Dopamínové receptory D2 v závislosti od závislosti od dysfunkcie a kompulzívneho stravovania u obéznych potkanov (2010)

komentár: Táto štúdia demonštruje, že keď má zviera neobmedzený prístup, silný prírodný výstuž (veľmi stimulujúca potrava) môže spôsobiť pokles D2 receptorov. Tento pokles bol pozorovaný takmer u všetkých potkanov a došlo k nemu pomerne rýchlo. Keď sa odstránilo „veľmi chutné“ jedlo, potkany odmietli jesť normálne jedlo. Potkany pokračovali v záchvate záchvatu (keď mohli), a to aj napriek tomu, že spojili elektrické šoky s „veľmi chutnou“ konzumáciou potravy.

• Úplná štúdia

Nat Neurosci. 2010 May; 13(5): 635-641. Publikované online 2010 March 28. doi:  10.1038 / nn.2519

abstraktné

Zistili sme, že vývoj obezity bol spojený so vznikom progresívne sa zhoršujúceho deficitu v odozve nervových odmien. Podobné zmeny v homeostáze odmeňovania vyvolanej kokaínom alebo heroínom sa považujú za rozhodujúce pri spúšťaní prechodu z príležitostného na nutkavé užívanie drog. V súlade s tým sme zistili kompulzívne kŕmenie u obéznych, ale nie chudých potkanov, merané ako chutná spotreba potravy, ktorá bola odolná voči narušeniu averzívnym podmieneným stimulom. Receptory striatálneho dopamínu D2 (D2R) boli u obéznych potkanov znížené, ako bolo hlásené u ľudí závislých od liekov. Okrem toho, lentivírusom sprostredkované knockdown striatálnych D2R rýchlo zrýchlilo vývoj závislostí odmien závislých od závislosti a nástup nutkavého hľadania potravy u potkanov s rozšíreným prístupom k chutným potravinám s vysokým obsahom tuku. Tieto údaje dokazujú, že nadmerná konzumácia chutných potravín spúšťa neuroadaptívne reakcie podobné závislosti v mozgových okruhoch a poháňa rozvoj nutkavého jedenia. Bežné hedonické mechanizmy preto môžu byť základom obezity a drogovej závislosti.

úvod

Kŕmenie je ovplyvnené potešením a odmenou a získanie potravinovej odmeny môže účinne motivovať konzumáciu1, 2. Avšak hedonické mechanizmy prispievajúce k obezite zostávajú nedostatočne pochopené. U hyperfágnych ľudí s vrodeným nedostatkom leptínu sa aktivita v dorzálnom a ventrálnom striate, ktoré sú základnými zložkami obvodov odmeňovania mozgu, výrazne zvyšuje v reakcii na obrázky jedla3 a substitučná terapia leptínom zmierňuje aktivitu v striate aj „obľúbené“ jedlo3, ktoré si sami označujú4 . To naznačuje, že striatum je dôležité v hedonických aspektoch správania pri kŕmení. Nedávno sa ukázalo, že aktivácia striata v reakcii na vysoko chutné jedlo je u obéznych jedincov oslabená v porovnaní s chudými kontrolami2. Navyše, hypofunkcia dorzálneho striata a dlhodobé priberanie na váhe sú najvýraznejšie u jedincov s alelou TaqIA v lokusu génu DRD1 – ANKK2, čo vedie k zníženej striatálnej expresii D4R a bolo preukázané, že predisponujú jednotlivcov k poruchám látkovej závislosti5, 6 Tieto a podobné pozorovania viedli k návrhu, že deficity v spracovaní odmien môžu byť dôležitým rizikovým faktorom pre vznik obezity a že obézni jedinci môžu nutne konzumovať chutné jedlo na kompenzáciu hyposenzitivity odmienXNUMX. Je pozoruhodné, že nie je jasné, či sú nedostatky v spracovaní odmien konštitutívne a predchádzajú obezite, alebo či nadmerná konzumácia chutných jedál môže viesť k dysfunkcii odmien a tým prispieť k obezite vyvolanej stravou.

Definujúcou charakteristikou jednotlivcov s nadváhou a obezitou je, že sa aj napriek známym negatívnym zdravotným a sociálnym dôsledkom naďalej prejedávajú. Mnohí jedinci s nadváhou skutočne vyjadrujú túžbu obmedziť svoju spotrebu potravín, ale snažia sa kontrolovať svoj príjem a opakovane konzumujú viac ako ich energetické požiadavky. 7, 8. Vývoj stravovacieho správania, ktoré je necitlivé na negatívny výsledok, je analogické s nutkavým správaním užívania drog, ktoré je pozorované u narkomanov u ľudí, čo je podobne nepriepustné voči negatívnym následkom9. Skúmali sme účinky rozšíreného prístupu k chutnej diéte s vysokým obsahom tuku na citlivosť systémov odmeňovania mozgu u potkanov. Tiež sme skúmali súvislosť medzi diétou indukovanou hedonickou dysreguláciou a vznikom nutkavého hľadania potravy. Nakoniec sme skúmali úlohu striatálnych D2R v týchto reakciách správania závislých od závislosti.

Závislosti od závislostí od obetí u obéznych potkanov

Na testovanie účinkov obmedzeného alebo predĺženého prístupu k chutnej strave s vysokým obsahom tukov sme pripravili samcov potkanov Wistar (300 - 350 g) s bipolárnou stimulačnou elektródou v laterálnom hypotalame a podrobili ich samostatnému pokusu 10-14 dní. postup s prahovou odmenou za stimuláciu mozgu (BSR), kým nebudú stanovené stabilné prahové hodnoty pre odmeňovanie4. V postupe BSR potkany energicky reagujú na získanie odmeňujúcej sa elektrickej stimulácie prostredníctvom zavedenej stimulačnej elektródy, pričom minimálna stimulačná intenzita, ktorá udržuje samostimulačné správanie, sa nazýva prahová hodnota odmeny10. Pretože prahové hodnoty odmeny zostávajú stabilné a nezmenené po dlhšiu dobu v základných podmienkach, poskytuje tento postup citlivú mieru odozvy systémov odmeňovania v mozgu. Po stanovení stabilných prahových hodnôt BSR (definovaných ako <10% variácia prahových hodnôt počas troch po sebe idúcich sedení) sme krysy rozdelili do troch skupín, ktoré medzi skupinami nevykazovali žiadne rozdiely v priemerných telesných hmotnostiach alebo prahových hodnotách odmien. Tieto tri skupiny dostali rozdielny prístup k strave v „jedálni“ pozostávajúcej z chutného energeticky výdatného jedla ľahko dostupného na ľudskú spotrebu (pozri Online metódy). Potkany mali 0 h (potkany iba na kŕmenie; n = 9), 1 h (potkany s obmedzeným prístupom; n = 11) alebo 18–23 h (potkany s predĺženým prístupom; n = 11) prístup k strave denne počas 40 po sebe nasledujúcich dní. Je známe, že stravovanie v jedálni vedie u potkanov k obezite vyvolanej stravou11. Všetky potkany mali tiež ad libitum prístup k štandardnému laboratórnemu krmivu, pričom boli zaznamenané prahové hodnoty odmeňovania, prírastok hmotnosti a kalorický príjem.

Hmotnosť sa u potkanov výrazne zvýšila s rozšíreným prístupom k diéte v kaviarňach v porovnaní so skupinami s prístupom len pre zvieratá alebo s obmedzeným prístupom (obr. 1a). Hmotnosť tiež mala tendenciu zvyšovať sa u potkanov s obmedzeným prístupom v porovnaní s potkanmi, ktoré mali len chow-only, ale tento účinok nedosiahol štatistickú významnosť. Vývoj obezity u potkanov s predĺženým prístupom bol úzko spojený so zhoršením deficitu funkcie odmeňovania mozgu, čo sa prejavilo v progresívne zvýšených prahových hodnotách BSR (Obr. 1b). Pretože medzi tromi skupinami neboli pozorované žiadne rozdiely v latencii odozvy pre BSR (doplnkový obrázok 1), deficity v behaviorálnom výkone nemôžu byť pre toto pozorovanie zodpovedné. Podobný deficit vo funkcii odmeňovania mozgu bol zaznamenaný u potkanov s predĺženým, ale nie obmedzeným prístupom k intravenóznemu kokaínu alebo heroínu, ktorým sa podával 12, 13, 14. Rozšírený prístup k chutným potravinám s vysokým obsahom tukov môže teda vyvolať v závislosti od odmeny funkciu závislú od závislosti, ktorá je považovaná za dôležitý zdroj motivácie, ktorá môže viesť k prejedaniu a prispieť k rozvoju obesity1, 6.

Obrázok 1: dysfunkcia prírastku hmotnosti a odmeňovania u potkanov s rozšíreným prístupom k diéte do kaviarne.

a) Priemerný (± sem) prírastok hmotnosti u potkanov iba s chow, obmedzeným a rozšíreným prístupom (interakcia x deň: F39,702 7.9 = 0.0001, P <0.05; * P <78,1092 v porovnaní so skupinou s iba chow) post hoc test). (b) Priemerná (± sem) percentuálna zmena oproti východiskovým prahovým hodnotám odmeny (prístup × časová interakcia: F1.7 0.0005 = 0.05, P <XNUMX; * P <XNUMX v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test).

Keď sme podrobne skúmali správanie pri kŕmení (obr. 2), zistili sme, že celkový denný príjem kalórií bol podobný u potkanov s jedinou chrípkou a potkanov s obmedzeným prístupom (obr. 2a, d). Naproti tomu, celkový príjem kalórií u potkanov s predĺženým prístupom bol takmer dvojnásobný ako u potkanov s obmedzeným prístupom a potkanov, ktoré boli len pre jedincov (obr. 2a, d). Aj keď krysy s obmedzeným prístupom a len s jedlom si zachovávali približne rovnaký denný príjem kalórií (obr. 2a, d), krysy s obmedzeným prístupom získali iba ~ 33% svojich denných kalórií z krmiva (obr. 2b, d), čo naznačuje, že Vyvinuli správanie pri kŕmení podobné fazule a spotrebovali ~ 66% svojho denného kalorického príjmu počas svojho prístupu 1 h do kaviarne diet15 (Obr. 2d). Potkany s predĺženým prístupom získali len malú frakciu (~ 5%) z ich celkového príjmu kalórií (obr. 2b); konzumovali stravu v jedálni takmer výlučne (obr. 2d). Posun v preferenciách výživy v skupinách s obmedzeným a rozšíreným prístupom sa tiež prejavil vo výraznom zvýšení príjmu tukov v porovnaní s potkanmi s jedinou chow (obr. 2c a doplnkový obrázok 2). V súlade s predchádzajúcimi správami16, tam bola tendencia k spotrebe stravy v jedálni sa časom znižovať u potkanov s predĺženým prístupom. To môže odrážať vývoj tolerancie k chutnosti potravinových položiek poskytovaných ako súčasť stravy v kaviarni v priebehu času. Avšak u týchto potkanov zostala u potkanov (v doplnkovom obr. 3) preferencia pre stravovanie v jedálni oproti štandardnému krmivu. Tieto údaje dokazujú, že rozšírený, ale nie obmedzený prístup k chutnej diéte s vysokým obsahom tukov indukuje závislosť od odmeny, prejedanie a stratu energetickej rovnováhy homeostatickej energie. Naopak, obmedzený prístup k chutným potravinám vedie k náhlym vzorcom konzumácie, ale nenarušuje homeostatickú energetickú rovnováhu ani funkciu odmeňovania mozgu. Je však možné, že obmedzený prístup k jedálenke v kaviarni na viac ako 40 po sebe idúcich dní by vyvolal významný nárast hmotnosti a narušenie funkcie odmeňovania mozgu.

Obrázok 2: Spôsoby konzumácie u potkanov s rozšíreným prístupom k diéte v kaviarni.

a) Priemerný (± sem) denný kalorický príjem u potkanov iba s chow, obmedzeným a rozšíreným prístupom (prístup: F1,324 100.6 = 0.0001, P <18,324; čas: F7.8 0.0001 = 18,324, P <4.6; prístup × časová interakcia: F0.0001 0.05 = 2,504, P <349.1; * P <0.0001 v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test). b) Priemerný denný kalorický príjem (± sem) z potravy (prístup: F18,504 5.9 = 0.0001, P <36,504; čas: F 3.52 0.0001 = 0.05, P <2,486; prístup × časová interakcia: F118.7 0.0001 = 18,486, P <8.8; * P <0.0001 v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test). (c) Priemerný denný kalorický príjem (± sem) z tuku (prístup: F36,486 6.2 = 0.0001, P <0.05; čas: F40 2,54 = 25.0, P <0.0001; prístup × časová interakcia: F2,54 1235.2 = 0.0001, P <2,54; * P <485.7 v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test). d) Porovnanie priemerného (± sem) celkového kalorického príjmu a kalórií spotrebovaných výlučne z potravy počas celého 0.0001-denného obdobia prístupu (prístup: F0.001 = 0.001, P <XNUMX; zdroj kalórií: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; prístup × interakcia zdroja kalórií: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; *** P <XNUMX v porovnaní s celkovými kalóriami v skupine s iba chow, ### P <XNUMX v porovnaní s celkovými kalóriami v rovnaká skupina potkanov, post hoc test).

Po 40 dňoch už potkanom nebol povolený prístup k chutnej strave, ale naďalej mali prístup podľa potreby ad libitum k štandardnému laboratórnemu krmivu. Denne sme počas tohto vynúteného obdobia „abstinencie“ hodnotili hraničné hodnoty odmien a spotrebu. Zvýšenie prahových hodnôt odmeny pretrvávalo najmenej 2 týždne u potkanov s rozšíreným prístupom, keď už nemali prístup k chutnej strave (obr. 3a). To kontrastuje s relatívne prechodnými (~ 48 h) deficitmi vo funkcii odmeňovania hlásenými u potkanov, ktorí abstinovali od kokaínu, ktorý si podával sám13. Taktiež došlo k výraznému zníženiu kalorického príjmu (obr. 3b) a postupnému znižovaniu telesnej hmotnosti (obr. 3c) u potkanov s rozšíreným prístupom a v menšej miere u potkanov s obmedzeným prístupom počas tohto obdobia abstinencie, v súlade s predchádzajúce správy11, 15. Po 14 dňoch abstinencie boli potkany usmrtené a umiestnenie elektród bolo stanovené farbením kresylovou fialovou farbou (obr. 3d).

Obrázok 3: Pretrvávajúca dysfunkcia odmeňovania a hypofágia počas abstinencie u potkanov s rozšíreným prístupom k diéte do kaviarne.

a) Priemerná percentuálna zmena oproti východiskovým prahovým hodnotám odmeny (± sem) počas abstinencie od chutnej stravy s vysokým obsahom tukov (prístup: F2,112 3.7 = 0.05, P <4,112; čas: F 2.3 0.05 = 0.05, P> 14; * P <2,168 v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc testom). (b) Priemerný kalorický príjem (± sem) v posledný deň prístupu k diéte s vysokým obsahom tukov (východisková hodnota) a počas 41.7 dní abstinencie, keď bol k dispozícii iba štandardný žrádlo (prístup: F0.0001 6,168 = 65.6, P <0.0001 ; čas: F12,168 38.3 = 0.0001, P <0.05; prístup × časová interakcia: F14 = 1,126, P <37.2; * P <0.0001 v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test). c) Zmena priemernej telesnej hmotnosti (± sem) v porovnaní s telesnou hmotnosťou v posledný deň prístupu k diéte s vysokým obsahom tukov (východisková hodnota) a počas 7,126 dní abstinencie, keď bol k dispozícii iba štandardný žrádlo (prístup: F3.1 0.01) = 7,126, P <40.9; čas: F0.0001 = 0.05, P <XNUMX; prístup × časová interakcia: FXNUMX = XNUMX, P <XNUMX; * P <XNUMX v porovnaní so skupinou iba s chow, post hoc test). (d) Histologická rekonštrukcia umiestnenia BSR stimulujúcich elektród v bočnom hypotalame potkanov iba pre chow (trojuholníky), obmedzeného prístupu (štvorce) a predĺženého prístupu (kruhy).

Striatálne D2R u obéznych potkanov: úloha pri deficite odmeňovania

Ďalej sme testovali hypotézu, že nadmerná konzumácia chutnej stravy v jedálni môže znížiť striatálnu hustotu D2R a prispieť k rozvoju hyposenzitivity odmien podobnej závislosti. Novej skupine potkanov iba s chow, obmedzeným a rozšíreným prístupom bol povolený prístup k strave do bufetu, kým nedošlo k štatisticky významnému zvýšeniu telesnej hmotnosti u potkanov s rozšíreným prístupom v porovnaní so skupinou, ktorá mala iba chow (P <0.05 ; Obr. 4a). Striatálna expresia údajne silne glykozylovanej (~ 70 kDa) formy D2R viazanej na membránu bola nižšia u potkanov s rozšíreným prístupom ako u potkanov s obmedzeným prístupom alebo iba s chow (obr. 4b; pozri online metódy). Keď sme potkany v každej prístupovej skupine rozdelili do dvoch podskupín na základe mediánu rozdelenia telesnej hmotnosti (ľahkej alebo ťažkej), našli sme jasný inverzný vzťah medzi telesnou hmotnosťou a striatálnou expresiou D2R (obr. 4a, c). Nezistili sme žiadne štatisticky významné zníženia expresie neglykozylovaných nezrelých (~ 39 kDa) a stredne glykozylovaných cytoplazmatických (~ 51 kDa) foriem D2R (doplnkový obrázok 4) 17, čo naznačuje, že striatálna expresia D2R u potkanov s rozšíreným prístupom je pravdepodobne regulované post-transkripčnými mechanizmami.

Obrázok 4: Prírastok hmotnosti je nepriamo úmerný hladinám striatálneho D2R.

(a) Krysy iba s chowom, obmedzeným prístupom a rozšíreným prístupom sa rozdelili do dvoch skupín na každú podmienku prístupu na základe stredného rozdelenia telesnej hmotnosti: ľahké (L) alebo ťažké (H). (b) Celý striatálny komplex sa zhromaždil od všetkých potkanov a hladiny D2R v každej skupine sa merali westernovým prenosom. Pás spojený s membránou D2R bol rozlíšený pri 70 kDa a kontrola nanášania proteínu je zobrazená nižšie (p-aktín, 43 kDa). Plnohodnotné imunobloty sú znázornené na doplňujúcom obrázku 12. (c) Relatívne množstvá D2R v striate potkanov, ktoré majú iba chow, obmedzený prístup a predĺžený prístup, boli kvantifikované denzitometriou (F2,6 = 5.2, P <0.05, hlavné efekt prístupu; * P <0.05 a ** P <0.01 v porovnaní so skupinou s chow-only-L).

Na testovanie funkčnej relevancie redukcie striatálneho D2R vyvolaného diétou na funkciu odmeňovania mozgu sme navrhli a overili lentivírusový vektor na dodanie krátkej vlásenkovej interferujúcej RNA (shRNA), aby sme mohli poraziť D2R (Lenti-D2Rsh; Obr. 1). 5 a doplnkový obrázok 5). Prahové hodnoty odmien začali vzrastať u potkanov liečených Lenti-D2Rsh takmer okamžite po tom, čo im bol povolený rozšírený prístup k jedálenskej jedálni, zatiaľ čo prahy odmeňovania zostali nezmenené u potkanov s predĺženým prístupom liečených prázdnym vektorom lentivírusu (Lenti-control) počas relatívne krátkeho obdobia. prístupu k jedálenskej jedálni (14 d; obr. 6a). Reakčné latencie sa nezmenili v oboch skupinách potkanov, čo dokazuje, že tento účinok nebol sekundárny k deficitom pri výkone úlohy (doplnkový obrázok 6). Prahové hodnoty odmeňovania sa tiež nezmenili u potkanov liečených Lenti-D2Rsh alebo Lenti-control, ktoré mali prístup ku krmivu len počas rovnakého obdobia (Obr. 6b).

Prahové hodnoty zostali trvalo zvýšené počas extra 15 d abstinencie, keď všetky potkany mali prístup iba k štandardnému krmivu (doplnkový obrázok 7). Knockdown striatálneho D2R teda zvýšil zraniteľnosť voči hypofunkcii vyvolanej diétou, ale nezmenil základnú aktivitu systémov odmeňovania mozgu.

Obrázok 5: Lentivírusom sprostredkované knockdown expresie striatálneho D2R.

(a) Grafické znázornenie striatálnych oblastí, v ktorých bol nadmerne exprimovaný Lenti-D2Rsh. Zelené kruhy v ľavej striatálnej hemisfére predstavujú miesta, na ktoré boli zamerané vírusové infúzie. Zelené farbenie v pravej striatálnej hemisfére je reprezentatívnym imunochemickým farbením zeleného fluorescenčného proteínu (GFP) z mozgu potkana Lenti-D2Rsh. (b) Reprezentatívny imunoblot zníženej expresie D2R v striate potkanov Lenti-D2Rsh. Plnohodnotné imunobloty sú uvedené na doplňujúcom obrázku 13. (c) Relatívne množstvá D2R v striate Lenti-control a Lenti-D2Rsh potkanov, kvantifikované denzitometriou (* P <0.05 v porovnaní s Lenti-kontrolnou skupinou, post hoc test) ). (d) Infekcia gliových buniek v striate vektorom Lenti-D2Rsh sa nezistila. Zeleným farbením je GFP z vírusu; červená je marker astrocytov gliálny fibrilárny kyslý proteín (GFAP); bunkové jadrá sú zvýraznené DAPI farbením na modro. Biele šípky označujú lokalizovanú oblasť gliózy nachádzajúcu sa iba v mieste vpichu vírusu do striata a nie do okolitých tkanív, do ktorých vírus difundoval. Ani v tejto oblasti nie je žiadny z astrocytov pozitívny na GFP. Žlté šípky na zväčšenom obrázku zvýrazňujú typické GFP-negatívne astrocyty, ktoré boli detekované. (e) Vysoká hladina neuronálnej infekcie v striate vektorom Lenti-D2Rsh. Zeleným farbením je GFP z vírusu; červená je neurónový jadrový marker NeuN; bunkové jadrá sú zvýraznené DAPI farbením na modro. Žlté šípky na zväčšenom obrázku zvýrazňujú GFP-pozitívne a NeuN-pozitívne neuróny v striate. (f) Obrázok vírusu infikovaného (GFP-pozitívneho) neurónu vo striate potkanov Lenti-D2Rsh s väčším zväčšením, ktorý ukazuje typické morfologické znaky stredne ostnatých neurónov.

Obrázok 6: Knockdown striatálneho D2R zvyšuje zraniteľnosť pri odmeňovaní dysfunkcie u potkanov s rozšíreným prístupom k diéte do kaviarne.

(a) Priemerná (± sem) percentuálna zmena oproti východiskovým prahovým hodnotám odmeny u potkanov Lenti-control a Lenti-D2Rsh, ktorí rozšírili prístup k diéte v bufete po dobu 14 po sebe nasledujúcich dní (vírus: F1,156 5.9 = 0.05, P <13,156; čas: F2.2 = 0.05, P <13,156; interakcia vírus × čas: F2.2 = 0.05, P <0.05; #P <2, účinok interakcie). (b) Priemerná (± sem) percentuálna zmena od základných prahových hodnôt odmeny u potkanov Lenti-control a Lenti-D14Rsh, ktoré mali prístup iba k chow. c) Priemerný (± sem) kalorický príjem potkanov iba počas 2,28 dní po podaní alebo predĺžený prístup (prístup: F135.6 = 0.0001, *** P <14). (d) Priemerný (± sem) prírastok hmotnosti iba počas 2,28 dní chow alebo predĺženého prístupu (prístup: F96.4 = 0.0001, P <0.001; *** P <XNUMX, hlavný efekt prístupu).

Zistili sme, že kalorický príjem (obr. 6c) a prírastok hmotnosti (obr. 6d) boli podobné v Lenti-D2Rsh a zodpovedajúcich Lenti-kontrolných skupinách v podmienkach len s chow alebo rozšíreným prístupom (doplnkové obrázky 8 a 9). Takže striatálne D2R knockdown nezmenilo ani preferenciu pre stravovanie v jedálni, ani celkový príjem kalórií, keď bolo chutné jedlo voľne dostupné na konzumáciu.

Kompulzívna strava u obéznych potkanov: úloha striatálneho D2R

Ďalej sme testovali hypotézu, že u potkanov by mohlo dôjsť ku kompulzívnemu jedlu s rozšíreným prístupom k stravovaniu v bufete a že k tomuto efektu môže prispieť deficit striatálnej D2R signalizácie. Nová skupina potkanov iba pre chow, obmedzený prístup a predĺžený prístup mala povolený prístup k strave do bufetu po dobu> 40 dní, kým u predĺžených potkanov nedošlo k štatisticky významnému zvýšeniu hmotnosti (P ​​<0.05 v porovnaní s iba potkanmi; údaje nie sú zobrazené). Všetky tri skupiny potkanov potom mali povolený iba 30-minútový prístup do jedálnička v jedálni po dobu 5–7 dní v operačnej komore, kým nebol dosiahnutý stabilný príjem (definovaný ako <10% zmena denného príjmu). Polovica potkanov v každej podmienke prístupu bola potom vystavená svetlu (podmienený stimul) spárovanému s výbojmi nôh (potrestaná skupina), zatiaľ čo zostávajúce potkany v každej skupine boli vystavené pôsobeniu svetla pri absencii šoku z chodidla (nepotrestaná skupina) ). V testovací deň sme skúmali účinky samotnej expozície svetlu na chutnú konzumáciu potravy (obr. 7; pozri online metódy). Zistili sme, že priemerný kalorický príjem počas 30-minútových základných relácií bol vyšší u potkanov, ktoré mali iba chow a obmedzený prístup, ako u potkanov s rozšíreným prístupom (obr. 7a, b). To naznačuje, že potkany, ktoré majú iba krmivo a majú obmedzený prístup, prilákali na chutné jedlo počas prerušovaných 30-minútových prístupov, čo sa prejavilo v skutočnosti, že tieto potkany konzumovali ~ 40–50% ich denného kalorického príjmu, zvyčajne ~ 100 kCal, počas týchto sedení (obr. 7a, b). Naproti tomu sa potkany s rozšíreným prístupom zdajú rezistentné voči rozvoju tohto nárazového správania pri kŕmení, možno preto, že ich história takmer neobmedzeného prístupu k chutnému jedlu počas> 40 po sebe nasledujúcich dní stanovila stravovacie vzorce, ktoré sa dali relatívne nepružne meniť. V deň testu sme nezaznamenali štatisticky významné účinky opakovania svetelného signálu na konzumáciu potravy u nepotrestaných potkanov zo skupín s chow-only, s obmedzeným prístupom alebo s rozšíreným prístupom v porovnaní s príjmom počas základnej periódy (obr. 7a). Samotné signálne svetlo preto nemalo žiadny motivačný význam. U potrestaných potkanov nárazovo spárované signálne svetlo významne znížilo chutný príjem potravy u potkanov, ktoré slúžili iba k chovu a s obmedzeným prístupom. Kontrolné svetlo však nemalo žiadny vplyv na chutný príjem potravy u potkanov s rozšíreným prístupom, čo ukazuje, že ich konzumácia bola necitlivá na averzné indikátory prostredia predpovedajúce nepriaznivé účinky. Základný energetický príjem u potkanov s rozšíreným prístupom bol nižší ako v ostatných skupinách. Pretože však príjem potravy počas podobných časových období bol oveľa nižší (obr. 7d), je nepravdepodobné, že by to predstavovalo „minimálny efekt“, ktorý by zmaril naše zistenia. Naše údaje spoločne podporujú myšlienku, že u potkanov s rozšíreným prístupom sa môže objaviť kompulzívne stravovacie správanie analogickým spôsobom ako pri nutkavom kokaíne pozorovanom u potkanov s predĺženým prístupom k droge18.

Obrázok 7: Kompulzívna reakcia na chutné jedlo.

(a) Priemerná (± sem) chutná spotreba stravy u nepotrestaných potkanov počas 30-minútových základných stretnutí a v testovací deň, keď boli potkany vystavené neutrálnemu podmienenému stimulu, ktorý nebol predtým spárovaný so škodlivým šokom z chodidla (prístup: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 v porovnaní s potkanmi iba s chow). (b) Priemerná (± sem) chutná spotreba stravy u potrestaných potkanov počas 30-minútových základných stretnutí a v testovací deň, keď boli potkany vystavené podmienenému stimulu, ktorý bol predtým spárovaný so škodlivým šokom z chodidla (prístup: F2,21 = 3.9 , P <0.05; narážka: F1,21 = 8.6, P <0.01; interakcie × narážka: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 v porovnaní s príjmom počas základnej relácie, # P <0.05 v porovnaní s iba potkany). (c) Priemerná (± sem) chutná spotreba stravy počas 30-minútových základných stretnutí a v testovací deň u potkanov Lenti-control a Lenti-D2Rsh, ktoré mali predtým iba čau alebo predĺžený prístup k jedálni v bufete (narážka: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 v porovnaní s príjmom počas základných relácií, post hoc test). (d) Priemerná (± sem) spotreba potravy počas 2-minútových základných relácií a v deň testu u potkanov Lenti-control a Lenti-D1,26Rsh, ktoré predtým mali iba jedlo alebo predĺžený prístup k jedálni v jedálni (narážka: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX v porovnaní s príjmom počas základných sedení, post hoc test).

Nakoniec sme skúmali účinky podmieneného stimulu spárovaného s trestom na príjem potravy u potkanov Lenti-control a Lenti-D2Rsh, ktoré mali predtým prístup iba k chow alebo predĺžený prístup k strave do bufetu (potkany z obr. 6). Zistili sme, že základný chutný príjem potravy počas 30-minútových základných relácií bol podobne vysoký (~ 40 kCal) vo všetkých štyroch skupinách (obr. 7c). Okrem toho bola celková denná spotreba krmiva (v domácej klietke) podobná medzi všetkými štyrmi skupinami potkanov počas kondičných cvičení a v testovací deň (doplnkový obrázok 10). 14 dní predchádzajúceho prístupu k jedálni v jedálni preto nebolo dostatočné na blokovanie chovania podobného prejedaniu sa podobným spôsobom, aký sa pozoruje u potkanov, ktorí mali o 40 dní predĺžený prístup k jedálni v jedálni (obr. 7a, b). Averzívny stimul svetelného stimulu narušil chutný príjem potravy u potkanov Lenti-control a Lenti-D2Rsh, ktoré mali predtým prístup iba k chow (obr. 7c). Podobne averzný podmienený stimul narušil chutný príjem potravy u potkanov s kontrolou Lenti, ktorí mali predtým o 14 dní predĺžený prístup k jedálničeku v jedálni. Naopak, averzný podmienený stimul nemal žiadny vplyv na chutnú konzumáciu potravy u potkanov Lenti-D2Rsh, ktoré mali predtým o 14 dní predĺžený prístup k jedálni v jedálni (obr. 7c). Prahové hodnoty BSR zostali u týchto potkanov významne zvýšené, keď sa zaznamenali 48 hodín po testovaní, zatiaľ čo prahy zostali stabilné a nezmenené v ďalších troch skupinách potkanov

(Doplnkový obrázok 11). Aby sme overili, že rezistencia voči podmienenému podnetu vyvolanému potlačeniu chutného príjmu potravy v potkanoch Lenti-D2Rsh s rozšíreným prístupom nebola sekundárna voči poškodeniam v klasických procesoch kondicionovania, testovali sme účinky averzívneho podmieneného stimulu na spotrebu menej chutného štandardného krmiva všetky štyri skupiny potkanov. Na rozdiel od konzumácie chutného jedla, ktorá je podobná flámskej nákaze, sme zistili, že všetky štyri skupiny potkanov spotrebovali malé množstvo potravy (2 kCal) počas základných vyšetrení 30 min (Obr. 7d) a príjem potravy bol prerušený vo všetkých štyroch skupinách. podobnú veľkosť po vystavení averzívnemu podmienenému stimulu (obr. 7d). Tieto údaje demonštrujú, že knockdown striatálnych D2R výrazne zrýchlil vznik nutkavého jedenia chutných potravín, ale iba u potkanov s históriou rozšíreného prístupu. Navyše, pretože nutkavé stravovanie bolo detegované len u potkanov Lenti-D2Rsh, ktoré mali zvýšené prahy BSR, hypofunkcia vyvolaná diétou môže byť nevyhnutným krokom k vzniku nutkavého hľadania potravy.

Diskusia

Ľahký prístup k chutným potravinám s vysokým obsahom tuku sa považuje za dôležitý environmentálny rizikový faktor pre obesity19. Zistili sme, že rozšírený prístup k vysoko chutnej strave v kaviarňach viedol k prejedaniu a nárastu hmotnosti v spojení s progresívnym zvyšovaním prahov BSR u potkanov. Tento vplyv na prahy BSR možno vysvetliť postupným znižovaním citlivosti okruhov odmeňovania mozgu, čo je v súlade so skutočnosťou, že obmedzenie potravy a úbytok hmotnosti môže vzrásť20, zatiaľ čo akútne prekrmovanie môže prechodne znížiť 21, reagujúc na BSR u potkanov. Toto zistenie predstavuje rozšírenie práce, ktoré ukazuje, že akútne prekrmovanie potkanov prostredníctvom intragastrickej kŕmnej trubice21 a infúzia žalúdka alebo intravenózna infúzia glukagónu, ktorá napodobňuje postprandiálnu satiety22, 23, 24, znižuje odpoveď na odmeňovanie laterálnej hypotalamickej BSR a zvyšuje reakcie podobné averzii na stimulation25. Predchádzajúca práca tiež ukázala, že opakované násilné kŕmenie potkanov intragastrickými skúmavkami, až kým sa ich hmotnosť nezvýši o 200 g, podobne znižuje rýchlosť reakcie na BSR, účinok, ktorý pretrváva až do normalizácie telesnej hmotnosti23. Podobne ako v týchto zisteniach u potkanov, reakcia u mačiek na laterálnu hypotalamickú BSR bola inhibovaná predchádzajúcim kŕmením satiation26, čo ukazuje, že interakcie medzi funkciou odmeňovania mozgu a metabolickým stavom sú zachované, a preto sa pravdepodobne vyskytujú aj u ľudí. Jednoduchý prístup a následné prejedanie jedál v štýlovom stravovacom zariadení u ľudí sa považuje za dôležitého environmentálneho prispievateľa k súčasnej epidémii obezity v západnej spoločnosti. Naše údaje ukazujú, že hypofýza odmeňovania vzniká u potkanov, ktoré dobrovoľne prekonávajú chutnú stravu v jedálni podobnú tej, ktorú konzumujú ľudia, a že tento efekt sa postupne zhoršuje, keď získavajú väčšiu váhu. Pozoruhodne, všetky potkany s výškou odmeny ≥19% mali BSR elektródy umiestnené v rozmedzí ~ 20 μm fornix dorsolaterally. Citlivosť neurónov súvisiacich s odmenou v tejto oblasti sa zvyšuje potravinovým obmedzením spôsobom, ktorý je citlivý na hormón leptín odvodený z tukov, a táto oblasť mozgu sa považuje za dôležitý substrát pre potravinovú odmenu500. Mozgové okruhy, ktoré regulujú hédonizmus potravy, sú preto inhibované signálmi po pôrode, ktoré predpovedajú sýtosť, čo je v súlade s nedávnymi štúdiami zobrazovania na ľuďoch, ktoré ukazujú, že distinácia žalúdka 27 a postprandiálny peptid YY28-3 (PYY) 36 (PYY) 29 modulujúci črevné črevné stavy modulujú aktivitu oblastí mozgu zapojené do spracovania odmien. Navyše, systémy odmeňovania sú tiež inhibované nadmerným nárastom hmotnosti. Nedávne správy ukazujú, že cirkulujúci leptín, kľúčový regulátor energetickej bilancie, môže preniknúť do mozgových tkanív a inhibovať aktivitu odmeňovacích obvodov3, 27, 30, 31.

Deficity odmien u potkanov s nadváhou môžu odrážať kontraadaptívne poklesy základnej citlivosti obvodov mozgových odmien, aby sa zabránilo ich nadmernej stimulácii chutným jedlom. Takáto hypofunkcia odmeny vyvolaná diétou môže prispieť k rozvoju obezity zvýšením motivácie konzumovať „obezitogénne“ diéty s vysokou odmenou, aby sa zabránilo alebo zmiernilo tento stav negatívnej odmeny6, 32. To by mohlo zodpovedať za hypofágiu, ktorú sme pozorovali v rozšírenom prístupe potkanov a v menšej miere u potkanov s obmedzeným prístupom, keď sa odobralo chutné jedlo a k dispozícii bolo iba menej chutné jedlo. Takýto scenár je v súlade aj s údajmi zo štúdií zobrazovania ľudského mozgu, v ktorých je tlmená aktivácia striata v reakcii na vysoko chutné jedlo, najmä u jedincov s genetickými polymorfizmami, o ktorých sa predpokladá, že znižujú expresiu D2R v striate, spojená s dlhodobým prírastkom hmotnosti4. Nie je jasné, či sa takáto hyposenzitivita odmeny u obéznych jedincov prejavuje pred rozvojom obezity a súvisí výlučne s genetickými faktormi („syndróm nedostatku odmeny“), alebo či prejedanie môže spôsobiť narušenie spracovania odmeny. Naše údaje ukazujú, že rozšírený prístup k chutným vysokoenergetickým potravinám a následné prejedanie sa otupujú odmeňujú citlivosť, a preto môžu predstavovať dôležitý hedonický mechanizmus, ktorý podporuje rozvoj obezity. Podobná dysfunkcia odmien, aká sa tu uvádza u obéznych potkanov, sa zistí aj u potkanov s anamnézou predĺženého prístupu k intravenóznemu podávaniu kokaínu alebo heroínu, ale nie u tých, ktorí majú anamnézu obmedzeného prístupu12, 13, 14. Okrem toho prechod z Bolo navrhnuté, že príležitostné až nutkavé hľadanie drog je výsledkom pokusu o zmiernenie pretrvávajúceho stavu zníženej odmeny vyvolanej touto dysfunkciou odmeny vyvolanej drogami12, 32, 33. Naše údaje teda naznačujú, že obezita a drogová závislosť môžu zdieľať základné hedonické mechanizmy.

Downregulácia expresie striatálneho D2R je významnou neuroadaptívnou odpoveďou na nadmernú konzumáciu chutných potravín. Skutočne, redukcia v striatálnej D2R hustote je pozorovaná u jednotlivcov s nadváhou4, 34 a rodents35, 36. Naopak, jedinci s mentálnou anorexiou majú zvýšené striatálne D2R37 a úbytok hmotnosti u obéznych jedincov po operácii bariatrického (gastrického bypassu) je spojený so zvýšeným striatálnym D2R density28. Polymorfizmus génu označovaný ako alela TaqIA A1 má za následok zníženú hustotu striatálneho D2R a jednotlivci s touto alelou sú nadmerne zastúpení v obéznych populáciách4. Alela TaqIA tiež zvyšuje zraniteľnosť voči alkoholu, opioidom a psychomotorickým stimulantom addiction38. Zníženie hustoty striatálneho D2R, ku ktorému dochádza buď prostredníctvom konštitutívnych genetických faktorov alebo ako dôsledok prejedania, môže preto prispieť k neurobiologickým mechanizmom obezity. Zistili sme, že striatálne hladiny izoformy 70 kDa D2R, o ktorej sa predpokladá, že odrážajú membránovo asociovanú D2R, boli nepriamo úmerné telesnej hmotnosti u potkanov zo skupín s obmedzeným prístupom a len s obmedzeným prístupom (obr. 4). Knockdown expresie striatálneho D2R, najvýraznejšie v dorsolaterálnom striate (obr. 5), spôsobil, že prahy BSR sa zvýšili takmer okamžite po vystavení jedálnicovej strave. Zníženie expresie striatálneho D2R teda rýchlo zrýchlilo vznik hypofunkcie u potkanov s rozšíreným prístupom k vysoko chutným potravinám, čo je výsledok, ktorý je v súlade s údajmi zobrazovania ľudských mozgových buniek, ktoré naznačujú, že deficity v striatálnej D2R hustote prispievajú k odmeňovaniu hypofunkcie u obéznych jedincov.

Pozoruhodné sú aj tri vlastnosti potkanov Lenti-D2Rsh. Po prvé, aj keď striatálne D2R knockdown v kombinácii s rozšíreným prístupom k chutnej strave viedlo k zvýšeniu prahov BSR, neboli u týchto potkanov žiadne rozdiely v kalorickom príjme alebo prírastku hmotnosti v porovnaní s kontrolnými potkanmi. To by mohlo odrážať skutočnosť, že potkany mali iba 14 d prístupu k jedálenskej jedálni; dlhšia doba prístupu mohla mať za následok vyšší nárast hmotnosti v priebehu času, podobne ako vyššia citlivosť na prírastok hmotnosti pozorovaná u ľudí s deficitmi v striatálnom D2R signalizácii4. Výhodou obmedzenia prístupu k diéte do kaviarne len na 14 d je však to, že jediní, ktorí vykazujú zvýšené hladiny BSR, sú jedinci, ktorí majú knockdown potkany s rozšíreným prístupom, a to nám umožnilo posúdiť potenciálnu úlohu hypofunkcie odmeňovania pri rozvoji kompulzívnosti. jesť (pozri nižšie). Po druhé, prahy BSR zostali stabilné a nezmenené u potkanov s knockdown, ktoré mali prístup len k chow. To naznačuje, že znížená expresia samotného striatálneho D2R nebola dostatočná na vyvolanie hyposenzitivity odmeňovania; Zdalo sa však, že interaguje s nadmernou spotrebou chutných potravín na urýchlenie vzniku tohto stavu zníženej citlivosti na odmenu. Iné adaptívne reakcie v okruhoch odmeňovania mozgu by preto mohli vyvolať odplatu hyposenzitivity u potkanov s rozšíreným prístupom k diéte v jedálni. S týmto vedomím si všimneme, že agonista brómkriptínu D2R znižuje hladiny cirkulujúceho leptínu39 a leptín inhibuje kŕmenie aspoň čiastočne inhibíciou striatálnych oblastí, ktoré kontrolujú hedonické odpovede na food3, 30, 31. Je teda možné, že downregulácia striatálneho D2R v reakcii na zvyšujúcu sa telesnú hmotnosť zvyšuje signalizáciu leptínu a tým zvyšuje inhibičné účinky tohto adipokínu na systémy odmeňovania mozgu. Nakoniec sme si všimli, že sme namierili naše lentivírusové vektory na dorsolaterálne striatum. Toto bolo primárne z technických dôvodov, pretože laterálne umiestnenie kanyly na dodávanie vírusu do striata nám umožnilo aj umiestnenie stálej hypotalamickej stimulačnej elektródy na stanovenie prahovej hodnoty BSR. Je teda možné, že zacielenie D2Rs na knockdown v iných oblastiach striata, najmä dorsomediálnych a ventrálnych oblastí (coreus accumbens core a shell), by mohlo mať zvýšené prahy BSR dokonca aj v neprítomnosti chutnej stravy.

Dorzolaterálne striatum bolo výrazne zapojené do učenia sa typu zvyku typu stimul-reakcia, čo sa prejavilo vo vývoji konzumného správania, ktoré je necitlivé na devalváciu predchádzajúcim napájaním na nasýtenie alebo spárovaním so škodlivými stimulmi40. Zameraním prevažne na dorzolaterálne striatum by sme mohli zraziť populácie D2R, ktoré regulujú citlivosť potkana na vývoj nutkavého stravovania. V súlade s úlohou striatálnych D2R v kompulzívnom správaní je alela TaqIA ľudského lokusu génu DRD2 – ANKK1 - ktorá vedie k nízkej striatálnej denzite D2R5, tlmí striatálnu aktiváciu v reakcii na chutné jedlo4 a zvyšuje náchylnosť k obezite4 - je tiež spojená s deficity v učení sa vyhýbať sa činom s negatívnymi dôsledkami41. Strata inhibičnej kontroly nad správaním, ktorá môže mať negatívny výsledok, je charakteristickým znakom obezity aj drogovej závislosti, v ktorej konzumné správanie pretrváva aj napriek negatívnym sociálnym, zdravotným alebo finančným dôsledkom. Chovanie pri užívaní kokaínu u potkanov s anamnézou rozsiahleho užívania drog sa môže stať nepružným a odolným proti narušeniu averzívnym podmieneným stimulom, ktorý predpovedá negatívny výsledok (šok na nohe) 18. Podobne myši, ktoré predtým mali prístup k chutnej strave s vysokým obsahom tukov, strávia viac času v averzívnom prostredí (jasne osvetlenom) na získanie chutného jedla ako myši, ktoré s diétou nemali skúsenosti42. Zistili sme, že chutná konzumácia potravy u potkanov s rozšíreným prístupom k stravovaniu v bufete bola podobne necitlivá na averzný podmienený stimul. V súlade s úlohou striatálnych D2R v tomto zmysle bolo nájdené kompulzívne stravovanie u striatálnych potkanov D2R, ktoré predtým mali 14 d predĺžený prístup k jedálni bufetu, ale nie v kontrolných skupinách. Z hľadiska neurocirkulácie môže rozšírený prístup k chutnému jedlu vyvolať plastickosť kortikostriatálnych dráh, čo spôsobí, že zvieratá budú zraniteľnejšie voči vývoju kompulzívneho správania, pričom tento proces zvyšuje deficit striatálnej D2R signalizácie. Znížená striatálna hustota D2R u obéznych jedincov skutočne koreluje so zníženým metabolizmom v prefrontálnych a orbitofrontálnych kortikálnych oblastiach43, ktoré majú inhibičnú kontrolu nad správaním44.

Pozoruhodne, kompulzívna konzumácia chutného jedla bola zistená len u potkanov, ktorí mali predtým prístup k jedálenke v kaviarni, nie u kontrolných potkanov, ktorí mali v rovnakom časovom období prístup k diéte v kaviarni, ani u potkanov s knockdown, ktoré mali prístup len pre chow. Hlavný rozdiel medzi knockdown potkanmi s predchádzajúcim rozšíreným prístupom a ostatnými skupinami bol ich trvalo zvýšený prah BSR. To by mohlo odrážať spoločné neurobiologické príčiny hypofunkcie odmeňovania a vznik nutkavého jedenia, ktoré sú časovo zhodné a zároveň nezávislé javy. Prípadne môže hypofunkcia vyvolaná diétou slúžiť ako substrát pre negatívne zosilnenie, ktoré uľahčuje rozvoj nutkavého jedenia 14, 32, 33. Bez ohľadu na základné mechanizmy, naše zistenia ukazujú, že závislosť-ako kompulzívna odpoveď na chutné jedlo môže objaviť u obéznych potkanov, a naznačujú, že deficity v striatálnej D2R signalizácia zvýšiť zraniteľnosť k rozvoju tohto správania.

Stručne povedané, zistili sme, že nadmerná stimulácia systémov odmeňovania mozgu prostredníctvom nadmernej konzumácie chutných, energeticky náročných potravín spôsobuje hlboký stav odmeňovania hypersenzitivity a rozvoj nutkavého jedenia. Tieto maladaptívne behaviorálne reakcie u obéznych potkanov pravdepodobne vyplývajú z nedostatkov vyvolaných diétou v striatálnom D2R signalizácii. Nadmerná konzumácia drog so zneužívaním podobne znižuje hustotu striatálneho D2R, indukuje hlboký stav hypofunkcie odmeňovania a spúšťa vznik kompulzívneho správania ako drogy. Naše zistenia preto podporujú predchádzajúce práce 4, 19, 42, 45, 46, 47, čo poukazuje na to, že obezita a závislosť od drog môžu vzniknúť z podobných neuroadaptívnych reakcií v okruhoch odmeňovania mozgu.

Metódy

Krysy.

Samce potkanov Wistar vážiace 300 – 350 g na začiatku pokusov boli získané od firmy Charles River. Po príchode boli potkany umiestnené individuálne pri konštantnej teplote na cykle 12-h svetlo-tma (svetlá zapnuté pri 2200 h). Potkanom bol povolený ad libitum prístup k štandardnému laboratórnemu krmivu a vode počas trvania experimentu. Všetky procedúry boli schválené Inštitucionálnym výborom pre starostlivosť o zvieratá a užívanie zvierat Scripps Florida a potkany boli liečené v súlade s pokynmi stanovenými National Institutes of Health, ktoré sa týkajú princípov starostlivosti o zvieratá.

Chirurgické zákroky.

Potkany pripravené s elektródami stimulujúcimi BSR boli najprv anestetizované inhaláciou 1-3% izofluranu v kyslíku a umiestnené v stereotaxickom ráme (Kopf). Bipolárne BSR elektródy (11 mm dlhé) boli implantované do laterálneho laterálneho hypotalamu (anteroposterior, −0.5 mm od bregma; mediolateral, ± 1.7 mm od stredovej čiary; dorsoventrálne, 8.3 mm od dury; rezáková lišta bola nastavená na 5 mm nad interaurálnou líniou ) 47. Potkany, ktoré dostávali vírusové injekcie, boli tiež pripravené s dvojstrannými vodiacimi kanylami (23 meradlo, 14 mm dlhé) umiestnené nad striatom (anteroposterior, 2.8 mm od bregma; mediolaterálne, ± 3.1 mm od stredovej čiary; dorsoventrálne, -2.4 mm od dura) 48 a plnené so styletmi 14-mm. Štyri skrutky z nehrdzavejúcej ocele a zubný akrylát držali elektródu a kanylu na mieste. Chirurgická rana bola po operácii liečená lokálnym antibiotikom raz 12 h pre 5 d. Potkanom bol povolený 7 – 10 d, aby sa zotavili z chirurgického zákroku a potom boli vyškolení v procedúre prahovej hodnoty BSR.

Postup BSR.

Potkany boli vyškolené, aby reagovali na BSR stimuláciu podľa postupu diskrétneho testovacieho prahu podobného tomu, ktorý bol opísaný indewhere10, 14. Stručne, hladiny prúdu BSR sa menili striedavými klesajúcimi a vzostupnými radmi v krokoch 5-μA. V každej testovacej relácii boli prezentované štyri striedavé zostupné / vzostupné série. Prahová hodnota pre každú sériu bola definovaná ako stred medzi dvoma po sebe idúcimi intenzitami prúdu, pre ktoré potkany odpovedali v najmenej troch z piatich pokusov, a dve po sebe idúce intenzity prúdu, pri ktorých krysy nereagovali v troch alebo viacerých z piatich pokusov. Celková prahová hodnota relácie bola definovaná ako priemer prahových hodnôt pre štyri jednotlivé série. Každá testovacia relácia trvala približne 30 min. Stabilné prahy BSR boli definované ako ≤10% odchýlky v prahových hodnotách počas 5 po sebe idúcich dní, zvyčajne stanovené po 10 – 14 d tréningu. Latencia odozvy pre každú testovanú reláciu bola definovaná ako stredná latencia odozvy všetkých štúdií, počas ktorých sa vyskytla pozitívna reakcia.

Vírusové balenie a dodávanie.

Krátka vlásenka RNA bola dodaná a konštitutívne exprimovaná pomocou vektorového systému pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Vírusové častice sa pripravili podľa protokolu výrobcu. Stručne povedané, bunky HEK 293FT boli transfekované vektorom obsahujúcim inzert shRNA (5'-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTCCAACTCGAG-3 ') alebo prázdnym vektorom a po dobu 72 hodín nahradeným médiom ViraPower Packaging Mix (Invitrogen). Supernatant sa potom zhromaždil a skoncentroval ultracentrifugáciou (24 76,755 g, rotor Beckman Coulter SW 32 TI., 90 min., 4 ° C) a vírusový titer sa stanovil pomocou fluorescenčne aktivovaného triedenia buniek podľa pokynov výrobcu. Vírus sa rozdelil na alikvóty a do použitia sa skladoval v boxoch chránených pred svetlom pri -80 ° C.

Potkany so stabilnými prahovými hodnotami BSR dostali bilaterálne vírusové injekcie na troch miestach v striate každého mozgovej hemisféry (2 μl na injekciu, 1 μl min − 1, 1 min medzi injekciami, celkovo šesť injekcií na potkana). Potkanom sa umožnilo prinajmenšom 2 – 3 d zotavenie z intrastriatálnych injekcií predtým, ako sa obnovilo stanovenie prahovej hodnoty BSR. Denné hodnotenie BSR prahových hodnôt pokračovalo pre 33 d po injekciách vírusu, aby sa zabezpečilo maximálne striatálne D2R knockdown pred tým, ako sa potkanom umožnil prístup do stravy v jedálni. Počas týchto 2 d neboli žiadne rozdiely v prahových hodnotách BSR medzi potkanmi Lenti-kontrola a Lenti-D33Rsh (údaje nie sú uvedené).

Imunoblotu.

Potkany boli usmrtené približne 1 h po ich pravidelnom plánovanom prístupe do jedálnicového systému a mozgy boli rýchlo odstránené. Mozgové rezy s hrúbkou ~ 1-2 mm boli pripravené s použitím koronálnej matice mozgu (interval rezu 1-mm; Plastics One) na ľadovom bloku a boli odobraté tkanivové razníky chrbtového striata (bregma: ~ 2.2 až -0.26 mm). Striatálne tkanivové razníky sa rýchlo odoberali, rýchlo sa zmrazili a uskladnili pri -80 ° C až do použitia. Jednotlivé vzorky boli rozmrazené na ľade a rovnaké množstvá striatálneho tkaniva boli spojené na základe hmotnostne závislého stredného rozdelenia prístupových skupín (7-10 potkany na jednu skupinu). Tkanivo sa resuspendovalo v 500 μl ľadovo studenom RIPA pufri (Thermo Scientific) obsahujúcom ortomovanadát sodný, inhibítory fosfatázy 1 a 2 (Sigma-Aldrich), leupeptín a pepstatín pred homogenizáciou. Tkanivové lyzáty sa varili pre 10 min vo vzorkovom pufri a naniesli na 4% -20% alebo 10% Tris-glycínové SDS gély (Invitrogen). Proteín bol prenesený na nitrocelulózové membrány, blokovaný pre 1 h pri -23-25 ° C (5% netučné sušené mlieko a 0.2% Tween-20 v PBS, pH 7.4) a inkubovaný v primárnej protilátke cez noc pri 4 ° C. Nasledujúce primárne protilátky boli nariedené v blokovom roztoku: D2R myší monoklonálny (Santa Cruz, 1: 100) alebo p-aktínový myší monoklonálny (Santa Cruz, 1: 200). Chemiluminiscenčné ECL činidlo sa pridalo po inkubácii so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s chrenovou peroxidázou (Amersham, 1: 2,000). Forma D2DR (~ 70 kDa) asociovaná s maturovanou membránou 17, 49, bola normalizovaná na kontrolu zaťaženia proteínom (p-aktín; 43 kDa) a kvantifikovaná denzitometricky s použitím softvéru NIH Image J.

Imunochemická analýza.

Potkany sa anestetizovali a transkardiálne perfundovali s 4% paraformaldehydom v PBS (pH 7.6). Mozgy boli odstránené, postfixované cez noc a skladované v sacharóze (30% roztok v PBS, pH 7.4) počas aspoň 72 h. Mrazené tkanivové rezy (hrúbka 30 μm) sa odobrali z mikrotómu a blokovali (3% BSA, 5% normálne kozie sérum a 0.3% Triton X-100 v PBS) pre 1 h pri 23-25 ° C. Nasledujúce primárne protilátky boli pridané do blokového roztoku a inkubované cez noc pri 4 ° C: kuracie polyklonálne k GFP (Abcam, 1: 1,000); králičí monoklonálny k GFAP (Millipore, 1: 1,000); myšia monoklonálna protilátka k NeuN (Millipore, 1: 1,000). Rezy sa inkubovali so sekundárnymi protilátkami konjugovanými s fluorescenčným farbivom pri -23-25 ° C: farbivo proti kuracím – 488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), farbivo proti králikom – 594-nm (Invitrogen, 1: 1,000 ) a farbivo anti-myší – 594-nm (Invitrogen, 1: 1000). Rezy boli namontované s montážnym médiom Vectashield obsahujúcim DAPI (Vector Labs) a zakryté prekrytím. Snímky sa odobrali s použitím fluorescenčného mikroskopu Olympus BX61 (objektív XXUMX) alebo konfokálneho mikroskopu Olympus (x 2 a x 10).

Postup kŕmenia.

Potkany sa umiestnili jednotlivo na papierové podstielky (podložky alfa; Shepherd Specialty Papers), aby sa zabránilo znečisteniu potravinárskych výrobkov sypkými materiálmi podstielky. Strava v jedálni pozostávala zo slaniny, klobásy, tvarohového koláča, polievkového koláča, polevy a čokolády, ktoré boli individuálne odvážené pred tým, ako boli sprístupnené potkanom. Potravinárske výrobky v jedálni sa dodávali v malých kovových nádobách. Všetky potravinové položky, vrátane štandardného laboratórneho krmiva, sa po ukončení kŕmenia znova zvážili. Príjem kalórií z rôznych makronutrientov bol vypočítaný s použitím nutričných informácií poskytnutých výrobcom.

Cue-indukované potlačenie kŕmneho správania.

Krmenie sa uskutočňovalo v zvukovo zoslabených operantných komorách, ktoré boli rozmerovo rovnaké ako tie, ktoré sa použili pri pokusoch s BSR. Potkany sa umiestnili do komory pre operátora a na 30 minút mali prístup k jedálni alebo jedlu v jedálni. Potraviny sa dodávali v malých kovových nádobách. Všetky potraviny boli zvážené pred a po kŕmení, ktoré sa uskutočňovalo počas normálneho obdobia kŕmenia potkanov. Spotreba krmiva sa hodnotila podľa spotreby 45 mg peliet s obsahom potravy, ktoré boli identického zloženia s obsahom krmiva v domácich klietkach pre potkany. Potkanom sa potom povolil 30-minútový prístup do jedálnička do dňa, kým sa nedosiahol stabilný príjem (definovaný ako <10% zmena denného príjmu), čo si vyžadovalo 5-7 dní. Po stabilizácii chutného príjmu potravy počas tohto základného obdobia boli potkany v každej podmienke prístupu rozdelené do dvoch skupín: potrestané (tí, ktorí dostávali šok z chodidla) a nepotrestaní (nedostávali šok z chodidla). Potkany sa potom podrobili štyrom kondičným sedeniam po sebe nasledujúcich dní v tej istej operačnej komore, v ktorej mali predtým prístup k chutnému jedlu. Počas 30-minútových kondičných relácií sa na 10 minút aktivovalo signálne svetlo (kondicionovaný stimul), na 10 minút sa vyplo a potom sa na 10 minút opäť zaplo. Potrestané potkany dostali šok z chodidla iba počas prezentácie cue svetla (0.5 mA po dobu 1.0 s; 10 stimulácií s ~ 1-minútovými intervalmi). Nepotrestané potkany dostali kontrolné svetlo rovnakým spôsobom, ale bez šoku. V testovací deň, deň po záverečnej kondicionácii, dostali potkany v potrestaných skupinách prerušovaný šok chodidla (celkovo päť stimulácií) spárovaný s aktiváciou kontrolného svetla po dobu 5 minút. Nepotrestané potkany boli opäť vystavené pôsobeniu svetla bez šoku z chodidla. Po 5-minútovej trestnej dobe boli všetkým potkanom umožnený prístup k chutnému jedlu na 30-minútové sedenie s prerušovaným aktivovaným kondicionovaným stimulom (10 minút zapnuté svetlo, 10 minút vypnuté svetlo, 10 minút zapnuté svetlo).

Štatistické analýzy.

Východiskové prahové hodnoty odmeňovania boli definované ako priemerná prahová hodnota pre 5 d pred prístupom k diéte v kaviarni pre každý subjekt. Prahové hodnoty odmien boli vyjadrené ako percentuálna zmena od základnej prahovej hodnoty. Údaje o percentuálnom podiele prahových hodnôt východiskovej odmeny, prírastku hmotnosti, kalorickej spotreby a kalorickej spotreby z tukov boli analyzované dvojfaktorovou analýzou rozptylu s opakovanými meraniami, s prístupom (iba pre čau, obmedzený prístup alebo rozšírený prístup), zdroj kalórií ( štandardné krmivo pre jedlá alebo kaviarne), vírus (Lenti-control alebo Lenti-D2Rsh) a tágo (párované alebo nepárované s trestom) ako faktory medzi subjektmi a čas ako faktor v rámci subjektov. Ak je to vhodné, hlavné účinky v analýzach rozptylu boli ďalej analyzované Bonferroniho post hoc testami. Všetky štatistické analýzy sa uskutočnili pomocou softvéru GraphPad Prism.

Referencie

Referencie

Korešpondencia:

· Paul J Kenny ([chránené e-mailom])