Dekódovanie neurálnych obvodov, ktoré riadia kompulzívnu sacharózu (2015) (BINGE MECHANISM)

Za účelom identifikácie LH neurónov, ktoré poskytujú monosynaptický vstup do VTA in vivo, a sledovania ich aktivity počas voľne sa pohybujúceho správania, sme použili stratégiu dvojitého vírusu na selektívnu expresiu channelrhodopsínu-2 (ChR2) v LH neurónoch poskytujúcich monosynaptický vstup do VTA (Obrázky 1A a S1). Injektovali sme adeno-asociovaný vírusový vektor (AAV)₅) nesúci ChR2-eYFP v konštrukte dvojito obráteného otvoreného čítacieho rámca (DIO) závislého na rekombináze, do LH, aby infikoval lokálnu somatu, a injikoval retrográdne putujúci vírus herpes simplex (HSV) nesúci Cre-rekombinázu do VTA. Následná rekombinácia umožňovala selektívne expresiu opsínu a fluoroforu v LH neurónoch poskytujúcich monosynaptický vstup do VTA. Aby sme potvrdili náš prístup, vykonali sme ex vivo celobunkové nahrávky patch-clamp v horizontálnych rezoch mozgu obsahujúcich LH a zaznamenané z neurónov exprimujúcich ChR2-eYFP, ako aj zo susedných LH neurónov, ktoré boli ChR2-eYFP negatívne (Obrázok 1B). Latencie špice vyvolané svetlom, merané od začiatku svetelného impulzu po vrchol akčného potenciálu, sa pohybovali od 3 do 8 ms (Obrázok 1C). Tiež sme zistili, že žiadna zo zaznamenaných neexprimujúcich (ChR2-negatívnych) buniek nevykazovala excitačné reakcie na fotostimuláciu (n = 14; Obrázok 1C), napriek ich blízkosti k bunkám exprimujúcim ChR2.

Aby sa uskutočnila optogeneticky sprostredkovaná fotoidentifikácia in vivo, bol do LH implantovaný optród na zaznamenanie neurónovej aktivity počas úlohy hľadania sacharózy. V tej istej relácii záznamu sme poskytli niekoľko vzorov fotostimulácie na identifikáciu LH-VTA neurónov exprimujúcich ChR2 (Obrázky 1D a S1). Preskúmali sme distribúciu excitačných fotoreaktívnych latencií vo všetkých LH neurónoch, ktoré vykazovali časovo blokovanú zmenu rýchlosti pálenia v reakcii na osvetlenie, a pozorovali sme bimodálnu distribúciu (Obrázok 1E). Populáciu neurónov sme pozorovali počas záznamov in vivo s latenciou v rozmedzí 3–8 ms. Toto bolo identické s rozsahom latencie zisteným v LH-VTA neurónoch exprimujúcich ChR2, keď sme ich zaznamenávali ex vivo. Tieto jednotky sme nazvali „Typ 1“ (Obrázky 1C, 1E a 1F). Okrem toho existovala zreteľná populácia buniek s latenciou fotoodpovede ~ 100 ms (Obrázky 1E a 1G) a nazvali sme tieto jednotky typu 2. Pozorovali sme tiež neuróny, ktoré boli inhibované v reakcii na fotostimuláciu neurónov LH-VTA (Obrázok S2) a nazvali sme tieto jednotky typu 3. Porovnali sme trvanie akčného potenciálu (merané od vrcholu po najnižšiu hodnotu) a priemerné rýchlosti vypaľovania jednotiek typu 1 a typu 2, ako aj tých, ktoré nevykazovali fotoreakciu (Obrázok 1H). Rozdelenie trvania akčného potenciálu typu 1 (Obrázok 1I) a typu 2 (Obrázok 1J) jednotky ukazujú, že väčšina jednotiek typu 1 má trvanie akčného potenciálu menej ako 500 μs (84%; n = 16/19, binomické rozdelenie, p = 0.002).

Aj keď jednotky typu 1 vyhovujú štandardným kritériám na klasifikáciu ako expresia ChR2 (Cohen a kol., 2012, Zhang a kol., 2013), nebolo jasné, či dlhšia latencia fotoodpovede jednotiek typu 2 svedčí o neurónoch exprimujúcich ChR2, ktoré odpovedali pomalšie k fotostimulácii alebo či bol tento efekt spôsobený sieťovou aktivitou. Vzhľadom na to, že LH neuróny exprimujúce ChR2 (typ 1) premietajú priamo do VTA, jednou z možností bolo, že neuróny typu 2 dostávali spätnú väzbu od VTA (Obrázok 1K). Ďalšou možnosťou bolo, že neuróny typu 2 boli aktivované axónovými kolaterálmi z neurónov typu 1 (Obrázok 1L). Na rozlíšenie medzi týmito dvoma možnými modelmi obvodov sme inhibovali VTA v spojení s fotoidentifikáciou v LH.

Na základe našich modelov s obvodmi by sme očakávali, že distálna inhibícia nebude mať žiadny vplyv na fotoreakcie LH neurónov exprimujúcich ChR2. Ak sú však fotoreaktívne, ale neexprimujúce, neuróny LH sa spoliehali na spätnú väzbu od VTA, aby vyvolali časovo blokovanú reakciu na osvetlenie (Obrázok 1K), očakávali by sme zoslabenie fotoreakcií v týchto neurónoch po inhibícii VTA. Exprimovali sme ChR2 v bunkách LH-VTA, ako je uvedené vyššie, ale tentoraz tiež exprimoval zosilnený halorodopsín 3.0 (NpHR) vo VTA a implantoval optické vlákno do VTA okrem optródy v LH (Obrázok 2A). V LH sme dodali rovnaké vzory modrého svetla pre všetky tri epochy, ale fotoinhibovali sme VTA žltým svetlom v druhej epoche (Obrázok 2A).

Fotoreakcie jednotiek typu 1 na osvetlenie modrým svetlom v LH neboli ovplyvnené fotoinhibíciou VTA, čo je v súlade s expresiou ChR2 v neurónoch typu 1 LH-VTA (Obrázok 2B). Naproti tomu väčšina jednotiek typu 2 (87%; n = 13/15, binomické rozdelenie, p = 0.004) vykázala významné zoslabenie fotoodpovedí na impulzy modrého svetla dodávané v LH po fotoinhibícii VTA neurónov. Odpovede jednotiek typu 1 a typu 2 počas fotoinhibície VTA boli významne odlišné (chí-kvadrát = 7.64, p = 0.0057; Obrázky 2B a 2C). Tieto rozdiely možno vidieť aj v maximálnom skóre Z počas jednotlivých epoch (Obrázok 2D) a so žltou-ON epochou normalizovanou na žltú-OFF epochu (Obrázok 2E). Tieto údaje naznačujú, že neuróny typu 2 LH prijímajú vstup (priamo alebo nepriamo) z VTA (Obrázok 1K) namiesto miestnych kolaterálov axónov (Obrázok 1L).

Po identifikácii týchto dvoch odlišných typov LH neurónov v slučke LH-VTA sme chceli skúmať prirodzene sa vyskytujúcu neurálnu aktivitu počas úlohy sacharózy pri samo-podaní (Obrázok 3A). Myši boli trénované na vykonávanie nosových reakcií na podnet, ktorý predpovedá dodanie sacharózy do susedného portu (ako v Tye et al., 2008). Aby sme mohli rozlíšiť neurálne reakcie na nosepoke a na tágo, boli tágo a sacharóza dodané podľa plánu čiastočného zosilnenia, kde 50% nosových kúskov bolo spárovaných s podaním a sacharózou.

Jednotky typu 1 vykazovali fázové reakcie na vstup do sacharózového portu, ako je vidieť na reprezentatívnej jednotke typu 1 (Obrázok 3B), ako aj údaje o populácii všetkých jednotiek typu 1 (Obrázok 3C). Fázické reakcie jednotiek typu 2 však odrážali najmä reakcie na odmeňovacie predikcie (Obrázky 3D a 3E). Normalizované vzorce streľby všetkých zaznamenaných neurónov (n = 198, rozdelené na jednotky typu 1, 2, 3 a nereagujúce jednotky) sa zobrazia pre každú zložku úlohy: nosové lúče spárované s tágom, nosné lúče v neprítomnosti tága a vstup do sacharózy (Obrázok 3F). Všetky jednotky typu 1, ktoré vykazovali fázové zmeny aktivity súvisiace s úlohou (74%; n = 14/19), boli buď fázovo excitované, alebo inhibované vstupom do portu sacharózy, pričom malý počet tiež vykazoval fázovú inhibíciu predpovede odmeny (Obrázky 3B, 3C a 3G). Na rozdiel od toho jednotky typu 2 boli heterogénnejšie, pričom neuróny reagujúce na úlohu kódovali tágo selektívne (35%), sacharózový port-vstup selektívne (26%), alebo ako vstupný a portový vstup (12%; Obrázky 3D, 3E a 3H). Na ilustráciu sily reakcií jednotiek typu 1 a typu 2 na udalosti súvisiace s úlohami sme každú bunku vykreslili na trojrozmernom grafe podľa skóre Z (Obrázok 3I). Aby sme ukázali distribúciu fázových zmien v paľbe na viacnásobné udalosti súvisiace s úlohami na kvalitatívnej úrovni, vykreslili sme počet buniek každého typu fotoreakcie, ktoré spadali do danej kategórie (Obrázok 3J).

Vzhľadom na dobre definovanú úlohu VTA pri chybe predikcie odmeny (napr. Fázická redukcia streľby DA neurónov v reakcii na neočakávané vynechanie odmeny a fázová excitácia v reakcii na neočakávané dodanie odmeny) (Schultz a kol., 1997) sme skúmali, či by neuróny LH kódovali neočakávané vynechanie odmeny za sacharózu. Aby sme to dosiahli, zaznamenali sme nervovú aktivitu fotoresponzívnych neurónov počas tej istej úlohy cue-odměna u dobre trénovaných zvierat, ale náhodne sme vynechali 30% dodávok sacharózy nasledujúcich za tágom (Obrázok 4A).

Väčšina jednotiek typu 1 (88%; n = 15/17, binomické rozdelenie, p = 0.001) bola necitlivá na vynechanie odmeny (Obrázky 4B a 4D), zatiaľ čo veľká podskupina jednotiek typu 2 (67%; n = 12/18) vykázala signifikantne odlišnú odpoveď na pokusy prezentované a ocenené (Obrázky 4C a 4D). Dospeli sme k záveru, že neuróny LH-VTA (typ 1) kódovali činnosť vstupu do prístavu, pretože tieto odpovede na vstup do prístavu pretrvávali aj po vynechaní odmeny (Obrázok 4D), na rozdiel od jednotiek typu 2 (chí-kvadrát = 10.9804, p = 0.0009).

Aby sme určili, či odpovede typu 1 na vstup do portu skutočne kódovali podmienenú odpoveď (CR), na rozdiel od všeobecného odmeňovania alebo prieskumného správania, zaznamenali sme u netrénovaných myší, ktoré túto úlohu ešte nezískali. U myší bez úlohy sme dodali sacharózu do prístavu v neprítomnosti prediktívneho narážky (nepredvídané doručenie odmeny) a zistili sme, že jednotky typu 1 nevykazovali fázové reakcie na vstup do portu (Obrázky 4E, 4F a 4I), v súlade s modelom, ktorý neuróny typu 1 kódujú CR (Obrázok 4J).

Ďalej, aby sme určili, či je aktivita jednotky typu 2 konzistentná s profilom odpovede podobnej chybe predpovede odmeny, zaznamenali sme tiež tieto neuróny u dobre trénovaných zvierat počas nepredvídaného doručenia odmeny (Obrázok 4G). Zistili sme, že podmnožina jednotiek typu 2 reagovala na nepredvídané dodávky sacharózy (50%; Obrázky 4G-4). Celkovo sú podmnožiny jednotiek typu 2 citlivé na neočakávané vynechanie odmeny (Obrázky 4C a 4D) a nepredvídané doručenie odmien (Obrázky 4G – 4I), konzistentné s profilom odpovede podobnej predpovedi odmeny.

Ako sme ukázali vyššie, jednotky typu 1 predstavujú nervovú koreláciu CR. Je dôležité, že zvýšenie rýchlosti paľby sa začína pred ČR a rampuje sa až do úplného splnenia CR (Obrázky 3B, 3C a 4B). Aby sme určili, či by aktivácia dráhy LH-VTA mohla podporovať CR, chceli sme vyskúšať schopnosť aktivácie LH-VTA pri poháňaní CR zoči-voči negatívnym dôsledkom. U myší divého typu sme exprimovali ChR2-eYFP alebo eYFP samotný v bunkách LH buniek a implantovali sme optické vlákno do VTA (Obrázky 5A a S4). Naopak, aby sme otestovali úlohu dráhy LH-VTA pri sprostredkovaní správania súvisiaceho s CR alebo s kŕmením, vyjadrili sme obojstranne samotný NpHR-eYFP alebo eYFP v bunkách LH a implantovali sme optické vlákno nad VTA (Obrázky 5A a S4).

Navrhli sme pavlovianskú úlohu kondicionovania, pri ktorej myši zbavené potravy museli prejsť šokovou mriežkou, aby získali sacharózovú odmenu (Obrázok 5B). V prvej „základnej“ epoche (s vypnutou šokovou mriežkou) sme overili, že každá myš získala úlohu podmieneného prístupu Pavlovian. V druhej („šokovej“) epoche mriežka šokov každú sekundu spôsobovala mierne otrasy chodidla. Nakoniec v tretej epoche („Šok + svetlo“) sme pokračovali v podávaní šokov chodidlami, ale tiež sme osvetlili svorky LH vo VTA modrým svetlom (10 Hz) u myší exprimujúcich ChR2 a porovnaných eYFP kontrol a žltého svetla (konštantného) pre myši exprimujúce NpHR a ich kontroly eYFP (Obrázok 5B).

Počas epizódy Shock + Light sme pozorovali významne vyšší počet vstupov na narážku a významne vyššie skóre rozdielu (Shock + Light epocha - iba šoková epocha) u myší ChR2 v porovnaní s myšami eYFP (Obrázok 5C a Film S1). Na rozdiel od toho, fotoinhibícia dráhy LH-VTA viedla k významnému zníženiu vstupov do portu na narážku a skóre skóre u myší NpHR v porovnaní s myšami eYFP (Obrázok 5D a Film S2). Experimenty vyhynutia v rámci relácie, počas ktorých prezentácie tága nenasledovali dodávky sacharózy, preukázali podobné trendy v účinnosti (Obrázok S4).

Dôležité je, že sme chceli zistiť, či zmeny v hľadaní sacharózy, ktoré sme dosiahli, boli zapríčinené zmenami v správaní sa potravou alebo citlivosťou na bolesť. Zistili sme, že fotoaktivácia projekcie LH-VTA významne zvýšila čas strávený kŕmením dobre kŕmených myší v skupine ChR2 (Obrázok 5E). Fotoinhibícia dráhy LH-VTA však významne neznížila príjem potravy (Obrázok 5F), aj keď tieto zvieratá boli zbavené potravy, aby sme zvýšili našu schopnosť detegovať zníženie v porovnaní s východiskovou epochou (v porovnaní so satedovanými zvieratami v Obrázok 5E). Ani v ChR2 (Obrázok 5G) ani skupina NpHR (Obrázok 5H) pozorovali sme rozdiel v latencii do odtiahnutia chvosta z horúcej vody (Ben-Bassat a kol., 1959, Grotto a Sulman, 1967), čo naznačuje, že manipulácia s projekciou LH-VTA nezmenila analgéziu.

Na štúdium zloženia zložiek rýchleho prenosu vstupov LH do VTA, ktoré vyvolávali tieto účinky, sme vykonali celobunkové záznamy patch-clamp z neurónov VTA v príprave akútneho rezu, pričom sme opticky aktivovali vstupy LH exprimujúce ChR2-eYFP (Obrázky 6A a S5). Vzhľadom na to, že vo VTA je zavedená heterogenita, vrátane - 65% neurónov DA, - 30% neurónov GABA a - 5% glutamátových neurónov (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et. al., 2007), naplnili sme bunky biocytínom počas záznamu, aby sme umožnili identifikáciu bunkového typu pomocou post-hoc imunohistochémie pre tyrozínhydroxylázu (TH; Obrázok 6B), okrem zaznamenávania katiónového prúdu aktivovaného hyperpolarizáciou (I_h) a umiestnenie mapovacej bunky (Obrázky 6B a S5).

Najprv sme zaznamenali prúdovú svorku počas fotostimulácie LR vstupov exprimujúcich ChR2 a pozorovali sme, že 23 neurónov 27 vykázala časovo blokovanú reakciu na fotostimuláciu LH vstupov (Obrázok 6C). Väčšina DA neurónov odobraných vo VTA dostala čistý excitačný vstup od LH (56%), zatiaľ čo iná podskupina vykázala čistú inhibíciu (30%; Obrázok 6C). Priestorové rozdelenie týchto DA neurónov sa mapuje na atlas pre horizontálne rezy obsahujúce VTA (Obrázok 6D).

Na stanovenie monosynaptického prínosu vstupov LH do neurónov VTA DA sme použili mapovanie obvodov s pomocou ChR2, kde sa zaznamenávali napäťové svorky v prítomnosti tetrodotoxínu (TTX) a 4-aminopyridínu (4AP; Petreanu et al., 2007). . V súlade s našimi pozorovaniami zo záznamov prúdových svoriek sme pozorovali, že väčšina zaznamenaných neurónov VTA DA dostávala výlučne excitačný monosynaptický vstup z LH (67%) v porovnaní s neurónmi VTA DA, ktoré dostávali výlučne inhibičný monosynaptický vstup (11%), alebo obaja (22%; Obrázky 6E a S6).

Neuróny VTA GABA sme identifikovali injekciou fluoroforu závislého na Cre (AAV₅-DIO-mCherry) do VTA myší VGAT :: Cre a využila expresiu mCherry na nasmerovanie záznamu neurónov VTA GABA (n = 24; Obrázok 6F). Štyridsaťšesť percent neurónov VTA GABA reagovalo s čistou excitáciou, zatiaľ čo 54% odpovedalo s čistou inhibíciou na fotostimuláciu LR vstupov exprimujúcich ChR2 (Obrázok 6G). Priestorové rozdelenie týchto buniek je uvedené v Obrázok 6H. Pri vyšetrení monosynaptického vstupu z LH (ako je opísané vyššie) sme zistili, že 18% neurónov vo vzorke GABA dostalo výlučne excitačný vstup a 9% dostalo výlučne inhibičný vstup (Obrázok 6Ja). Avšak v porovnaní s neurónmi VTA DA sme zistili, že viac neurónov VTA GABA dostávalo excitačné AMPAR sprostredkované aj inhibičné GABA_AR sprostredkovaný monosynaptický vstup z LH (73%; chí-kvadrát = 5.0505, p = 0.0246; Obrázky 6Ja a S6).

Vzhľadom na to, že naše nahrávky ex vivo poskytli dôkazy podporujúce robustný vstup z projekcií GABAergického aj glutamatergického LH do VTA, ďalej sme sondovali úlohu každej zložky nezávisle. Na to sme použili transgénne myšie línie exprimujúce Cre-rekombinázu v neurónoch, ktoré exprimovali buď vezikulárny glutamátový transportér 2 (VGLUT2) alebo vezikulárny transportér GABA (VGAT). Injekčne sme podali AAV₅-DIO-ChR2-eYFP alebo AAV₅-DIO-eYFP do LH myší VGLUT2 :: Cre a VGAT :: Cre a implantovali optické vlákno cez VTA (Obrázok S7). Tieto zvieratá sa potom podrobili každému z behaviorálnych testov znázornených na obrázku Obrázok 5.

Nepozorovali sme žiadne zistiteľné rozdiely v počte vstupných portov vykonaných na narážku medzi myšami exprimujúcimi ChR2 alebo eYFP v LH.^presýteniu-VTA projekcia (Obrázok 7A) alebo v LH^GABA-VTA projekcia (Obrázok 7B). Po analýze videa sme však v LH zaznamenali aberantné nahlodanie^GABA-VTA: skupina ChR2 po osvetlení modrým svetlom (pozri Filmy S3 a S4). V LH^presýteniu-VTA myši, aj keď v skupine so skupinou ChR2 v porovnaní so skupinou eYFP existoval trend znižovania príjmu potravy v porovnaní so skupinou eYFP, nebolo to štatisticky významné (Obrázok 7C). Na rozdiel od toho sme pozorovali výrazné predĺženie času stráveného kŕmením u sated myší po osvetlení v LH^GABA-VTA: skupina ChR2 vzhľadom na kontroly (Obrázok 7D a Film S3). U žiadnej skupiny zvierat nebol pri skúške odtiahnutia chvosta účinok stimulácie svetla (Obrázky 7E a 7F).

Počas úlohy kŕmenia, ako sme to robili počas úlohy hľadania sacharózy, sme si opäť všimli aberantné motorické sekvencie súvisiace s kŕmením, ktoré neboli zamerané na jedlo. Natáčali sme reprezentatívnu myš v LH^GABA-VTA: Skupina ChR2 v prázdnej priehľadnej komore a po 20 Hz fotostimulácii sme pozorovali neobvyklé chuťové sekvencie motora, ako je olizovanie a hryzenie podlahy alebo prázdneho priestoru (Film S4). Kvantifikovali sme tieto „nahlodanie“ správania počas úlohy kŕmenia v divokom type LH-VTA (Obrázok 7G), LH^presýteniu-VTA (Obrázok 7H) a LH^GABA-VTA (Obrázok 7I) skupiny a preukázali, že LH^GABA-VTA: myši ChR2 hlodali viac ako divý typ alebo LH^presýteniu-VTA: myši ChR2, keď boli fotostimulované, v porovnaní s ich príslušnými skupinami eYFP (Obrázok 7J). Zvážili sme, či by sa aberantné správanie súvisiace s kŕmením mohlo oddeliť od správne nasmerovaného kŕmenia pri nižších frekvenciách. Keď sme však testovali LH^GABA-VTA: Skupina ChR2 s 5 Hz a 10 Hz sledmi modrého svetla, pozorovali sme proporcionálny vzťah medzi frekvenciou stimulácie a kŕmením aj hryzaním (Obrázok 7K).

Projekcia LH do VTA bola skúmaná pomocou kolíznych štúdií o elektrickej stimulácii (Bielajew a Shizgal, 1986) a dlho sa predpokladalo, že zohrávajú úlohu pri spracovaní odmien (Hoebel a Teitelbaum, 1962, Margules and Olds, 1962), a napriek tomu ich určujú. úloha bola výzvou. Tu uvádzame podrobnú rozpravu o tom, ako jednotlivé komponenty slučky LH-VTA spracúvajú rôzne aspekty úlohy súvisiacej s odmenou.

Prostredníctvom optogeneticky sprostredkovaného fototagovania (Obrázok 1) sme identifikovali dve samostatné populácie neurónov LH: bunky, ktoré vysielajú projekcie do VTA (typ 1), a bunky, ktoré prijímajú spätnú väzbu z VTA (typ 2; Obrázok 2) - hoci tieto populácie sa nemusia vzájomne vylučovať, pretože je možné, že LH neuróny mohli odosielať a prijímať vstupy do a z VTA. Je zaujímavé, že sme zistili, že relatívne málo fotoreaktívnych neurónov spadlo mimo bimodálnu distribúciu zapuzdrujúcu tieto dve populácie (Obrázky S2B a 1E). Vzhľadom na to v kombinácii s dlhým oneskorením latencie vo fotoodpovediach typu 2 (~ 100 ms) predpokladáme, že môže existovať jedna dominantná dráha prispievajúca k aktivite neurónov typu 2. Ďalej, pretože DA viaže receptory spojené s G proteínom, kinetika je pomalšia ako väčšina glutamátergických synapsií (Girault a Greengard, 2004) a môže vysvetliť tento zhluk fotoresponzívnych jednotiek s latenciou 100 ms. Je tiež možné, že VTA môže poskytovať nepriamu spätnú väzbu cez ďalšie distálne oblasti, cez excitačné medziľahlé oblasti, ako je amygdala, alebo s dezinhibíciou cez nucleus accumbens (NAc) alebo lôžkové jadro stria terminalis (BNST).

Je zaujímavé, že zatiaľ čo fotostimulácia jednotiek typu 1 vyvoláva excitačné reakcie v jednotkách typu 2, jednotky typu 1 a 2 vykazujú odlišné vlastnosti kódovania správania. Napríklad počty jednotiek typu 1 a typu 2, ktoré selektívne kódujú tágo, ktoré predpovedajú odmenu, sú výrazne odlišné (n = 0/19 typ 1 verzus n = 12/34 typ 2, chí-kvadrát = 8.67, p = 0.003) . Tento paradoxný model odozvy by mohol byť spôsobený výpočtovými procesmi na prvku prechodového obvodu, ako je napríklad VTA, ktoré môžu hrať aktívnu úlohu počas úlohy správania, ale neaktívne počas fototagovania. Na to, ako sa tieto údaje spracúvajú, by mohol mať vplyv aj stav správania zvieraťa.

Naše experimenty s vynechaním odmeny nám umožnili rozlišovať medzi LH neurónovým kódovaním ČR a spotrebou nepodmieneného stimulu (USA). V týchto experimentoch podskupina jednotiek typu 2 reagovala na predikciu predpovedí odmeny (CS) a USA a tiež vykázala zníženie rýchlosti prepúšťania, keď sa vynechali očakávané odmeny. Okrem toho podmnožina jednotiek typu 2 tiež vykazuje fázové budenie po neočakávanom doručení odmeny (Obrázky 4G a 4H). Tieto údaje pripomínajú spôsob, akým DA neuróny vo VTA kódujú chybu predikcie odmeny (Cohen a kol., 2012, Schultz a kol., 1997). Špekulujeme, že VTA neuróny môžu prenášať chybové chybové predikčné signály do podmnožiny LH neurónov, ktoré sú v dobrej pozícii na integráciu týchto signálov na určenie vhodného správania. Konkrétne je LH robustne prepojený s mnohými ďalšími oblasťami mozgu (Berthoud a Münzberg, 2011) a bol kauzálne spojený s homeostatickými stavmi, ako sú spánok / vzrušenie a hlad / sýtosť (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

O kompulzívnom správaní pri hľadaní odmeny sa diskutovalo predovšetkým v súvislosti s drogovou závislosťou, pričom klasickou paradigmou pre kompulzívne hľadanie drog bolo skúmať mieru, do akej správanie pri hľadaní drog pretrváva zoči-voči negatívnym následkom, napríklad šoku z chodidla. (Belin a kol., 2008, Pelloux a kol., 2007, Vanderschuren a Everitt, 2004). Prispôsobili sme túto úlohu hľadaniu sacharózy, aby sme mohli preskúmať, či je aktivácia dráhy LH-VTA dostatočná na podporu nutkavého hľadania sacharózy. Vzhľadom na to, že zreteľným rozdielom medzi drogou a prírodnou odmenou je, že odmena za drogu nie je pre prežitie nevyhnutná, vedú sa polemiky o tom, aké správanie by predstavovalo kompulzívne správanie pri hľadaní sacharózy alebo potravy. Alternatívnou interpretáciou našich údajov je, že aktivácia dráhy LH-VTA jednoducho zvyšuje motivačný pohon alebo nutkanie hľadať apetitívne posilňovače. Pretože sa miera obezity v posledných desaťročiach zvýšila (Mietus-Snyder a Lustig, 2008), sú prevládajúcim stavom nutkavé prejedanie sa a závislosť od cukru (Avena, 2007). Správanie pri kŕmení nasýtených (úplne kŕmených) myší po aktivácii dráhy LH-VTA pripomína stravovacie správanie pozorované u ľudí s diagnostikovanou kompulzívnou poruchou prejedania (alebo poruchou prejedania) (DSM-V).

Navrhuje sa, aby opakované akcie viedli k vytváraniu návykov, ktoré samy o sebe vedú k hľadaniu nutkavej odmeny, ktorá charakterizuje závislosť (Everitt a Robbins, 2005). Naše zistenie, že neuróny LH-VTA kódujú vstup do portu až po kondicionovaní, naznačuje, že táto dráha selektívne kóduje podmienenú odpoveď, nielen motivovanú akciu. To je v súlade s našimi pozorovaniami, že optická aktivácia tejto projekcie môže podporiť hľadanie kompulzívnej odmeny napriek negatívnym dôsledkom (Obrázok 5C), ako aj v neprítomnosti (ako je vidieť u satedovaných myší, Obrázok 5E). Táto interpretácia je ďalej podložená naším zistením, že fotoinhibícia dráhy LH-VTA selektívne znižuje nutkavé hľadanie sacharózy (Obrázok 5D), ale neznižuje kŕmenie myší s obmedzeným príjmom potravy (Obrázok 5F). Jednou z najväčších výziev pri liečbe kompulzívneho prejedania sa alebo nadmerného prejedania sa je riziko narušenia správania pri kŕmení všeobecne. Z translačného hľadiska sme mohli identifikovať špecifický nervový obvod ako potenciálny cieľ pre vývoj terapeutických zásahov pri kompulzívnom prejedaní alebo závislosti na cukre bez obetovania prirodzeného spôsobu stravovania.

Ukázali sme, že okrem glutamátergnej zložky LH-VTA (Kempadoo et al., 2013) existuje v projekcii aj významná zložka GABAergic (Leinninger et al., 2009) a že LH neuróny synapujú priamo na DA aj na GABA neuróny vo VTA (Obrázok 6). Existuje však rozdiel v rovnováhe excitačného / inhibičného vstupu na neuróny VTA DA a GABA.

Aj keď sme použili imunohistochemické spracovanie na overenie identity neurónov VTA, merali sme aj I_h, dovnútra usmerňujúci nešpecifický katiónový prúd aktivovaný hyperpolarizáciou (Lacey et al., 1989, Ungless a Grace, 2012). Prítomnosť tohto prúdu bola široko používaná v elektrofyziologických štúdiách na identifikáciu DA neurónov, ale ukázalo sa, že je prítomná iba v subpopuláciách DA neurónov vymedzených projekčným cieľom (Lammel et al., 2011). Aj keď už bolo v rámci preskúmania Fieldsom a kolegami navrhované, že „LH neuróny sa synchronizujú na projekcie VTA na PFC, ale nie na tie, ktoré premietajú na NAc“ (Fields et al., 2007), naše údaje naznačujú, že je potrebné túto kontroverziu znovu otvoriť na ďalšie vyšetrovanie. Aj keď sme pozorovali podmnožinu DA neurónov, ktoré dostávali čistú excitáciu z LH a vlastnili veľmi malú I_h (konzistentné s DA neurónmi premietajúcimi mPFC- alebo NAc), pozorovali sme tiež podskupinu DA neurónov, ktoré dostali čistý excitačný vstup a vykazovali veľké I_h (v súlade s charakteristikami DA neurónov vyčnievajúcich do bočného obalu NAc; Obrázok S5; Lammel a kol., 2011). Naopak, neuróny VTA DA, ktoré dostali čistý inhibičný vstup, vykazovali veľmi malé I_h alebo tento prúd postrádal, čo je v súlade s predstavou, že LH vysiela prevažne inhibičný vstup na VTA DA neuróny vyčnievajúce do mPFC alebo do mediálneho obalu NAc. Ukazujeme tiež, že vstupy LH možno pozorovať v mediálnej aj laterálnej VTA, čo naznačuje, že LH poskytuje vstupy do VTA neurónov s rôznymi cieľmi projekcie, pretože je známe, že cieľ projekcie VTA trochu zodpovedá priestorovému umiestneniu pozdĺž mediálnej-laterálnej osi ( Lammel a kol., 2008).

Úloha dráhy LH-VTA pri podpore odmeny sa predtým pripisovala glutamátergickému prenosu vo VTA (Kempadoo et al., 2013), pretože promótor CaMKIIα sa často považuje za selektívny pre neuróny excitačnej projekcie. Naše údaje však jasne ukazujú, že expresia ChR2 pod kontrolou CaMKIIα promótora sa zameriava aj na neuróny GABAergickej projekcie v LH (Obrázok 6).

Správanie vyvolané fotostimuláciou LH^GABA-VTA cesta bola šialená, nesprávne zameraná a maladaptívna (Film S4). Jedna interpretácia je, že aktivácia LH^GABA-VTA cesta vysiela signál myši, ktorý spôsobuje rozpoznávanie chuti do jedla. Alternatívny výklad je, že LH^GABA- Dráha VTA by mohla viesť k stimulačnému vývinu alebo intenzívnemu „túžbe“ v súlade so signálom, ktorý je základom podmieneného prístupu, ale na nefyziologickej úrovni, ktorá spôsobuje toto aberantné stravovacie správanie (Berridge a Robinson, 2003). V súlade s tým je možné, že aktivácia LH^GABA- Projekcia VTA v skutočnosti vytvára intenzívne pocity túžby alebo nutkanie kŕmiť sa. Naše experimenty však ukazujú, že aktivácia LH^GABA-VTA nespôsobuje zvýšenie kompulzívneho hľadania sacharózy, je to však pravdepodobne spôsobené nadmerným nahlodaním a aberantným správaním chuti zameraným na nepotravinové predmety v testovacej komore. Aj keď je ťažké určiť skúsenosť myši počas tejto manipulácie, je jasné, že správne zamerané správanie súvisiace s kŕmením vyžaduje koordinovanú aktiváciu GABAergických aj glutamatergických zložiek dráhy LH-VTA.

Optogenetické a farmakogénne manipulácie sú účinnými nástrojmi na nadviazanie kauzálnych vzťahov, neodhaľujú však endogénne fyziologické vlastnosti prvkov nervových obvodov. Naša štúdia zjednocuje informácie o synaptickej konektivite, prirodzene sa vyskytujúcej endogénnej funkcii a príčinnej úlohe dráhy LH-VTA a poskytuje novú úroveň vhľadu toho, ako sú informácie integrované v tomto obvode. Tieto výsledky zdôrazňujú dôležitosť skúmania funkčnej úlohy neurónov prostredníctvom konektivity, okrem genetických markerov. Neuróny LH-VTA selektívne kódovali činnosť pri hľadaní odmeny, ale nekódovali environmentálne stimuly, zatiaľ čo stimuly a odmeny predpovedajúce odmenu boli kódované diskrétnou populáciou neurónov LH po prúde od VTA. Ďalej sme identifikovali špecifickú projekciu, ktorá je kauzálne spojená s nutkavým správaním o sacharóze a kŕmení. Heterogenita v projekcii LH-VTA je nevyhnutná na zabezpečenie adaptívnej rovnováhy medzi motiváciou pri riadení a reguláciou správne riadeného chutného správania. Tieto nálezy poskytujú informácie týkajúce sa patologických stavov, ako je nutkavá porucha prejedania, závislosť od cukru a obezita