 po sebe nasledujúcich dňoch a lokomotorické odpovede sa zaznamenávali pre 30 min. Po každej injekcii (obrázok) (Figure5A) .5A). Fotostimuly boli podávané počas 30 min. Relácií pred injekciou kokaínu, pričom sa intervalové rozptyly 3 min. Periódovali s 5 min. (Figure5A) .5A). Vzhľadom na to, že fotostimulácia D2R-MSN v NAc znižuje bazálnu lokomotorickú aktivitu (obrázok (Figure4), 4) boli fotostimuly podané bezprostredne pred podaním kokaínu, aby sa zabránilo možnému narušeniu behaviorálnych reakcií na injekciu kokaínu.

Kontrolné myši D2-Cre (-) NAc-ChR2 aj myši D2-Cre (+) NAc-ChR2 vykázali v reakcii na opakované injekcie kokaínu výrazné zvýšenie lokomotorickej aktivity (obrázok). (Figure5B), 5B), čo naznačuje začatie senzibilizácie. Nezdalo sa, že fotostimulácia D2R-MSN v NAc ovplyvňuje iniciáciu behaviorálnej senzibilizácie, pretože kokaínom indukovaná senzibilizácia v správaní bola podobná u myší D2-Cre (+) NAc-ChR2 a kontrolných myší D2-Cre (-) NAc-ChR2.

Po vyvolaní behaviorálnej senzibilizácie opakovaním takýchto injekcií kokaínu (15 mg / kg) počas 5 dní sa liek stiahol na 14 dní a stupeň expresie senzibilizácie sa skúmal vystavením myší nižšej dávke kokaínu (10 mg) / kg). Vyjadrenie senzibilizácie je dlhodobá forma behaviorálnej plasticity, ktorá pretrváva aj po ukončení užívania drog (Steketee a Kalivas, 2011; Sim a kol., 2013). Aby sa preskúmala úloha D2R-MSN pri expresii senzibilizácie, NAc bola fotostimulovaná bezprostredne pred podaním kokaínu (obrázok). (Figure5A) 5) a senzibilizácia sa merala ako množstvo lokomotorickej aktivity vyvolanej injekciou kokaínu.

V oboch skupinách myší ošetrených kokaínom - myši D2-Cre (-) NAc-ChR2 (D2-Cre (-) :: coc-coc) a D2-Cre (+) NAc-ChR2 (D2-Cre (+): : coc-coc) - došlo k striktnej expresii senzibilizácie (obrázok č (Figure5C) .5C). Časový priebeh pohybových stimulovaných zmien kokaínu bol tiež medzi týmito dvoma skupinami podobný (obrázok č (Figure5C), 5C), bez výrazného rozdielu medzi dvoma skupinami. Celkovo tieto dva experimenty s fotostimuláciou naznačujú, že aktivácia D2R-MSN v NAc neovplyvňuje iniciovanie alebo expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom.

Fotostimulácia NAc D2R-MSN počas vysadenia liečiva

Chronický stres počas sťahovania lieku po opakovanej expozícii kokaínu vedie k selektívnemu náboru adaptačného mechanizmu závislého od D2R, ktorý riadi stresom vyvolané zvýšenie správania pri vyhľadávaní a relapsu kokaínu v spojení so zmenami synaptickej plasticity v NAc (Sim a kol., 2013). To naznačuje, že mechanizmy spojené s vysadením drog sú odlišné od mechanizmov zapojených do senzibilizácie vyvolanej drogami. Preto sme ďalej skúmali, či fotostimulácia D2R-MSN v NAc počas odoberania kokaínu ovplyvňuje expresiu kokaínom indukovanej senzibilizácie správania.

Po vyvolaní behaviorálnej senzibilizácie opakovanou injekciou kokaínu, ako je uvedené vyššie, boli myši D2-Cre (-) a D2-Cre (+) rozdelené do dvoch skupín na denné ochranné obdobie 14: jedna skupina bola denne vystavená modrej stimulácii NAc pre 1 h (3 min. X 8-krát), zatiaľ čo druhá skupina nebola (obrázok) (Figure6A) .6A). Opakovaná fotostimulácia D2R-MSN v NAc počas odoberania kokaínu neovplyvnila expresiu senzibilizácie u myší D2-Cre (-) :: coc-coc (obrázok) (Figure6B) .6B). Naopak u myší D2-Cre (+) :: coc-coc bola expresia senzibilizácie významne znížená opakovanou fotostimuláciou počas vysadenia lieku (obrázok). (Figure6B), 6B), hoci časový priebeh stimulácie pohybu vyvolanej kokaínom nebol ovplyvnený (obrázok č (Figure6C) .6C). Fotostimulácia D2R-MSNs NAc počas vysadenia liečiva teda znížila expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom (kokaín × fotostimulačná interakcia) F(1,18) = 11.08, P = 0.0037, obrázok Figure6B) .6B). Tieto údaje naznačujú, že aktivácia MSN D2R-NAc počas obdobia vysadenia lieku ovplyvňuje správanie pri vyhľadávaní a relapsu kokaínu.

Diskusia

Značné dôkazy naznačujú, že senzibilizácia správania vyvolaná kokaínom je spojená so zvýšeným dopaminergným prenosom v mezokortikoidickom systéme zahŕňajúcom ventrálnu tegmentálnu oblasť, prefrontálnu kôru a nucleus accumbens (NAc). Expresná fáza behaviorálnej senzibilizácie sa vyznačuje najmä pretrvávajúcou hyperreaktivitou na liek po ukončení liečby, ktorá je spojená s kaskádou adaptačných mechanizmov (Kalivas a Duffy, 1990; Robinson a Berridge, 1993; Kalivas a kol., 1998), ktoré by mohli prispieť k nutkavej túžbe po drogách (Robinson a Berridge, 1993; Kalivas a kol., 1998; Steketee a Kalivas, 2011). Bolo navrhnuté, že kokaínom vyvolané zmeny v molekulárnej, bunkovej a behaviorálnej plasticite v NAc, v spojení so signalizáciou DA receptora v MSN, môžu regulovať návykové správanie sprostredkované liečivom (Lobo et al., 2010; Schmidt a Pierce, 2010; Ferguson a kol., 2011; Pascoli a kol., 2011; Bocklisch a kol., 2013; Grueter a kol., 2013).

Nedávne štúdie s použitím geneticky modifikovaných myší, ktoré podmienene exprimujú Cre rekombinázu, odhalili úlohu D1R-MSN alebo D2R-MSN pri návykových návykoch na kokaín. Optogenetická aktivácia D1R-MSNs NAc po 6 dňoch opakovaného podávania kokaínu zvyšuje lokomotorickú aktivitu, zatiaľ čo aktivácia D2R-MSN údajne nemá žiadny účinok (Lobo et al., 2010). Tieto údaje naznačujú, že opakovaná expozícia kokaínu zvyšuje produkciu D1R-MSN z NAc. Inhibícia D1R exprimujúcich MSN tetanickým toxínom (Hikida a kol., 2010) znižuje preferenciu miesta podmieneného užívaním kokaínu (CPP), zatiaľ čo po zrušení synaptického prenosu v D2R-MSN sa nepozorovali žiadne zmeny v CPP kokaínu (Hikida et al., 2010). Optogenetická aktivácia D1R-MSN v dorzálnom striatu indukuje pretrvávajúce zosilnenie, zatiaľ čo stimulácia neurónov exprimujúcich receptor D2 indukuje prechodné trestanie (Kravitz et al., 2012). Nedávna štúdia tiež uvádza, že inhibícia D2R-MSN pomocou chemokinetického prístupu zvyšuje motiváciu získať kokaín, zatiaľ čo optogenetická aktivácia D2R-MSN potláča samopodanie kokaínu (Bock a kol., 2013). Na druhej strane Bocklisch a kol. (2013) uviedli, že D1R-MSNs NAc projektujú na VTA, konkrétne na GABAergické neuróny v rámci VTA, zatiaľ čo D2R-MSNs nevyčnievajú priamo na VTA. Tento obvod znamená, že optogenetická aktivácia D1R-MSN bráni DA neurónom, čo nakoniec zvyšuje návykové správanie vyvolané kokaínom (Bocklisch et al., 2013).

Napriek zdanlivo jednoduchej organizácii týchto dvoch populácií MSN, skutočnosť, že MSN prijímajú viac vstupov a majú rôzne výstupy z / do iných oblastí mozgu, ako aj formujú miestne obvody medzi MSN a inými triedami interneurónov, výsledný výstup D1R- MSN a D2R-MSN môžu priniesť komplexné a rôzne molekulárne, bunkové a behaviorálne následky.

Predtým sa ukázalo, že D2R prispieva k synaptickým modifikáciám vyvolaným počas vysadenia lieku a tieto zosilňujú recidívu pri vyhľadávaní kokaínu bez ovplyvnenia počiatočného získania alebo hľadania lieku (Sim a kol., 2013). Naše súčasné údaje naznačujú, že fotostimulácia D2R-MSN v NAc vyvoláva zníženie bazálnej lokomotorickej aktivity. Lobo a kol. (2010) nezistili žiadnu zmenu lokomócie, keď bol aktivovaný niektorý z podtypov MSN, ale skôr skúmali celkovú lokomotorickú aktivitu ako skúmali okamžité reakcie bazálnej lokomotorickej aktivity na fotostimuláciu. Kravitz a kol. (2010) tiež zistili, že optogenetická aktivácia D2R-MSN v dorzálnom striatu tiež znižuje lokomotorickú aktivitu. Naše dáta sú teda prvé, ktoré demonštrujú, že bazálna lokomotorická aktivita je inhibovaná fotostimuláciou D2R-MSN NAc, a prvé, ktoré systematicky skúmajú časový priebeh bazálnej lokomotorickej aktivity počas fotostimulácie týchto neurónov.

V tejto štúdii sme pozorovali, že optogenetická aktivácia D2R-MSN v NAc neovplyvnila začatie alebo expresiu behaviorálnej senzibilizácie. Fotostimulácia D2R-MSN v období vysadenia lieku však oslabila expresiu senzibilizácie vyvolanej kokaínom. Naše dáta preto naznačujú, že D2R-MSN získavajú určitý signál špecificky počas ochrannej lehoty, ktorá ďalej mení génovú expresiu alebo iné formy signalizácie, a tým spúšťa zmeny synaptickej plasticity, čo vedie k zmenám senzibilizácie správania vyvolanej kokaínom. Nie je známe, ako tieto MSN využívajú adaptácie špecifické pre daný typ bunky, ktoré môžu spôsobiť ich zreteľné následky v správaní súvisiacom so závislosti. Grueter a kol. (2013) navrhli, že AFosB v NAc diferencovane moduluje synaptické vlastnosti a správanie súvisiace s odmeňovaním spôsobom špecifickým pre bunkový typ a subregión. Nedávno Chandra a kol. (2013) uviedli, že opakovaná aktivácia D2R-MSNs ChR1, ale nie D2R-MSN, spôsobila down-reguláciu génu Tiam1, proteínu, ktorý sa podieľa na prestavbe aktínového cytoskeletu, podobný účinkom kokaínu. Preto, aby sme pochopili mechanizmy, ktoré poskytujú trvalé účinky správania vyvolaného liečivom, bude dôležité vymedziť bunkovo ​​selektívnu indukciu molekulárnych udalostí v týchto MSN, ktoré kontrolujú synaptickú adaptáciu na opakovanú expozíciu lieku.

V súvislosti s opakovanou expozíciou liekom sa predpokladá, že odobratie hrá dôležitú úlohu, pretože niektoré zmeny sa objavia až niekoľko týždňov po konečnej expozícii kokaínu. To naznačuje, že abstinencia je dôležitým mediátorom pri vývoji plasticity (Robinson a Berridge, 2003; Boudreau a Wolf, 2005; Boudreau a kol., 2007; Kourrich a kol., 2007). Tieto pozorovania zvyšujú možnosť, že samotné stiahnutie môže byť spúšťačom zmien NAc, ktoré sú pod kontrolou signalizácie závislej od D2R. Náš výsledok, ktorý ukazuje, že aktivácia D2R-MSN v NAc počas stiahnutia lieku ovplyvňuje kokaínmi indukovanú senzibilizáciu správania, poskytuje presvedčivú podporu tejto myšlienke.

Už skôr sa ukázalo, že opakovaná expozícia stresu počas vysadenia liečiva potláča expresiu behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom, ako aj správanie pri hľadaní a relapsu kokaínu u myší D2R KO (Sim a kol., 2013). Je preto zaujímavé, že fotostimulácia D2R-MSN počas vysadenia liečiva tiež zoslabuje expresiu senzibilizácie. Stresom indukovaná synaptická plasticita pri glutamategických synapsiách je zmenená v NAc myší D2R KO (Sim a kol., 2013). Aj keď ešte nie je známe, či fotostimulácia MSN D2R alebo chronický stres počas ochrannej lehoty vyvoláva podobné zmeny synaptickej plasticity, naše súčasné zistenia podporujú hypotézu, že D2R-MSN NAc hrajú kľúčovú úlohu v plasticite vyvolanej stiahnutím a môžu prispievať k relaps po ukončení užívania drog. Bude potrebné ďalšie skúmanie, aby sa zistilo funkčné nervové obvody, na ktorých sa zúčastňujú D2R MSN počas sťahovania liečiva, a analyzovali a porovnávali dôsledky fotostimulácie D2R-MSN a chronického stresu na synaptickú plasticitu v tomto konkrétnom obvode.

Inou možnou úlohou MSN exprimujúcich D2R môže byť inhibícia výstupu D1R-MSN z NAc. Predchádzajúci výskum naznačuje, že hoci MSN premietajú dlhé axóny do vzdialených cieľov, medzi kolaterálmi axónov a dendritickými stromami susediacich ostnatých projekčných neurónov dochádza k výraznému prekrývaniu (Grofová, 1975; Preston a kol., 1980; Wilson a Groves, 1980). To by mohlo naznačovať možnú lokálnu synaptickú konektivitu pre MSN v rámci NAc. Intracelulárne záznamy z párov neurónov projekcie ostnatých plôch identifikovali funkčné inhibičné spojenia medzi MSN v striatume potkana (Czubayko a Plenz, 2002; Tunstall a kol., 2002; Koos a kol., 2004; Gustafson a kol., 2006). Tiež sa uvádza, že synapsie tvorené recidivujúcimi kolaterálnymi axónmi MSN v striatu nie sú náhodné, D2R-MSNs vytvárajú synaptické spojenia s inými D2R-MSN a s D1R-MSN, zatiaľ čo D1R-MSN takmer výlučne tvoria synaptické spojenia s ostatnými D1R-MSN (Taverna et al., 2008). Hoci bolo zaznamenané aj GABAergické prepojenie lokálnymi rekurentnými axonálnymi kolaterálmi medzi akumbálnymi MSN (Taverna et al., 2004), zatiaľ nie je jasné, či D2R-MSN náhodne tvoria lokálne mikroobvody alebo prispievajú k mikroobvodom v NA s preferenčným prepojením ako v striatume. Naše údaje naznačujú, že D2R-MSN v NAc exprimujúcich ChR2 vytvárajú synaptické spojenia so susednými MSN, ktoré exprimujú D1R, a že D2R-MSN potom vyvíjajú inhibičný kontakt s D1-MSN na modulovanie D1R-sprostredkovanej podpory návykového správania.

Záverom sme ukázali, že optogenetická aktivácia NAc D2R-MSNs mení plasticitu vyvolanú abstinenciou, ktorá sa vyskytuje počas závislosti od kokaínu. Vzhľadom na to, že aktivita signalizácie závislej od D2R počas ochrannej periódy sa zdá byť kľúčovým regulátorom expresie behaviorálnej senzibilizácie vyvolanej kokaínom, navrhujeme, aby D2R-MSN boli dôležitým mediátorom dlhodobej adaptácie na vyhľadávanie a relapsu drog. Identifikácia molekulárnych substrátov signalizácie závislej od D2R, spolu s identifikáciou špecifického obvodu NAc D2R-MSN používaných pri opakovanej expozícii lieku, by mala poskytnúť nové ciele pre terapeutickú intervenciu pri relapse lieku.

Vyhlásenie o konflikte záujmov

Autori vyhlasujú, že výskum bol vykonaný bez obchodných alebo finančných vzťahov, ktoré by mohli byť interpretované ako potenciálny konflikt záujmov.

Poďakovanie

Táto práca bola podporená grantom Kórejskej národnej výskumnej nadácie (NRF), ktorý financovalo Ministerstvo vedy, IKT a budúceho plánovania v rámci Programu výskumu mozgu (Ja-Hyun Baik; Grant č. 2013M3C7A1056101) a Bio a lekárska technológia. Program rozvoja (pre Ja-Hyun Baika; grant č. 2013M3A9D5072550) a program World Class Institute (WCI) Národnej výskumnej nadácie Kórey (NRF) financovaný ministerstvom vedy, IKT a plánovania budúcnosti (Georgeovi J. Augustinovi) ; WCI 2009-003), ako aj Grant Kórejskej univerzity (Ja-Hyun Baik) a grant CRP od Národnej výskumnej nadácie v Singapure (George J. Augustine).

Referencie

  1. Baik JH (2013). Dopamínová signalizácia pri odmeňovaní. Predná. Neurónové obvody 7: 152 10.3389 / fncir.2013.00152 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  2. Baik JH, Picetti R., Saiardi A., Thiriet G., Dierich A., Depaulis A., a kol. (1995). Parkinsonovské poškodenie lokomotora u myší bez dopamínových D2 receptorov. Príroda 377, 424 – 428 10.1038 / 377424a0 [PubMed] [Cross Ref]
  3. Berridge KC (2007). Debata o úlohe dopamínu ako odmena: dôvod motivácie. Psychofarmakológia (Berl) 191, 391 – 431 10.1007 / s00213-006-0578-x [PubMed] [Cross Ref]
  4. Bock R., Shin JH, Kaplan AR, Dobi A., Markey E., Kramer PF, a kol. (2013). Posilnenie accumbal nepriamej dráhy podporuje odolnosť proti nutkavému užívaniu kokaínu. Nat. Neurosci. 16, 632 – 638 10.1038 / nn.3369 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  5. Bocklisch C., Pascoli V., Wong JC, House DR, Yvon C., de Roo M., a kol. (2013). Kokaín inhibuje dopamínové neuróny potenciou prenosu GABA vo ventrálnej tegmentálnej oblasti. Science 341, 1521 – 1525 10.1126 / science.1237059 [PubMed] [Cross Ref]
  6. Boudreau AC, Reimers JM, Milovanovič M., Wolf ME (2007). Receptory AMPA na bunkovom povrchu v jadre potkana sa zvyšujú počas odoberania kokaínu, ale internalizujú sa po kokaínovej stimulácii v spojení so zmenenou aktiváciou mitogénom aktivovaných proteínkináz. J. Neurosci. 27, 10621 – 10635 10.1523 / jneurosci.2163-07.2007 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  7. Boudreau AC, Wolf ME (2005). Behaviorálna senzibilizácia na kokaín je spojená so zvýšenou povrchovou expresiou receptora AMPA v nucleus accumbens. J. Neurosci. 25, 9144 – 9151 10.1523 / jneurosci.2252-05.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  8. Chandra R., Lenz JD, Gancarz AM, Chaudhury D., Schroeder GL, Han MH a kol. (2013). Optogenetická inhibícia jadra obsahujúceho D1R accumbens neurónov mení kokaínom sprostredkovanú reguláciu Tiam1. Predná. Mol. Neurosci. 6: 13 10.3389 / fnmol.2013.00013 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  9. Chang HT, Kitai ST (1985). Projekčné neuróny jadra accumbens: štúdia intracelulárneho značenia. Brain Res. 347, 112 – 116 10.1016 / 0006-8993 (85) 90894-7 [PubMed] [Cross Ref]
  10. Chausmer AL, Elmer Gl, Rubinstein M., Low MJ, Grandy DK, Katz JL (2002). Lokomotorická aktivita indukovaná kokaínom a diskriminácia kokaínu u myší s mutantným receptorom dopamínu D2. Psychofarmakológia (Berl) 163, 54 – 61 10.1007 / s00213-002-1142-y [PubMed] [Cross Ref]
  11. Chevalier G., Deniau JM (1990). Disinhibícia ako základný proces pri vyjadrovaní striatálnych funkcií. Trendy Neurosci. 13, 277 – 280 10.1016 / 0166-2236 (90) 90109-n [PubMed] [Cross Ref]
  12. Czubayko U., Plenz D. (2002). Rýchly synaptický prenos medzi neurónmi projekcie ostnatého ostnatého telesa Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 15764 – 15769 10.1073 / pnas.242428599 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  13. Ferguson SM, Eskenazi D., Ishikawa M., Wanat MJ, Phillips PE, Dong Y., a kol. (2011). Prechodná neurónová inhibícia odhaľuje protichodné úlohy nepriamych a priamych dráh senzibilizácie. Nat. Neurosci. 14, 22 – 24 10.1038 / nn.2703 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  14. Goto Y., Grace AA (2005). Dopaminergná modulácia limbického a kortikálneho pohonu jadra narastá v cielenom správaní. Nat. Neurosci. 8, 805 – 812 10.1038 / nn1471 [PubMed] [Cross Ref]
  15. Grofová I. (1975). Identifikácia striatálnych a palidálnych neurónov premietajúcich do substantia nigra. Experimentálna štúdia pomocou retrográdneho axonálneho transportu chrenovej peroxidázy. Brain Res. 91, 286 – 291 10.1016 / 0006-8993 (75) 90550-8 [PubMed] [Cross Ref]
  16. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC (2013). AFosB diferenciálne moduluje nukleus accumbens priamu a nepriamu funkciu dráhy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 110, 1923 – 1928 10.1073 / pnas.1221742110 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  17. Gustafson N., Gireesh-Dharmaraj E., Czubayko U., Blackwell KT, Plenz D. (2006). Porovnávacia analýza spätnej väzby a prúdovo-zvieracej analýzy spätnej väzby a priameho synaptického prenosu v striatálnom mikroobvode in vitro. J. Neurofyziol. 95, 737 – 752 10.1152 / jn.00802.2005 [PubMed] [Cross Ref]
  18. Hikida T., Kimura K., Wada N., Funabiki K., Nakanishi S. (2010). Odlišné úlohy synaptického prenosu v priamych a nepriamych striatálnych cestách odmeňovania a averzívneho správania. Neuron 66, 896 – 907 10.1016 / j.neuron.2010.05.011 [PubMed] [Cross Ref]
  19. Kalivas PW, Duffy P. (1990). Vplyv akútnej a dennej liečby kokaínom na extracelulárny dopamín v jadre accumbens. Synapse 5, 48 – 58 10.1002 / syn.890050104 [PubMed] [Cross Ref]
  20. Kalivas PW, Pierce RC, Cornish J., Sorg BA (1998). Úloha senzibilizácie pri túžbe a recidíve závislosti od kokaínu. J. Psychopharmacol. 12, 49 – 53 10.1177 / 026988119801200107 [PubMed] [Cross Ref]
  21. Koos T., Tepper JM, Wilson CJ (2004). Porovnanie IPSC vyvolaných ostnatými a rýchlo sa vyskytujúcimi neurónmi v neostrii. J. Neurosci. 24, 7916 – 7922 10.1523 / jneurosci.2163-04.2004 [PubMed] [Cross Ref]
  22. Kourrich S., Rothwell PE, Klug JR, Thomas MJ (2007). Skúsenosti s kokaínom kontrolujú obojsmernú synaptickú plasticitu v jadre accumbens. J. Neurosci. 27, 7921 – 7928 10.1523 / jneurosci.1859-07.2007 [PubMed] [Cross Ref]
  23. Kravitz AV, Freeze BS, Parker PR, Kay K., Thwin MT, Deisseroth K., a kol. (2010). Regulácia parkinsonovského motorického správania optogenetickou reguláciou obvodov bazálnych ganglií. Príroda 466, 622 – 626 10.1038 / nature09159 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  24. Kravitz AV, Tye LD, Kreitzer AC (2012). Odlišné úlohy pri posilňovaní striatálnych neurónov s priamou a nepriamou cestou. Nat. Neurosci. 15, 816 – 818 10.1038 / nn.3100 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  25. Kreitzer AC, Malenka RC (2008). Funkcia obvodovej plasticity a funkcie bazálnych ganglií. Príroda 60, 543 – 554 10.1016 / j.neuron.2008.11.005 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  26. Le Moine C., blok B. (1996). Expresia dopamínového receptora D3 v peptidergických neurónoch jadra accumbens: porovnanie s dopamínovými receptormi D1 a D2. Neuroveda 73, 131 – 143 10.1016 / 0306-4522 (96) 00029-2 [PubMed] [Cross Ref]
  27. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D., Friedman AK, Sun H., Damez-Werno D., a kol. (2010). Strata signalizácie BDNF špecifická pre bunkový typ napodobňuje optogenetickú kontrolu odplaty za kokaín. Science 330, 385 – 390 10.1126 / science.1188472 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  28. Lobo MK, Nestler EJ (2011). Striatálne vyváženie pôsobí v drogovej závislosti: zreteľné úlohy priamych a nepriamych dráh stredne ostnatých neurónov. Predná. Neuroanat. 5: 41 10.3389 / fnana.2011.00041 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  29. Lüscher C., Malenka RC (2011). Synaptická plasticita vyvolaná liečivom v závislosti od molekulárnych zmien až po prestavbu obvodu. Neuron 69, 650 – 663 10.1016 / j.neuron.2011.01.017 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  30. O'Donnell P., Grace AA (1993). Fyziologické a morfologické vlastnosti accumbens neurónov jadra a škrupiny zaznamenané in vitro. Synapse 13, 135 – 160 10.1002 / syn.890130206 [PubMed] [Cross Ref]
  31. Pascoli V., Turiault M., Lüscher C. (2011). Zvrátenie synaptického zosilnenia vyvolaného kokaínom resetuje adaptívne správanie vyvolané drogami. Príroda 481, 71 – 75 10.1038 / nature10709 [PubMed] [Cross Ref]
  32. Preston RJ, Bishop GA, Kitai ST (1980). Stredná neurónová projekcia neurónov z neostriatia potkana: štúdia intracelulárnej chrenovej peroxidázy. Brain Res. 183, 253 – 263 10.1016 / 0006-8993 (80) 90462-x [PubMed] [Cross Ref]
  33. Robinson TE, Berridge KC (1993). Nervový základ túžby po drogách: motivačno-senzibilizačná teória závislosti. Brain Res. Brain Res. 18, 247 – 291 10.1016 / 0165-0173 (93) 90013-p [PubMed] [Cross Ref]
  34. Robinson TE, Berridge KC (2003). Addiction. Annu. Psychol. 54, 25 – 53 10.1146 / annurev.psych.54.101601.145237 [PubMed] [Cross Ref]
  35. Schmidt HD, Pierce RC (2010). Kokaíny indukované neuroadaptácie prenosu glutamátu: potenciálne terapeutické ciele pre chuť a závislosť. Ann. NY Acad. Sci. 1187, 35 – 75 10.1111 / j.1749-6632.2009.05144.x [PubMed] [Cross Ref]
  36. Sesack SR, Grace AA (2010). Sieť odmien kortiko-bazálnych ganglií: mikroobvod. Neuropsychofarmakológia 35, 27 – 47 10.1038 / npp.2009.93 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  37. Sim HR, Choi TY, Lee HJ, Kang EY, Yoon S., Han PL, a kol. (2013). Úloha dopamínových D2 receptorov v plasticite stresovo vyvolaných návykových návykov. Nat. Commun. 4: 1579 10.1038 / ncomms2598 [PubMed] [Cross Ref]
  38. Smith RJ, Lobo MK, Spencer S., Kalivas PW (2013). Prispôsobenie kokaínu v D1 a D2 pripisuje projekčným neurónom (dichotómia, ktorá nemusí byť nevyhnutne synonymom pre priame a nepriame dráhy). Akt. Opin. Neurobiol. 23, 546 – 552 10.1016 / j.conb.2013.01.026 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  39. Steketee JD, Kalivas PW (2011). Hľadanie drog: senzibilizácia v správaní a návrat k správaniu pri hľadaní drog. Pharmacol. X. Rev. 63, 348 – 365 10.1124 / pr.109.001933 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  40. Taverna S., Ilijic E., Surmeier DJ (2008). V modeloch Parkinsonovej choroby sú prerušené kolaterálne spojenia striatálnych stredne ostnatých neurónov prerušené. J. Neurosci. 28, 5504 – 5512 10.1523 / JNEUROSCI.5493-07.2008 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  41. Taverna S., dodávka Dongen YC, Groenewegen HJ, Pennartz CM (2004). Priamy fyziologický dôkaz synaptickej konektivity medzi stredne veľkými ostnatými neurónmi v jadre potkana accumbens in situ. J. Neurofyziol. 91, 1111 – 1121 10.1152 / jn.00892.2003 [PubMed] [Cross Ref]
  42. Thomas MJ, Kalivas PW, Shaham Y. (2008). Neuroplasticita v mezolimbickom dopamínovom systéme a závislosť od kokaínu. Br. J. Pharmacol. 154, 327 – 342 10.1038 / bjp.2008.77 [Článok bez PMC] [PubMed] [Cross Ref]
  43. Tunstall MJ, Oorschot DE, Kean A., Wickens JR (2002). Inhibičné interakcie medzi ostnatými projekčnými neurónmi v striatume potkana. J. Neurofyziol. 88, 1263 – 1269 10.1152 / jn.00886.2001 [PubMed] [Cross Ref]
  44. Vanderschuren LJ, Kalivas PW (2000). Zmeny dopaminergného a glutamatergického prenosu pri indukcii a expresii senzibilizácie správania: kritický prehľad predklinických štúdií. Psychofarmakológia (Berl) 151, 99 – 120 10.1007 / s002130000493 [PubMed] [Cross Ref]
  45. Wilson CJ, Groves PM (1980). Jemná štruktúra a synaptické spojenie spoločného ostnatého neurónu potkanieho neostriatum: štúdia využívajúca intracelulárnu injekciu peroxidázy chrenu. J. Comp. Neurol. 194, 599 – 615 10.1002 / cne.901940308 [PubMed] [Cross Ref]
  • Wise RA (2004). Dopamín, učenie a motivácia. Nat. Neurosci. 5, 483 – 494 10.1038 / nrn1406 [PubMed] [Cross Ref]