diabetológia, 2017; 60 (8): 1502 – 1511.
Publikované online 2017 May 20. doi: 10.1007/s00125-017-4305-4
PMCID: PMC5491592
1abstraktné
Ciele / hypotézu
Prejedanie tukov v strave spôsobuje obezitu u ľudí a hlodavcov. Nedávne štúdie na ľuďoch a hlodavcoch ukázali, že závislosť na tukoch má spoločný mechanizmus so závislosťou od alkoholu, nikotínu a narkotík v zmysle dysfunkcie systémov odmeňovania mozgov. Bolo zdôraznené, že diéta s vysokým obsahom tuku (HFD) zoslabuje signalizáciu dopamínového receptora D2 (D2R) v striate, kľúčovom regulátore systému odmeňovania mozgov, čo vedie k hedonickému prejedaniu. V minulosti sme uviedli, že bioaktívna zložka y-oryzanol špecifická pre hnedú ryžu oslabila preferenciu HFD prostredníctvom kontroly hypotalamu. Preto sme skúmali možnosť, že y-oryzanol by moduloval fungovanie systému odmeňovania mozgu u myší.
Metódy
Samce myší C57BL / 6J kŕmené HFD sa orálne ošetrili y-oryzanolom a hodnotili sa striatálne hladiny molekúl zapojených do signalizácie D2R. Skúmal sa vplyv y-oryzanolu na metyláciu DNA promótora D2R a následné zmeny v preferenciách pre tuk z potravy. Okrem toho sa skúmali účinky 5-aza-2-deoxycytidínu, silného inhibítora DNA metyltransferáz (DNMT), na preferencie potravín, signalizácie D2R a hladín DNMT v striate. Inhibičné účinky y-oryzanolu na aktivitu DNMT boli enzymaticky vyhodnotené in vitro.
výsledky
V striate z myší kŕmených HFD bola produkcia D2R znížená zvýšením metylácie DNA promótorovej oblasti D2R. Orálne podávanie y-oryzanolu znížilo expresiu a aktivitu DNMT, čím sa obnovila hladina D2R v striate. Farmakologická inhibícia DNMT pomocou 5-aza-2-deoxycytidínu tiež zlepšila preferenciu pre diétny tuk. V súlade s týmito zisteniami enzymatické testy in vitro preukázali, že y-oryzanol inhibuje aktivitu DNMT.
Závery / interpretácia
Ukázali sme, že y-oryzanol zlepšuje hypermetyláciu promótorovej oblasti D2R indukovanú HFD v striatum myši. Naša experimentálna paradigma zdôrazňuje γ-oryzanol ako sľubnú antiobezitnú látku s odlišnou vlastnosťou, že je novým epigenetickým modulátorom.
Elektronický doplnkový materiál
Online verzia tohto článku (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) obsahuje recenzovaný, ale neupravený doplnkový materiál, ktorý je dostupný autorizovaným používateľom.
úvod
Prejedanie u obéznych jedincov zdieľa aspoň čiastočne spoločné mechanizmy so závislosťou od alkoholu, nikotínu a narkotík [1]. Rovnako ako hypotalamická a hormonálna regulácia apetítu, systém odmeňovania mozgov, najmä signalizácia dopamínových receptorov, úzko súvisí s návykovým alebo hedonickým správaním sa pri kŕmení [2]. Predchádzajúca štúdia na potkanoch ukázala, že knockdown striatálneho dopamínového D2 receptora (D2R) prostredníctvom RNA sprostredkovanej lentivírusom sprostredkovanej krátkou vlásenkou rýchlo indukovalo závislosť odmien závislú od závislostí a nutkavé hľadanie potravy [3]. Vzhľadom na zníženú hustotu D2R je dorzálne striatum menej citlivé na potravinovú odmenu v porovnaní s chudými kontrolnými skupinami u obéznych ľudí a hlodavcov.3-5]. V súlade s týmto pojmom. \ T TaqIA alela ANKK1 (kódujúce DRD2 / ankyrínovú replikáciu a kinázovú doménu obsahujúcu 1), ktorá znižuje tvorbu striatálneho D2R, je spojená s obéznym fenotypom u ľudí [6], zatiaľ čo účinky úbytku hmotnosti po bariatrickej operácii sú spojené so zvýšenou hustotou striatálneho D2R [7]. Tieto údaje silne naznačujú význam striatálneho D2R ako nového terapeutického cieľa na liečbu obezity. Niektoré lieky, ktoré boli vyvinuté na základe systému odmeňovania mozgov, však spôsobili značné nepriaznivé účinky, vrátane závažných psychiatrických problémov, čo viedlo k ich prípadnému vysadeniu z kliník [8].
Epigenetické modifikácie sú rozhodujúce nielen pre vývoj a diferenciáciu, ale aj preto, že vznikajú v dôsledku environmentálnych zmien, vrátane stravy a životného štýlu [9]. Metylácia DNA je hlavným epigenetickým javom pre stabilitu génovej expresie [9]. U potkanov maternálna expozícia diéty s vysokým obsahom tuku (HFD) medzigeneračne mení metyláciu DNA v rámci centrálneho systému odmeňovania u potomkov, čo vedie k nadmernej konzumácii HFD u mláďat [10]. Najmä DNA metyltransferázy (DNMTs) hrajú rozhodujúcu úlohu v regulácii správania pri kŕmení a fyzickej aktivity [10, 11], čo naznačuje, že DNMT by mohli byť sľubnými terapeutickými cieľmi pre liečbu syndrómu obezity – diabetes. Dôležité je, že niektoré prírodné látky pochádzajúce z potravín, vrátane kyseliny kávovej a epigalokatechínu, sú známe ako inhibítory DNMT [12, 13].
Nedávno sme ukázali, že bioaktívna zložka γ-oryzanol, špecifická pre hnedú ryžu, zmes esteru kyseliny ferulovej a niekoľkých fytosterolov, zmierňuje preferenciu tuku v strave prostredníctvom poklesu stresu hypotalamického endoplazmatického retikula (ER).14]. U myší a králikov sa perorálne podaný y-oryzanol rýchlo absorboval z čreva a distribuoval sa hlavne do mozgu [15, 16]. Ak vezmeme do úvahy tieto zistenia, prírodné produkty pochádzajúce z potravy pôsobiace na centrálny nervový systém by mohli byť alternatívou na bezpečné zmiernenie zhoršeného stravovacieho správania pri obezite. V tomto kontexte sme testovali hypotézu, že γ-oryzanol by zmenil stav metylácie DNA v systéme odmeňovania mozgu, čo by viedlo k zmierneniu preferencie HFD u myší.
Metódy
zver
Sedemtýždňové myšie samce C57BL / 6J získané od spoločnosti Charles River Laboratories Japan (Kanagawa, Japonsko) boli chované (3–4 na klietku) v podmienkach bez špecifických patogénov pri 24 ° C pri svetle 12 h / 12 h / temný cyklus. Po týždni aklimatizácie sa 8-týždňové myši porovnali podľa hmotnosti a rozdelili sa do dvoch alebo troch skupín, aby sa podrobili každému experimentu. Myšiam bol umožnený voľný prístup k potrave a vode. Všetky experimenty na zvieratách boli schválené Etickou komisiou pre experimenty na zvieratách na univerzite v Rjúkjú (č. 5352, 5718 a 5943).
Podávanie y-oryzanolu a 5-aza-2-deoxycytidínu
Aby sa vyhodnotila preferencia HFD, y-oryzanol (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japonsko) sa podával myšiam starým v týždni 8 pomocou žalúdočnej sondy počas testu výberu potravín, ako bolo opísané vyššie.14, 17]. Pre ďalšie experimenty sa ako pelety vyrobil HFD (D12079B; Research Diets, New Brunswick, NJ, USA) obsahujúci 0.4% y-oryzanol. Zložky diéty sú uvedené v tabuľke elektronických doplnkových materiálov (ESM) 1. Po 12 týždňoch kŕmenia sa tkanivo odobralo zo striata a hypotalamu. Denný príjem y-oryzanolu, odhadnutý z priemerného príjmu potravy u myší, bol približne 320 μg / g telesnej hmotnosti. Dávky y-oryzanolu sa stanovili, ako už bolo opísané [14]. 5-aza-2'-deoxycytidín (5-aza-dC; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) bol intraperitoneálne injikovaný (0.25 μg / g telesnej hmotnosti) trikrát týždenne po dobu 12 týždňov [18].
Odhad preferencie pre diétny tuk
Na vyhodnotenie preferencií pre diétne tuky, potravinové testy poskytli možnosť voľby medzi Chow a HFD (D12450B a D12451; Výskumné diéty), ako bolo opísané vyššie [14]. Zložky stravy sú uvedené v tabuľke ESM 1. Stručne povedané, myšiam bol umožnený voľný prístup k krmivu a HFD. Príjem potravy a HFD sa meral týždenne a analyzoval sa z hľadiska zmien v preferencii tuku v potrave. Preferencia HFD bola vypočítaná podľa vzorca: Preferencia HFD = [(príjem HFD / celkový príjem potravy) × 100].
Sekvenovanie bisulfitu pre metyláciu DNA
DNA bola purifikovaná s použitím súpravy DNeasy Blood & Tissue Kit (QIAGEN, Tokio, Japonsko). Roztok DNA sa zmiešal s čerstvo pripraveným 3 mol / l NaOH, inkuboval sa pri 37 ° C počas 15 minút a pridal sa k 5.3 mol / l močoviny, 1.7 mol / l hydrogénsiričitanu sodného a 4.9 mmol / l hydrochinónu. Roztok sa podrobil 15 cyklom denaturácie pri teplote 95 ° C počas 30 s a inkubácii pri teplote 50 ° C počas 15 minút [19]. Bisulfitovo spracovaná DNA bola purifikovaná s použitím súpravy na čistenie minElute PCR (QIAGEN) a amplifikovaná pomocou PCR s použitím súpravy KAPA HiFi HotStart Uracil + ReadyMix PCR Kit (KAPA Biosystems, Woburn, MA, USA) a primérov okolo CpG miesta promótorovej oblasti D2R , Sekvencie primérov boli nasledujúce: forward primér, 5-GTAAGAATTGGTTGGTTGGAGTTAAAA-3 '; reverzný primér, 5′-ACCCTACCCTCTAAAACCACAACTAC-3 ′. Potom sa pridali sekvencie adaptéra a vyčistili sa použitím Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, CA, USA). Vzorky sa potom spojili a naniesli na GS Junior (Roche Diagnostics, Tokyo, Japonsko) na sekvenovanie podľa protokolu výrobcu. Úroveň metylácie bola vyjadrená ako percento metylovaných cytozínov vo všetkých cytozínových zvyškoch.
Test aktivity DNMT
Test enzymatickej aktivity DNMT sa uskutočňoval s použitím súpravy EpiQuik DNA Methyltransferase Activity / Inhibition Assay (Epigentek Group, Brooklyn, NY, USA) a súpravy EPIgeneous Methyltransferase Assay (Cisbio Japan, Chiba, Japonsko) podľa protokolov výrobcu.
Na stanovenie inhibičnej aktivity každej zlúčeniny na metyláciu DNA, tvorba S-adenosyl-l-homocysteín (SAH) sa meral v prítomnosti každej zlúčeniny (20 μmol / l pre skríningové testy), S-adenosyl metionín (SAM; 10 μmol / l) a substrát DNMT (4 ng / μl) pri teplote 37 ° C počas 90 minút. Na vyhodnotenie kinetiky Michaelis – Menten sa DNMT1 (20 μmol / l) inkuboval s y-oryzanolom, SAM (5 μmol / l) a indikovanou koncentráciou poly dl-dC pri 37 ° C po dobu 90 minút. DNMT3a (100 μmol / l) a DNMT3b (100 μmol / l) sa inkubovali s y-oryzanolom, SAM (5 μmol / l) a indikovanou koncentráciou poly dG · dC pri 37 ° C počas 120 minút. Testy sa uskutočňovali štvormo. Extrahovaný proteín (0.75 mg / ml) sa inkuboval s SAM (5 μmol / l), poly dl-dC (5 μg / ml) a poly dG · dC (5 μg / ml) pri 40 ° C počas 120 minút a Merala sa tvorba SAH.
Test aktivity receptora-y súvisiace s estrogénom
Potenciálna antagonistická aktivita y-oryzanolu na estrogénový receptor-y (ERRy) sa hodnotila pomocou systému pre analýzu receptora pre gama s ľudským estrogénom (INDIGO Bioscience, State College, PA, USA) podľa protokolu výrobcu. Stručne, reportérske bunky iného ako ľudského cicavca konštitutívne exprimujúce aktívny ERRy boli vystavené uvedeným koncentráciám každej zlúčeniny po dobu 24 hodín v troch opakovaniach.
Western blotting
Toto sa vykonalo tak, ako bolo opísané vyššie [20] s protilátkami proti D2R (1: 500, králik), transportérov dopamínu (DAT; 1: 500, králik), tyrozínhydroxyláze (TH; 1: 1000, králik) (AB5084P, AB1591P a AB152, Merck Millipore, Billerica, MA, USA), signálny prevodník a aktivátor transkripcie 3α (STAT3α; 1: 1000, králik), DNMT1 (1: 1000, králik), DNMT3a (1: 1000, králik) (č. 8768, 5032 a 3598; Cell Signaling Technology, Tokio, Japonsko), DNMT3b (1 μg / ml, králik), ERRy (1: 1000 1, králik) a p-aktín (10,000: 16049 128930, myš) (ab6276, abXNUMX a abXNUMX; Abcam, Cambridge, MA, USA).
Kvantitatívna real-time PCR
Expresia génu bola skúmaná ako bolo opísané vyššie [14]. hladiny mRNA boli normalizované na Rn18s (18S rRNA). Súpravy primérov použité na kvantitatívne analýzy PCR v reálnom čase sú zhrnuté v tabuľke ESM 2.
Štatistická analýza
Údaje sú vyjadrené ako priemer ± SEM. V prípade potreby sa použila jednosmerná ANOVA a ANOVA s opakovanými meraniami, po ktorých nasledovali viaceré porovnávacie testy (metóda Bonferroni – Dunn). Študentské t test bol použitý na analýzu rozdielov medzi dvoma skupinami. Rozdiely boli považované za významné pri p <0.05.
výsledky
Farmakologická inhibícia DNMT pomocou 5-aza-dC zmiernila uprednostňovanie tuku v potrave u myší
U myší kŕmených HFD bola významne zvýšená metylácia DNA v promótorovej oblasti D2R v striate v porovnaní s myšami kŕmenými krmivom (obr. 1). (Fig.1a) .1a). Na druhej strane, metylácia hypotalamickej DNA v promótorovej oblasti D2R bola zjavne vyššia ako v striatu pod krmivovou stravou (p <0.01) (obr. (Fig.1a, 1a, f) a nebol zmenený HFD (Obr. (Fig.1f) .1f). U myší kŕmených HFD bola normalizovaná rozšírená metylácia DNA v promótorovej oblasti D2R v striate, a to pôsobením 5-aza-dC, silného inhibítora DNMT (obr. 1). (Fig.1a) .1a). Oproti tomu metylácia DNA v promótorovej oblasti D2R v hypotalame nebola významne zmenená liečbou s 5-aza-dC (obr. 1). (Fig.1f) .1f). V striate 20-týždňových samcov myší kŕmených HFD po dobu 12 týždňov boli hladiny mRNA a proteínov D2R významne znížené (obr. (Fig.1b, 1b, k, l). Naproti tomu hladiny dopamínových D1 receptorov (D1Rs, kódované Drd1), ktoré pôsobia opačným spôsobom ako D2Rs na adenylylcyklázu a cAMP-sprostredkovanú intracelulárnu signalizáciu, sa nezmenili (Obr. (Fig.1c) .1c). Okrem toho nedošlo k žiadnej zmene hladín iných molekúl súvisiacich so signalizáciou D2R, ako je TH a DAT na úrovni mRNA a / alebo proteínu (obr. 1). (Fig.1d, 1d, e, k, m). Na druhej strane neboli pozorované žiadne zjavné zmeny v hypotalame, vrátane D2R (obr. 1). (Fig.1g-m) .1g-m). Najmä hladiny proteínov D2R a TH v hypotalame boli oveľa nižšie ako hladiny v striate (obr. 1). (Fig.1l, 1l, m), čo môže odrážať relatívny význam signalizácie dopamínových receptorov v systéme odmeňovania mozgu v porovnaní s hypotalamom.
Aby sa zistilo, či metylácia DNA v promótorovej oblasti D2R by zmenila preferenciu pre výživový tuk, analyzovalo sa stravovacie správanie myší ošetrených 5-aza-dC. Ako sa očakávalo, 5-aza-dC signifikantne zvýšil hladiny mRNA a proteínu pre D2R v striatu myší kŕmených HFD (obr. 1). (Fig.1b, 1b, k, l). Na druhej strane, na úrovniach Drd1, Th a Slc6a3 (kódovanie DAT) v striate alebo na úrovniach. \ t Drd2, Drd1, Th a Slc6a3 v hypotalame (Obr. (Fig.1c-e, 1c – e, g – m). Zatiaľ čo myši ošetrené vehikulom uprednostňovali HFD, u myší liečených 5-aza-dC (88% hodnôt pre myši ošetrené vehikulom) bola významne znížená preferencia pre HFD (Obr. (Fig.1n) .1n). V dôsledku toho liečba 5-aza-dC znížila prírastok telesnej hmotnosti (Obr. (Fig.11o).
y-oryzanol znižuje hladiny DNMT v striatum myší kŕmených HFD
Ako sme už uviedli [14], orálne podávanie y-oryzanolu samcom myší žalúdočnou sondou významne oslabilo preferenciu HFD (93% hodnôt pre myši ošetrené vehikulom) (Obr. (Fig.2a), 2a), čo má za následok zjavné zmiernenie prírastku telesnej hmotnosti (Obr. (Fig.2b) .2b). Skúmali sme teda potenciálny vplyv y-oryzanolu na epigenetickú moduláciu D2R v striate.
U cicavcov existujú tri hlavné DNMT - DNMT1, 3a a 3b. DNMT1 funguje na udržanie metylácie DNA, zatiaľ čo DNMT3a a 3b hrajú úlohu pri uľahčovaní de novo metylácie DNA [21]. Na preskúmanie potenciálneho vplyvu y-oryzanolu na DNMT in vivo sme hodnotili hladiny DNMT v mozgoch myší kŕmených HFD. Hoci HFD ako taký nemal žiadny vplyv na hladiny mRNA a proteínu DNMT v striate alebo v hypotalame, suplementácia y-oryzanolom významne znížila hladiny DNMT v striate, ale nie v hypotalame (obr. 1). (Fig.2c-e, 2c – e, g – i, k – n). Tieto údaje zvyšujú možnosť, že y-oryzanol môže regulovať hladiny DNMTs špecifickým spôsobom striatum. Podobným spôsobom 5-aza-dC významne znížil hladiny mRNA DNMT3a a 3b prednostne v striate (ESM Obr. 1a-d).
Na základe predchádzajúcej štúdie, ktorá ukázala, že hladina mRNA DNMT1 bola pozitívne regulovaná, aspoň čiastočne, nukleárnym receptorom ERRy [22] sme skúmali potenciálny účinok y-oryzanolu na aktivitu ERRy. V ne-ľudských cicavčích bunkách konštitutívne exprimujúcich aktívne ERRy, 4-hydroxytamoxifen, silný inverzný agonista ERRy, výrazne znížil ERRy aktivitu. Je potrebné poznamenať, že y-oryzanol čiastočne znížil aktivitu ERRy (približne 40% zníženie vrodenej hodnoty) (Obr. (Fig.3a) .3a). Dôležité je, že ERRy bol vysoko exprimovaný v striate, ale nie v hypotalame (obr. 1). (Fig.3b-d) .3b-d). Na rozdiel od situácie pre striatum, γ-oryzanol významne zvýšil hladiny proteínov DNMT1 len v hypotalame (obr. 1). (Fig.2k, 2k, l). Tieto výsledky možno aspoň čiastočne vysvetliť naším zistením, že STAT3α, pozitívny regulátor hladiny DNMT1 [23], bol hojne exprimovaný v hypotalame, ale nie v striate (Obr. (Fig.33e-g).
Na ďalšie vyhodnotenie vplyvu y-oryzanolu na aktivitu DNMT in vivo sa vyhodnotila tvorba SAH, vedľajšieho produktu metylácie DNA a tiež silného inhibítora DNMT, u myší ošetrených y-oryzanolom kŕmených HFD. Neboli zistené žiadne významné zmeny v tvorbe SAH ani v striate alebo v hypotalame medzi myšami kŕmenými HFD a myšami kŕmenými krmivom (obr. 1). (Fig.2f, 2f, j). Je zrejmé, že y-oryzanol významne znižuje tvorbu SAH v striate (obr. 1). (Fig.2f) 2f) ale nie v hypotalame (Obr. (Fig.2j), 2j), čo naznačuje, že y-oryzanol môže potláčať aktivitu DNMTs spôsobom špecifickým pre striatum u myší kŕmených HFD.
Enzymatické analýzy inhibičných vlastností y-oryzanolu pre DNMT in vitro
Ďalej sme hodnotili vplyv y-oryzanolu na aktivitu DNMT in vitro. Hodnotili sa inhibičné účinky y-oryzanolu, kyseliny ferulovej, 5-aza-dC, haloperidolu (reprezentatívny antagonista D2R), chinpirolu (reprezentatívneho agonistu D2R) a SAH proti DNMT. Ako pozitívna kontrola SAH silne zmiernil aktivity DNMT spôsobom závislým od dávky (obr. 1). (Fig.4a-f) .4a-f). Ako sa očakávalo, haloperidol a chinpirol nevykazovali žiadny vplyv na aktivity DNMT (ESM Obr. 2). Je zrejmé, že y-oryzanol významne inhiboval aktivity DNMT1 (IC50 = 3.2 μmol / l), 3a (IC50 = 22.3 μmol / l) a 3b (maximálna inhibícia 57%) (obr. (Fig.4d-f) .4d-f). Naopak, inhibičná aktivita kyseliny ferulovej, metabolitu y-oryzanolu, bola omnoho nižšia ako aktivita y-oryzanolu (obr. 1). (Fig.44d-f).
Ďalej sme skúmali inhibičné vlastnosti y-oryzanolu na DNMT. Zmerala sa tvorba SAH, aby sa stanovila inhibičná aktivita y-oryzanolu na DNMT in vitro. Údaje o tvorbe SAH počas metylácie DNA sprostredkovanej DNMT indikujú saturovateľnú kinetiku Michaelis-Mentenovej prítomnosti pre prítomnosť aj neprítomnosť y-oryzanolu (Obr. 1). (Fig.4g-i) .4g-i). Pri metylácii DNA sprostredkovanej DNMT1 preukázala analýza Eadie – Hofstee, že γ-oryzanol nevykazoval žiadne účinky na V max tvorby SAH (vehikulum, 597 pmol / min; y-oryzanol 2 μmol / l, 619 pmol / min; y-oryzanol 20 μmol / l, 608 pmol / min), zatiaľ čo γ-oryzanol zjavne zvyšoval K m (vehikulum, 0.47 μg / ml; γ-oryzanol 2 μmol / l, 0.67 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.89 μg / ml) (obr. (Fig.4j) .4j). Tieto výsledky naznačujú, že y-oryzanol inhibuje aspoň čiastočne kompetitívnym spôsobom DNMT1. Na druhej strane, pre DNMT3a- a 3b-sprostredkovanú metyláciu DNA, y-oryzanol znížil V max tvorby SAH (DNMT3a: vehikulum, 85.3 pmol / min; y-oryzanol 2 μmol / l, 63.1 pmol / min; y-oryzanol 20 μmol / l, 42.5 pmol / min; DNMT3b: vehikulum, 42.3 pmol / min; γ -oryzanol 2 μmol / l; 28.0 pmol / min, γ-oryzanol 20 μmol / l, 15.0 pmol / min) a podobne K m pre túto reakciu (DNMT3a: vehikulum, 0.0086 μg / ml; y-oryzanol 2 μmol / l, 0.0080 μg / ml; y-oryzanol 20 μmol / l, 0.0058 μg / ml; DNMT3b: vehikulum, 0.0122 μg / ml; γ- oryzanol 2 μmol / l, 0.0097 μg / ml; γ-oryzanol 20 μmol / l, 0.0060 μg / ml) (obr. (Fig.4k, 4k, l). Tieto výsledky naznačujú, že y-oryzanol inhibuje aspoň čiastočne nekompetitívnym spôsobom DNMT3a a 3b.
y-oryzanol zvyšuje hladiny D2R u striatum myší kŕmených HFD
Ďalej sme testovali možnosť, že y-oryzanol by zvýšil obsah striatálneho D2R prostredníctvom inhibície DNMT. U myší kŕmených HFD orálne podávanie y-oryzanolu významne znížilo metyláciu striatálnej DNA v promótorovej oblasti D2R (obr. 1). (Fig.5a), 5a), zatiaľ čo v hypotalame to neurobil (Obr. (Fig.5f) .5f). V súlade s týmito zisteniami boli hladiny mRNA a proteínu D2R recipročne zvýšené (obr. 1). (Fig.5b, 5b, g, k, l). Podobne ako údaje o liečbe 5-aza-dC (Obr. (Fig.1), 1), neboli pozorované žiadne zjavné účinky na hladiny RNA a proteínu. \ t Drd1, Th a Slc6a3 (DAT) v striate a žiadne účinky na hladiny Drd1, Th a Slc6a3 v hypotalame (Obr. (Fig.5c-e, 5c – e, h – k, m).
Predchádzajúce štúdie ukázali, že hladiny D2R a DNMT1 sú regulované ER stresom a zápalom aspoň čiastočne prostredníctvom NF-κB [17, 24, 25]. Preto sme skúmali hladiny génov súvisiacich so stresom ER a zápalom. Ako už bolo preukázané [26], HFD zvýšila expresiu génov kódujúcich TNF-a (TNFa), monocytový chemoatraktantný proteín - 1 (MCP-1) (Ccl2), C / EBP homológny proteín (kotleta), ER-lokalizovaný DnaJ 4 (ERdj4) (Dnajb9) a zostrihanú formu X-box viažuceho proteínu 1 (Xbp1s) v hypotalame, ale nie v striate (Obr. (Fig.6) .6). Najmä suplementácia HFD y-oryzanolom významne znížila zosilnenú expresiu Ccl2, kotleta, Dnajb9 a Xbp1s výlučne v hypotalame, ale nie v striate (Obr. (Fig.66).
Diskusia
Hlavným zistením v tejto štúdii je to, že y-oryzanol pôsobí ako silný inhibítor DNMT v striatum myší, čím aspoň čiastočne znižuje preferenciu HFD prostredníctvom epigenetickej modulácie striatálneho D2R. V striate z HFD-kŕmených myší boli hladiny D2R významne znížené, zatiaľ čo hladiny D1R, TH a DAT neboli zmenené (Obr. 1). (Fig.1b-e, 1b – e, k – m). Tieto údaje sú v súlade s predstavou, že dysregulácia striatálneho D2R hrá rozhodujúcu úlohu vo vnímaní odmeny za jedlo pri HFD, čo vedie k hedonickej nadmernej spotrebe HFD u obéznych zvierat [3]. V tejto štúdii liečba HFD-kŕmených myší s 5-aza-dC významne zvýšila hladiny striatálneho D2R (obr. 1). (Fig.1b, 1b, k, l) pravdepodobne prostredníctvom zníženia hladiny metylácie DNA v promótorovej oblasti D2R (Obr. (Fig.1a), 1a) a následne zoslabil preferenciu pre diétny tuk (obr. 1). (Fig.1n) .1n). Toto zistenie tiež podporuje kritickú úlohu striatálnych D2R pri vnímaní potravinovej odmeny na HFD.
Naša in vitro skúška ukázala, že inhibičná aktivita y-oryzanolu proti DNMT bola zjavne silnejšia ako jeho metabolitová kyselina ferulová (obr. 1). (Fig.4d-f), 4d – f), čo poukazuje na dôležitosť úplnej štruktúry y-oryzanolu pre jeho inhibičný účinok na DNMT. V myšiach kŕmených HFD naše štúdie naznačujú, že po perorálnom podaní sa y-oryzanol dostane do mozgu ako úplná štruktúra a znižuje hladiny a aktivity DNMTs prednostne v striate, s následným znížením metylácie DNA v promótorovej oblasti D2R v striate. Okrem toho naše in vitro štúdie preukázali, že y-oryzanol pôsobí ako parciálny antagonista proti ERRy, ktorý primárne slúži ako pozitívny regulátor pre produkciu DNMT1 [22] a následne znížila aktivitu DNMT1 (Obr. (Fig.3a) .3a). Dôležité je, že ERRy bola vysoko exprimovaná v striate, ale nie v hypotalame u myší (Obr. (Fig.3b) .3b). Tieto údaje naznačujú, že y-oryzanol má potenciál znížiť hladinu mRNA DNMT1, aspoň čiastočne, prostredníctvom inhibície ERRy. Na rozdiel od striata nevykazoval y-oryzanol žiadny účinok na hladinu D2R v hypotalame z myší kŕmených HFD (obr. 1). (Fig.5g, 5g, k, l).
Na druhej strane sme preukázali, že y-oryzanol významne zvyšuje hladiny DNMT1 v hypotalame, ale nie v striate (obr. 1). (Fig.2k, 2k, l). Ukázalo sa, že STAT3 zvyšuje obsah DNMT1 u malígnych T-lymfómových buniek [23]. Predovšetkým sme dokázali, že y-oryzanol významne zvyšuje fosforyláciu STAT3 indukovanú leptínom v hypotalame z myší kŕmených HFD [14]. Treba tiež poznamenať, že STAT3a bol v podstate exprimovaný v hypotalame, ale nie v striate u myší (obr. 1). (Fig.3e-g) .3e-g). Tieto údaje nás vedú k špekulácii, že zdanlivý rozdiel v účinku y-oryzanolu na hladiny DNMT1 medzi hypotalamom a striatom môže byť prinajmenšom čiastočne priradený k obsahu STAT3a a ERRy špecifickému pre oblasť v mozgu myší (čiastočne). obr. (Fig.3b-g) .3b-g). Zdá sa, že existuje kolektívny vzorec expresie ERRy a STAT3a medzi striatom a hypotalamom u myší. Na základe našich výsledkov je preto rozumné špekulovať, že v striate, kde je produkcia ERRy bohatá, môže y-oryzanol prednostne znižovať hladinu mRNA a enzymatickú aktivitu DNMT1 ako negatívneho regulátora ERRy. Naopak v hypotalame, kde je dominantná produkcia STAT3a, môže y-oryzanol prednostne zvyšovať hladiny DNMT1.
Nedávna štúdia ukázala, že zoslabenie striatálnej D2R signalizácie vyvolanej HFD dysreguluje stravovacie správanie [3], čo naznačuje potenciálny význam inhibície striatálnych DNMT na liečenie obezity. Na druhej strane, predchádzajúca štúdia ukázala možnosť, že stav metylácie DNA génu pre receptory melanolortínu 4 exprimovaného v špecifických hypotalamických jadrách by mohol modulovať transgeneračné formy obezity u viabilných žltej myši.27]. Aj keď sú potrebné ďalšie štúdie na objasnenie základných mechanizmov, tieto štúdie naznačujú význam tkanivovej, génovej a sekvenčne špecifickej metylácie DNA v patofyziológii HFD-indukovanej obezity.
Nedávno sme uviedli, že HFD zvyšuje hladinu D2R v pankreatických ostrovčekoch myší [17, 24]. Je pravdepodobné, že takéto zväčšenie je sprostredkované aspoň čiastočne stresom ER a zápalom prostredníctvom NF-KB, pretože v promótorovej oblasti D2R existuje niekoľko elementov citlivých na NF-KB.17, 24]. Nedávna štúdia okrem toho ukázala, že TNF-a a IL-1β zvyšujú hladinu a aktivitu DNMT1 v tukovom tkanive myší kŕmených HFD [25]. Dôležité je, že táto štúdia ukázala, že HFD indukuje ER stres a zápal prednostne v hypotalame, ale nie v striate (obr. 1). (Fig.6) .6). In-hĺbkové mechanizmy tkanivovej, oblastnej a miestne špecifickej metylácie DNA a demetylácie v našej experimentálnej paradigme musia čakať na ďalšie vyšetrenie.
Spolu s našou predchádzajúcou správou, ktorá ukazuje, že y-oryzanol zmierňuje preferenciu HFD prostredníctvom hypotalamickej regulácie ER stresu u myší [14], y-oryzanol tiež predstavuje jedinečnú vlastnosť zlepšenia hédonickej aj metabolickej dysregulácie kŕmneho správania. Pretože niektoré lieky proti obezite, ktoré boli vyvinuté, sú známe, že spôsobujú kritické nepriaznivé účinky [8] sa predpokladá, že prirodzený prístup založený na potravinách k systému odmeňovania mozgov sa bude liečiť na liečbu syndrómu obezity a diabetu bezpečne [.16]. V tejto paradigme je y-oryzanol sľubným kandidátom na antiobezitu s odlišnou vlastnosťou bytia epigenetickým modulátorom.
Poďakovanie
Sme vďační S. Okamoto (University of the Ryukyus, Japonsko) za preskúmanie rukopisu. Ďakujeme M. Hiratovi, H. Kaneshiro, I. Asato a C. Noguchimu (University of the Ryukyus, Japonsko) za sekretársku pomoc.
Skratky
| 5-aza-dC | 5-aza-2 '-deoxycytidin |
| D1R | Dopamínový receptor D1 |
| D2R | Dopamínový receptor D2 |
| DAT | Dopamínový transportér |
| DNMT | DNA metyltransferáza |
| ER | Endoplazmatické retikulum |
| ERR | Receptor súvisiaci s estrogénom |
| HFD | Dieta s vysokým obsahom tuku |
| SAH | S-Adenosyl-l-homocysteín |
| SAM | S-Adenosylmetionín |
| STAT3α | Signálny prevodník a aktivátor transkripcie 3a |
| TH | Tyrozínhydroxyláza |
Poznámky
Dostupnosť údajov
Dátové súbory generované a / alebo analyzované počas aktuálnej štúdie sú k dispozícii od príslušného autora na základe primeraných požiadaviek.
Financovanie
Túto prácu čiastočne podporili Granty-in-Aid od Japonskej spoločnosti na podporu vedy (JSPS; KAKENHI Grant Numbers 15K19520 a 24591338), Rady pre vedu, technológiu a inovácie (CSTI), Programu podpory nadnárodných strategických inovácií (SIP) „Technológie na vytvorenie poľnohospodárstva, lesníctva a rybného hospodárstva novej generácie“, Nadácia Lotte, Japonská nadácia pre aplikovanú enzymológiu, Organizácia pre rozvoj nových energetických a priemyselných technológií (NEDO), Projekt na vytvorenie siete pre prírodné vedy (Farmaceutické odvetvie (Prefektúra Okinawa, Japonsko) a Promotion Project of Medical Clustering prefektúry Okinawa v Japonsku, spolu s grantom prefektúry Okinawa na podporu pokrokovej medicíny (prefektúra Okinawa, Japonsko).
Dualita záujmu
Autori prehlasujú, že s týmto rukopisom nie je spojená žiadna dualita záujmu.
Vyhlásenie o príspevku
CK a HM navrhli výskum. CK a TK uskutočnili experimenty a analyzovali údaje. TK, CS-O, CT, MT, MM a KA prispeli k interpretácii údajov. CK a HM napísali rukopis. Všetci autori prispeli k interpretácii dát. Všetci autori sa pripojili k revízii rukopisu a schválili jeho konečnú verziu. HM je garantom tejto práce, mal plný prístup ku všetkým údajom a preberá plnú zodpovednosť za integritu údajov a presnosť analýzy údajov.
poznámky pod čiarou
Elektronický doplnkový materiál
Online verzia tohto článku (doi: 10.1007 / s00125-017-4305-4) obsahuje recenzovaný, ale neupravený doplnkový materiál, ktorý je dostupný autorizovaným používateľom.
Referencie
;