Proc Natl Acad Sci US A. 2007 Mar 20, 104 (12): 5181-6. Epub 2007 Mar 9.
Ventura R, Morrone C, Puglisi-Allegra S.
zdroj
Nadácia Santa Lucia, Európske centrum pre výskum mozgov (CERC), Via del Fosso di Fiorano 65, 00143 Rím, Taliansko. [chránené e-mailom]
abstraktné
Nedávne dôkazy naznačujú, že odmeňovanie a averzívne podnety ovplyvňujú tie isté oblasti mozgu, vrátane mediálneho prefrontálneho kortexu a nucleus accumbens. Hoci je známe, že nucleus accumbens reaguje na výrazné stimuly, bez ohľadu na ich hedonickú valenciu, so selektívnym zvýšeným uvoľňovaním dopamínu, je málo známe o úlohe prefrontálneho kortexu pri motivácii súvisiacej s odmenou a averziou alebo o zúčastnených neurotransmiteroch. Tu sme zistili, že selektívna deplécia norepinefrínu v mediálnom prefrontálnom kortexe myší zrušila zvýšenie uvoľňovania norepinefrínu prefrontálnym kortexom a dopamínom v dôsledku nucleus accumbens, ktoré je indukované jedlom, kokaínom alebo chloridom lítnym a zhoršuje kondicionovanie miesta indukované lítiom. chlorid (averzia) a potrava alebo kokaín (preferencia). To je dôkazom toho, že prefrontálny prenos kortikálneho norepinefrínu je nevyhnutný na to, aby sa motivácia motivácie prisudzovala stimulom, ktoré súvisia s odmenou, ako aj s averziou prostredníctvom modulácie dopamínu v nucleus accumbens, oblasti mozgu, ktorá sa zúčastňuje všetkých motivovaných správ.
Zvieratá, ako aj ľudia majú sklon hľadať odmeny a vyhýbať sa trestom. Toto jasne adaptívne správanie zahŕňa schopnosť reprezentovať hodnotu odmeňovania a trestania podnetov, stanoviť predpovede o nich a využiť tieto predpovede na usmernenie správania (1). Pokiaľ sa emócie dajú definovať ako „stavy vyvolané posilňovačmi (odmenami a trestancami)“ (2), pochopenie oblastí mozgu zapojených do spracovania motivačne významných odmien alebo averzívnych podnetov môže byť relevantné pre pochopenie mnohých emocionálnych deficitov u ľudí.
Nedávne údaje naznačujú, že nucleus accumbens (NAc) a prefrontálny kortex (pFC) predstavujú spoločný substrát na spracovanie odmeňovania aj averzívnych stimulov (3 – 7). Ventrálne striatum (alebo NAc) sa podieľa na spracovaní informácií, ktoré sú základom motivačnej kontroly cieľovo orientovaného správania, a štúdie na ľuďoch a zvieratách podporujú všeobecnú úlohu tejto oblasti mozgu pri spracovaní odmeňovania a averzívnych stimulov bez ohľadu na valenciu (3 – 8 ).
Okrem toho, veľké množstvo dôkazov naznačuje, že pFC je priamo zapojený do cieleného správania, ako aj do afektívneho spracovania (1, 9). Hoci bol navrhnutý prenos dopamínu v NAc na sprostredkovanie spoločného procesu „motivačnej saliencie“ v pozitívnej a negatívnej valencii (3, 6), úloha pFC v tomto procese a zahrnutý neurochemický substrát sú stále neznámy.
Prenos norepinefrínu v pFC je aktivovaný averzívnymi stimulmi (10, 11) a averzívnymi a podmienenými chuťovými stimulmi (12, 13). Okrem toho sa nedávno ukázalo, že norepinefrín v mediálnom pFC (mpFC) sa podieľa na účinkoch odmeňovania niektorých bežne zneužívaných liekov prostredníctvom jeho modulačného účinku na uvoľňovanie dopamínu v NAc (14, 15). To naznačuje, že prefrontálny prenos kortikálneho norepinefrínu zapríčiňuje akumuláciu dopamínu na spracovanie motivačne výrazných stimulov.
Pomocou myši sme sa rozhodli zhodnotiť, či je prefrontálny kortikálny norepinefrín / mezoaccumbens dopamínový systém bežným nervovým substrátom, ktorý sa podieľa na spracovaní účinne pozitívnych a negatívnych stimulov. Skúmali sme najmä to, či je norepinefrin v mpFC, prostredníctvom jeho modulačného pôsobenia na dopaminergný mezolimbický systém, nevyhnutný na priradenie motivačnej motivácie k stimulom súvisiacim s odmenou a averziou.
Pretože skúsenosť je hlavným determinantom motivačného vplyvu akéhokoľvek stimulu (7), hodnotili sme účinky prvej expozície na odmeňovanie prírodných (chutných potravín, mliečnej čokolády) a farmakologických (kokaínových) stimulov a na averzívny farmakologický stimul [chlorid lítny (LiCl)] na uvoľňovanie prefrontálneho kortikálneho norepinefrínu a uvoľňovanie dopamínu do mozgu intracerebrálnou mikrodialýzou. Okrem toho, aby sme zistili, či norepinefrinový prefrontálny prenos riadi zvýšený odtok akumulovaného dopamínu vyvolaný prvým vystavením týmto motivačne významným stimulom, hodnotili sme tiež účinky selektívnej deplécie norepinefrínu na mpFC na uvoľňovanie dopamínu v NAc a na uvoľňovanie norepinefrínu v mpFC indukovanom prvou expozíciou. k týmto stimulom.
Nakoniec sme skúmali účinky selektívnej noradrenergnej prefrontálnej deplécie na podmienenú preferenciu miesta (CPP) indukovanú čokoládou a kokaínom a na podmienenú averziu miesta (CPA) indukovanú LiCl. Pre túto štúdiu bol zvolený postup kondicionovania miesta, pretože umožňoval hodnotenie získania podmienených apetitívnych a averzívnych vlastností pre stimuly spárované s primárnymi odmenami a averzívnymi udalosťami a pretože veľký súbor dôkazov ukazuje, že je spoľahlivým meradlom procesov, ktoré sú základom motivačné priradenie stimulov k podnetom (3, 16).
VÝSLEDKY
Experiment 1.
Aby sme zhodnotili, či prvé vystavenie tak odmeňovaniu, ako aj averzívnym výrazným stimulom ovplyvňuje prefrontálny odtok norepinefrínu a akumulácie dopamínu, hodnotili sme pomocou intracerebrálnej mikrodialýzy účinky systémového kokaínu alebo LiCl a spotreby čokolády na uvoľňovanie norepinefrínu v odtoku mpFC a dopamínu v NAc. Okrem toho, aby sme zistili, či je kortikálny noradrenergný prenos nevyhnutný pre úbytok akumulovaného dopamínu vyvolaný prvým vystavením týmto motivačne významným stimulom, hodnotili sme účinky selektívnej noradrenergnej deplécie na alobalnú dopamínovú odpoveď vyvolanú kokaínom, čokoládou a LiCl. Kokaín, čokoláda a LiCl viedli k časovo závislému zvýšeniu odtoku norepinefrínu v mpFC skupín liečených falošnými skupinami, pričom sa dosiahol maximálny nárast ≈200% pri 40 min, ≈70% pri 120 min a ≈100% pri 60 min, (Obr. 1a). Aj keď bolo zvýšené uvoľňovanie norepinefrínu v pFC v reakcii na kokaín široko hlásené, je to podľa našich vedomostí prvá správa o zvýšenom odtoku norepinefrínu vyvolanom prvou expozíciou čokoládou alebo systémovým LiCl v rámci mpFC. Tieto stimuly tiež produkovali paralelný časovo závislý nárast odtoku dopamínu u NAc u zvierat liečených simulovanou terapiou (obr. 1b), v súlade s názorom, že táto oblasť hrá hlavnú úlohu pri spracovaní výrazných stimulov bez ohľadu na ich valenciu (3 , 6). Hodnotili sa aj účinky tohto úbytku na uvoľňovanie norepinefrínu v mpFC. Prefrontálna deplécia norepinefrínu sa získala selektívnou neurotoxickou depléciou prefrontálnych kortikálnych norepinefrínových afferentov (skupiny zbavené norepinefrínu) v mpFC po ochrane dopamínu selektívnym inhibítorom absorpcie. Táto metóda viedla k hlbokej deplécii hladín norepinefrínu v tkanivách (≈90%), pričom hladiny dopamínu v tkanivách neboli prakticky ovplyvnené. Kontrolné zvieratá (skupiny, ktorým bol podávaný simulovaný liek) boli podrobené rovnakému ošetreniu ako myši, ktoré boli zbavené norepinefrínu, ale dostali intracerebrálny nosič. (Hladiny norepinefrínu v tkanivách boli nasledovné: skupina s falošnou liečbou, skupina 698 ± 26 ng / g vlhkého tkaniva; skupina s depléciou norepinefrínu, skupina 63 ± 17 ng / g vlhkého tkaniva. Hladiny dopamínového tkaniva boli nasledovné: skupina s falošnou liečbou, skupina 203 ± 18 ng / g vlhkého tkaniva, skupina s nulovou hladinou norepinefrínu, 189 ± 16 ng / g vlhkého tkaniva.)
Obr. 1.
Prefrontálne kortikálne vyčerpanie norepinefrínu na extracelulárnom norepinefríne v mpFC a dopamíne v NAc. Extracelulárny norepinefrín (NE) v mpFC (a) a dopamín (DA) v NAc (b) simulovane alebo so zníženou hladinou norepinefrínu injikovaný soľný roztok, (viac ...)
Selektívna deplécia norepinefrínu u mpFC zhoršila zvýšenie akumulácie dopamínu a prefrontálneho uvoľňovania kortikálneho norepinefrínu vyvolaného liekmi aj čokoládou (Obr. 1), hoci významne neovplyvnila bazálny extracelulárny dopamín v skupine NAc (skupina s falošnou liečbou, 1.35 ± 0.15 pg per 20 μl, skupina s depléciou norepinefrínu, 1.29 ± 0.18 pg na 20 μl) alebo bazálny extracelulárny norepinefrín v mpFC (skupina liecená falošnou skupinou, 1.31 ± 0.18 pg na 20 μl; skupina s depléciou norepinefrínu, 1.26 ± 0.17 pg na 20 μl). Priemerné bazálne hodnoty dopamínu v NAc a norepinefríne v mpFC pre každú skupinu [fyziologický roztok, kokaín (20 mg / kg), LiCl (3 meq / kg) a čokoláda] sa významne nelíšili
Naše výsledky naznačujú, že neporušená noradrenergná transmisia v rámci mpFC je nevyhnutnou podmienkou pre stimuláciu uvoľňovania dopamínu indukovaného odmeňovaním a averzívnymi stimulmi v rámci NAc, čo silne naznačuje jeho hlavnú úlohu v motivačnej saliencii.
Experiment 2.
Aby sme zistili, či je prefrontálny prenos norepinefrínu nevyhnutný na získanie podmienených apetitívnych a averzívnych vlastností pre stimuly spárované s primárnymi odmenami a averzívnymi udalosťami, hodnotili sme účinky selektívnej deplécie prefrontálneho norepinefrínu na kondicionovanie miesta.
Prefrontálna noradrenergná deplécia zrušila tak CPP indukovanú kokaínom, ako aj čokoládou, ako aj CPA indukovanú LiCl. Teda, aj keď zvieratá ošetrené falošnou liečbou vykazovali významnú preferenciu pre kokaínový alebo čokoládovo párovaný kompartment a významná averzia k LiCl-spárovanému kompartmentu (Obr. 2a), zvieratá s depléciou norepinefrínu nevykazovali žiadnu preferenciu pre žiadne oddelenie (Obr. 2b ).
Obr. 2.
Prefrontálne kortikálne vyčerpanie norepinefrínu pri podmieňovaní miesta. Účinky konzumácie potravy (1 g mliečnej čokolády; skupina s fingovanou liečbou, n = 8; skupina s depléciou norepinefrínu, n = 8) a systémová injekcia (ip) fyziologického roztoku (Sal) (skupina s fingovanou liečbou, (viac ...)
Všimnite si, že v predbežných experimentoch sme pozorovali, že tak CPP, ako aj CPA u zvierat ošetrených falošnou chorobou boli nerozoznateľné od zvierat naivných zvierat. Zvieratá, ktoré zažili párovanie s fyziologickým roztokom v obidvoch oddeleniach, nepreukázali žiadnu preferenciu ani jedného kompartmentu bez ohľadu na stav lézie (falošne liečený alebo vyčerpaný norepinefrin). Chovanie zvierat, ktoré boli liečené kokaínom, čokoládou alebo LiCl, bolo podobné ako u zvierat, ktoré mali počas tréningu len roztok vehikula; tj nepreukázali žiadnu preferenciu ani jedného oddelenia.
DISKUSIA
Tu uvádzame dôkazy o tom, že prefrontálna transmisia kortikálneho norepinefrínu, prostredníctvom modulácie dopamínu v NAc, je nevyhnutnou podmienkou pre motivačné priradenie motivácie k stimulom súvisiacim s odmenou aj asociáciou.
Po prvé, pretože predchádzajúca skúsenosť je hlavným determinantom motivačného vplyvu akéhokoľvek stimulu (7), hodnotili sme pomocou intracerebrálnej mikrodialýzy účinky prvej expozície systémovému kokaínu alebo LiCl, ako aj účinky konzumácie čokolády na norepinefrin alebo dopamín uvoľňovanie v mpFC a NAc. Kokaín, čokoláda a LiCl viedli k časovo závislému zvýšeniu akumulácie dopamínu, ako aj k prefrontálnemu odtoku norepinefrínu zo skupiny liečenej falošnou liečbou. Významné zvýšenie prepadu norepinefrínu bolo evidentné v mpFC zvierat ošetrených falošnou chorobou v priebehu 20 min prijímania čokolády; prepad sa následne vrátil na východiskové hladiny a nasledoval veľký trvalý nárast. Hoci tento dvojfázový čokoládom indukovaný nárast norepinefrínu v mpFC nie je paralelný so zvýšením dopamínu v NAc počas celého obdobia, počiatočné zvýšenie pravdepodobne súviselo s vplyvom chutných potravín a zvýšením dopamínu v NAc. Na druhej strane, druhé veľké zvýšenie môže predstavovať neurochemický korelát kortikálneho vzrušenia potrebného na spracovanie priestorových informácií súvisiacich s vyhľadávaním a lokalizáciou potravinovej odmeny (17). V skutočnosti sa predpokladá, že zvýšený odtok norepinefrínu slúži na signalizáciu prítomnosti stimulov s vysokou motivačnou silou (17). Tento zvýšený odtok norepinefrínu by teda mohol umožniť selektívnu pozornosť potrebnú na vyhľadávanie ďalších chutných potravín a mohol by pomôcť pri získavaní podmienených chutných vlastností stimulov spojených s jedlom. Nie je však možné vylúčiť následky požitia potravy na norepinefrín.
Napriek tomu, že sa zvýšilo uvoľňovanie dopamínu v NAc vyvolané odmeňovaním alebo averzívnymi stimulmi a zvýšeným uvoľňovaním norepinefrínu v pFC v reakcii na kokaín, je podľa našich vedomostí prvá správa o zvýšenom odtoku norepinefrínu vyvolanom expozíciou čokolády alebo LiCl v rámci mpFC. Najdôležitejšie je, že prefrontálny kortikálny noradrenergný prenos je nevyhnutný pre únik akumulovaného dopamínu vyvolaný prvou expozíciou týmto motivačným výkyvom. V skutočnosti, u myší s depléciou norepinefrínu nebol pozorovaný žiadny významný nárast odtoku prefrontálneho norepinefrínu a akumulácie dopamínu indukovaného týmito stimulmi. Norepinefrín v mpFC by mohol aktivovať uvoľňovanie mezoaccumbens dopamínu prostredníctvom excitačnej prefrontálnej kortikálnej projekcie do ventrálnej tegmentálnej oblasti dopamínových buniek (18, 19) a / alebo prostredníctvom kortikoakumbalových glutamatergických projekcií (20). Okrem toho je možné predpokladať úlohu pFC projekcie locus coeruleus pri vyvíjaní excitačného vplyvu, pretože sa ukázalo, že toto jadro aktivuje dopamínové neuróny ventrálnej tegmentálnej oblasti (21 – 23), čo by mohlo viesť k zvýšenému uvoľňovaniu dopamínu v NAc.
Naše výsledky teda v súlade s predchádzajúcimi správami ukazujú, že nepodmienené odmeňovanie a averzívne podnety zvyšujú odtok norepinefrínu v mpFC (10 – 15), ako aj uvoľňovanie dopamínu v NAc (3, 24). Najdôležitejšie však je, že neporušená noradrenergná transmisia v rámci mpFC je nevyhnutnou podmienkou pre stimuláciu uvoľňovania dopamínu indukovaného odmeňovaním a averzívnymi farmakologickými a prírodnými stimulmi v rámci NAc. Preto poukazujú na prefrontálny norepinefrin a akumulácia dopamínu ako neurálneho systému, ktorého aktivácia nepodmieneným odmeňovaním a averzívnymi stimulmi je pravdepodobne substrátom pre motivačnú dôležitosť. Tento názor je podporený výsledkami experimentov správania na účinkoch deplécie prefrontálneho norepinefrínu na kokaín, čokoládu alebo LiCl-indukovanú úpravu miesta.
Druhým dôležitým zistením tejto štúdie je, že deplécia prefrontálneho kortikálneho norepinefrínu zhoršuje CPP indukovaný kokaínom alebo potravou a CPA indukovanú LiCl. Napriek tomu, že u zvierat liečených falošným stavom bola uprednostňovaná kokaínová alebo čokoládovo spárovaná komora a významná averzia voči LiCl-spárovanému kompartmentu, u zvierat s neadefinínom neboli u žiadneho kompartmentu uprednostňované žiadne zvieratá, čo dokazuje, že je potrebná intaktná transmisia prefrontálneho kortikálneho norepinefrínu. na získanie podmienených vlastností na podnety spárované s primárnymi odmenami alebo averzívnymi udalosťami v postupe kondicionovania miesta.
Súčasné výsledky ukazujú, že u myší s depléciou prefrontálneho kortikálneho norepinefrínu, nedostatok uvoľňovania norepinefrínu vyvolaný expozíciou odmeňovaním a averzívnymi stimulmi (kokaín, potrava alebo LiCl, nepodmienený stimul) zabránil motivačnému prisudzovaniu závažnosti podmienenému stimulu (priestorovému vzoru) počas párovanie. Treba tiež poznamenať, že deplécia prefrontálneho norepinefrínu neinterferovala s ani asociatívnymi ani mnemotechnickými procesmi, pretože, ako bolo ukázané vyššie, zvieratá s depléciou norepinefrínu sa ukázali ako schopné naučiť sa pasívne vyhýbanie sa úlohe (15) a spájať kontext s účinkami lieku (14). Je však potrebné ďalšie skúmanie, aby sme pochopili presnú povahu porúch zvierat prefrontálneho kortikálneho norepinefrínu.
Dopaminergný prenos v rámci NAc sa považuje za sprostredkovanie hedonického dopadu odmeny alebo niektorých aspektov učenia sa odmeňovania (pozri ref. 25). Naše výsledky v zhode s iným názorom (3) ukazujú, že prenos dopamínu v NAc hrá úlohu v pozitívnom aj aversívne motivovanom správaní; Najdôležitejšie však je, že tento motivačný proces sa riadi prefrontálnym kortikálnym norepinefrínom. V skutočnosti selektívna deplécia prefrontálneho norepinefrínu produkuje blokáciu CPA vyvolaného kokaínom alebo čokoládou, CPA indukovanú CPP a LiCl indukovanú CPA a zhoršenie uvoľňovania dopamínu v NAc indukované týmito výraznými stimulmi u kontrolných myší, čím sa preukázalo, že noradrenergný prefrontálny prenos prostredníctvom modulácie uvoľňovanie dopamínu v rámci NAc, je nevyhnutnou podmienkou pre motivačné spracovanie stimulov súvisiacich s odmenou a aj averziou.
Súhrnne, súčasné výsledky experimentov správania a mikrodialýzy ukazujú, že prefrontálny prenos norepinefrínu nielen sprostredkováva odmeňujúce vlastnosti bežne zneužívaných liekov, ako to naznačujú predchádzajúce štúdie (14, 15), ale je nevyhnutný na to, aby sa motivácia motivácie prejavila ako odmenou, tak odmenou. stimuly súvisiace s averziou, ktoré ďalej ukazujú, že návykové lieky, ako aj averzívne farmakologické stimuly, využívajú rovnaký neurobiologický mechanizmus ako prirodzené stimuly.
Na záver, naše údaje rozširujú predchádzajúce zistenia, ktoré poukazujú na mezolimbický dopaminergný systém ako „systém saliencie“, ktorý je súčasťou všetkých motivovaných správ (3, 6, 26). Taktiež dokazujú, že tento systém je pod norepinefrínovou prefrontálnou kortikálnou kontrolou, čím podporuje názor, že odmeňovanie a averzívne podnety ovplyvňujú podobné cesty v CNS (7).
Naše výsledky poskytujú pohľad na neurobiológiu odmeňovania a averzie, pretože ukazujú, že spracovanie odmeňovania aj averzívnych výrazných podnetov zahŕňa tie isté oblasti mozgu; tj poukazujú na prefrontálny noradrenergný a akumulačný dopaminergný prenos ako spoločný nervový systém. Pochopenie neurotransmiterových systémov aktivovaných účinným odmeňovaním alebo averzívnymi stimulmi a ich molekulárnymi mechanizmami pomôže vytvoriť základ pre objasnenie fungovania nervových systémov zapojených do pozitívnych aj negatívnych emócií.
MATERIÁLY A METÓDY
Zvieratá.
Samce myší inbredného kmeňa C57BL / 6JIco (Charles River Laboratories, Wilmington, MA), ktoré sa bežne používajú v neurobehaviorálnom fenotypovaní, 8-9 týždne staré v čase experimentov, boli chované tak, ako bolo opísané vyššie (14, 15). Každá experimentálna skupina pozostávala zo šiestich až ôsmich zvierat. Všetky experimenty boli uskutočnené v súlade s talianskymi národnými zákonmi (Decreto Legislative no. 116, 1992), ktorými sa riadi používanie zvierat na výskum.
Drogy.
Chloralhydrát, 6-hydroxydopamín (6-OHDA), GBR 12909, hydrochlorid kokaínu a LiCl boli zakúpené od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Kokaín (20 mg / kg), LiCl (3.0 meq / kg), chloralhydrát (350 – 450 mg / kg) a GBR 12909 (15 mg / kg) boli rozpustené vo fyziologickom roztoku (0.9% NaCl) a injikované ip do injekcie. objem 10 ml / kg. 6-OHDA sa rozpustil vo fyziologickom roztoku obsahujúcom disiričitan sodný (0.1 M). Za experimenty s potravinami bola odmena mliečnou čokoládou (1 g; Nestlé, Vevey, Švajčiarsko).
Microdialysis.
Zvieratá sa anestetizovali chloralhydrátom (450 mg / kg), umiestnili do stereotaxického rámu (David Kopf Instruments, Tujunga, CA) vybaveného adaptérom pre myši a implantovali sa jednostranne vodiacou kanylou (nerezová oceľ, vonkajší priemer hriadeľa 0.38 mm). Metalant AB, Stockholm, Švédsko) v mpFC alebo v NAc (14, 15). Dĺžka vodiacej kanyly bola 1 mm pre mpFC a 4.5 mm pre NAc. Vodiaca kanyla bola fixovaná epoxidovým lepidlom a na ďalšiu stabilizáciu bol pridaný dentálny cement. Súradnice od bregma [merané podľa metód Franklina a Paxinosa (27)] boli nasledovné: + 2.52 anteroposterior a 0.6 laterálny pre mpFC a + 1.60 anteroposterior a 0.6 laterálny pre NAc [väčšinou vrátane subdivízie shell (27)]. Sonda (dĺžka dialyzačnej membrány 2 mm pre mpFC a 1 mm pre NAc a vonkajší priemer 0.24 mm, MAB 4 cuprofánová mikrodialyzačná sonda; Metalant AB) bola zavedená 24 h pred mikrodialyzačnými experimentmi. Zvieratá sa mierne anestetizovali chloralhydrátom (350 mg / kg), aby sa uľahčilo manuálne vloženie mikrodialyzačnej sondy do vodiacej kanyly. Zvieratá sa vrátili do svojich domácich klietok. Vývod a hadička vstupnej sondy boli chránené lokálne aplikovaným Parafilmom. Membrány sa testovali na in vitro regeneráciu dopamínu a norepinefrínu (relatívna výťažnosť bola nasledovná: dopamín, 10.7 ± 0.82%; norepinefrin, 12.2 ± 0.75%; n = 20) v deň pred použitím na overenie zotavenia.
Mikrodialyzačná sonda bola pripojená k čerpadlu CMA / 100 (Carnegie Medicine, Štokholm, Švédsko) cez potrubie PE 20 (Metalant AB) a dvojkanálový kvapalinový otočný krúžok s veľmi nízkym krútiacim momentom (model 375 / D / 22QM; Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA) umožniť voľný pohyb. Umelá cerebrospinálna tekutina (147 mM NaCl / 1 mM MgCl / 1.2 mM CaCl2 / 4 mM KCl) bola prečerpávaná cez dialýzovú sondu pri konštantnom prietoku 2 μl / min. Pokusy sa uskutočňovali 22–24 hodín po umiestnení sondy. Každé zviera bolo umiestnené do kruhovej klietky vybavenej mikrodialyzačným zariadením (Instech Laboratories) a s podstielkou domácej klietky na podlahe. Dialyzačná perfúzia bola zahájená o 1 hodinu neskôr. Po začiatku perfúzie dialýzy boli myši nerušene ~ 2 hodiny pred odberom základných vzoriek. Priemerná koncentrácia troch vzoriek odobratých bezprostredne pred ošetrením (<10% variácia) sa brala ako bazálna koncentrácia. Pred začatím experimentov s mikrodialýzou boli myši zaradené do jednej z rôznych liečebných metód (soľný roztok, kokaín, čokoláda alebo LiCl) v rámci každej skupiny (fingovaná liečba alebo vyčerpanie noradrenalínu). Na experimenty s jedlom sa zvieratá umiestnili do plánu potravinovej deprivácie (28) 4 dni pred začiatkom experimentov.
Dialyzát bol odoberaný každý 20 min pre 120 (pre kokaínové a LiCl skupiny) alebo 160 (pre potravinové skupiny) min. Uvádzajú sa iba údaje od myší so správne umiestnenou kanylou. Umiestnenia sa posudzovali farbením metylénovou modrou. Dvadsať mikrolitrov dialyzačných vzoriek sa analyzovalo pomocou HPLC. Zvyšná 20 μl sa uchovávala pre možnú následnú analýzu. Koncentrácie (pg na 20 μl) neboli korigované na obnovu sondy. HPLC systém sa skladal z HPLC systému Alliance (Waters, Milford, MA) a coulometrického detektora (model 5200A; Coulochem II, ESA, Chelmsford, MA) poskytnutého s kondicionujúcou bunkou (M 5021) a analytickou bunkou (M 5011) , Klimatizačná bunka bola nastavená na 400 mV, elektróda 1 bola nastavená na 200 mV a elektróda 2 bola nastavená na -250 mV. Použila sa kolóna Nova-Pack C18 (3.9 × 150 mm; Waters) udržiavaná na 33 ° C. Prietoková rýchlosť bola 1.1 ml / min. Mobilná fáza bola opísaná vyššie (14, 15). Detekčný limit testu bol 0.1 pg.
Deplécia norepinefrínu v mpFC.
Anestézia a chirurgický set sú opísané vyššie. Zvieratám bol injikovaný GBR 12909 (15 mg / kg) 30 min pred mikroinjekciou 6-OHDA na ochranu dopaminergných neurónov. Bilaterálna injekcia 6-OHDA (1.5 μg na 0.1 μl pre 2 min. Pre každú stranu) bola urobená na mpFC [súradnice boli + 2.52 anteroposterior, ± 0.6 laterálne a −2.0 ventrálne vzhľadom na bregma (27)] cez nerezovú oceľ kanyla (vonkajší priemer 0.15 mm; Unimed, Lausanne, Švajčiarsko) pripojená k injekčnej striekačke 1-μl polyetylénovou trubicou a poháňaná pumpou CMA / 100. Kanyla bola ponechaná na mieste pre ďalší 2 min po ukončení infúzie. Zvieratá liečené falošne sa podrobili rovnakému ošetreniu, ale dostali intracerebrálny nosič. Zvieratá sa použili na mikrodialýzu alebo behaviorálne experimenty 7 dni po operácii.
Hladiny norepinefrínu a dopamínu v mpFC boli hodnotené tak, ako bolo opísané vyššie (14, 15), aby sa vyhodnotil rozsah deplécie.
Umiestnite kondicionovanie.
Behaviorálne experimenty sa uskutočnili s použitím zariadenia na úpravu miesta (14, 15, 29). Prístroj sa skladal z dvoch sivých plexisklových komôr (15 x 15 x 20 cm) a centrálnej uličky (15 × 5 × 20 cm). Dve posuvné dvere (4 × 20 cm) spojili uličku s komorami. V každej komore boli ako podmienené stimuly použité dva trojuholníkové hranoly (5 × 5 × 20 cm) vyrobené z čierneho plexiskla a usporiadané v rôznych vzoroch (vždy pokrývajúcich rovnaký povrch komory). Zvieratá boli použité na behaviorálne experimenty 7 dni po operácii. Pred kondicionovaním boli myši zaradené do jednej z rôznych terapií (fyziologický roztok, kokaín, čokoláda alebo LiCl) v každej skupine (falošne liečená alebo deplecia norepinefrínu).
Tréningový postup pre kondicionovanie miesta bol opísaný skôr (14, 15). V stručnosti, v deň 1 (pretest), myši mali možnosť preskúmať celý prístroj pre 20 min. V priebehu nasledujúcich 8 dní (fáza kondicionovania) boli myši v 40 min. Pre kondicionovanie miesta s farmakologickými stimulmi, jeden zo vzorov bol konzistentne spárovaný s fyziologickým roztokom a druhý s kokaínom (20 mg / kg ip, CPP) alebo LiCl (3.0 meq / kg ip, CPA) počas fázy kondicionovania. Tieto dávky boli vybrané na základe predchádzajúcich štúdií, ktoré ukazujú, že myši C57BL / 6JIco vykazujú silnejší CPP pri dávke kokaínu 20 mg / kg (30, 31) a trend smerom k averzii v teste CPA pri dávke LiCl 3.0 meq / kg (32). U zvierat v kontrolnej skupine boli obe komory spárované so soľankou. V prípade CPP s jedlom bol jeden zo vzorcov konzistentne spárovaný so štandardnou potravou (1 g štandardnej diéty myši) a druhý s chutným jedlom (1 g mliečnej čokolády). Zvieratá sa umiestnili do potravinového reštrikčného plánu (28) 4 dní pred začatím kondicionovania. Tento rozvrh trval počas kondicionovania.
Pre všetky experimenty s kondicionovaním miesta boli párovania vyvážené tak, že pre polovicu každej experimentálnej skupiny bol nepodmienený stimul (kokaín, čokoláda alebo LiCl) spárovaný s jedným z dvoch vzorov; pre druhú polovicu každej skupiny bol nepodmienený stimul spárovaný s druhým vzorom. Testovanie na expresiu CPP alebo CPA sa uskutočňovalo 10. deň pomocou postupu predbežného testu. Údaje o správaní boli zhromažďované a analyzované plne automatizovaným systémom na sledovanie videa EthoVision (Noldus, Wageningen, Holandsko). Stručne, experimentálny systém je zaznamenaný CCD videokamerou. Signál sa potom digitalizuje (pomocou hardvérového zariadenia nazývaného grabovač snímok) a odovzdáva sa do pamäte počítača. Neskôr sú digitálne dáta analyzované pomocou softvéru EthoVision, aby sa získal „čas strávený“ (v sekundách), ktorý sa použije ako nespracované dáta pre skóre preferencie v každom sektore prístroja každým subjektom.
Štatistika.
Miesto klimatizácia.
Pre experimenty s kondicionovaním na mieste sa štatistické analýzy uskutočňovali vypočítaním času (v sekundách) stráveného v centre (centrum), párov liečivo / čokoláda (pár) a fyziologického roztoku / štandardného oddielu potravín (nepárový) v deň testu. V prípade zvierat, ktoré dostávali pár fyziologického roztoku s obidvomi oddeleniami, bola spárovaná komora identifikovaná ako prvá, ktorej boli vystavené.
Účinky selektívnej prefrontálnej kortikálnej deplécie norepinefrínu na kondicionovanie miesta.
Dáta z experimentov s kondicionovaním miesta boli analyzované pomocou ANOVA s opakovanými meraniami s jednou medzi faktorom (predošetrenie, dve úrovne: simulovaná liečba a norepinefrinovaný, dokončená) a jednou v rámci faktora (párovanie, tri úrovne: centrum, spárovaná a nepárovaná) pre každú liečbu [ fyziologický roztok / fyziologický roztok, soľný roztok / kokaín (20 mg / kg), fyziologický roztok / LiCl (3 meq / kg) a štandardné jedlo / čokoláda]. Pretože sú dôležité porovnania medzi spárovanými a nepárovými kompartmentmi, priemerné porovnanie času stráveného v týchto komorách sa uskutočnilo pomocou ANOVA s opakovanými meraniami v každej skupine.
Obojsmerná ANOVA odhalila významnú interakciu predliečenia × párovania pre kokaín [F (2, 28) = 3.47; P <0.05], LiCl [F (2) = 28; P <4.55] a čokoláda [F (0.05, 2) = 28; P <3.5].
ANOVA s opakovanými meraniami v rámci každej skupiny odhalila významný účinok párovacieho faktora iba u zvierat s fingovanou liečbou, ktorým bol injekčne podaný kokaín [F (1) = 14; P <24.3], LiCl [F (0.0005) = 1; P <14] alebo čokoláda [F (10.3) = 0.01; P <1].
Deplécia norepinefrínu v mpFC.
Účinky prefrontálnej deplécie norepinefrínu na tkanivové hladiny dopamínu a norepinefrínu v mpFC sa analyzovali dvojcestnou analýzou ANOVA. Faktory boli nasledujúce: lézia (dve úrovne: fingovaná liečba a vyčerpaný norepinefrín) a experiment (dve úrovne: experiment so správaním a experimenty s mikrodialýzou). Jednotlivé porovnania medzi skupinami sa uskutočňovali podľa potreby post hoc testom, Duncanovým testom na viac rozsahov. Štatistické analýzy sa uskutočňovali na dátach z experimentov správania a mikrodialýzy. Dvojsmerná ANOVA pre účinky prefrontálnej deplécie norepinefrínu na hladiny dopamínu a noradrenalínu v mpFC preukázala signifikantný lézny účinok iba pre norepinefrín [F (1, 188) = 2.02; P <0.0005], ale bez experimentálnych účinkov.
Microdialysis.
Štatistické analýzy sa uskutočňovali na prvotných údajoch (koncentrácie pg na 20 μl). Účinky prefrontálnej deplécie norepinefrínu na uvoľňovanie norepinefrínu v mpFC alebo na odtok dopamínu v NAc zvierat vystavených účinku kokaínu (20 mg / kg) alebo LiCl (3 mekv./kg) sa analyzovali pomocou ANOVA s opakovanými meraniami s dvoma faktormi (pred liečbou, dve úrovne, fingovaná liečba a vyčerpaný norepinefrín a liečba, tri úrovne, soľný roztok, kokaín a LiCl) a jedna v rámci faktora (čas, sedem úrovní, 0, 20, 40, 60, 80, 100 a 120). Účinky prefrontálnej deplécie norepinefrínu na uvoľňovanie norepinefrínu v mpFC alebo na odtok dopamínu v NAc zvierat vystavených čokoláde sa analyzovali opakovanými meraniami ANOVA s jedným medzi faktorom (predbežná liečba, dve hladiny, simulovaná liečba a deplécia norepinefrínu) a jedna vo vnútri faktora ( čas, deväť úrovní, 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 a 160). Jednoduché účinky boli hodnotené jednosmernou ANOVA pre každý časový bod. Jednotlivé porovnania medzi skupinami sa uskutočňovali podľa potreby post hoc testom, Duncanovým testom s viacerými rozsahmi.
Štatistické analýzy účinkov farmakologických stimulov na odtok prefrontálneho norepinefrínu odhalili významnú predbežnú liečbu × liečbu × časovú interakciu [F (12, 180) = 4.98; P <0.005]. Štatistické analýzy účinkov konzumácie čokolády na uvoľňovanie norepinefrínu odhalili interakciu predošetrenia × čas [F (8, 80) = 7.77; P <0.005]. Jednoduché analýzy účinkov odhalili významný časový efekt iba pre skupinu s fingovanou liečbou a významný rozdiel medzi skupinami s falošnou liečbou a skupinou s depléciou norepinefrínu po injekcii kokaínu alebo LiCl, ako aj po konzumácii čokolády.
Štatistické analýzy účinkov farmakologických stimulov na odtok dopamínu z accumbalu odhalili významnú predbežnú liečbu × liečbu × časovú interakciu [F (12, 180) = 10.02; P <0.0005]. Štatistické analýzy čokoládových údajov odhalili významnú interakciu predošetrením × čas [F (8, 80) = 2.12; P <0.05]. Jednoduché analýzy účinkov odhalili významný časový efekt iba pre skupiny s fingovanou liečbou a významný rozdiel medzi skupinami s falošnou liečbou a skupinami s depléciou norepinefrínu po injekcii drogy (kokaínu alebo LiCl), ako aj po konzumácii čokolády.
Poďakovanie
Ďakujeme Dr. E. Catalfamovi za šikovnú pomoc. Tento výskum podporili Ministero della Ricerca Scientifica e Tecnologica (PRIN 2005), Università „La Sapienza“ Ateneo (2004 / 2005) a Ministero della Salute (Progetto Finalizzato RF03.182P).
SKRATKY
Jadro NAc accumbens
pFC prefrontálna kôra
mpFC stredný pFC
Preferované miesto podľa CPP
CPA podmienená averzia k miestu
6-OHDA 6-hydroxydopamín.
poznámky pod čiarou
Autori neuvádzajú žiadny konflikt záujmov.
Tento článok je priamym podaním PNAS.
REFERENCIE
1. O'Doherthy J. Curr, posudok Neurobiol. 2004; 14: 769–776. [PubMed]
2. Rolls ET. Behav Brain Sci. 2000; 23 :. 177-191 [PubMed]
3. Berridge KC, Robinson TE. 1998; 28: 309 – 369. [PubMed]
4. Becerra L, Breiter HC, Wise R, Gonzalez RG, Borsook D. Neuron. 2001; 32 :. 927-946 [PubMed]
5. Gottfried JA, O'Doherthy J, Dolan RJ. J Neurosci. 2002; 22: 10829–10837. [PubMed]
6. Jensen J, Mcintosh AR, Crawley AP, Mikulis DJ, Remington GR, Kapur S. Neuron. 2003; 40 :. 1251-1257 [PubMed]
7. Borsook D, Becerra L, Carlezon WA, Jr, Shaw M, Renshaw P, Elman I, Levine J. Eur J Pain. 2007; 11 :. 7-20 [PubMed]
8. Wise R. Nat Rev Neurosci. 2004; 5 :. 483-494 [PubMed]
9. Bechara A, Tranel D, Damasio H. Brain. 2000; 123 :. 2189-2202 [PubMed]
10. McQuade R, Creton D, Stanford SC. Psychopharmacology. 1999; 145 :. 393-400 [PubMed]
11. Dazzi L, Seu E, Cherchi G, Biggio G. Eur J. Pharmacol. 2003; 476 :. 55-61 [PubMed]
12. Feenstra MGP, Teske G, Botterblom MHA, de Bruin JP. Neurosci Lett. 1999; 272 :. 179-182 [PubMed]
13. Mingote S, de Bruin JPC, Feenstra MGP. J Neurosci. 2004; 24 :. 2475-2480 [PubMed]
14. Ventura R, Cabib S, Alcaro A, Orsini C, Puglisi-Allegra S. J Neurosci. 2003; 23 :. 1879-1885 [PubMed]
15. Ventura R, Alcaro A, Puglisi-Allegra S. Cereb Cortex. 2005; 15 :. 1877-1886 [PubMed]
16. Di Chiara G, Bassareo V, Fenu S, De Luca MA, Spina L, Cadoni C, Acquas E, Carboni E, Valentini V, Lecca D. Neurofarmakológia. 2004; 47 :. 227-241 [PubMed]
17. Aston-Jones G, Rajkowski J, Cohen J. Biol Psychiatry. 1999; 46 :. 1309-1320 [PubMed]
18. Shi WX, Pun CL, Zhang XX, Jones MD, Bunney BS. J Neurosci. 2000; 20 :. 3504-3511 [PubMed]
19. Sesack SR, Pickel VM. J Comp Neurol. 1992; 320 :. 145-160 [PubMed]
20. Darracq L, Drouin C, Blanc G, Glowinski J, Tassin JP. Neuroscience. 2001; 103 :. 395-403 [PubMed]
21. Jodo E, Chiang C, Aston-Jones G. Neuroscience. 1998; 83 :. 63-79 [PubMed]
22. Grenhoff J, Nisell M, Ferre S, Aston-Jones G, Svensson TH. J Neural Transm. 1993, 93: 11-25.
23. Liprando LA, Miner LH, Blakely RD, Lewis DA, Sesack SR. Synapsie. 2004; 52 :. 233-244 [PubMed]
24. Salamone JD, Correa M, Mingote S, Weber SM. J Pharmacol Exp Ther. 2003; 305 :. 1-8 [PubMed]
25. Everitt BJ, Robbins TW. Nat Neurosci. 2005; 11 :. 1481-1487 [PubMed]
26. Horvitz JC. Behav Brain Res. 2002; 137 :. 65-74 [PubMed]
27. Franklin KBJ, Paxinos G. Mozog myši: v stereotaxických súradniciach. San Diego: Academic; 1997.
28. Ventura R, Puglisi-Allegra S. Synapse. 2005; 58 :. 211-214 [PubMed]
29. Cabib S, Orsini C, Le Moal M, Piazza PV. Science. 2000; 289 :. 463-465 [PubMed]
30. Romieu P, Phan VL, Martin-Fardon R., Maurice T. Neuropsychopharmacology. 2002; 4 :. 444-455 [PubMed]
31. Orsini C, Bonito-Oliva A, Conversi D, Cabib S. Psychopharmacology. 2005; 181 :. 327-336 [PubMed]
32. Risinger FO, Cunningham CL. Pharmacol Biochem Behav. 2000; 1 :. 17-24 [PubMed]
;
