Inzulín zvyšuje uvolňovanie dopamínu v striele aktiváciou cholinergných interneurónov a tým signalizuje odmenu (2015)

 

Melissa A. Stouffer,

Catherine A. Woodsová,

Jyoti C. Patel,

Christian R. Lee,

Paul Witkovsky,

Li Bao,

Robert P. Machold,

Kymry T. Jones,

Soledad Cabeza de Vaca,

Maarten EA Reith,

Kenneth D. Carr

& Margaret E. Riceová

Medzinárodná spolupráca

Príspevky

zodpovedajúci Autor

Nature Communications

6,

Číslo článku:

8543

doi: 10.1038 / ncomms9543

Prijaté

 

02 júna 2015

prijatý

 

02 2015 septembra

uverejnené

 

  

abstraktné

Inzulín aktivuje receptory inzulínu (InsRs) v hypotalame, aby signalizoval sýtosť po jedle. Rastúci výskyt obezity, ktorý má za následok chronicky zvýšené hladiny inzulínu, však znamená, že inzulín môže pôsobiť aj v centrách mozgu, ktoré regulujú motiváciu a odmenu. Uvádzame, že inzulín môže zosilniť uvoľňovanie dopamínu (DA) závislého od akčného potenciálu v jadre accumbens (NAc) a kaudát-putamen prostredníctvom nepriameho mechanizmu, ktorý zahŕňa striatálne cholinergné interneuróny, ktoré exprimujú InsRs. Okrem toho dve rôzne chronické diétne manipulácie u potkanov, potravinové obmedzenia (FR) a obezogénna (OB) diéta, opačne menia citlivosť striatálneho uvoľňovania DA na inzulín, so zvýšenou citlivosťou vo FR, ale stratou citlivosti na OB. Behaviorálne štúdie ukazujú, že intaktné hladiny inzulínu v NAc škrupine sú nevyhnutné na získanie preferencie chuti párového roztoku glukózy. Tieto údaje spoločne naznačujú, že striatálna inzulínová signalizácia zvyšuje uvoľňovanie DA, čo ovplyvňuje výber potravín.

Na prvý pohľad

číselné údaje

ľavý

  1. Inzulínovo závislé zvýšenie evokovaných [lsqb] DA [rsqb] o vyžaduje InsRs a PI3K.
    Obrázok 1
  2. Inzulínom závislá regulácia striatálneho uvoľňovania DA vyžaduje ACh od ChI.
    Obrázok 2
  3. Inzulínom indukované zvýšenia evokovaných [lsqb] DA sú zosilnené FR a stratené v OB.
    Obrázok 3
  4. Mikroinjekcia InsAb do škrupiny NAc znižuje preferencie chuti.
    Obrázok 4

 

 

úvod

Je dobre známe, že trvalé zvýšenie plazmatického inzulínu počas jedla a po jedle aktivuje inzulínové receptory (InsRs) v hypotalame, čo poskytuje negatívnu spätnú väzbu na chutné okruhy, ktoré znižujú ďalšie jedenie1, 2, 3, Mozgový inzulín je primárne odvodený z pankreatických β buniek, s aktívnym transportom z plazmy do mozgu v hematoencefalickej bariére4, 5, 6, 7, 8, aj keď existuje rastúci dôkaz pre syntézu a uvoľňovanie neuronálneho inzulínu1, 9, Expresia InsR nie je obmedzená len na hypotalamus, hoci funkcia extra-hypotalamických InsRs zostáva nevyriešená.1, 2, 3, Vzhľadom na zvyšujúci sa výskyt obezity a diabetu typu II, pri ktorých sú hladiny inzulínu v obehu neustále zvýšené a transport inzulínu v mozgu a citlivosť receptora sú znížené3, 8, 10, 11je dôležité pochopiť funkciu inzulínu v oblastiach mozgu, ktoré regulujú motiváciu a odmenu. Mimoriadne zaujímavé oblasti mozgu zahŕňajú nukleus accumbens (NAc), ktorý sprostredkováva odmeňujúce účinky potravín a liekov.12, 13a caudate – putamen (CPu), ktorý zohráva úlohu pri správaní založenom na zvykoch a túžbe po13, InsR sú exprimované v týchto oblastiach s najvyššou hustotou vyskytujúcou sa v NAc3, 14; InsRs sú tiež exprimované dopamínovými (DA) neurónmi v strednom mozgu, vrátane tých vo ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) a substantia nigra pars compacta (SNc).15, Hladiny inzulínu v mozgu sú úmerné koncentráciám inzulínu v plazme a telesnej adipozite6, 7, 8, čo vedie k hypotéze, že inzulín môže pôsobiť na InsRs v týchto oblastiach mozgu, aby ovplyvnil potravinovú odmenu3, 16, 17.

Predchádzajúce štúdie v striatálnych synaptozómoch, heterológnych bunkách, rezoch mozgu a in vivo ukázali, že inzulínová aktivácia InsR vedie k zvýšeniu príjmu DA DA transportérom (DAT)18, 19, 20, 21, 22, 23, Tento proces zahŕňa signálnu dráhu PI3 kinázy19, 20a vedie k inzercii DAT v plazmatickej membráne19, Hladiny cirkulujúceho inzulínu dynamicky modulujú aktivitu striatálneho DAT so zníženou expresiou DA a povrchovou expresiou DAT pozorovanou na zvieracích modeloch diabetu a po potravinovom obmedzení (FR)20, 21, Ukázalo sa, že zvýšenie aktivity DAT závislé od inzulínu znižuje evokovanú extracelulárnu koncentráciu DA ([DA]).o) vo VTA23, čo odráža posun rovnováhy medzi uvoľňovaním a vychytávaním DA. V súlade so zavedenou úlohou inzulínu v sýtosti môže akútna mikroinjekcia inzulínu vo VTA znížiť potravinovú odmenu23, 24, zatiaľ čo myši, ktorým chýbajú InsR v neurónoch VTA a SNc DA, vykazujú zvýšený príjem potravy a sú obézne25, Hoci inzulín môže indukovať dlhodobú depresiu excitačného vstupu do neurónov VTA DA24, opäť v súlade s úlohou v sýtosti, expozícia inzulínu môže tiež zvýšiť rýchlosť spaľovania DA neurónov, pravdepodobne znížením inhibície uvoľňovania DA a autoreceptora25, Čistý účinok inzulínu na striatálne uvoľňovanie DA je preto ťažké predvídať. Výsledky štúdií o vplyve inzulínu na striatálne uvoľňovanie DA v ex vivo plátky19 a účinok lokálnej mikroinjekcie inzulínu v NAc na potravinovú odmenu26 protichodné. Na vyriešenie tohto problému sme hodnotili uvoľňovanie axonálneho DA a jeho príjem v intaktnom mikroprostredí NAc a CPu v ex vivo striatálne rezy využívajúce cyklickú voltametriu s rýchlym skenovaním (FCV) a určili účinky inzulínovej signalizácie v NAc na správanie sa pri odmeňovaní in vivo.

Naše štúdie ukazujú, že primárnym účinkom inzulínu v NAc a CPu je zvýšenie uvoľňovania DA, napriek súčasnému zvýšeniu absorpcie DA. Táto dynamická regulácia uvoľňovania DA zahŕňa zvýšenie excitability striatálnych cholinergných interneurónov závislých od inzulínu (ChI), čo vedie k zvýšenému uvoľňovaniu DA prostredníctvom aktivácie nikotínových acetylcholínových (ACh) receptorov (nAChR). Vplyv inzulínu na ChI a na uvoľňovanie DA je sprostredkovaný InsRs. Je pozoruhodné, že účinok inzulínu na uvoľňovanie DA sa amplifikuje v rezoch z potkanov FR, ale potkanom sa otupí pri obezogénnej (OB) diéte. Tieto údaje ukazujú zosilnenie uvoľnenia DA v ex vivo rezy inzulínom vedú k predikcii, že inzulín môže pôsobiť ako odmenový signál in vivo, Štúdie paralelného správania preukázali úlohu inzulínu v škrupine NAc pri kondicionovaní preferencie chuti. Tieto zistenia spoločne naznačujú novú úlohu inzulínu ako odmenového signálu, ktorý môže ovplyvniť výber potravín

 

 

výsledky

Inzulín pôsobiaci na InsRs zvyšuje evolúciu striatálneho DA

Počiatočné vyšetrenie lokálne vyvolaného [DA]o monitorované pomocou FCV in ex vivo striatálne rezy z potkanov s podľa chuti (AL) prístup k potravinám a vode odhalil neočakávané zistenie, že akútna aplikácia inzulínu v celom rade fyziologicky relevantných koncentrácií1, 4 zvýšený jednorázový impulz vyvolaný [DA]o (Obr. 1a – c), s inzulínom EC50 (koncentrácia, pri ktorej bol účinok polovičný) 2 – 12 nM (Obr. 1b). Zvýšené evokované [DA]o obzvlášť prekvapujúce, keďže to bolo sprevádzané výrazným zvýšením maximálnej miery (\ tVmax) pre príjem sprostredkovaný DAT v každom subregióne (\ tTabuľka 1), čo by viedlo k konkurenčnému poklesu evokovaného [DA]o, ako bolo uvedené vyššie22, 23, Namiesto toho sme zistili, že to vyvolalo [DA]o 20-55% bol maximálne zosilnený 30-XNUMX inzulínom; oblasť s najväčším proporcionálnym účinkom bola NAc shell, čo je striatálna subregión s najvyššou expresiou InsR1, 14, Rezy vystavené inzulínu 30 nM za rovnakých podmienok nevykazovali žiadnu zmenu obsahu striatálneho DA (Doplnkový obrázok 1a), z čoho vyplýva, že inzulín mení skôr reguláciu dynamického uvoľňovania, než len upreguláciu syntézy DA. Najmä účinok inzulínu na evokované [DA]o stratil pri suprafyziologických koncentráciách ≥100 nM (Obr. 1b). Toto nebolo dôsledkom zvýšeného uvoľňovania aktivity DAT, ako účinok inzulínu na Vmax stratil aj pri týchto koncentráciách (\ tTabuľka 1). Celkovo tieto údaje ukazujú, že v neporušenom striatálnom mikroprostredí je prevládajúci účinok inzulínu na evokované [DA]o je zvýšenie uvoľňovania napriek súčasnému zvýšeniu absorpcie DA.

Obrázok 1: Inzulínovo závislé zvýšenie evokovaného [DA]o vyžadujú InsRs a PI3K.
  

Inzulínovo závislé zvýšenie evokovaných [lsqb] DA [rsqb] o vyžaduje InsRs a PI3K.   

(a) Priemerný jednorazový impulz evokovaný [DA]o v NAc shell, NAc jadre a CPu pred a po inzulíne (Ins) ilustrovanom pre 30 nM; chybové stĺpce sú vynechané, ale vidíte (b); šípky označujú čas stimulu. Zvýšený inzulín vyvolaný [DA]o v shell (podľa 55 ± 10%), jadro (podľa 37 ± 5%) a CPu (podľa 20 ± 4%) (***P<0.001). (bVplyv inzulínu bol závislý od koncentrácie v celom fyziologickom rozsahu (1 – 30 nM) v škrupine (n= 22-24, F5,133= 14.471, P<0.001), jadro (n= 36-76, F5,308= 16.318, P<0.001) a CPu (n= 30-62, F5,253= 13.763, P<0.001), ale stratili sa pri ≥ 100 nM. (c) Reprezentatívne záznamy špičkovo vyvolaných [DA]o versus čas na jednom mieste v jadre NAc v neprítomnosti aplikácie lieku (Con), počas aplikácie inzulínu (30 nM) alebo keď bol inzulín aplikovaný v prítomnosti inhibítora InsR HNMPA (5 uM). (d) Priemerná maximálna hodnota [DA]o údaje preukazujúce prevenciu účinku inzulínu (30 nM) HNMPA, antagonistu InsR S961 (1 μM) a inhibítora PI3K LY294002 (1 μM), ale nie inhibítorom IGF-1R PPP (1 μM) (n= 29-76; P> 0.9 oproti samotnému inzulínu). Pre Obr. 1a – d, n= počet miest na subregión od potkanov 3 – 6 pre každé liečivo alebo koncentráciu inzulínu; jednosmerný ANOVA, Tukeyov čestný test významnosti (HSD). vidieť Doplnkový obrázok 1b, c pre NAc shell a CPu dáta.

 

 

Tabuľka 1: Inzulín pri fyziologických koncentráciách (30 nM) sa zvyšuje Vmax pre DAT-sprostredkovanú absorpciu v striatálnych rezoch.
  

 

 

Pretože inzulín môže pôsobiť aj na receptory inzulínu podobného rastového faktora 1 (IGF-1R), aj keď pri koncentráciách vyšších ako 100 nM (ref. 1). 1), sme sa snažili potvrdiť, že zvyšujúci sa účinok inzulínu na evokované [DA]o bol závislý od InsR. Ukázalo sa, že je to tak, pretože tomuto účinku bolo zabránené intracelulárnym inhibítorom InsR, kyselinou hydroxy-2-naftalenylmetylfosfónovou (HNMPA) a antagonistom InsR, S961, ale nie selektívnym inhibítorom IGF-1R, pikropodofylínu24 (PPP; Obr. 1c, d a Doplnkový obrázok 1b, c). Potom sme skúmali zapojenie kinázy PI3, ktorá iniciuje signálnu dráhu zodpovednú za reguláciu DAT závislú od inzulínu.19, Pri koncentrácii 1uM nemal samotný inhibítor P13K LY249002 žiadny účinok na vrchol vyvolaný [DA].o or Vmax (n= Miesta 29 – 76 (NAc jadro) na liek, P> 0.05, jednosmerná analýza odchýlky (ANOVA); údaje nie sú zobrazené), napriek tomu sa zabránilo účinku inzulínu na vyvolané [DA]o vo všetkých striatálnych podoblastiach (Obr. 1d a Doplnkový obrázok 1b, c).

Lokalizácia InsRs na DA axónoch a ChI

Pozorovaný nárast v roku 2006. \ T Vmax pre príjem DA s fyziologickými hladinami inzulínu naznačuje prítomnosť InsRs na DA axónoch, rovnako ako predchádzajúce výsledky v rôznych striatálnych prípravkoch18, 19, 20, 21, 22, Hoci bola preukázaná funkčná expresia InsR na neurónoch DA stredného mozgu15, 23, 24, 25Expresia InsR na striatálnych DA axónoch nebola zaznamenaná. Riešili sme to imunohistochémiou. Hustá imunoreaktivita InsR počas obmedzeného kvantitatívneho stanovenia InsR lokalizácie na DA axónoch, ktoré boli identifikované imunoreaktivitou pre enzým syntetizujúci DA, tyrozínhydroxylázu (TH). Preto sme prijali predtým oznámený protokol27, ktoré zahŕňali počítanie InsR puncta, ktoré sa prekrývalo s TH + profilmi v normálnom zobrazení obrazu a počítanie opäť po tom, čo bol obraz InsR len otočený o 90 °. Ak zdanlivé prekrývanie profilov InsR a TH + bolo nešpecifické, tento postup by mal poskytnúť štatisticky podobné počty, či už normálne alebo 90 ° mimo fázy. Táto analýza však ukázala pokles prekrývania InsR puncta s TH + profilmi 14 ± 9% (n= Polia 42, P<0.01, spárované s dvoma chvostmi t-test; údaje nie sú uvedené), čo potvrdzuje prítomnosť InsR na DA axónoch. Zaujímavejšie je však, že InsR imunoznačenie striatum odhalilo výraznú expresiu InsR na veľkých bunkových telách, ktoré boli identifikované ako striatálne ChI pomocou imunoznačenia cholín acetyltransferázy (ChAT), primárneho enzýmu potrebného na syntézu ACh. Použitie elektrofyziologických kritérií28 na identifikáciu ChI v predbežných štúdiách zaznamenávania celých buniek sa niekoľko neurónov naplnilo biocytínom a potom sa spracovalo na imunohistochémiu; všetky tieto (4 / 4) boli imunopozitívne pre InsR aj ChAT (Obrázok 2a). Následné vyhodnotenie InsR a ChAT ko-lokalizácie v NAc potvrdilo, že prakticky všetky ChAT + neuróny exprimovali InsR (96%; n= Neuróny 27 / 28 v štyroch častiach od dvoch potkanov).

Obrázok 2: Inzulínom závislá regulácia striatálneho uvoľňovania DA vyžaduje ACh od ChI.
  

Inzulínom závislá regulácia striatálneho uvoľňovania DA vyžaduje ACh od ChI.   

(a) ChI naplnený biocytínom, potom imunoznačený na ChAT a InsR (reprezentujúci 4 / 4 biocytín-naplnené ChI); zlúčený obraz ukazuje spoločnú lokalizáciu; mierka, 10 μm. (b-e) Reakcia striatálnych ChI na sériu depolarizujúcich prúdových pulzov (trvanie 3-u; 200, 300 a 400 pA; intervaly 120-u) pred a po inzulíne (30 nM). (bAdaptácia spike frekvencie v ChI (hornom) je pozorovaná pri výskyte potenciálu akčného potenciálu (AP) počas aktuálnej injekcie, zatiaľ čo spiking pretrváva v celom súčasnom pulze inzulínu (nižšie); kompletný súbor údajov zobrazený v d, (c) Reprezentatívny časový priebeh inzulínom indukovaného zvýšenia AP čísla pri každom aktuálnom kroku pre ChI in b, (d) Zhrnutie čísla AP počas aktuálnych impulzov dodaných pred a pri maximálnom účinku expozície inzulínu (n= Párové stimulácie 21, neuróny 7, potkany 5) (e) Priemerné odozvy ukazujúce účinok inzulínu (+ Ins) v kontrolných podmienkach (Con; n= 21 párové stimulácie, 7 neuróny, ***P<0.001, spárované s dvoma chvostmi t-test), v prítomnosti HNMPA (5 μM) (n= Párové stimulácie 12, neuróny 4, potkany 4, P>0.05, spárovaný dvojaký t-test) av prítomnosti PPP (1 μM) (n= Párové stimulácie 18, neuróny 6, potkany 6, **P<0.01, Wilcoxon zhodný párový podpísaný rank test). (f) Priemerný jednorazový impulz evokovaný [DA]o v NAc jadre pred a po inzulíne (30 nM) v mekamylamíne (Mec; 5 μM) alebo DHpE (1 μM) normalizované na 100% špičkovej kontroly (n= 20 – 40 stránky na subregión za podmienky potkanov 3 – 4, P> 0.05 oproti kontrole, nespárované t-test). (g) Priemerný jednorazový impulz evokovaný [DA]o v rezoch predného mozgu z heterozygotnej kontroly (Het) a. \ t chatou KO myši pred a po inzulíne (30 nM), normalizované na 100% vrcholovej kontroly. Zvýšený inzulín vyvolaný [DA]o u heterozygotných myší pomocou 190 ± 23% v NAc shell, 140 ± 8% v NAc jadre a 137 ± 12% v CPu (n= Miesta 15 – 25 na subregión od myší 3 – 4 na jeden genotyp, **P<0.01, ***P<0.001 verzus kontrola nespárovaná t-test), ale nemal žiadny vplyv na vyvolané [DA]o v akomkoľvek striatálnom subregióne chatou KO myši (P> 0.1).

 

 

Inzulín zvyšuje excitabilitu ChI

Na testovanie funkčnosti InsRs na striatálnych ChI sme skúmali účinok inzulínu na excitabilitu ChI pomocou záznamu v celých bunkách. ChI excitabilita bola hodnotená použitím série 3-depolarizačných prúdových impulzov na vyvolanie radu akčných potenciálov, ktoré spoľahlivo vykazovali adaptáciu frekvencie špice (Obr. 2b), často so stratou špičky na konci súčasného pulzu. Je prekvapujúce, že inzulín (30 nM) zmiernil adaptáciu spike frekvencie, čo viedlo k progresívnemu zvýšeniu počtu akčných potenciálov v čase (Obr. 2c) s maximálnym zvýšením (\ tObr. 2d, napr) typicky pozorované medzi 20 a 50 min vystavenia inzulínu. V neprítomnosti inzulínu kontrolné ChI nevykazovali žiadnu zmenu v počte evokovaných akčných potenciálov (P> 0.05, spárované s dvoma chvostmi t-test; údaje nie sú zobrazené); V porovnaní s kontrolnými neurónmi sledovanými v rovnakom časovom intervale, neuróny vystavené inzulínu vykazovali významne väčšiu zmenu v počte evokovaných akčných potenciálov (kontrola n12 stimulačné páry zo štyroch neurónov, inzulínu n= Páry stimulov 21 zo siedmich neurónov, F1,25= 5.63, P<0.05, obojsmerná ANOVA so zmiešanými mierami; údaje nie sú zobrazené). Účinku inzulínu na zvýšenie počtu akčných potenciálov zabránilo HNMPA, ale nie selektívny inhibítor IGF-1R PPP (Obr. 2e), čo dokazuje, že zvýšená excitabilita ChI inzulínom bola sprostredkovaná InsR.

Zlepšenie inzulínu vyvolaného [DA]o vyžaduje nAChRs a ACh

Predchádzajúce štúdie ukázali, že ChI a ACh silne regulujú striatálne uvoľňovanie DA prostredníctvom nAChRs na DA axónoch29, 30, 31, 32, 33, 34, Bohatá expresia InsR na ChI a zvýšenie excitability ChI pozorované pri akútnej expozícii inzulínom naznačujú, že tieto neuróny môžu byť novými cieľmi pre inzulín, ktoré by mohli viesť k zvýšenému uvoľňovaniu DA. Na testovanie tohto stavu sme skúmali účinok inzulínu v prítomnosti mekamylamínu, neselektívneho antagonistu nAChR alebo dihydro-β-erytroidínu (DHpE), selektívneho antagonistu nXhNs (β2 *) nXhumu obsahujúceho p2. DA axóny35, Evokované [DA]o v prítomnosti týchto antagonistov sa ľahko detegovala, aj keď obidva lieky znižovali amplitúdu jednorázového impulzu vyvolaného [DA].o (napríklad pomocou 13 – 26% v jadre NAc), ako bolo uvedené predtým29, 30, 31, 32, Na podporu úlohy ACh a nAChRs účinok inzulínu na evokované [DA]o sa zabránilo buď mekamylamínu alebo DHβE (Obr. 2f). Na potvrdenie zapojenia striatálneho ACh signalizácie do inzulínového zosilneného uvoľňovania DA sme skúmali účinok inzulínu v ex vivo striatálne rezy z myší, v ktorých bola expresia ChAT geneticky ablokovaná v štruktúrach predného mozgu (predný mozog chatou KO myši), vrátane striatum32, Aj keď sú ChI u týchto myší neporušené, syntéza ACh je zrušená, čo vedie k zníženiu, ale stále ľahko detegovateľným [1] pulzom vyvolaným [1]o, ako je opísané vyššie32, U kontrolných heterozygotných súrodencov sa zvýšil inzulín (30 nM) vyvolaný [DA]o v shell a jadre NAc av CPu podľa 37 – 90% (Obr. 2g), prekračujúce amplifikáciu pozorovanú v striatum potkana (napr. Obr. 1). Účinok inzulínu na evokované [DA] \ to chýba v striatálnom komplexe v prednom mozgu chatou KO myši, čo dokazuje, že inzulínmi sprostredkované zvýšenie uvoľňovania DA vyžaduje striatálne ACh, ale nie ko-uvoľnené vysielače z ChI, ako je glutamát36.

Vplyv inzulínu na evokované [DA]o je závislá od stravy

Koncentrácie inzulínu v plazme a mozgu sú úmerné adipozite tela6, 7, 8a mohli by viesť k kompenzačným zmenám v citlivosti mozgu na inzulín. Preto sme testovali hypotézu, že diéta ovplyvňuje schopnosť inzulínu podporovať uvoľňovanie DA, s použitím striatálnych rezov z potkanov udržiavaných buď na chronickej FR alebo OB diéte oproti AL kontrolám. Ako sa očakávalo, plazmatické hladiny inzulínu korelovali s telesnou hmotnosťou, s nižším inzulínom vo FR ako u AL alebo OB potkanov (Obrázok 3a a Tabuľka 2). Napriek týmto rozdielom v cirkulujúcom inzulíne, vrchol vyvolaný [DA]o v NAc škrupine a jadre a CPu bol výrazne nižší v ex vivo striatálne rezy oboch skupín stravy v porovnaní s AL (Obr. 3b a Doplnkový obrázok 2 a, b), čo znamená, že faktory okrem inzulínu riadia absolútne vyvolané [DA]o, Obsah striatálneho DA sa v diétnych skupinách nelíšil, čo poukazuje na zmenu regulácie uvoľňovania namiesto syntézy DA (Doplnkový obrázok 2c). V súlade so zmenou dynamickej regulácie bola citlivosť striatálneho uvoľňovania DA na inzulín výrazne závislá od diéty. U potkanov FR koncentrácia inzulínu ≤ 1 nM, ktorá nemala žiadny účinok na AL (Obr. 1b), zvýšené evokované [DA]o (Obr. 3c), čo odráža zvýšenú citlivosť na inzulín u EC50 hodnoty v FR striatum (0.4 – 0.6 nM), ktoré boli približne rádovo nižšie ako hodnoty AL (porovnaj Obr. 1b a 3c). V nápadnom kontraste sa účinok inzulínu stratil v OB striatum; inzulín 30 nM, ktorý mal maximálny účinok v AL striate (Obr. 1b), nemal žiadny účinok na OB (\ tObr. 3c).

Obrázok 3: Inzulínom indukované zvýšenie evokovaného [DA]o sú zosilnené FR a stratené v OB.
  

Inzulínom indukované zvýšenia evokovaných [lsqb] DA sú zosilnené FR a stratené v OB.   

(a) Plazmatická koncentrácia inzulínu pozitívne koreluje s telesnou hmotnosťou v kŕmnych skupinách (R= 0.76). (b) Priemerný jednorazový impulz evokovaný [DA]o v jadre NAc (pozri Doplnkový obrázok 2a, b pre NAc shell a CPu) bola nižšia vo FR (38 ± 4%) a OB (25 ± 4%) oproti AL (n= Miesta 50 – 60 u potkanov 5 – 6 na jednu diétu, \ t F2,15623.337, jednosmerná ANOVA, Tukey HSD; ***P<0.001); OB verzus FR (P<0.08). (c) Citlivosť evokovaného [DA]o inzulínu bola zvýšená vo FR, ale stratená v OB (n21 – 49 miesta na subregión na koncentráciu z potkanov 2 – 4 na jednu diétu, jednosmerná ANOVA, Tukey HSD), s väčšou citlivosťou vo FR oproti AL potkanom vo všetkých subregiónoch (P<0.001 pre každý región; obojsmerná ANOVA; CPU: F(conc × diéta; 3,286)= 10.253; jadro: F(conc × diéta; 3,353)= 6.166; shell: F(conc × diéta; 3,195)= 10.735).

 

 

Tabuľka 2: Konečná telesná hmotnosť, zmena hmotnosti, plazmatický inzulín a hodnoty glukózy v krvi u potkanov pri AL, OB alebo FR strave.
  

 

 

Tieto údaje naznačujú inverzný vzťah medzi citlivosťou striatálneho InsR a telesnou adipozitou. Alternatívne však tieto rozdiely závislé od stravy môžu odrážať zmenenú citlivosť nAChR. Preto sme určili koncentráciu odpovede na nikotín v NAc jadre z každej diétnej skupiny. Nikotín spôsobuje desenzibilizáciu nAChR, ktorá môže byť kvantifikovaná porovnaním pomeru [DA]o vyvolané krátkym súpisom piatich impulzov pri 100 Hz až po jeden impulzom vyvolaný [DA]o (5 p: 1 p pomer) ako index nAChR aktivácie / desenzibilizácie30, 31, Pomocou tohto prístupu sme nezistili žiadne rozdiely medzi dietetickými skupinami v citlivosti nAChR v jadre NAc (Doplnkový obrázok 3a – c). Okrem toho sa kontrolný pomer 5 p: 1 p nelíšil medzi diétnymi skupinami v jadre NAc (Doplnkový obrázok 3d) alebo CPu (neznázornené), čo znamená, že diéta nemení nAChR-dependentnú reguláciu uvoľňovania DA. Zdá sa teda, že striatálna citlivosť InsR je zvýšená vo FR oproti potkanom AL, ale v OB potkanoch chýba, so stratou regulácie uvoľňovania striatálneho DA pri fyziologických koncentráciách inzulínu.

NAc shell inzulín moduluje podmienené preferencie chuti

Potravinové preferencie sú vytvárané pred- aj post-ingestívnymi faktormi; mechanizmy pre každého nie sú úplne vyriešené, ale súčasné dôkazy naznačujú, že NAc DA signalizácia je v obidvoch37, 38, Vzhľadom na to, že hladiny inzulínu v plazme a mozgovomiechovom moku (CSF) rýchlo stúpajú po zvýšení periférnej glukózy6a že zvýšenie inzulínu v striate môže byť detegované v rámci 5 min zvýšenia plazmatického inzulínu7je logické predpokladať, že periférne uvoľňovanie inzulínu počas jedla by mohlo zvýšiť uvoľňovanie NAc DA a prispievať k post-ingestívnym mechanizmom odmeňovania. Upravili sme už opísaný protokol preferencie chuti37 s roztokmi glukózy sladenými sacharínom u potkanov, aby sa otestovala hypotéza, že blokovanie účinku endogénneho inzulínu prostredníctvom lokálnej aplikácie inzulínovej protilátky (InsAb) v NAc by znížilo preferenciu párovej chuti. Účinnosť InsAb pri blokovaní účinkov inzulínu bola testovaná v in vitro test absorpcie DA do striatálnych synaptozómov. Inzulín (30 nM) spôsobil signifikantné zvýšenie hladiny Vmax v synaptozómoch z NAc alebo CPu (Doplnkový obrázok 4), v súlade s našimi Vmax údaje zo striatálnych rezov (Tabuľka 1) as predchádzajúcimi štúdiami18, 19, 20, 21, 22, 23, V neprítomnosti inzulínu InsAb ani kontrolná protilátka imunoglobulín G (IgG) nezmenili Vmax pre príjem DA oproti kontrole. V prítomnosti IgG, inzulín stále spôsobil významné zvýšenie Vmax; avšak účinok inzulínu na Vmax bola stratená v prítomnosti InsAb (Doplnkový obrázok 4).

Aby sa minimalizovalo poškodenie tkaniva a zachovala sa citlivosť cieľového tkaniva, testovali sa dve skupiny subjektov, v ktorých sme striedali intrainjekčnú mikroinjekciu s falošným mikroinjekčným postupom, namiesto použitia jednej skupiny jedincov a párovania jedného ochuteného roztoku s InsAb a iným s injekčnou aplikáciou. vozidlo. Následne, počas jednodávkových stretnutí, experimentálna skupina dostala InsAb mikroinjekcie spojené s jednou z dvoch príchutí a na striedajúcich sa sedeniach, falošnými mikroinjekciami spárovanými s inou príchuťou (Obrázok 4a, vľavo). Kontrolná skupina dostala falošnú mikroinjekciu striedanú s mikroinjekciami buď fosfátom pufrovaného fyziologického roztoku (PBS) alebo IgG. Obidva ochutené roztoky obsahovali počas kondicionovania glukózu. V skupine kontrolných mikroinjekcií sa neočakávala žiadna diferenciálna preferencia medzi príchuťami, pričom sa očakáva, že preferencia sa posunie smerom k falošnej mikroinjekčnej párovej príchute v skupine InsAb-mikroinjektovaných.

Obrázok 4: Mikroinjekcia InsAb do škrupiny NAc znižuje preferencie chuti.
  

Mikroinjekcia InsAb do škrupiny NAc znižuje preferencie chuti.   

(a) Schéma znázorňujúce kondicionovanie s jednou fľašou (vľavo) a test s dvoma fľašami (vpravo). (b) Objem spotrebovaný (ml) počas jednodávkových sedení. Významná interakcia medzi infúznou úpravou a mikroinjekčnou liečbou (n= Potkany 19 – 20 na skupinu, F(3,111)= 3.088, P<0.05, 2 × 4 zmiešaná ANOVA s opakovanými meraniami pri infúznom kondicionovaní). Mikroinjekcia InsAb významne znížila spotrebu v porovnaní s kontrolou počas tretej (t(40) = 3.026, **P<0.01) a štvrtý (t(40) = 3.052, **P<0.01, chránený jednostranný t- testy) infúzie. Mock injekcie nemali žiadny vplyv na spotrebu v žiadnej skupine (F3,111= 1.110, 2 × 4 zmiešaná ANOVA s opakovanými meraniami na simulovanej klimatizačnej relácii). (c) Objem spotrebovaný počas testu s dvoma chuťovými preferenciami. Počas kondicionovania došlo k významnej interakcii medzi úpravou chuti a mikroinjekcie (F1,37= 5.36, P<0.05, obojsmerne zmiešaná ANOVA s opakovanými meraniami arómy). Skupina InsAb konzumovala výrazne menej príchuti spárovanej s InsAb v porovnaní s príchuťou simulovanej spárovania (t(18) = 2.82, ** P<0.01, chránený jednostranný t-test); kontrolná skupina nevykazovala žiadne preferencie chuti (t(19) = 0.803, P> 0.05, chránené t-test). Porovnávacie skupiny, InsAb potkany pili významne menej infúziou spárovanej príchute (t(40) = 1.96, *P<0.05) a podstatne viac simulovane spárovanej príchute (t(40) = 1.77, *P<0.05, chránený jednostranný t-test) ako kontroly.

 

 

Počas jednodávkových sedení, InsAb mikroinjekcia významne znížila spotrebu v porovnaní s vehikulom počas tretej a štvrtej infúzie (Obr. 4b). Naproti tomu obe skupiny konzumovali rovnaký objem roztoku počas všetkých štyroch simulovaných injekčných sedení (F3,111= 0.127, P>0.05, zmiešaná obojsmerná ANOVA) (Obr. 4b). Po celkovo ôsmich kondicionačných sedeniach sa preferencia chuti hodnotila v dvojfázovom teste, v ktorom potkany mali prístup k obom ochuteným roztokom súčasne (Obrázok 4a). Štatistická analýza odhalila významnú interakciu medzi príchuťou a mikroinjekčnou liečbou, ktorá sa získala počas kondicionovania (Obr. 4c). Skupina InsAb konzumovala významne menej príchutí InsAb-spárovaných v porovnaní s falošnou párovou príchuťou (Obr. 4c), zatiaľ čo skupina vozidiel nevykazovala žiadne preferencie \ tObr. 4c), čo znamená, že neporušená inzulínová signalizácia prispela k výberu sladkého kalorického roztoku. V porovnaní s vehikulom, InsAb-mikroinjektované potkany pili významne menej infúziou spárovanej príchute a významne viac falošnej príchuti spárovanej injekciou (Obr. 4c). Mikroinjekcia IgG (t(9) = 0.792. P>0.05, chránené t- testy) alebo PBS (t(9) = 0.442. P>0.05, chránené t- testy) nemali žiadny vplyv na preferencie chuti (údaje nie sú uvedené), argumentujúc proti možnosti, že nešpecifický účinok mikroinjekcie InsAb znížil spotrebu alebo preferencie chuti. Treba tiež poznamenať, že preferencia skupiny InsAb pri teste nie je uprednostňovaná pre menej novú príchuť, pretože pre skupinu InsAb nebola žiadna interakcia medzi typom relácie a typu relácie (skutočná infúzia v porovnaní s falošnou infúziou).F3,54= 1.584, P> 0.05, obojsmerná ANOVA). To znamená, že skupina InsAb nekonzumovala viac príchuti simulovanej infúzie spárovanej s príchuťou spárovanej infúzie InsAb; skôr sa rozdiely medzi liečebnými skupinami objavili až počas infúznych sedení. Celkovo tieto údaje naznačujú, že inzulín v NAc hrá úlohu pri posilňovaní preferencie arómy, ktorá signalizuje glykemickú záťaž.

 

 

  

Diskusia

  

Uvádzame tu, že inzulín zosilňuje striatálne uvoľňovanie DA spôsobom závislým od nAChR modulovaním ChI excitability prostredníctvom InsRs. Naše výsledky naznačujú, že inzulín môže slúžiť ako odmenný signál, okrem svojej zavedenej úlohy v signalizácii sýtosti. Je pozoruhodné, že účinok inzulínu na uvoľňovanie DA je modulovaný diétou, s výrazne zvýšenou citlivosťou na inzulín po FR, ale úplnou stratou regulácie zvýšenej inzulínom na diéte OB. Zdá sa, že tieto zmeny odrážajú zmeny v citlivosti InsR, ktoré sú nepriamo úmerné hladinám cirkulujúceho inzulínu, keďže hladiny inzulínu v plazme boli závislé od diéty, ale citlivosť nAChR nebola. Nakoniec, naše štúdie o preferenciách chuti pri chovaní zvierat naznačujú, že inzulínová signalizácia v škrupine NAc ovplyvňuje preferencie potravín, čo nielenže implikuje inzulín pri vzdelávaní súvisiacom s potravinami, ale tiež potvrdzuje svoju úlohu ako signál odmeňovania.

Net [DA]o odráža rovnováhu medzi uvoľňovaním DA a absorpciou DA cez DAT. Predchádzajúce dôkazy preukazujúce, že inzulín môže regulovať aktivitu DAT18, 19, 20, 21, 22, 23 viedli k predikcii, že zvýšenie inzulínu by malo spôsobiť čistý pokles evokovaného [DA]o prostredníctvom zvýšeného príjmu DA. Zistili sme však, že v striate je účinok inzulínu zložitejší ako tento. Aj keď sa expozícia inzulínu zvýšila Vmax pre DAT bol primárny účinok inzulínu na DA uvoľnenie, nie na DA absorpciu, s konzistentným zvýšením evokovaného [DA]o vo fyziologickom rozsahu koncentrácií inzulínu v NAc shell a jadre a v CPu. Hoci nárast evokovaného [DA]o kontrolných hladín pri suprafyziologickej koncentrácii 100 nM, Vmax bol tiež nezmenený od kontroly, čo eliminovalo prevládajúci účinok na DAT ako vysvetlenie. Namiesto toho strata účinku na absorpciu, ako aj uvoľňovanie, znamená desenzibilizáciu InsRs alebo down-reguláciu downstream signálnych dráh pri vysokých koncentráciách inzulínu. V skutočnosti, InsRs podliehajú rýchlej endocytóze a degradácii po viazaní inzulínu v periférnych tkanivách1s objavujúcimi sa dôkazmi o strate citlivosti na neuronálnu InsR po krátkodobom vystavení vysokým hladinám inzulínu alebo diéty s vysokým obsahom kalórií10, 11, 39.

Dominantný účinok inzulínu na zvýšenie striatálneho uvoľňovania DA, ktorý je tu uvedený, kontrastuje s výsledkami dvoch ďalších nedávnych ex vivo štúdie rezov. V prvom prípade inzulín spôsobil pokles elektricky vyvolaného prepadu [3H] DA zo striatálnych rezov, hoci sa zvýšila [3H] DA prepad bol detegovaný, keď bol DAT inhibovaný22, Vzhľadom k tomu, že uvoľnený [3H] DA musí uniknúť DAT-sprostredkovanému príjmu v tkanive, ktoré sa má detegovať v superfúznom roztoku, tento protokol je obzvlášť citlivý na DAT reguláciu. Naše výsledky ukazujú, že inzulín zvyšuje uvoľňovanie DA prostredníctvom ChIs a aktivácie nAChR, okrem zvýšenia príjmu sprostredkovaného DAT, by vysvetlil zdanlivo paradoxné zvýšenie inzulín-zosilneného [3H] DA prepad, ktorý bol pozorovaný, keď boli blokované konkurenčné účinky na DAT22, Druhá štúdia použila FCV na priamu detekciu somatodendritického uvoľňovania DA vo VTA, ale tiež zistila prevládajúci účinok inzulínu na príjem DA, čo sa prejavilo zníženým evokovaným [DA]o (Ref. 23). Rozdiely v mnohých faktoroch, od lokálnej mikrocirkulácie po somatodendritické versus axonálne mechanizmy uvoľňovania DA40by mohli prispieť k tomuto regionálnemu rozdielu. Ako je ďalej diskutované nižšie, regionálne závislé úlohy inzulínu sú skôr komplementárne ako protichodné.

Predtým sa predpokladalo, že akákoľvek úloha inzulín-dependentnej regulácie DA signalizácie je sprostredkovaná priamou aktiváciou InsRs na DA neurónoch. Ukázali sme, že InsRs sú tiež exprimované na striatálnych ChI a že inzulín moduluje excitabilitu ChI na zosilnenie striatálneho uvoľňovania DA, čo môže zohrávať kľúčovú úlohu pri účinku inzulínu na diétu. Striatálne ChI dostávajú projekcie z neurónov intralaminárnych jadier talamu, ktoré vykazujú výbuch v reakcii na výrazné zmyslové podnety a pomáhajú stimulovať roztrhané vzory v ChI, ktoré sú dôležité pri usmerňovaní pozornosti, posilňovaní a asociatívnom učení.41, Preto účinok inzulínu v InsRs na striatálne ChIs by mohol zvýšiť účinok senzorických podnetov na striatálnu reakciu na talamické pálenie, čo by prispelo k zvýšenému vnímaniu hodnoty odmeny požitého jedla. Priama podpora striatálneho uvoľňovania DA aktiváciou ChI viedla k podnetu, že faktory, ktoré stimulujú ChI, budú mať privilegovanú úlohu ako spúšťače vydania DA33, Naše údaje poskytujú prvý podporný dôkaz tohto, s excitabilitou ChI s posilnenou inzulínom a signalizáciou ACh, ktorá riadi dynamické zvyšovanie uvoľňovania DA.

Zvýšené uvoľňovanie DA v prítomnosti inzulínu tiež namieta proti zvýšeniu ACh signalizácie v rozsahu, ktorý spôsobuje desenzibilizáciu nAChR alebo aktiváciu muskarínového ACh receptora (mAChR), pričom každá z nich môže potláčať jedno-pulzne vyvolané [DA]o (ref 29, 30, 31, 42). Tu opísané mechanizmy sú teda odlišné od aktivácie mAChRs ACh, ktorá bola asociovaná s averziou a sýtosťou43.

Jednosmerne vyvolané [DA]o u potkanov FR aj OB bola nižšia ako u potkanov AL; hoci tieto výsledky sú v súlade s predchádzajúcimi správami44, 45, 46naše štúdie poskytujú prvé systematické porovnanie troch striatálnych subregiónov v dvoch stravovacích skupinách v konštantnom časovom rámci. Mechanizmy, ktoré sú základom zmien v uvoľňovaní DA závislých od diéty, neboli objasnené a presahujú rámec týchto štúdií. Avšak vzhľadom na to, že hladiny inzulínu v plazme sú opačne pozmenené FR a OB diétou, je nepravdepodobné, že by sa znížila evokovaná hodnota [DA]o v obidvoch skupinách je dôsledkom hladiny inzulínu závislej od diéty.

Na druhej strane zmeny citlivosti InsR na diétu a následné plazmatické hladiny inzulínu závislé od diéty poskytujú najpravdepodobnejšie vysvetlenie zvýšenej citlivosti na inzulín vo FR a stratu citlivosti na inzulín v OB. Nebol žiaden dôkaz alternatívneho vysvetlenia zmenenej citlivosti nAChR u potkanov FR alebo OB oproti AL. Aj keď naše zistenia patria medzi prvé, ktoré indikujú zvýšenú citlivosť striatálneho InsR s FR18úbytok hmotnosti môže byť sprevádzaný zníženými hladinami inzulínu v CSF7, ktoré by prispeli k zvýšenej citlivosti uvoľňovania DA na inzulín vo FR. Naopak, strata citlivosti na inzulín u potkanov OB je v súlade s predchádzajúcimi dôkazmi o zníženej citlivosti mozgu na InsR indukovanú zvýšením telesnej hmotnosti alebo diétou OB.3, 10, 11.

Naše ex vivo Údaje o rezoch podporujú hypotézu, že inzulín môže signalizovať odmenu, ako aj sýtosť. Túto hypotézu sme testovali blokovaním účinku endogénneho inzulínu s bilaterálnou injekciou InsAb v NAc škrupine počas kondicionovania preferencie chuti. V súlade s úlohou v odmeňovaní, blokovanie účinku inzulínu znížilo preferenciu chuti párovaného roztoku obsahujúceho glukózu oproti chuti spojenej s intaktnou inzulínovou signalizáciou. Blokovanie inzulínu v NAc škrupine tiež znížilo spotrebu párového roztoku počas kondicionovania v jednej fľaši, zatiaľ čo falošné alebo kontrolné mikroinjekcie nemali žiadny vplyv na spotrebu. Tieto údaje naznačujú, že inzulín v NAc škrupine hrá úlohu v preferencii potravín. Predchádzajúce štúdie ukázali, že neporušená DA signalizácia v NAc je nevyhnutná na získanie dochucovania37, 38, potvrdzujúce úlohu NAc DA pri sprostredkovaní posilňujúcich účinkov nutričných roztokov. V tomto svetle preferencia roztoku glukózy spárovaného s nedotknutou dostupnosťou inzulínu namieta proti primárnemu účinku inzulínu na príjem DAT sprostredkovaného DAT v škrupine NAc, pretože by sa očakávalo, že sa zníži [DA].o a teda znížiť spotrebu príchute s párovaním kontrol. Naše výsledky sú tiež v súlade s výsledkami z predchádzajúcej štúdie, v ktorej mikroinjekcia inzulínu v škrupine NAc zvýšila čas, počas ktorého boli zvieratá zapojené do perorálneho podávania sacharózy, s hraničným zvýšením spotreby sacharózy26, čo bolo opakom očakávaného zvýšenia absorpcie DA. Celkovo sú tieto behaviorálne údaje konzistentné s predpokladaným vplyvom inzulínu na striatálne ChI a zvýšené uvoľňovanie DA. Tieto výsledky však nevylučujú zapojenie iných prvkov striatálnej mikrocirkulácie do sledovaného správania, vzhľadom na širokú expresiu InsR v striate.1, 14.

Uvedené štúdie poskytujú prvý dôkaz, že inzulín zohráva úlohu pri komunikácii kalorickej hodnoty, a teda aj odmeňujúcich účinkov jedla, čo má významný vplyv na vplyv inzulínu u pacientov s podváhou a obezitou. Niekoľko štúdií ukazuje, že post-ingestívne účinky jedla bez ohľadu na to, či sú cesty transdukcie chuti neporušené47, zvýšiť uvoľňovanie NAc DA a pozitívne posilnenie správania37, 47, Teda postabsorpčná inzulínová odpoveď môže kódovať glykemický výťažok jedla a prispievať k posilneniu potravinových preferencií a správania, ktoré umožňujú spotrebu. Avšak extrémne zmeny v hladinách cirkulujúceho inzulínu a centrálnej citlivosti na InsR by mohli mať úlohu pri abnormálnom, ako aj adaptívnom správaní. Napríklad hypoinzulinémia a kompenzačná upregulácia citlivosti InsR u pacientov s FR by mohla byť faktorom ich dispozície k záchvatu.48, Naopak, centrálna inzulínová necitlivosť pri diabete typu II alebo obezita, ktorá sa tu odráža u potkanov OB, by mohla prispieť k zníženiu pocitu odmeňovania po požití, čo by viedlo k príjmu potravy s vysokým glykemickým indexom ako kompenzácie.49, 50, Preto buď zvýšenie alebo zníženie striatálnej citlivosti na inzulín môže prispieť k patologickému jedeniu, čo má za následok prejedanie a / alebo obezitu.

Naše zistenia celkovo odhaľujú novú úlohu inzulínu ako odmeňovacieho signálu. Takáto úloha kontrastuje so svojou známou funkciou ako signál sýtosti, vrátane nedávnych zistení, že inzulín mikroinjekovaný do VTA môže znížiť hedonické kŕmenie a preferenciu podnetov spojených s odmenou jedla23, 24, To vyvoláva otázku, ako je možné zmierniť zdanlivo protichodné úlohy inzulínu v týchto funkciách závislých od DA. Odpoveď môže byť, že tieto účinky sú skôr komplementárne než protichodné. Súčasné výsledky naznačujú, že inzulín v striatu komunikuje hodnotu odmeny požitého jedla. Dvojitá úloha v signalizácii sýtosti môže jednoducho umožniť inzulínu, aby slúžil dôležitému účelu ukončenia jedla, pričom súčasne vytvára pamäť jeho nutričných a teda odmeňujúcich vlastností, čím sa posilňuje opakovanie ingestívneho správania.

 

 

  

Metódy

  

Manipulácia so zvieratami

Postupy na zvieratách boli v súlade s pokynmi NIH a schválené Výborom pre starostlivosť a používanie zvierat v NYU School of Medicine. Všetky zvieratá boli na 12 h svetle: tmavý cyklus, so svetlom zapnutým od 06: 00 až 18: 00; ex vivo Rezy boli pripravené medzi 08: 00 a 12: 00. Boli uskutočnené štúdie mechanizmu na potkanoch AL a myšiach ex vivo rezy zo zvierat umiestnených v pároch, zatiaľ čo potkany boli jednotlivo umiestnené na porovnanie všetkých skupín diét a na štúdie správania.

Diétne režimy potkanov

Dospelé samce potkanov Sprague – Dawley (Taconic) boli vo veku 8 – 10 týždne staré na začiatku diétneho režimu 21 – 30 dní. Potkany boli semi-náhodne rozdelené do skupín s diétou: jedinci boli zoradení podľa počiatočnej hmotnosti, potom bolo každé následné trio potkanov rozdelené náhodne medzi skupiny s diétou. AL potkany mali voľný prístup k potkanom potkanov v rovnakom období ako párované potkany na FR alebo OB diéte. Všetky potkany mali voľný prístup k vode. Obmedzenie potravín bolo implementované ako predtým51; potkany krátko dostávali 40-50% AL príjmu štandardného potkaniaho krmiva denne, až kým sa telesná hmotnosť neznížila o 20%, po čom sa potravina titrovala na udržanie tejto hmotnosti. OB potkany mali voľný prístup k potkanom a čokoláde potkanov. Zabezpečte vysoko chutnú tekutinu so stredne vysokým obsahom tuku a cukru52.

predného mozgu chatou vyradených myší

Myši s podmienenou floxovanou alelou chatou (chatouflox) boli krížené s a Nkx2.1Cre transgénnu líniu na produkciu myší, u ktorých je ablácia syntézy ACh obmedzená na predný mozog32, Nemutované transgénne súrodenci boli kontroly; ich genotypy Cre+;chatouflox / + a Cre-;chatouflox / flox "heterozygoti". Dospelé samce myší použité na štúdie rezu mali podľa chuti prístup ku krmivu a vode.

Ex vivo príprava rezov a fyziologické roztoky

Potkany alebo myši boli hlboko anestetizované 50 mg kg-1 pentobarbital (intraperitoneálne (ip)) a dekapitovaný. Pre voltametriu boli rezy koronálnych predných mozgov (hrúbka 300-400-μm) narezané na vibračnom lopatkovom mikrotóme Leica VT1200S (Leica Microsystems; Bannockburn, IL) v ľadovo chladnom umelom CSF (aCSF) s pufrom HEPES obsahujúcim (v mM): NaCl (120); hydrogénuhličitan sodný3 (20); glukóza (10); Kyselina HEPES (6.7); KCl (5); Sodná soľ HEPES (3.3); CaCl2 (2); a MgS044 (2), ekvilibrované s 95% O2/ 5% CO2, Rezy sa potom udržiavali v tomto roztoku pri teplote miestnosti pre 1 h pred experimentovaním30, 32, 53, Pre elektrofyziológiu, po anestézii, boli potkany transkardiálne perfundované ľadovo studeným roztokom obsahujúcim (v mM): sacharózu (225); KCl (2.5); CaCl2 (0.5); MgCl2 (7); hydrogénuhličitan sodný3 (28); NaH2PO4 (1.25); glukóza (7); askorbát (1); a pyruvát (3) a ekvilibrovaný s 95% O2/ 5% CO2, V tomto roztoku sa narezali rezy, potom sa preniesli do regeneračnej komory v modifikovanom aCSF obsahujúcom (v mM): NaCl (125); KCl (2.5); NaH2PO4 (1.25); hydrogénuhličitan sodný3 (25); MgCl2(1); CaCl2 (2); glukóza (25); askorbát (1); pyruvát (3); a myo-inositol (4), ekvilibrovaný s 95% O2/ 5% CO2; tento roztok bol spočiatku pri 34 ° C, potom sa nechal postupne ochladiť na laboratórnu teplotu54, Všetky experimenty týkajúce sa voltametrie a fyziológie boli uskutočňované v ponornej záznamovej komore pri 32 ° C, ktorá bola superfúzovaná pri 1.5 ml min.-1 s aCSF obsahujúcim (v mM): NaCl (124); KCl (3.7); hydrogénuhličitan sodný3 (26); CaCl2 (2.4); MgSO4 (1.3); KH2PO4 (1.3); a glukózy (10) a albumínu hovädzieho séra (BSA, 0.05 – 0.1 mg ml \ t-1) ekvilibrované s 95% O2/ 5% CO2; rezy sa nechali ekvilibrovať v tomto prostredí pre 30 min pred experimentovaním.

Rýchla kontrola cyklickej voltametrie

Štúdie evokovaného uvoľňovania DA sa uskutočňovali s použitím FCV v rezoch mozgu32, 53 pripravené zo samcov potkanov alebo chatou vyradených myší predného mozgu a kontroly heterozygotov (5 – 8 týždňov). Štúdie v chatou vyradené myši boli zaslepené, ale skupiny potkanov mali zjavné fenotypy, ktoré bránili zaslepeniu. Voltametrické merania boli uskutočnené s Millar Voltammeter (k dispozícii na špeciálnu požiadavku Dr Julian Miller na St Bartholomew's a Royal London School of Medicine and Dentistry, University of London). Bežný trojuholníkový priebeh bol použitý pre FCV, s rozsahom skenovania −0.7 na + 1.3 V (oproti Ag / AgCl), rýchlosť skenovania 800 V s-1a interval vzorkovania 100 ms30, 32, 53, Údaje sa získali s použitím dosky DigiData 1200B A / D riadenej softvérom Clampex 7.0 (Molecular Devices). Uvoľňovanie DA bolo vyvolané pomocou koncentrickej stimulačnej elektródy; amplitúda stimulačného impulzu bola 0.4 – 0.6 mA a trvanie bolo 100 μs30, 32, 53, Lokálna pulzová stimulácia bola použitá v NAc jadre a CPu; krátke vysokofrekvenčné impulzové zariadenie (päť impulzov pri 100 Hz) sa však použilo na zosilnenie evokovaného [DA]o v NAc shell. Obidve stimulačné paradigmy evokujú uvoľňovanie DA, čo je akčný potenciál a Ca2+ závislý, neovplyvnený súčasne uvoľneným glutamátom a GABA42, 55a uľahčené súbežne uvoľneným ACh29, 30, 31, 32, 33, 34, Kvantifikovať evokované [DA]oelektródy boli kalibrované so známymi koncentráciami DA pri 32 ° C po každom experimente v aCSF a v prítomnosti každého liečiva použitého počas daného experimentu53.

Voltametrické experimenty na stanovenie účinku inzulínu na evokované [DA]o boli získané použitím jedného z dvoch protokolov. Počiatočné experimenty na stanovenie časového priebehu účinku inzulínu (Sigma, I5523) sa uskutočnili monitorovaním vyvolaným [DA]o každý 5 min na jednom mieste. Inzulín bol aplikovaný po dôslednom vyvolaní [DA]o (zvyčajne merania 4 – 5); účinok inzulínu bol maximálny po 50 – 60 min a potom vyvolaný [DA]o zostala na tejto úrovni počas trvania experimentu (typicky 90 min celková expozícia inzulínu; Obr. 1c). Následne bol účinok inzulínu hodnotený záznamom evokovaným [DA]o na 4 – 5 diskrétne miesta v rezoch (+ 1.5 mm od bregma) v každej z troch striatálnych subregiónov za kontrolných podmienok (aCSF alebo aCSF plus liek) a opäť v čase maximálneho účinku inzulínu (odber vzoriek cez 60 – 80 min) tieto vzorky boli spriemerované pre každú subregión. Účinok inzulínu sa znížil s časom po príprave rezu; minimalizovať čas ex vivo a na optimalizáciu použitia na zvieratách sa typicky testovali dve rezy z daného zvieraťa v záznamovej komore súčasne. Lieky používané na vyvolanie účinku inzulínu boli aplikované 15 min pred inzulínom prostredníctvom superfúzovania aCSF, vrátane trisacetoxymetylesteru HNMPA (HNMPA-AM).3; Enzo Life Sciences), S961 (Novo Nordisk), LY294002 (Sigma), pikropodofylotoxín (PPP; Tocris), mekamylamín (Tocris) a DHβE (Tocris). Ako je opísané vo výsledkoch, prípadná zmenená citlivosť nikotínových ACh receptorov medzi diétnymi skupinami bola testovaná porovnaním pomeru píku [DA]o vyvolané 5 p (100 Hz) s evokovaným vyvolaným 1 p (pomer 5 p: 1 p)30, 31 v NAc jadre v prítomnosti nikotínu 0 – 500 nM (Sigma).

Stanovenie V max z evokovaného [DA]o prechodov v striatálnych rezoch

Na vyhodnotenie zmien vyvolaných inzulínom v DAT-sprostredkovanom vychytávaní DA, počiatočná časť klesajúcej fázy evokovaného [DA]o krivky boli vybavené Michaelis-Menten rovnica extrahovať Vmax (maximálna rýchlostná konštanta príjmu)56. Km (ktorá je nepriamo úmerná afinite DAT pre DA) bola stanovená na 0.2 μM a je známe, že je podobná v rámci striatálnych subregiónov.57 a neovplyvnený inzulínom (pozri Doplnkový obrázok 4 titulok).

Nahrávanie celých buniek

Rezy mozgu sa pripravili z 29- až 35-dní starých samcov potkanov; záznamové podmienky boli identické s podmienkami používanými v štúdiách uvoľňovania DA. Záznamy s celými bunkovými prúdmi používali konvenčné metódy54, Striatálne ChI boli vizualizované pomocou mikroskopu Olympus BX51WI (Olympus America, Center Valley, PA) s kontrastnou optikou s infračervenou diferenciálnou interferenciou a vodnou imerziou × 40. Roztok pipety obsahoval (v mM): K-glukonát (129); KCl (11); HEPES (10); MgCl2 (2); EGTA (1); na2-ATP (2); na3-GTP (0.3); a upravený na pH 7.2 – 7.3 pomocou KOH. Pre zaznamenané neuróny, ktoré majú byť hodnotené na imunoreaktivitu ChAT, bol 0.3% biocytín zahrnutý do roztoku pipety a neuróny boli zaznamenané krátko (~ 5 min), aby sa minimalizovalo riedenie intracelulárneho obsahu. Odpor pipety bol ~ 3 – 5 MΩ. Záznamy sa získali s použitím zosilňovača Axopatch 200B (Molecular Devices, Sunnyvale CA) a filtrovania pri nízkej priepustnosti pri 2 kHz. ChI boli identifikované pomocou zavedených elektrofyziologických kritérií28; väčšina z nich bola pôvodne tonicky aktívna, ale aktivita sa po záplate zmenšovala. Reakcia na súčasnú injekciu bola však vo všeobecnosti robustná a konzistentná v priebehu času, a preto sa použila na skúmanie účinku inzulínu na excitabilitu ChI (pozri výsledky). V experimentoch na skúmanie úlohy InsRs a IGF-1Rs v tejto odozve sa aplikoval buď HNMPA alebo PPP aspoň 20 min pred tým, ako sa ChI ošetrila. Maximálne účinky samotného inzulínu boli typicky pozorované po ~ 16 min expozície, hoci v niektorých bunkách zvýšenie nebolo maximálne až do 50 min alebo dlhšie. Okrem toho, v štyroch zo šiestich neurónov zaznamenaných v PPP spôsobil inzulín počiatočné zníženie počtu hrotov pred obnovením a prekročením počiatočného čísla špice. V dôsledku toho sa vo všetkých experimentoch účinok inzulínu kvantifikoval porovnaním maximálneho účinku na počet hrotov s počtom hrotov vyvolaných bezprostredne pred aplikáciou inzulínu. Zjavný rozdiel v čase dosiahnutia maximálneho účinku by mohol odrážať množstvo faktorov, vrátane hĺbky zaznamenanej bunky v reze. Evokované akčné potenciály boli tiež zaznamenané v ChI v neprítomnosti inzulínu v porovnateľných časových bodoch.

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

Obsah DA v striatálnych rezoch potkanov (hrúbka 400-μm) sa určil pomocou vysokoúčinnej kvapalinovej chromatografie s elektrochemickou detekciou.58, Dvojice rezov boli ekvilibrované pre 30 min pri 32 ° C v aCSF a potom jeden rez na jeden pár bol inkubovaný počas ďalších 60 min pri 32 ° C v aCSF, zatiaľ čo druhý bol inkubovaný v aCSF s 10 alebo 30 nM inzulínom. V porovnaní s 30-60 min. Po inkubácii sa prebytok aCSF opatrne odstránil z rezov, odvážila sa vzorka striatálneho tkaniva (7-10 mg), zmrazila sa na suchom ľade a potom sa uskladnila pri teplote -80 ° C. V deň analýzy sa vzorky sonikovali v ľadovo chladnom, eluent, deoxygenovali argónom58, odstredil v mikrocentrifúge pre 2 min a supernatant bol injikovaný priamo do HPLC kolóny (BAS, West Lafayette, IN); detektorom bola sklenená uhlíková elektróda nastavená na 0.7 V proti Ag / AgCl.

imunohistochémia

Na imunohistochemické značenie sa potkany anestetizovali pentobarbitalom sodným (50 mg kg).-1, ip), potom perfundovaný transkardiálne s PBS (154mM NaCl v 10mM fosfátovom pufri, pH 7.2) nasledovaným 4% paraformaldehydom v tomto PBS; mozgy boli odstránené a koronálne rezy (20 μm) boli narezané a spracované konvenčným spôsobom27, 59, Imunofluorescenčné obrazy sa získali pomocou konfokálneho mikroskopu Nikon PM 800 vybaveného digitálnym fotoaparátom ovládaným softvérom Spot (Diagnostic Instruments Inc.) a pomocou objektívu × 100 (numerická apertúra = 1.4) alebo pomocou konfekčného mikroskopu Zeiss LSM 510 pomocou x63. (numerická apertúra = 1.2). Lasery boli argón (488 nm), He / Ne (543 nm) a He / Ne (633 nm). Konfokálny mikroskopový softvér vybral vhodné filtre pre každý laser. Veľkosť dierky sa líšila podľa použitého cieľa a hrúbky rezu vybranej v z- generovanie zásobníkov; Vybrali sme optimálnu hodnotu dierok označovanú softvérom (typicky 30 μm). Digitálne súbory boli analyzované dekonvolučným softvérom (AutoQuant Imaging) s finálnymi obrazmi spracovanými pomocou Adobe Photoshop 7.0. Všetky obrázky boli upravené pre jas a kontrast; takéto úpravy sa vykonali jednotne na všetky časti obrazu. Striatálne DA axóny boli identifikované použitím dvoch TH protilátok: polyklonálneho AB152 králičieho anti-TH (1: 800) a monoklonálneho MAB318 myšieho anti-TH (1: 500) (oba od Chemicon). Použili sa tri InsR protilátky: sc-57342 a sc-09 (1: 100; Santa Cruz) a PP5 (dar od Pfizer). Špecifickosť každého z nich bola preukázaná predtým60, 61a bol potvrdený v predložených štúdiách neprítomnosťou imunoznačenia protilátkami sc-57342 alebo PP5 v prítomnosti zodpovedajúceho blokujúceho peptidu. Protilátka ChAT bola AB144 (1: 200; Millipore) a biotín bol z Vector (1: 200). Použitými sekundárnymi protilátkami boli donkey anti-králičí Alexa 488 (Invitrogen), alebo donkey anti-králičí Cy2 (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME), oslí anti-kozí Cy3 (Jackson) a donkey anti-myší Cy5 (Jackson).

Na vyhodnotenie ko-lokalizácie InsRs v TH + axónoch sme použili metódy opísané skôr na identifikáciu prítomnosti Kir6.2, podjednotky tvoriacej póry ATP citlivej na póry.+ kanálov v DA axónoch27, Puncta reprezentujúca InsRs bola distribuovaná v upravených obrazoch, čo naznačuje, že superpozícia s TH imunoreaktivitou sa môže vyskytnúť v určitom stupni náhodne. Na overenie tohto predpokladu sme spočítali prekrytia InsR / TH v 42 nezávislých poliach v troch NAc imunoznačených rezoch z dvoch potkanov. Digitálne súbory InsR sa potom otočili o 90 ° v smere hodinových ručičiek a počet sa opakoval; rotácia znížila počet InsR puncta, ktorý bol lokalizovaný spolu s TH vo väčšine polí (pozri Výsledky). Pokles počtu superpozícií s rotáciou27 označuje podiel InsR puncta v každom striatálnom poli asociovanom s DA axónmi.

Krvná glukóza a inzulínový test ELISA

Kmeňová krv sa odobrala v čase dekapitácie pre štúdie rezov. Hladina glukózy v krvi sa okamžite stanovila štandardným monitorom glukózy v krvi. V prípade inzulínu sa do skúmaviek obsahujúcich EDTA odobrala ďalšia krv a centrifugovala sa v zariadení 1,500g pre 15 min; supernatant (plazma) sa odoberal a skladoval pri -80 ° C až do spracovania pomocou ELPCO potkanej inzulínovej ELISA súpravy.

Umiestnenie kanyly a histologické overenie

Štyridsaťjeden dospelých samcov potkanov Sprague-Dawley (Taconic a Charles River) spočiatku vážiacich 350-425 g sa anestetizoval ketamínom (100 mg kg).-1, ip) a xylazínu (10 mg kg-1a ip) a stereotaxicky implantované dvomi chronicky zavedenými vodiacimi kanylami (meradlo 26) umiestnenými bilaterálne 2.0 mm dorzálne k infúznym miestam v NAc mediálnom obale62 (1.6 mm anterior k bregma; 2.1 mm laterálne od sagitálneho stehu, hroty 8 ° smerom k stredovej línii, 5.8 mm ventrálne k povrchu lebky). Potkanom sa podával banamín (2.0 mg kg)-1subkutánne) ako pooperačné analgetikum po zotavení z anestézie a ráno po ňom. Jeden týždeň po operácii sa potkany umiestnili na FR (opísané vyššie) a udržali sa na 80% ich pooperačnej zotavovacej hmotnosti pre zvyšok štúdie. Umiestnenie kanyly bolo stanovené histologicky po ukončení testovania správania. Každá krysa bola usmrtená CO2, dekapitovaný a mozog odstránený a fixovaný v 10% pufrovanom formalíne po dobu> 48 hodín. Zmrazené koronálne rezy (hrúbka 40 μm) sa narezali na kryostate Reichert-Jung, rozmrazili sa pripevnené na sklenené podložné sklíčka potiahnuté želatínou a zafarbili sa kresylovou fialovou farbou. Údaje od danej krysy sa použili iba vtedy, ak boli obe kanyly v mediálnom plášti NAc62 (vrátane okraja tuberkulózy / jadra alebo škrupiny / čuchového \ tDoplnkový obrázok 5); na základe týchto kritérií boli dve krysy vylúčené z konečnej analýzy.

Predkondicionovanie kondicionovania preferencií

Potkany dostali jednu noc (v domácej klietke) a šesť 30-min-denných sedení pre-expozície (v testovacích komorách) do 0.2% sacharínu sodného (Sigma) vo vode s intervalom 48-h medzi zasadnutiami. Potkany potom dostali dve 5-min-denné relácie vystavenia 0.2% sodnej soli sacharínu v 0.05% nesladenom hroznovom alebo čerešňovom Kool-Aid (Kraft Foods) vo vode. Pre prvé stretnutie Kool-Aid pred expozíciou dostala polovica potkanov roztok s príchuťou čerešní a druhá polovica dostala roztok s príchuťou hrozna. Chuťové príchute sa zvrátili na druhom pred-expozičnom sedení Kool-Aid, aby sa zaistilo, že všetky potkany odobrali každú príchuť. Príjem bol meraný pre všetky pred-expozičné relácie. Testovacie komory boli číre plastové klietky s čerstvou podstielkou. Pre všetky pred-expozičné sedenia mali potkany prístup k rovnakému roztoku na oboch stranách komory. S výnimkou jednodňovej predexpozičnej relácie sa všetky sedenia uskutočňovali v miestnosti s behaviorálnou procedúrou, s obdobím návyku 30-min pred akýmkoľvek tréningom alebo testovaním.

Klimatizácia s jednou fľašou

Predchádzajúce štúdie ukázali, že mikroinjekcia InsAb do ventromediálneho hypotalamu môže blokovať účinok inzulínu na správanie sa kŕmenia a sekréciu glukagónu.63, 64, Použili sme tento prístup na posúdenie možnej úlohy inzulínu pri posilňovaní výberu potravín. Potkany boli semi-náhodne rozdelené na základe priemerného objemu pred podaním dávky do dvoch skupín, kontrolných alebo experimentálnych (InsAb). V kontrolnej skupine potkany dostali vehikulum (mikroinjekciu PBS; 137mM NaCl a 2.7mM KCl v 10mM fosfátovom pufri) alebo IgG (Abcam ab81032; 0.5 μg μl-1 v PBS, ako bolo prijaté) mikroinjekciu v NAc škrupine pred konzumáciou jedného z dvoch ochutených roztokov a falošnou mikroinjekciou pred spotrebovaním iného ochuteného roztoku. V experimentálnej skupine dostávali potkany mikroinjekciu Insc InsAb (Abcam ab46707; 0.5 μl 1 μg μl).-1 v PBS, ako bol prijatý) pred vystavením jednému ochutenému roztoku a falošnej mikroinjekcii pred vystavením druhému. Použili sa dve skupiny subjektov so striedaním medzi mikroinjekciou tekutiny a falošnou mikroinjekciou, takže celkový počet mikroinjekcií bol obmedzený na štyri, čím sa minimalizovalo možné poškodenie tkaniva a strata citlivosti na mieste mikroinjekcie.65, Na tekutú mikroinjekciu sa kontrolný roztok alebo InsAb naplnili do dvoch 30-cm dĺžok PE-50 hadičiek pripojených na jednom konci do injekčných striekačiek 5 μl Hamilton naplnených destilovanou vodou a na druhom konci do injekčnej kanyly 31-gauge, ktorá predĺžila 2.0 mm. mimo implantovaných vodidiel. Infúzne objemy 0.5 μl boli aplikované cez 90 s rýchlosťou 0.005 μl-1; injektor bol ponechaný na mieste, aby 60 umožnil čas na difúziu, potom bol injektor nahradený vodičom.

Potkany sa preniesli priamo do behaviorálnych komôr v 2 min po dokončení mikroinjekcie alebo falošnej mikroinjekcie. Kondicionačné roztoky obsahovali 0.2% sacharínu sodného, ​​0.05% nesladeného hrozna alebo čerešne Kool-Aid a 0.8% glukózy. Prístup k riešeniu bol obmedzený na 30 min na reláciu. Párová príchuť a strana komory s prístupom k pitiu boli v každej skupine semi-náhodne priradené a vyvážené. Interval medzi mikroinjekciami bol aspoň 72 h, striedavo medzi infúznymi a falošnými reláciami pre celkovo osem kondicionačných relácií.

Dvojfázový test preferencií

Štyridsaťosem hodín po poslednej relácii kondicionovania sa potkany umiestnili do testovacích komôr so súčasným prístupom k obidvom kondicionátorom; roztoky boli 0.2% sodná soľ sacharínu v 0.05% hroznového alebo čerešňového Kool-Aid, bez glukózy. Testovanie prebiehalo počas 2 dní (60 min za deň). Poloha pitnej skúmavky obsahujúca falošne spárovaný alebo infúzne spárovaný roztok sa striedala, aby sa zabezpečilo, že každý potkan sa testoval na spotrebu každého roztoku na oboch stranách klietky. Príjem každého ochuteného roztoku bol spriemerovaný pre dva testovacie dni, aby sa určila preferencia.

[3H] DA v striatálnych synaptozómoch na stanovenie účinnosti InsAb

Striatálne synaptozómy21, 66 boli pripravené z AL potkanov (samec, 350-400 g), s NAc (shell a jadro) a CPu oddelené a pripravené oddelene. Tkanivo z každej oblasti sa homogenizovalo v 15 objemoch ľadovo studeného 0.32 M sacharózového roztoku v sklenenom homogenizátore s motoricky poháňanou teflónovou paličkou; po opláchnutí a centrifugácii sa konečná peleta resuspendovala v ľadovo studenej 0.32 M sacharóze21, 66, Pred začatím [3H] DA test absorpcie66alikvóty synaptozómov v celkovom objeme 180 μl absorpčného pufra boli inkubované v trepačke pre 15 min pri 30 ° C v prítomnosti alebo neprítomnosti inzulínu 30 nM, vo vehikule (PBS) alebo v InsAb (konečné riedenie 1: 500) , v IgG (konečné riedenie 1: 500) alebo vo vehikule. Obsahuje tlmivý roztok (v mM): NaCl (122); na2HPO4 (3); NaH2PO4 (15); KCl (5); MgSO4 (1.2); glukóza (10), CaCl2 (1); nialamid (0.01); tropolon (0.1); a kyselina askorbová (0.001), pH 7.4. Príjem [3H] DA sa iniciovala rýchlym dávkovaním 20 μl každej synaptozomálnej suspenzie do doštičiek s 96 jamkami s rôznymi koncentráciami DA (0.003-1.0 μM) a [3H] DA (5 nM); po 5 min v doštičkovej trepačke pri 25 ° C bola absorpcia ukončená studenou, rýchlou vákuovou filtráciou66, Počty na jamku sa konvertovali na pmoly, potom sa korigovali na mg celkového proteínu za minútu. Všetky testy sa uskutočnili trojmo a opakovali sa aspoň štyrikrát; Vmax a Km boli vypočítané pomocou softvéru Biosoft Kell Radlig (Cambridge, UK).

Štatistická analýza

Údaje sú uvedené ako priemer ± sem; význam bol hodnotený pomocou párového alebo nepárového Studentovho testu ttesty alebo ANOVA, pokiaľ nie je uvedené inak. Pre údaje o voltametrii, n je počet záznamových miest, vzhľadom na to, že variabilita medzi miestami v rámci striatálneho subregiónu je väčšia ako variabilita medzi zvieratami alebo medzi rezmi30, 32, 55, 56; počet zvierat je zaznamenaný pre každý súbor údajov. ES50 na účinok inzulínu a nikotínu na vrchol vyvolaný [DA]o sa vypočíta použitím Prism 6.0 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Pre elektrofyziologické údaje sa štatistická významnosť hodnotila pomocou párovania ttesty alebo Wilcoxonov test v Prism 6.0, alebo zmiešaná obojsmerná ANOVA v SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC). Na vyhodnotenie postihnutia inzulínu pri kondicionovaní preferencie chuti sa dokončili dve úplné štúdie s použitím protokolov, ktoré boli identické s výnimkou použitej liečby vehikulom. V prvej štúdii krysy 10 dostali infúzie vehikula PBS a 9 dostal infúzie InsAB. V druhej štúdii krysy 10 dostali infúzie vehikula IgG a 10 dostal infúzie InsAb. Počas podávania infúznej úpravy nebol pozorovaný signifikantný rozdiel medzi dvomi skupinami vehikula (PBS alebo IgG) (F19= 0.619, zmiešaná obojsmerná ANOVA) s opakovanými meraniami na infúznom sedení) alebo pri teste (\ tF19= 0.012, obojsmerná zmiešaná ANOVA s opakovanými opatreniami na arómu). Následne boli tieto dva experimenty kombinované na analýzu. Na túto analýzu sa použila zmiešaná ANOVA 2 × 4 (s opakovanými meraniami v deň podania infúzie) na stanovenie účinkov mikroinjekčného ošetrenia počas kondicionovania, po ktorom nasledovala ochrana t- testy (jeden chvost, aby sa určilo, v ktorých kondičných sedeniach sa mikroinjekčná liečba znížila objem príjmu). Rovnaká analýza bola dokončená pre simulované sedenia. Aby sa určil účinok kondicionačnej liečby počas testu s dvoma fľaštičkovými príchuťovými preferenciami, údaje sa analyzovali použitím zmiešanej obojsmernej ANOVA (s opakovanými meraniami chuti), po ktorej nasledovali chránené t-testy (jeden sledoval test hypotézy, že InsAb zníži preferencie).

 

 

  

Ďalšie informácie

  

Ako citovať tento článok: Stouffer, MA et al, Inzulín zvyšuje uvoľňovanie striatálneho dopamínu aktiváciou cholinergných interneurónov a tým signalizuje odmenu. Nat. commun, 6: 8543 doi: 10.1038 / ncomms9543 (2015).

 

 

  

Referencie

  

  1. Schulingkamp, ​​RJ, Pagano, TC, Hung, D. & Raffa, RB Inzulínové receptory a pôsobenie inzulínu v mozgu: prehľad a klinické dôsledky. Neurosci. Biobehav. Rev. 24, 855 - 872 (2000).
  2. Gerozissis, K. Mozgový inzulín, energia a homeostáza glukózy; gény, životné prostredie a metabolické patológie. Eur. J. Pharmacol. 585, 38 – 49 (2008).
  3. CAS
  4. PubMed
  5. Článok
  6. Zobraziť kontext
  7. CAS
  8. PubMed
  9. Článok
  10. Zobraziť kontext
  11. CAS
  12. PubMed
  13. Článok
  14. Zobraziť kontext
  15. CAS
  16. PubMed
  17. Článok
  18. Zobraziť kontext
  19. CAS
  20. ISI
  21. PubMed
  22. Článok
  23. Zobraziť kontext
  24. ISI
  25. PubMed
  26. Článok
  27. Zobraziť kontext
  28. CAS
  29. PubMed
  30. Článok
  31. Zobraziť kontext
  32. Zobraziť kontext
  33. CAS
  34. ISI
  35. PubMed
  36. Článok
  37. Zobraziť kontext
  38. CAS
  39. ISI
  40. PubMed
  41. Článok
  42. Zobraziť kontext
  43. CAS
  44. ISI
  45. PubMed
  46. Zobraziť kontext
  47. ISI
  48. PubMed
  49. Článok
  50. Zobraziť kontext
  51. CAS
  52. ISI
  53. PubMed
  54. Článok
  55. Zobraziť kontext
  56. CAS
  57. ISI
  58. PubMed
  59. Článok
  60. Zobraziť kontext
  61. Zobraziť kontext
  62. CAS
  63. ISI
  64. PubMed
  65. Článok
  66. Zobraziť kontext
  67. CAS
  68. ISI
  69. PubMed
  70. Článok
  71. Zobraziť kontext
  72. CAS
  73. ISI
  74. PubMed
  75. Článok
  76. Zobraziť kontext
  77. PubMed
  78. Článok
  79. Zobraziť kontext
  80. Zobraziť kontext
  81. CAS
  82. PubMed
  83. Článok
  84. Zobraziť kontext
  85. ISI
  86. PubMed
  87. Článok
  88. Zobraziť kontext
  89. CAS
  90. ISI
  91. PubMed
  92. Článok
  93. Zobraziť kontext
  94. CAS
  95. ISI
  96. PubMed
  97. Článok
  98. Zobraziť kontext
  99. CAS
  100. PubMed
  101. Článok
  102. Zobraziť kontext
  103. Zobraziť kontext
  104. CAS
  105. ISI
  106. PubMed
  107. Článok
  108. Zobraziť kontext
  109. CAS
  110. ISI
  111. PubMed
  112. Článok
  113. Zobraziť kontext
  114. CAS
  115. ISI
  116. PubMed
  117. Článok
  118. Zobraziť kontext
  119. CAS
  120. ISI
  121. PubMed
  122. Článok
  123. Zobraziť kontext
  124. PubMed
  125. Článok
  126. Zobraziť kontext
  127. CAS
  128. ISI
  129. PubMed
  130. Článok
  131. Zobraziť kontext
  132. CAS
  133. PubMed
  134. Článok
  135. Zobraziť kontext
  136. CAS
  137. ISI
  138. PubMed
  139. Článok
  140. Zobraziť kontext
  141. CAS
  142. PubMed
  143. Článok
  144. Zobraziť kontext
  145. ISI
  146. PubMed
  147. Článok
  148. Zobraziť kontext
  149. Zobraziť kontext
  150. Zobraziť kontext
  151. CAS
  152. ISI
  153. PubMed
  154. Článok
  155. Zobraziť kontext
  156. CAS
  157. ISI
  158. PubMed
  159. Článok
  160. Zobraziť kontext
  161. CAS
  162. ISI
  163. PubMed
  164. Článok
  165. Zobraziť kontext
  166. CAS
  167. ISI
  168. PubMed
  169. Článok
  170. Zobraziť kontext
  171. CAS
  172. ISI
  173. PubMed
  174. Zobraziť kontext
  175. CAS
  176. ISI
  177. PubMed
  178. Článok
  179. Zobraziť kontext
  180. PubMed
  181. Článok
  182. Zobraziť kontext
  183. CAS
  184. ISI
  185. PubMed
  186. Článok
  187. Zobraziť kontext
  188. CAS
  189. ISI
  190. PubMed
  191. Článok
  192. Zobraziť kontext
  193. CAS
  194. ISI
  195. PubMed
  196. Článok
  197. Zobraziť kontext
  198. CAS
  199. ISI
  200. PubMed
  201. Článok
  202. Zobraziť kontext
  203. Zobraziť kontext
  204. CAS
  205. ISI
  206. PubMed
  207. Zobraziť kontext
  208. Zobraziť kontext
  209. Zobraziť kontext
  210. Zobraziť kontext
  211. CAS
  212. ISI
  213. PubMed
  214. Článok
  215. Zobraziť kontext
  216. CAS
  217. PubMed
  218. Článok
  219. Zobraziť kontext
  220. CAS
  221. ISI
  222. PubMed
  223. Zobraziť kontext
  224. Zobraziť kontext
  225. CAS
  226. PubMed
  227. Článok
  228. Zobraziť kontext
  229. ISI
  230. PubMed
  231. Článok
  232. Zobraziť kontext
  233. Zobraziť kontext
  234. ISI
  235. PubMed
  236. Článok
  237. Zobraziť kontext
  238. Zobraziť kontext
  239. CAS
  240. ISI
  241. PubMed
  242. Článok
  243. Zobraziť kontext
  244. Zobraziť kontext
  245. Vogt, MC & Bruning, JC Signalizácia inzulínu CNS pri kontrole energetickej homeostázy a metabolizmu glukózy - od embrya po starobu. Trendy endokrinol. Metab. 24, 76–84 (2013).
  246. Havrankova, J., Schmechel, D., Roth, J. & Brownstein, M. Identifikácia inzulínu v mozgu potkana. Proc. Natl Acad. Sci. USA 75, 5737 - 5741 (1978).
  247. King, GL & Johnson, S. Receptorom sprostredkovaný transport inzulínu cez endotelové bunky. Science 227, 1583 - 1586 (1985).
  248. Strubbe, JH, Porte, D. Jr & Woods, SC Inzulínové odpovede a hladiny glukózy v plazme a mozgovomiechovom moku počas pôstu a doplňovania potravy u potkanov. Physiol. Behav. 44, 205 - 208 (1988).
  249. Banks, WA & Kastin, AJ Diferenciálna permeabilita hematoencefalickej bariéry pre dva pankreatické peptidy: inzulín a amylín. Peptides 19, 883 - 889 (1998).
  250. Banky, WA Zdroj cerebrálneho inzulínu. Eur. J. Pharmacol. 490, 5 – 12 (2004).
  251. Nemoto, T. et al, Nové poznatky týkajúce sa syntézy inzulínu a jeho sekrécie v hipokampuse potkanov a mozgovej kôre: redukcia hladiny proinzulínu indukovaná amyloidom-p1-42 prostredníctvom glykogénsyntázy kinázy-3p. Cell Signal. 26, 253 – 259 (2014).
  252. De Souza, CT et al, Spotreba stravy bohatej na tuky aktivuje zápalovú reakciu a indukuje inzulínovú rezistenciu v hypotalame. Endokrinológia 146, 4192 – 4199 (2005).
  253. Anthony, K. et al, Zoslabenie reakcií vyvolaných inzulínom v mozgových sieťach riadiacich chuť k jedlu a odmenu v inzulínovej rezistencii: cerebrálny základ pre narušenú kontrolu príjmu potravy pri metabolickom syndróme? Cukrovka 55, 2986 – 2992 (2006).
  254. Kelley, AE & Berridge, KC Neuroveda o prírodných odmenách: význam pre návykové drogy. J. Neurosci. 22, 3306 - 3311 (2002).
  255. Koob, GF & Volkow, ND Neurocircuitry of návyku. Neuropsychopharmacology 35, 217–238 (2010).
  256. Werther, GA et al, Lokalizácia a charakterizácia receptorov inzulínu v mozgu potkanov a hypofýze pomocou in vitro autorádiografia a počítačová denzitometria. Endokrinológia 121, 1562 – 1570 (1987).
  257. Figlewicz, DP, Evans, SB, Murphy, J., Hoen, M. & Baskin, DG Expresia receptorov pre inzulín a leptín vo ventrálnej tegmentálnej oblasti / substantia nigra (VTA / SN) potkana. Brain Res. 964, 107 - 115 (2003).
  258. Daws, LC et al, Inzulínová signalizácia a závislosť. Neurofarmakológia 61, 1123 – 1128 (2011).
  259. Figlewicz, DP & Sipols, AJ Energetické regulačné signály a potravinová odmena. Pharmacol. Biochem. Behav. 97, 15–24 (2010).
  260. Patterson, TA et al, Potravinová deprivácia znižuje mRNA a aktivitu potkanieho dopamínového transportéra. Neuroendokrinológia 68, 11 – 20 (1998).
  261. Carvelli, L. et al, Regulácia PI 3-kinázy príjmu dopamínu. J. Neurochem. 81, 859 – 869 (2002).
  262. Williams, JM et al, Hypoinsulinémia reguluje reverzný transport dopamínu indukovaný amfetamínom. PLoS Biol. 5, e274 (2007).
  263. Zhen, J., Reith, MEA & Carr, KD Chronické obmedzenie potravy a funkcia transportéra dopamínu v striate potkana. Brain Res. 1082, 98–101 (2006).
  264. Schoffelmeer, AN et al, Inzulín moduluje kokaín-senzitívnu funkciu transportéra monoamínu a impulzívne správanie. J. Neurosci. 31, 1284 – 1291 (2011).
  265. Mebel, DM, Wong, JC, Dong, YJ & Borgland, SL Inzulín vo ventrálnej tegmentálnej oblasti znižuje hedonické kŕmenie a potláča koncentráciu dopamínu zvýšeným spätným vychytávaním. Eur. J. Neurosci. 36, 2336 - 2346 (2012).
  266. Labouebe, G. et al, Inzulín indukuje dlhodobú depresiu dopamínových neurónov ventrálnej tegmentálnej oblasti prostredníctvom endokanabinoidov. Nat. Neurosci. 16, 300 – 308 (2013).
  267. Konner, AC et al, Úloha inzulínovej signalizácie v katecholaminergných neurónoch pri kontrole energetickej homeostázy. Cell Metab. 13, 720 – 728 (2011).
  268. Figlewicz, DP, Bennett, JL, Aliakbari, S., Zavosh, A. & Sipols, AJ Inzulín pôsobí na rôznych miestach CNS, aby znížil akútny príjem sacharózy a samopodanie sacharózy u potkanov. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 295, R388 - R394 (2008).
  269. Patel, JC, Witkovsky, P., Coetzee, WA & Rice, ME Subsekundová regulácia striatálneho uvoľňovania dopamínu presynaptickým KATP kanály. J. Neurochem. 118, 721 – 736 (2011).
  270. Tepper, JM & Bolam, JP Funkčná rozmanitosť a špecifickosť neostriatálnych interneurónov. Curr. Názor. Neurobiol. 14, 685 - 692 (2004).
  271. Zhou, FM, Liang, Y. & Dani, JA Endogénna nikotínová cholinergná aktivita reguluje uvoľňovanie dopamínu v striate. Nat. Neurosci. 4, 1224 - 1229 (2001).
  272. Rice, ME & Cragg, SJ Nikotín zosilňuje dopamínové signály spojené s odmenou v striate. Nat. Neurosci. 7, 583 - 584 (2004).
  273. Zhang, H. & Sulzer, D. Frekvenčná modulácia uvoľňovania dopamínu nikotínom. Nat. Neurosci. 7, 581 - 582 (2004).
  274. Patel, JC, Rossignol, E., Rice, ME & Machold, RP Protikladná regulácia striatálneho uvoľňovania dopamínu a prieskumné motorické správanie predným mozgom a cholinergnými vstupmi mozgového kmeňa. Nat. Commun. 3, 1172 (2012).
  275. Threlfell, S. et al, Uvoľňovanie striatálneho dopamínu sa spúšťa synchrónnou aktivitou v cholinergných interneurónoch. Neuron 75, 58 – 64 (2012).
  276. Cachope, R. et al, Selektívna aktivácia cholínergných interneurónov zvyšuje uvoľňovanie akumulovaného fázového dopamínu: nastavenie tónu pre spracovanie odmien. Cell Rep. 2, 1 – 9 (2012).
  277. Jones, IW, Bolam, JP & Wonnacott, S. Presynaptická lokalizácia imunoreaktivity nikotínového acetylcholínového receptora beta2 podjednotky v potkaních nigrostriatálnych dopaminergných neurónoch. J. Comp. Neurol. 439, 235 - 247 (2001).
  278. Higley, MJ et al, Cholinergné interneuróny sprostredkovávajú rýchly VGluT3-dependentný glutamátergický prenos v striate. PLoS ONE 6, e19155 (2011).
  279. Touzani, K., Bodnar, R. & Sclafani, A. Aktivácia dopamínových D1-podobných receptorov v nucleus accumbens je rozhodujúca pre získanie preferencií arómy podmienenej výživou, ale nie pre expresiu. Eur. J. Neurosci. 27, 1525 - 1533 (2008).
  280. Sclafani, A., Touzani, K. & Bodnar, RJ Dopamín a naučené potravinové preferencie. Physiol. Behav. 104, 64 - 68 (2011).
  281. Mayer, CM & Belsham, DD Centrálna inzulínová signalizácia je oslabená dlhodobou expozíciou inzulínu prostredníctvom fosforylácie serínu substrátom 1 inzulínu, degradáciou proteazómu a degradáciou lyzozomálneho receptora inzulínu. Endocrinology 151, 75–84 (2010).
  282. Rice, ME, Patel, JC & Cragg, SJ Uvoľňovanie dopamínu v bazálnych gangliách. Neuroscience 198, 112–137 (2011).
  283. Smith, Y., Surmeier, DJ, Redgrave, P. & Kimura, M. Thalamické príspevky k zmene správania a posilneniu v súvislosti s bazálnymi gangliami. J. Neurosci. 31, 16102–16106 (2011).
  284. Threlfell, S. et al, Striktálne muskarínové receptory podporujú aktivitu dopamínového prenosu prostredníctvom odlišných receptorových podtypov na cholinergných interneurónoch vo ventrálnom versus dorzálnom striate. J. Neurosci. 30, 3398 – 3408 (2010).
  285. Hoebel, BG, Avena, NM a Rada, P. Accumbens dopamín-acetylcholínovú rovnováhu v prístupe a vyhýbaní sa. Curr. Názor. Pharmacol. 7, 617 - 627 (2007).
  286. Pothos, EN, Creese, I. & Hoebel, BG Obmedzené stravovanie s úbytkom hmotnosti selektívne znižuje extracelulárny dopamín v nucleus accumbens a mení dopamínovú odpoveď na amfetamín, morfín a príjem potravy. J. Neurosci. 15, 6640 6650 - 1995 XNUMX (XNUMX).
  287. Geiger, BM et al, Deficity mesolimbickej dopamínovej neurotransmisie u potkanovej obezity. Neuroscience 159, 1193 – 1199 (2009).
  288. Morris, JK et al, Inzulínová rezistencia zhoršuje nigrostriatálnu dopamínovú funkciu. Exp. Neurol. 231, 171 – 180 (2011).
  289. De Araujo, IE et al, Potravinová odmena v neprítomnosti signalizácie chuťového receptora. Neuron 57, 930 – 941 (2008).
  290. Stice, E., Spoor, S., Bohon, C. & Small, DM Vzťah medzi obezitou a otupenou striatálnou reakciou na jedlo je moderovaný alelou TaqIA Al. Science 1, 322–449 (452).
  291. Wang, GJ et al, Mozog dopamín a obezita. Lancet 357, 354 – 357 (2001).
  292. Johnson, PM & Kenny, PJ Dopamínové D2 receptory pri závislostnej dysfunkcii odmien a kompulzívnom jedení u obéznych potkanov. Nat. Neurosci. 13, 635 - 641 (2010).
  293. Carr, KD, Kim, G.-Y. & Cabeza de Vaca, S. Odmeňovanie a lokomotorické aktivačné účinky priamych agonistov dopamínových receptorov sú zosilnené chronickým obmedzovaním potravy u potkanov. Psychopharmacology (Berl.) 154, 420–428 (2001).
  294. Levin, BE & Keesey, RE Obrana rozdielnych nastavených hodnôt telesnej hmotnosti u obéznych a rezistentných potkanov vyvolaných stravou. Am. J. Physiol. 274, R412 - R419 (1998).
  295. Patel, JC & Rice, ME Monitorovanie axonálneho a somatodendritického uvoľňovania dopamínu pomocou rýchlej skenovacej cyklickej voltametrie v rezoch mozgu. Methods Mol. Biol. 96, 243–273 (2013).
  296. Lee, CR, Witkovsky, P. & Rice, ME Regulácia substantia nigra pars reticulata GABAergická aktivita neurónov H2O2 cez kanály citlivé na flufenamovú kyselinu a KATP kanály. Predná. Syst. Neurosci. 5, 14 (2011).
  297. Chen, BT, Moran, KA, Avshalumov, MV & Rice, ME Obmedzená regulácia somatodendritického uvoľňovania dopamínu napäťovo citlivým Ca2+ kanály kontrastovali so silnou reguláciou uvoľňovania axonálneho dopamínu. J. Neurochem. 96, 645 – 655 (2006).
  298. Li, X. et al, Zvýšený prenos striatálneho dopamínu a motorická výkonnosť s nadmernou expresiou LRRK2 u myší je eliminovaná familiárnou mutáciou Parkinsonovej choroby G2019S. J. Neurosci. 30, 1788 – 1797 (2010).
  299. Wu, Q., Reith, MEA, Wightman, RM, Kawagoe, KT & Garris, PA Stanovenie parametrov uvoľňovania a absorpcie z elektricky vyvolanej dynamiky dopamínu merané voltametriou v reálnom čase. J. Neurosci. Methods 112, 119–133 (2001).
  300. Chen, BT, Avshalumov, MV & Rice, ME H2O2 je nový, endogénny modulátor uvoľňovania synaptického dopamínu. J. Neurophysiol. 85, 2468 – 2476 (2001).
  301. Witkovsky, P., Patel, JC, Lee, CR & Rice, ME Imunocytochemická identifikácia proteínov podieľajúcich sa na uvoľňovaní dopamínu zo somatodendritického kompartmentu nigrálnych dopaminergných neurónov. Neuroscience 164, 488–496 (2009).
  302. Sugimoto, K. et al, Inzulínový receptor v periférnom nerve potkana: jeho umiestnenie a alternatívne zostrihnuté izoformy. Diabetes Metab. Res. 16, 354 – 363 (2000).
  303. Sanchez-Alavez, M. et al, Inzulín spôsobuje hypertermiu priamou inhibíciou neurónov citlivých na teplo. Cukrovka 59, 43 – 50 (2010).
  304. Paxinos, G. & Watson, C. Krysí mozog v stereotaxických súradniciach, 6. vydanie, akademické (2007).
  305. Strubbe, JH & Mein, CG Zvýšené kŕmenie v reakcii na bilaterálnu injekciu inzulínových protilátok do VMH. Physiol Behav. 19, 309 - 313 (1977).
  306. Paranjape, SA et al, Vplyv inzulínu na ventromediálny hypotalamus na sekréciu pankreatického glukagónu in vivo, Cukrovka 59, 1521 – 1527 (2010).
  307. Wise, RA & Hoffman, DC Lokalizácia mechanizmov odmeňovania liekov intrakraniálnymi injekciami. Synapse 10, 247–263 (1992).
  308. Zhen, J., Maiti, S., Chen, N., Dutta, AK & Reith, MEA Interakcia medzi hydroxypiperidínovým analógom 4- (2-benzhydryloxyetyl) -1- (4-fluórbenzyl) piperidínu a aspartátom 68 v ľudský transportér dopamínu. Eur. J. Pharmacol. 506, 17–26 (2004).

Stiahnuť odkazy

 

 

  

Poďakovanie

  

Tieto štúdie boli podporené NIH grantmi DA033811 (MER, KDC a MEAR), NS036362 (MER), DA03956 (KDC) a NARSAD Independent Investigator Award (KDC). S961 bol veľkorysý darček od Dr. Lauge Schaffer, Novo Nordisk. Protilátka PP5 bola veľkorysým darom od spoločnosti Pfizer. Ďakujeme Dr Charles Nicholson, NYU School of Medicine za softvér na extrahovanie Vmax hodnoty z údajov FCV.

 

 

  

Informácie o autorovi

  

Poznámky pod čiarou autora

  1. Títo autori prispeli k tejto práci rovnako.

    • Catherine A. Woods &
    • Jyoti C. Patel

Medzinárodná spolupráca

  1. Katedra neurovedy a fyziológie, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

    • Melissa A. Stouffer,
    • Li Bao &
    • Margaret E. Riceová
  2. Neurochirurgické oddelenie, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  3. Melissa A. Stouffer,
  4. Jyoti C. Patel,
  5. Christian R. Lee,
  6. Li Bao &
  7. Margaret E. Riceová
  8. Catherine A. Woodsová
  9. Paul Witkovsky
  10. Robert P. Machold
  11. Kymry T. Jones,
  12. Soledad Cabeza de Vaca,
  13. Maarten EA Reith &
  14. Kenneth D. Carr
  15. Maarten EA Reith &
  16. Kenneth D. Carr
  17. Centrum pre neurónové vedy, New York University, 4 Washington Place, New York, New York 10003, USA

  18. Katedra oftalmológie, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  19. Smilow Neuroscience Program, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  20. Katedra psychiatrie, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

  21. Katedra biochémie a molekulárnej farmakológie, New York University School of Medicine, 550 First Avenue, New York, New York 10016, USA

Príspevky

MAS, MER a KDC navrhli celkovú štúdiu a vypracovali rukopis; všetci autori prispeli k záverečnému textu rukopisu; MAS uskutočnila experimenty s voltametrickou analýzou a analýzou údajov s príspevkami od LB a JCP; JCP prispel k návrhu voltametrických experimentov a poskytol softvér a analyzoval Vmax údajov; PW získal všetky imunohistochemické obrazy a poskytol kvantitatívnu analýzu týchto údajov; CRL navrhol elektrofyziologické protokoly a získal neuróny plnené biocytínom; CRL a JCP vykonali elektrofyziologické štúdie a uskutočnili všetky súvisiace analýzy dát; RPM vyvinul a poskytol predný mozog chatou KO myši; CAW a MAS navrhli behaviorálne štúdie v konzultácii s KDC a SCdV; tieto boli realizované predovšetkým prostredníctvom CAW; SCdV tiež prispel k štatistickej analýze údajov o správaní; KTJ a MEAR navrhli a analyzovali experimenty absorpcie DA v synaptozómoch na stanovenie účinnosti InsAb; KTJ uskutočnila experimenty.