Stredne vysoký obsah tuku zvýši sacharózu v mladých potkanoch (2013)

Chuť, Autorský rukopis; dostupné v PMC 2014 Feb 1.

Publikované v konečnom upravenom formulári ako:

Chuti do jedla. 2013 Feb; 61 (1): 19 – 29.

Publikované online 2012 Sep 27. doi: 10.1016 / j.appet.2012.09.021

PMCID: PMC3538965

NIHMSID: NIHMS411020

Dianne P. Figlewicz,^1,² Jennifer L. Jay,² Molly A. Acheson, Irwin J. Magrisso,⁴ Constance H. West,¹ Aryana Zavosh,² Stephen C. Benoit,³ a Jon F. Davis³

abstraktné

Už skôr sme uviedli, že diéta so stredne vysokým obsahom tuku zvyšuje motiváciu pre sacharózu u dospelých potkanov. V tejto štúdii sme testovali motivačné, neurochemické a metabolické účinky diéty s vysokým obsahom tukov u samcov potkanov, ktorí prešli pubertou počas veku 5-8. Zistili sme, že diéta s vysokým obsahom tuku zvyšuje motiváciu reagujúcu na sacharózu, ktorá je nezávislá od metabolických zmien alebo zmien metabolitov katecholamínových neurotransmiterov v nucleus accumbens. Avšak hladiny AGRP mRNA v hypotalame boli významne zvýšené. Ukázali sme, že zvýšená aktivácia AGRP neurónov je spojená s motivovaným správaním a že exogénne (tretie cerebroventrikulárne) podávanie AGRP viedlo k významne zvýšenej motivácii pre sacharózu. Tieto pozorovania naznačujú, že zvýšená expresia a aktivita AGRP v mediálnom hypotalame môže byť základom zvýšenej reakcie na sacharózu spôsobenú diétou s vysokým obsahom tuku. Nakoniec sme porovnávali motiváciu pre sacharózu v potkanoch puberta vs. dospelí a pozorovali sme zvýšenú motiváciu pre sacharózu u potkanov v pubertách, čo je v súlade s predchádzajúcimi správami, že u mladých zvierat a ľudí je v porovnaní s dospelými uprednostňovaná sladká chuť. Naše štúdie spoločne naznačujú, že základná strava zohráva silnú modulačnú úlohu v motivácii sladkej chuti u dospievajúcich zvierat.

Kľúčové slová: Motivácia, odmena za potraviny, diéta s vysokým obsahom tuku, mládež

úvod

Už skôr sme uviedli, že krátka expozícia stredne vysokým obsahom tuku (31.8%) má za následok zvýšenú motiváciu pre sacharózu u dospelých potkanov (Figlewicz a kol., 2006). Vplyvy na životné prostredie a biologické vplyvy, resp. Ich synergia, na potravinové preferencie a motiváciu energeticky náročných potravín sa v poslednom desaťročí zhodnotili. Táto skutočnosť zvýšila význam u mladých ľudí, pretože detská obezita sa v poslednom desaťročí dramaticky zvýšila (Ogden & Carroll, 2010). Zvýšená preferencia sladkej chuti bola zdokumentovaná u mladých zvierat aj u detskej pediatrickej populácie (\ tColdwell, Oswald a Reed, 2009; Desor a Beauchamp, 1987; Desor, Greene a Maller, 1975; Mennella, Pepino a Reed, 2005; Meyers & Sclafani, 2006)) a je predpokladom pre potravinársky priemysel navrhovať a predávať balené potraviny a nápoje s vysokým obsahom cukru pre deti. Vplyv vplyvov na životné prostredie, ako je základná strava, na motiváciu k sacharóze u mladých potkanov však nebol systematicky hodnotený.

Aktuálne odhady naznačujú, že 10-20% detí a adolescentov v USA sa považuje za obéznych (Ogden & Carroll, 2010). V priemere americká populácia spotrebuje 336 kcal pridaného cukru denne (National Cancer Institute Applied Research Program). Keď je populácia rozdelená na dospelých (19 + roky) a detskú populáciu (2-18 rokov), tento počet je mierne vyšší u detí / dospievajúcich a mierne nižší u dospelých. Pre dospievajúcich, väčšina pridaných cukrov pochádza zo sódy, energetických nápojov a športových nápojov (National Cancer Institute Applied Research Program). Rozsiahly systematický prehľad a metaanalýza ukázali, že príjem nealkoholických nápojov je spojený so zvýšeným príjmom energie a telesnou hmotnosťou (Vartanian, Schwartz a Brownell, 2007). Dospievajúca populácia (14 - 18 rokov) konzumuje denne pridaný cukor v hodnote 444 kcal a deti vo veku od 9 do 13 rokov konzumujú pridaný cukor 381 kcal denne (Aplikovaný výskumný program National Cancer Institute). Túto dodatočnú spotrebu možno čiastočne pripísať zvýšenej sladkej preferencii u mladších jedincov oproti dospelým (Coldwell, Oswald a Reed, 2009; Desor a Beauchamp, 1987; Desor, Greene a Maller, 1975; Mennella, Pepino a Reed, 2005). Štúdie ukázali, že deti vo veku 9 a 15 uprednostňujú cukrové roztoky pri vyšších koncentráciách, ako je preferovaná koncentrácia vzorky pre dospelých (Desor, Greene a Maller, 1975). Dlhodobé štúdie testovali sladkú preferenciu týchto detí o desaťročie neskôr v živote, kedy sa ich preferencia znížila a nebola významne odlišná od preferencií dospelých (Desor a Beauchamp, 1987). Štúdie tiež preukázali uprednostňovanie vyšších koncentrácií sacharózy u detí v porovnaní s ich matkami (\ tMennella, Pepino a Reed, 2005). To naznačuje, že zvýšená preferencia cukru v detstve nie je spôsobená genetikou, ale skôr môže odrážať vývojový fenomén. Štúdie tiež preukázali túto zvýšenú preferenciu sacharózy u potkanov (\ tMeyers & Sclafani, 2006).

Mnohé systémy CNS a konektivita sú plastové počas dospievania u ľudí a hlodavcov, vrátane mezokortikolimického systému a dopaminergnej aktivity v nucleus accumbens, kľúčového miesta na sprostredkovanie odmeny a motivácie (Ikemoto a Panksepp, 1996; Kelley a Berridge, 2002) (pozri Andersen a Teicher [2008] pre nedávne preskúmanie). Funkčný význam týchto anatomických a neurochemických zmien je teraz objasnený. Nedávny výskum Bolañosa a jeho kolegov a ďalších skúmal následný účinok antagonistu transportéra dopamínu na retransmisiu metylphendátu (Ritalin) v post-odstavnom, juvenilnom hlodavcovi. Existujú hlásenia o zmenenej neurochémii a správaní v dospelosti ako funkcie peri-adolescentnej liečby metylfenidátom (Bolaños a kol., 2003; Bolaños, Glatt a Jackson, 1998; Brandon, Marinelli, Baker & White, 2001; Brandon, Marinelli a White, 2003). Zatiaľ čo zistenia nie sú úplne konzistentné, možno kvôli rôznym študovaným modelom zvierat, kolektívne tieto štúdie zdôrazňujú, že obdobie dospievania sa zdá byť vývojovým oknom na zmenu funkcie dopamínu. Jedlo je prirodzený stimul pre uvoľňovanie dopamínu z projekcií ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) do nucleus accumbens a príjem operačného množstva sacharózy potkany má za následok veľmi akútne uvoľňovanie dopamínu (Roitman a kol., 2004). Predpokladáme, že motivácia pre sacharózu je spojená so zvýšením dopamínu nucleus accumbens a modulácia vplyvmi prostredia môže byť jedinečne citlivá počas tohto adolescentného, peri-pubertálneho štádia u potkanov.

Vzhľadom na vysokú preferenciu sladkej chuti u detí a mladých hlodavcov sme považovali za dôležité určiť aj parametre motivácie pre sacharózu u adolescentných hlodavcov. V tejto sérii štúdií sme hodnotili účinok diétnej diéty s vysokým obsahom tuku na motiváciu pre sacharózu u potkanov, keď rástli z obdobia po odstavení do puberty. Následne sme uskutočnili metabolické a CNS hodnotenia na rozpoznanie metabolických, endokrinných alebo nervových zmien spojených s diétnou intervenciou. Porovnateľná s tým, čo sme uviedli u dospelých potkanov, bola stredne silná strava s vysokým obsahom tuku (31.8%) účinná pri zvyšovaní vlastného podávania sacharózy. Taktiež sme testovali, či bol u potkanov ako mladých dospelých pozorovaný post-diétny účinok liečby na motiváciu sacharózy, čo je porovnateľné s typmi neskorších účinkov, ktoré boli hlásené pre iné správanie. Naše štúdie ukazujú, že mladé potkany vykazujú zvýšenú motiváciu k sacharóze, keď sú kŕmené diétou so stredne vysokým obsahom tuku, ktorá môže byť sprostredkovaná orexigénnym hypotalamickým peptidom AGRP; že sa zdá, že účinok včasnej diétnej intervencie nie je prenesený do post-pubertálnej dospelosti; a že správanie sa prejavuje, hoci potkany sú metabolicky normálne a pred obézne. Nakoniec peripubertálne potkany vykazujú zvýšenú motiváciu pre sacharózu v porovnaní s mladými dospelými potkanmi.

Materiály a metódy

Predmety

Jedinci boli samci potkanov Albino od firmy Simonsen (Gilroy, CA). Potkany sa udržiavali na krmive (Laboratórna Diéta 5001, LabDiet) alebo diéte so stredne vysokým obsahom tuku (31.8%; Research Diets Inc) podľa chuti, Strava sa zhoduje s celkovým obsahom sacharidov (58% kcal vs. 51% kcal pre nízky obsah tuku v porovnaní s vysokým obsahom tuku). Zariadenie s nízkym obsahom tuku má 6.23 gm% voľných cukrov a diéta s vysokým obsahom tukov má 29 gm% sacharózy. Boli udržiavané na 12: 12 h svetlo-tmavý cyklus s rozsvietenými svetlami na 6 AM. Pokiaľ nie je uvedené inak, potkany boli zavedené vo veku 3 týždňa, bezprostredne po odstavení a boli umiestnené na aklimatizáciu až do týždňa 5. V tomto veku sa začalo s tréningom a testovaním stravy a / alebo správania. Špecifické protokoly sú podrobne opísané nižšie a sú zhrnuté v texte Tabuľka 1, Pretože samce potkanov prechádzajú pubertou v 6^th-7^th V týždni veku bolo načasovanie štúdií určené na štúdium potkanov, keď prechádzajú týmto vývojovým štádiom. Všetky postupy uskutočňované na potkanoch sa riadili NIH smernicami pre starostlivosť o zvieratá a boli schválené podvýborom pre starostlivosť o zvieratá a použitie Výboru pre výskum a vývoj vo VA Puget Sound Health Care System.

Experimentálne protokoly

Samopodávanie sacharózy

Všeobecný protokol. Postupy boli založené na našej publikovanej metodike (Figlewicz a kol., 2008; Figlewicz a kol., 2006). Všetky tréningové a testovacie postupy boli uskutočňované medzi 0700 a 1200 hr. Experiment zahrnoval 2-3 fázy: tréning autoshapingu a fixného pomeru (FR); chirurgia a regenerácia v špecifikovaných kohortách (pozri Tabuľka 1); a progresívneho pomeru (PR) pomocou PR algoritmu Richardsona a Robertsa (Richardson & Roberts, 1996). PR algoritmus vyžaduje 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, atď.) tlačí na následné dodávky odmeny počas zasadnutia a je prísnym testom motivácie a odmeny (437). Krysy boli vycvičené na samo-podávanie 575% sacharózy (759 ml odmeny) dodaných do nádoby na kvapaliny. Operandové boxy ovládané systémom Med Associates (Georgia, VT) mali dve páky, ale iba jedna páka (aktívna, zasúvateľná páka) aktivovala infúzne čerpadlo. Stlačili sa aj na druhej páke (neaktívna, stacionárna páka). Roztok sacharózy bol dodaný do nádoby na kvapalné kvapky na orálnu spotrebu (Med Associates). Počiatočný tréning bol vykonaný v priebehu jednorazových relácií pre 999 dni podľa harmonogramu nepretržitého zosilnenia (FR999: každý pákový lis bol zosilnený) s maximálnym počtom odmien 27 sacharózy dodaných za jednu reláciu. Každé zasadnutie začalo s vložením aktívnej páky a osvetlením bieleho svetla, ktoré zostalo na celom sedení. Tón 5-u (0.5 Hz, 10 dB nad pozadím) + svetlo (biele svetlo 1 W nad aktívnou pákou) oddelilo jednotlivé oddelené znamenie doprevádzané každým doručením odmeny a po každom podaní sacharózy nasledovalo časový limit 50-sek. PR tréning bol vykonaný na maximálny možný 5 h / deň počas desiatich dní. Denné relácie skončili po min. 2900 min, keď nebol aktivovaný pákový ovládač, v ktorom bode bolo osvetlenie domu vypnuté a aktívna páčka bola zatiahnutá.

Účinok AGRP na samopodávanie sacharózy

Pretože naše výsledky ukázali zvýšenie expresie AGRP mRNA u pubertálnych potkanov kŕmených diétou s vysokým obsahom tukov, chceli sme potvrdiť, že AGRP by mohlo zvýšiť samopodanie sacharózy. 5-wk staré potkany kŕmené krmivom sa odobrali pomocou FR tréningu, potom sa dostali kanyly do tretej mozgovej komory (ICV). Po týždni zotavenia, potvrdenie umiestnenia s testom reakcie na pitie angiotenzínu II (pozri Figlewicz a kol., [2006]), a jedno zasadnutie FR preškolenia, potkany sa začali na paradigme samosprávy PR. Po PR deň 1 boli potkany zaradené do jednej z dvoch skupín tak, že priemerný výkon PR deň 1 sa medzi týmito dvoma skupinami nelíšil (umelé vehikulum CSF, aCSF alebo AGRP, 2 ul 0.01 nmol). Dostali injekcie aCSF (n = 8) alebo AGRP (n = 7) v PR dňoch 2, 5 a 8. Celkový denný príjem potravy bol kvantifikovaný počas PR tréningového času.

Vplyv veku na samopodávanie sacharózy

Porovnali sme správanie sa samovoľného podávania medzi pubertálnymi potkanmi a mladými dospelými, kŕmené krmivom alebo potravou 31.8% tuku. Potkany mali dva týždne aklimatizácie na vivárium VAPSHCS (3 - 5wk alebo 8 - 10 wk). Potom dostali stravu počas celého testovacieho / tréningového obdobia (4 wk). Tak, ako v počiatočnom experimente, boli pubertálne potkany študované v 5-8 wk veku. Mladí dospelí boli študovaní vo veku 10-13.

Stanovenie zloženia tela

Zloženie tela bolo merané pomocou kvantitatívnej magnetickej rezonančnej spektroskopie (QMR [Nixon a kol., 2010]), aby sa určil obsah tela vody u jednotlivých potkanov, z ktorých sa vypočíta relatívny telesný tuk. Zvieratá boli umiestnené do valcovitých držiakov bez anestézie a potom boli držiaky vložené do stroja QMR na 2 minútové skenovanie, ktoré vykonáva trojnásobné merania. Údaje sa ukladajú do integrovaného počítača (EchoMRI, Echo Medical Systems, Houston, TX) na okamžitý výpočet celkovej vody, tuku a slabej hmotnosti.

Intravenózne glukózové tolerančné testovanie (IVGTT)

Vedomé IVGTT sa uskutočňovali na potkanoch s chronicky implantovanými IV kanylami, ktoré sa nechali hladovať cez noc pred štúdiou s využitím metodológie založenej na Frangioudakis, Gyte, Loxham a Poucher (2008), Bilaterálne intravenózne kanyly boli implantované dva týždne pred štúdiou podľa našej zavedenej metodiky (Figlewicz a kol., 2009). Východiskové vzorky boli odobraté pri t-10 min (0.5 ml na stanovenie inzulínu a glukózy vo všetkých časových bodoch) a t0 min. Potkany dostávali infúziu 1 gm glukózy / 2ml / kg oproti 15-20 sekúnd, po čom nasledovalo premytie fyziologickým roztokom 0.5 ml. Vzorky krvi boli odoberané pri 5, 15, 30, 60, 90 a 120 min. Vzhľadom na zasunutie katétra v priebehu zákroku (teda neschopnosť získať vzorky krvi) sú konečnými údajmi pre východiskové / IVGTT prezentované údaje 7-8 pre potkany kŕmené krmivom a 8 pre potkany kŕmené 31.8% tukovou diétou (Tabuľka 3). Plazmatický inzulín sa stanovil s použitím súprav RIA (# RI-13K a SRI-13K, Linco), ktoré sa použili na potkanie inzulínu Linco a glukóza v plazme sa stanovila na analyzátore glukózy YSI). Plocha pod krivkou (AUC) pre odpoveď od základnej línie bola vypočítaná pri 5 min a 120 min. Index HOMA bol vypočítaný nalačno (glukóza [mM] x inzulín [U / L]) / 22.5 a bol vypočítaný s použitím terminálnych vzoriek nalačno meraných na inzulín a glukózu.

Metabolické parametre¹

Metabolické parametre nalačno

Potkany z experimentu 1 sa nechali cez noc nalačno pred eutanáziou, niekoľko dní po dokončení IVGTT. Potkany boli hlboko anestetizované inhaláciou izofluránu a vykrvácané. Mozgy sa rýchlo odstránili a zmrazili v kvapalnom dusíku na meranie mRNA hypotalamického peptidu a katecholamínov nucleus accumbens. Konečná plazma alebo sérum sa použili na meranie inzulínu nalačno, glukózy, leptínu a triglyceridov. Pre triglyceridy sa použili Point vědecká Triglycerid GPO Kit # T7531-400 (Fisher # 23-666-418) a štandardy KIT # 7531-STD (Fisher # 23-666-422) a 3 μl séra sa testoval v duplikáte. Plazmatický leptín sa meral s Millipore Linco RIA Kit # RL 83K.

Catecholamínové HPLC metódy [Davis a kol., 2008]

Potkany sa usmrtili anestéziou izofluranom a mozgy sa rýchlo odstránili, zmrazili a uskladnili pri -80 ° C. Z každého zvieraťa sa izolovali dvojstranné mikro-razníky nucleus accumbens (NAcc). Hoci bola venovaná značná pozornosť minimalizácii kontaminácie susednými oblasťami mozgu, vzhľadom na povahu a veľkosť každého mikro-úderu nám naša metóda nedovoľovala rozlišovať subregióny (tj NAcc jadro vs. škrupina) v rámci NAcc. Na analýzu vysokovýkonnou kvapalinovou chromatografiou (HPLC) sa k vzorkám pridal roztok antioxidantu (0.4 N perchlorát, 1.343 mM kyselina etyléndiamíntetraoctová (EDTA) a metabisulfit sodný 0.526MM), po čom nasledovala homogenizácia použitím ultrazvukového homogenizátora tkaniva (Biologics; Gainesville, VA Malá časť tkanivového homogenátu sa rozpustila v 2% dodecylsulfáte sodnom (SDS) (w / v) na stanovenie proteínu (Pierce BCA Protein Reagent Kit; Rockford, IL) Zvyšná suspenzia sa odstredila pri 14,000 g pre 20. Supernatant bol rezervovaný pre HPLC.

Vzorky sa oddelili na kolóne Microsorb MV C-18 (5 Am, 4.6_250 mm, Varian; Walnut Creek, CA) a súčasne sa testovali na DA, kyselinu 3,4-dihydroxyfenyloctovú (DOPAC) a kyselinu homovanilovú (HVA), pričom obidve sú markery degradácie dopamínu, 5-HT a 5-HIAA. Zlúčeniny boli detegované použitím 12-kanálového detektora (CoulArray 5200, ESA; Chelmsford, MA) pripojeného k Waters 2695 Solvent Delivery System (Waters; Milford, MA) za nasledujúcich podmienok: prietoková rýchlosť 1 ml / min; detekčné potenciály 50, 175, 350, 400 a 525 mV a; potenciál prania 650 mV. Mobilná fáza pozostávala z 10% metanolového roztoku v destilovanej H₂0 obsahujúce 21 g / 1 (0.1 M) kyselinu citrónovú, 10.65g / 1 (0.075 M) Na2HPO4, 176 mg / l (0.8 M) kyselinu heptánsulfónovú a 36 mg / l (0.097MM) EDTA pri pH 4.1. Neznáme vzorky boli kvantifikované proti štandardnej krivke 6-bodu s minimálnym R² 0.97. Vzorky kontroly kvality boli rozptýlené v každom cykle, aby sa zabezpečila HPLC kalibrácia.

Orexigénne peptidy mRNA qPCR

Merali sme expresiu hypotalamických peptidov, ktoré stimulujú kŕmenie a zúčastňujú sa na motivačnom a odmeňovacom správaní (Figlewicz & Sipols, 2010): neuropeptid Y (NPY [ Hahn, Breininger, Baskin a Schwartz, 1998; Jewett a kol., 1995; Kelley, Nannini, Bratt a Hodge, 2001]); peptidu súvisiaceho s aguti (AGRP [Aponte, Atasoy a Sternson, 2011; Barnes, Argyropoulos a Bray, 2010; Broberger a kol., 1998; Hagan a kol., 2000; Hahn, Breininger, Baskin a Schwartz, 1998; Kaushik a kol., 2011; Krashes a kol., 2011; Rossi a kol., 1998; Tracy a kol., 2008]); a orexín (Cason et al., 2010; Choi, Davis, Fitzgerald a Benoit, 2010). Potkany sa usmrtili anestéziou izofluránom a mozgy sa rýchlo odstránili, zmrazili a až do spracovania sa skladovali pri -80 ° C. Mediálny a laterálny hypotalamus sa mikrodisekovali ako jeden blok pomocou zmrazovacej roviny AHP-1200CPV (Thermoelectric Cooling America, Chicago, IL), ktorá udržiavala konštantnú teplotu 12 ° C počas celého procesu disekcie. Celková RNA z mikrodisekovaného tkaniva bola izolovaná reagentom Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) a prečistená pomocou súpravy RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) podľa pokynov výrobcu. Celková RNA bola spracovaná tak, aby bola odstránená akákoľvek potenciálna kontaminácia genomovou DNA pomocou DNázy neobsahujúcej RNázu (Promega, Madison, WI), a bola kvantifikovaná pomocou spektrofotometra NanoVue (GE Healthcare, Cambridge, UK). Kvalita RNA sa potvrdila štandardnou elektroforézou na agarózovom géli. Komplementárna DNA (cDNA) sa potom retrotranskribovala (RT) z 1 až 2 ug celkovej RNA zmesou náhodných hexamérov a oligo DT primovaním pomocou súpravy iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA). Z každej vzorky boli tiež pripravené reakcie bez retrotranskripcie (bez RT) na kontrolu potenciálnej kontaminácie genómovou DNA. Kontroly cDNA a no-RT sa zriedili a na meranie expresie mRNA vybraných génov pomocou kvantitatívnej PCR v reálnom čase s použitím detekčného systému MyIQ Real-Time PCR (Bio-Rad, Hercules) sa použilo 5 až 10 ng templátovej cDNA z každej vzorky. , CA). Trojnásobné merania pre každú vzorku sa uskutočňovali na štandardných 96-jamkových doštičkách iCycler spolu s kontrolou bez šablón (NTC) na detekciu potenciálnej krížovej kontaminácie v 20 μl reakčných objemov pozostávajúcich z 10 μl 2 × iQ Sybr Green Supermix (Bio- Rad, Hercules, CA), 2 μl 0.2-0.5 μM každého primeru, 3 μl DEPC vody a 5 μl templátu. Všetky reakcie qPCR zahŕňali analýzu krivky tavenia na zaistenie špecifičnosti signálu. Relatívna expresia pre každý požadovaný gén bola vypočítaná extrapoláciou na štandardnú krivku jednotlivo použitú na každej doštičke a odvodenú zo sériových riedení zhromaždenej vzorky referenčnej cDNA a normalizovaná na relatívnu expresiu referenčných génov (kyslý ribozomálny fosfoproteín 36B4 na génovú expresiu v hypotalamické tkanivo a mitochondriálny ribozomálny proteín L32 na expresiu v nucleus accumbens). Nasledujúce sekvencie primérov (IDT, San Diego, CA) sa použili na amplifikáciu potkanieho prepro-orexínu, NPY a AGRP: Prepro-orexín, ďalej: 5'-TTCCTTCTACAAAGGTTCCCT-3 ', 5'-GCAACAGTTCGTAGAGACGGCAG-3'; NPY: Útočník, 5- TACTCCGCTCTGCGACACTACATC-3 '; Zadná strana: 5'-CACATGGAAGGGTCTTCAAGCC-3 '; AGRP, útočník: 5'-GCAGAAGGCAGAAGCTTTGGC-3 '; Zadná strana: 5'-CCCAAGCAGGACTCGTGCAG-3 ′.

cFos Imunocytochémia (ICC) a kvantifikácia

Fluorescenčný ICC sa použil na identifikáciu fosfogénnych a AGRP pozitívnych buniek neurónových buniek v mediálnom hypotalamuse podľa našej zavedenej metodológie (Figlewicz a kol., 2011). Posledný deň (PR deň 10) sa potkany umiestnili do komôr na samopodanie ako obvykle na 90 minút. Bezprostredne po tomto poslednom 90-minútovom sedení boli potkany hlboko anestetizované inhaláciou izofluránu a premyté 0.9% NaCI a potom studeným 4% roztokom paraformaldehydu. Načasovanie anestézie a eutanázie bolo založené na známom časovom priebehu vrcholovej expresie proteínu cFos v čase 90 - 120 minút po udalosti. Expresia cFos by teda skôr odrážala aktiváciu CNS na začiatku behaviorálnej úlohy, než aby bola výsledkom toho, že zviera túto úlohu zažilo. Mozgy sa vybrali a niekoľko dní sa fixovali v paraformaldehyde, potom sa vložili do 20% sacharózy-PBS, potom 30% roztoku sacharózy-PBS. Mozgy sa rezali na kryostatu (Leica CM 3050S kryostat) na imunohistochémiu. Na stanovenie imunoreaktívneho proteínu cFos v mozgových rezoch sme použili našu zavedenú metodiku (Figlewicz a kol., 2011). Priložené 12 μm koronálne úseky celého mozgu boli trikrát premyté fosfátom pufrovaným soľným roztokom (PBS, OXOID, Hampshire, Anglicko). Časti boli premyté 20 min s 100% etanolom / DI vodou (50% obj.) A následne s PBS premytím, potom boli blokované 1 hodinu pri izbovej teplote v PBS obsahujúcom 5% normálne kozie alebo oslávové sérum. Sekcie sa potom niekoľkokrát premyli v PBS a inkubovali sa cez noc pri 4 ° C v primárnych roztokoch protilátok pripravených v PBS. Segmenty sa trikrát premyli v PBS a potom sa inkubovali v tme pri izbovej teplote v sekundárnom roztoku protilátky pripravenom v PBS na 1 hodinu. Sekcie sa následne opäť premyli v PBS a namontovali a zakryli vo vektážnikovom držiaku tvrdého média (Vector, Burlingame, CA). Digitálne snímky sekcií boli získané pomocou fluorescenčného mikroskopu Nikon Eclipse E-800 pripojeného k digitálnej snímacej kamere Qimaging Retiga pomocou softvéru NIS Elements (Nikon).

Na základe štúdií PCR, ktoré demonštrovali zvýšené hladiny AGRP mRNA, sme sa zamerali na mediálne hypotalamické oblasti, najmä ventromediálne jadro a oblúkové jadro (ARC). Rezy 12 μm zodpovedajúce atlasu boli vyhodnotené na expresiu cFos a kvantifikáciu v zhodných sekciách a oblastiach na základe atlasu Paxinos a Watson [2005], Na kvantifikáciu (pri zväčšení 40 ×) boli vybrané atlasové oblasti. Softvér NIS Elements (Nikon) sa použil na zachytenie obrazu požadovanej oblasti. Bola vymedzená plocha na počítanie a stanovil sa prah pre počet pozitívnych buniek. Rovnaká oblasť a pozadie (prah) boli použité pre rezy z príslušných experimentálnych skupín a počítanie pozitívnych buniek (kvantifikácia) bolo uskutočnené v tej istej relácii pre všetky experimentálne skupiny, aby sa zabránilo zmenám medzi reláciami v pozadí. Na štatistickú analýzu sa odčítali počty jednotlivých potkanov, iba ak boli dostupné zodpovedajúce alebo úplné rezy cez každú oblasť; údaje pre konkrétnu oblasť neboli odobraté od potkana, ak pre túto oblasť nebolo úplné dvojstranné zastúpenie.

Okrem kvantifikácie cFos sa uskutočnila kvantitatívna dvojitá značka imunohistochémie pre cFos a AGRP. Pretože sme nechceli narušiť behaviorálny výkon zvierat, neboli zvieratá vopred ošetrené kolchicínom, aby sa optimalizovala vizualizácia AGRP. Vizualizácia AGRP-pozitívnych neurónov by preto mohla byť podhodnotená. Postup dvojitého farbenia pre AGRP bol porovnateľný s testom na samostatnú imunoreaktivitu cFos, až na to, že rezy boli blokované po dobu jednej hodiny pri izbovej teplote v PBS-5% somárskom sére. Potom sa zmes fos-Ab a primárnych protilátok AGRP použila na inkubáciu cez noc pri 4 ° C; rovnako boli obe sekundárne protilátky v rovnakom roztoku a inkubovali sa jednu hodinu v tme pri izbovej teplote. Uskutočnili sa počiatočné optimalizačné testy na stanovenie vhodného zriedenia primárnych protilátok. Použité primárne protilátky boli králičie anti-cFos (1: 500) (sc-52) a kozie anti-AGRP (1: 100) (18634) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA). Použité sekundárne protilátky boli Cy3-konjugovaný oslí anti-králik (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA) a Alexa fluór 488, oslí anti-kozý IgG (Molecular Probes, Eugene, OR); všetky sekundárne protilátky boli zriedené v pomere 1: 500.

Štatistické analýzy

Skupinové údaje sú v texte, tabuľkách a obrázkoch prezentované ako priemer ± štandardná chyba priemeru (SEM). Dôležitosť je definovaná ako p ≤ 0.05. Štatistické porovnania sa uskutočňujú medzi experimentálnymi skupinami, ako sa uvádza v časti „Výsledky“ pomocou nespárovaného Studentovho testu (napr. Porovnanie stravy, veku alebo liečby). „Normalizácia“ údajov je definovaná tak, ako sa používa.

výsledky

Účinok diéty so stredne vysokým obsahom tuku na peri-pubertálnu motiváciu pre sacharózu

Potkany kŕmené 31.8% tukovou diétou počas liečby 5-8, zatiaľ čo v samo-podávaní, mali signifikantne zvýšenú motiváciu pre sacharózu v porovnaní s potkanmi kŕmenými krmivom. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 1aV počiatočnom FR tréningu nebol žiadny rozdiel vo výkone (priemerné FRDays 1-10 aktívne pákové lisy, 38 ± 5 vs. 39 ± 2 pre krmivo vs. 31.8% tukovej diéty). Keď sa však potkany prešli na prísnejšiu PR úlohu, došlo k významnému zvýšeniu počtu aktívnych pákových lisov a počtu odmien sacharózy, ale nie v celkovej dĺžke relácie (Obrázok 1b). Neexistoval žiadny účinok chronickej diétnej liečby na počet neaktívnych pákových lisov. Keď boli potkany kŕmené diétou s vysokým obsahom tukov počas užívania 5-8, ale následne sa vrátili do kŕmnej diéty prijatej prostredníctvom FR a PR tréningu počas týždňov 9-12, bol tu trend, ale žiadny významný rozdiel v aktívnych pákových lisoch. Zdá sa teda, že v priebehu peri-pubertálnej časovej periódy nedochádza k žiadnemu efektu prenosu zo stredne vysokého tuku. Údaje o parametroch PR pre tieto skupiny sú zhrnuté v Tabuľka 2, Aby sme začali objasňovať prispievajúci mechanizmus (-y) k diétou vyvolanému zvýšeniu motivácie k sacharóze, vykonali sme niekoľko meraní metabolizmu a CNS.

Obrázok 1

PR motivovaná odpoveď na odmeny sacharózy sa zvyšuje u peripubertálnych potkanov kŕmených 31.8% tukovou diétou (n = 8). 1. V rámci relácií FR sa nevyskytol žiadny účinok diéty, ale účinok diéty sa prejavuje, keď sa potkany preorientujú na paradigmu PR. 1b. Údaje sú ...

Vplyv peri-pubertálnej diéty s vysokým obsahom tukov na progresívne pomery výkonnosti sacharózy

Účinok miernej diéty s vysokým obsahom tuku na metabolické parametre

Bezprostredne po ukončení behaviorálneho testovania sa stanovilo zloženie telesného tuku na potkanoch, ktoré mali diétnu intervenciu a behaviorálnu paradigmu počas liečby 5-8. Potkany potom dostávali chronické intravenózne kanyly na (vedomé) IV glukózové tolerančné testy (IVGTT). Následne bola získaná terminálna plazma nalačno a sérum pre ďalšie metabolické opatrenia. Ako je znázornené na obrázku Tabuľka 3neboli pozorované žiadne rozdiely v zložení tela, telesnej hmotnosti, inzulíne nalačno alebo glukózových meraniach, citlivosti na inzulín (výpočet HOMA) alebo odpovediach na IVGTT medzi potkanmi kŕmenými krmivom a potravou s vysokým obsahom tuku. Merania terminálneho leptínu nalačno a triglyceridov sa medzi týmito dvoma skupinami nelíšili. Hoci liečba diétou mala významný vplyv na motiváciu pre sacharózu, odráža behaviorálnu odpoveď u potkanov s vysokým obsahom tuku, ktoré sú predobézne.

Vplyv miernej diéty s vysokým obsahom tukov na homeostikum CNS a odmenu neurochémie

Okrem terminálnych metabolických meraní sa merali mozgy z kohorty, ktorá mala v priebehu týždňov 5-8 aj diétnu intervenciu a tréning správania, pre amínové profily nucleus accumbens (n = 4 na diétnu skupinu) alebo hladiny mRNA hypotalamických orexigénnych peptidov. Ako je znázornené na obrázku Tabuľka 4, nebol pozorovaný významný účinok diéty s vysokým obsahom tukov na metabolity dopamínu, norepinefrínu alebo serotonínu v nucleus accumbens, centrálnom mieste odmeňovania a motivačnej aktivity (Ikemoto a Panksepp, 1996; Kelley a Berridge, 2002), v ktorom každý z týchto neurotransmiterových systémov hrá kľúčovú regulačnú úlohu. V hypotalamových extraktoch sa merali hladiny mRNA orexigénnych peptidov, NPY, AGRP a orexínu. V tejto skupine bol pozorovaný silný, ale nevýznamný trend zvýšeného AGRP u potkanov kŕmených tukmi (n = 8 pre každú diétu); preto sme opakovali paradigmu tréningu stravovania / správania v ďalšej skupine a merali NPY, AGRP a orexínovú mRNA v hypotalame. V kombinovaných skupinách sme pozorovali významné (p <0.05) zvýšenie AGRP mRNA u potkanov kŕmených stravou s vysokým obsahom tukov oproti kontrolám chow (Obrázok 2), ale žiadna významná zmena v expresii NPY alebo orexínu. Na vyhodnotenie možných súvislostí medzi expresiou AGRP a správaním pri samo-administrácii sme merali cFos a AGRP imunopozitívne neuróny v mediobasálnom hypotalame. Skupiny potkanov boli kŕmené krmivom pre krmivo alebo 31.8% tuku; niektoré z nich boli urobené v protokole samopodania (týždne 5-8) a iné boli spracované ako kontroly správania. Obrázok 3a ukazuje príklad spoločnej lokalizácie cFos a AGRP v neuróne oblúkového jadra. Ako je zhrnuté v Tabuľka 5aktivácia AGRP neurónov (koexpresia cFos-ICC a AGRP-ICC v rámci tých istých buniek) bola spojená s aktivitou samosprávy. Toto je preukázané v Obrázok 3b, kde počet aktivovaných (cFos-pozitívnych) neurónov je znázornený ako počet neuronálnych buniek, alebo ako percento z celkového počtu neurónov pozitívnych na AGRP: je tu významná aktivácia AGRP neurónov u potkanov, ktorí si sami podávajú sacharózu, v porovnaní s kontrolnými kontrolami. v skupinách s kombinovanou diétou. Porovnanie liečby v rámci diéty pre počet aktivovaných neurónov AGRP v skupine s vlastným podávaním verzus kontrolné kontroly vykazovali trend, ktorý nedosiahol štatistickú významnosť (chow, p = .078; 31.8% diéta, p = .073) , Dôležité je, že nielen tieto údaje spájajú neurónovú aktiváciu AGRP s vlastným správaním, ale vzhľadom na načasovanie merania cFos (90 minút po umiestnení potkanov do ich samo-administračných komôr) expresia cFos odráža aktivitu neurónov AGRP v očakávania, alebo pri nástupe samosprávnej činnosti. V skupine s vlastným podávaním bol zaznamenaný nevýznamný trend zvýšenia celkového počtu neurónov pozitívnych na AGRP (vs. kontrola pri manipulácii, p = 0.16). U tých potkanov, kde sa pákové lisovanie zhodovalo medzi diétnymi skupinami, sa tiež zhodoval počet AGRP-pozitívnych neurónov. Samotný účinok diétnej liečby nebol pozorovaný na počte neurónov pozitívnych na AGRP v potkanoch s behaviorálnou kontrolou.

Obrázok 2

Účinok stravy s obsahom 31.8% tukov na expresiu mediálneho hypotalamického peptidu mRNA. Údaje sú normalizované pre potkany s vysokým obsahom tukov (n = 17) oproti údajom o kontrolách chow (n = 16). AGRP mRNA je významne zvýšená (p <0.05).

Obrázok 3

Aktivácia neurónov AGRP na začiatku podávania sacharózy. 3. Ko-lokalizácia cFos a AGRP v neurónoch oblúkových jadier, zväčšenie 60x. 3b. Počet aktivovaných (cFos-imunopozitívnych) AGRP-imunopozitívnych neurónov v mediobasálnom hypotalame ...

Nucleus Accumbens Amínové metabolity

Aktivácia Agrp Neuron: Diéta a behaviorálna liečba

Vplyv podávania AGRP na motiváciu sacharózy

Naša interpretácia tohto zistenia spočíva v tom, že expresia AGRP v pubertálnych potkanoch je kľúčovým mechanizmom, ktorý je základom pre zvýšené podávanie sacharózy u potkanov s vysokým obsahom tuku. Na potvrdenie účinnosti AGRP na zvýšenie motivácie pre sacharózu sa AGRP podával cez tretiu komoru peri-pubertálnym potkanom kŕmeným krmivom počas PR časti paradigmy správania. Tento dávkovací režim AGRP bol sub-prahom pre stimuláciu príjmu žrádz v priebehu dvoch týždňov PR paradigmy, ale vyústil do signifikantne zvýšeného vlastného podávania sacharózy. Obrázok 4, (Všimnite si, že každá sacharózová odmena má kalorický obsah 0.1 kcal, preto aktivita self-administration sacharózy prispieva k celkovému dennému príjmu zanedbateľných kalórií.) Tabuľka 6 zobrazuje údaje o parametroch samokontroly v rámci paradigmy 9-dňového PR, pričom AGRP alebo aCSF vstrekujú ICV v dňoch 2, 5 a 8. U potkanov liečených AGRP bol celkový počet lisov s aktívnou pákou celkovo celkovo zvýšený počas PR dní 2-10 (p = 0.03) a dní bez injekcie (p = 0.048) s tendenciou k zvýšeniu (priemerne) dni injekcie. Okrem toho, Stop Time (ktorý odráža celkový čas strávený v samoobslužnej úlohe) bol významne zvýšený v dňoch bez injekcie (p = 0.02) s trendmi smerom k celkovému zvýšeniu a v dňoch injekcie. Celkový počet odmien sacharózy sa celkovo zvýšil v PR dňoch 2-10 (p = 0.03). V porovnaní s kontrolami liečenými aCSF alebo medzi dňami injekcie a injekcie neboli pozorované žiadne účinky liečby AGRP na neaktívne stlačenie páky. Výsledky podporujú interpretáciu pretrvávajúceho účinku AGRP na zvýšenie autonómie sacharózy: potkany tlačili viac na odmeňovaciu páku, dostali viac odmien sacharózy a strávili viac času venovaním sa tejto úlohe.

Tretia ventrikulárna (ICV) AGRP (0.01 nmol) stimuluje samopodávanie sacharózy v PR modeli, ale nemá žiadny vplyv na denný príjem potravy počas celého obdobia štúdie (PR Days 2 - 10, s injekciami v dňoch 2, 5 a 8) , Údaje o AGRP (n = 9) sú vyjadrené ...

Vplyv ICV AGRP na aCSF na progresívne pomery výkonnosti sacharózy

Vplyv štádia života na preferenciu a motiváciu sacharózy

V záverečnom experimente sme zhodnotili, či sa motivácia pre sacharózu líši medzi pubertálnymi a dospelými potkanmi. Na začiatku boli starým krysám 5 a 10-wk podávané testy preferencie sacharózy s výberom roztokov od 0 po 20% sacharózy, pred začiatkom testovania a tréningu samoliečbou. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 5aa v súlade so zisteniami uvedenými v literatúre sa zdá, že pre-pubertálne potkany preferujú sladší roztok ako mladé dospelé potkany: väčšina pre-pubertálnych potkanov mala vrcholný príjem roztoku 20% sacharózy, zatiaľ čo dospelé potkany vykazovali maximálny príjem 15% sacharózy. Následne boli obidve vekové skupiny rozdelené medzi potkanie potkany a diétu s vysokým obsahom tuku počas samokonzervačného tréningu a testovania. Bol zaznamenaný malý, ale štatisticky významný nárast počtu aktívnych pákových lisov peri-pubertálnymi verzus dospelými potkanmi (45 ± 3 vs. 37 ± 2, p = 0.05) spriemerovaný v rámci FR relácií, bez rozdielu v počte odmien sacharózy alebo počtu lisov na neaktívnej páke. Ako je znázornené na obrázku Obrázok 5b, bol veľmi významný celkový vplyv veku, počas PR relácií, s významne zvýšeným aktívnym pákovým stlačením u pubertálnych (n = 15) verzus mladých dospelých (n = 14) potkanov (2-way ANOVA, PRDay × vek; účinok veku, p = 0.017, žiadny nezávislý účinok PRDay, žiadna významná interakcia). Tthere bol trendom väcšieho úcinku veku v stravovaní s vysokým obsahom tuku, ale nedosiahol štatistickú významnosť (p = .13). Tabuľka 7 uvádza parametre správania PR: okrem zvýšených aktívnych pákových lisov dostávali peri-pubertálne potkany podstatne viac odmien sacharózy a vykazovali trend smerom k zvýšenému času zastavenia. Okrem toho peri-pubertálne potkany mali malý, ale signifikantný nárast v tlakoch na inaktívnu (tj neodmeňujúcu) páku, hoci pre peri-pubertálne aj pre dospelých potkanov bol počet neaktívnych pákových lisov približne 10% počtu. aktívnych pákových lisov. Tieto výsledky naznačujú, že peri-pubertálne potkany preferujú a budú viac vyhľadávať sladko-ochutnávacie potraviny a účinok môže byť zosilnený na pozadí diéty s vysokým obsahom tuku.

Obrázok 5

Juvenilné potkany majú v porovnaní s dospelými potkanmi zvýšenú motiváciu pre odmeňovanie sacharózy. 5. Testy preferencie sacharózy pre juvenilné (peri-pubertálne, n = 15) a mladé dospelé (n = 14) potkany. Potkany mali 30 min piť z rozsahu koncentrácií (0-20% sacharózy). ...

Vplyv veku na výkonnostné progresívne pomery^a pre sacharózu

Diskusia

Hlavným zistením tejto štúdie je, že stredne vysoká tuková diéta spotrebovaná počas peri-pubertálneho obdobia (tesne pred, počas a tesne po veku prechodu do puberty) významne zvýšila motiváciu pre roztoky sacharózy. Toto zistenie je v súlade s naším predchádzajúcim, podobným pozorovaním u dospelých potkanov (Figlewicz a kol., 2006). U týchto zvierat av ďalších kohortách zodpovedajúcich veku a liečby sme pomocou extenzívnej metabolickej charakterizácie zistili, že potkany neboli obézne alebo pre-obézne a neboli periférne rezistentné na inzulín. Nemôžeme vylúčiť možnosť, že potkany mali rezistenciu voči účinkom inzulínu alebo leptínu lokalizovanú na CNS: oba tieto hormóny prispievajú k modulácii potravinovej odmeny špecifickej pre miesto CNS (Davis, Choi a Benoit, 2010; Davis a kol., 2011a; Figlewicz & Sipols, 2010).

V podskupine potkanov sme merali amínové neurotransmitery a príbuzné metabolity v nucleus accumbens, ktoré dostávajú veľké investície dopaminergných projekcií zo stredného mozgu a považujú sa za kľúčové a centrálne miesto CNS na sprostredkovanie odmien a motivovaného správania (Ikemoto a Panksepp, 1996; Kelley a Berridge, 2002). Nepozorovali sme žiadnu zmenu absolútnych hladín alebo pomerov ktoréhokoľvek z týchto metabolitov vysielača, čo naznačuje, že zmenená katecholaminergná alebo serotonergná aktivita v jadre accumbens nie je primárnym alebo hlavným mechanizmom CNS, ktorý je základom zvýšenej motivácie k sacharóze. To je v súlade s nedávnou správou z roku Davis a kol. [2011 b], ktorí preukázali u dospelých potkanov, že ICV AGRP zvyšuje obrat dopamínu v mediálnom prefrontálnom kortexe, ale nie v nucleus accumbens. Okrem toho sme nepozorovali žiadny účinok „diétneho prenosu“ pri testovaní na potkanoch bezprostredne po puberte, ako mladí dospelí. To je v protiklade s nálezmi Bolañosa a ďalších, o behaviorálnych aj katecholaminergných parametroch u dospelých hlodavcov liečených metylfenidátom (Bolaños a kol., 2003; Bolaños, Glatt a Jackson, 1998; Brandon, Marinelli, Baker & White, 2001; Brandon, Marinelli a White, 2003). Je to pravdepodobne spôsobené priamym zacielením dopaminergných neurónov metylfenidátom a môže byť aj funkciou načasovania diétneho zásahu a času testovania zvierat. Nakoniec, nemusíme pozorovať prenosové účinky, pretože v tejto štúdii sa zdá, že primárnym miestom diétneho efektu je mediálny hypotalamus.

V tejto štúdii podporujú tri línie dôkazov kľúčovú úlohu mediálneho hypotalamického neuropeptidu AGRP pri zvýšenom podaní sacharózy u potkanov s vysokým obsahom tuku. Najprv sme pozorovali zvýšenie expresie AGRP (mRNA) v extraktoch celého hypotalamu u potkanov kŕmených 31.8% tukovou diétou v porovnaní s kontrolnými zvieratami. Hladiny mRNA orexínu a NPY mRNA sa však nezmenili. Zdá sa teda, že účinok diéty s vysokým obsahom tuku / behaviorálnej paradigmy je špecifický pre AGRP a nie je generalizovaný na orexigénne neuropeptidy. Toto zdôrazňuje úlohu AGRP v motivácii alebo hľadaní potravy a je v súlade s množstvom nedávnych správ v literatúre (diskutovaných nižšie). Naša nedávna práca ukázala kľúčovú úlohu mediálnej hypotalamickej aktivácie v spojení s výkonom PR v našom paradigme motivácie, so zvýšenou expresiou cFos v niekoľkých stredných hypotalamických jadrách (Figlewicz a kol., 2011). Taktiež sme identifikovali ARC ako kľúčovú oblasť pre účinok (exogénneho) inzulínu na zníženie autoregulácie sacharózy (Figlewicz a kol., 2008). ARC obsahuje neuróny AGRP / NPY (Broberger a kol., 1998; Hahn, Breininger, Baskin a Schwartz, 1998), ktoré pôsobia v mediálnom hypotalame na stimuláciu kŕmenia viacerými mechanizmami. V tejto štúdii imunocytochemická kvantifikácia aktivovaných neurónov AGRP demonštrovala zvýšenie neurónov cFos / AGRP u potkanov, ktoré boli trénované na podávanie sacharózy v porovnaní s neškolenými kontrolami správania. Toto je druhý prístup vedúci k interpretácii, že aktivácia neurónov neurónov AGRP prispieva k (samému nástupu) samopodania sacharózy. Predchádzajúce aj novšie štúdie súviseli s expresiou AGRP a účinkom s preferenčným príjmom tuku, buď ako diéta (Hagan a kol., 2000) alebo v kontexte motivačnej paradigmy (Tracy a kol., 2008); u dospelých potkanov ICV AGRP prednostne podmieňuje preferenciu miesta pre tuk (\ tDavis a kol., 2011b). Nedávne štúdie využívajúce cielené molekulárne techniky, ktoré umožňujú špecifickú aktiváciu AGRP neurónov u myší (Aponte, Atasoy a Sternson, 2011; Krashes a kol., 2011) potvrdili, že AGRP silne stimuluje výživu, zvyšuje hľadanie potravín a znižuje výdavky na energiu. Je zaujímavé poznamenať, že v experimentálnych skupinách kŕmených diétou s vysokým obsahom tuku bol celkový kalorický príjem významne nižší v porovnaní s kontrolnými potkanmi kŕmenými krmivom (Tabuľka 8), čo by bolo v súlade s endogénnym účinkom AGRP na zníženie výdavkov na energiu. Tieto účinky sú v súlade s predchádzajúcimi zisteniami Hagan a kol. [2000], že exogénne účinky AGRP na niektoré aspekty energetickej bilancie môžu byť pomerne predĺžené. Takže ako tretí prístup, naše výsledky ukazujúce zvýšené podávanie sacharózy v pubertálnych krysách (chow-fed) podávaných ICV AGRP tiež naznačujú, že účinok je trvalý. Špecifický nárast expresie mRNA AGRP u potkanov kŕmených diétou s vysokým obsahom tukov počas štyroch týždňov je v súlade s nedávnym výskumom Kaushik a kolegovia [2011] ktorý spája exogénne mastné kyseliny, intracelulárne generované mastné kyseliny a zvýšenú expresiu AGRP v hypotalamických neurónoch. Pridanie kyseliny olejovej alebo kyseliny palmitovej do kultivovaných buniek hypotalamu teda viedlo k zvýšenej expresii AGRP. Kým strava, ktorú sme použili, zvýšila kyselinu stearovú, palmitovú a olejovú, nie je možné zistiť, či sa tieto mastné kyseliny zvyšujú in vivo hypotalamické prostredie, či by ich lokalizované koncentrácie zodpovedali profilu dietetických mastných kyselín a či by jedna alebo viac z nich špecificky viedla k zvýšenej expresii AGRP. Napriek tomu je lákavé špekulovať, že diétne zložky môžu prispieť k zvýšeniu motivácie pre sladkosti prostredníctvom primárneho pôsobenia na mediálny hypotalamus.

Experimentálne protokoly: Kcal spotrebované

Naša štúdia ukazuje, že mladé potkany majú v porovnaní s dospelými potkanmi zvýšenú motiváciu pre sacharózu. Toto bolo zjavné počas celého obdobia samo-podávania PR a existovala tendencia pre diétu s vysokým obsahom tuku na zvýšenie veku. Je možné, že to nedosiahlo štatistickú významnosť z dôvodu relatívne malých skupín; údaje teda naznačujú, že u pubertálnych zvierat (a možno aj u ľudí) môže mierne zvýšený tuk v potrave prispieť k zlepšenému správaniu pri hľadaní, aby sa získali sladené nápoje alebo potraviny. Zo spoločenského hľadiska zdôrazňuje potrebu venovať pozornosť tukovej zložke stravy „mladistvých“ alebo dospievajúcich, a to nielen kvôli priamym negatívnym metabolickým dôsledkom nadmerného príjmu tuku v potravinách, ale aj preto, že môže prispieť k správaniu, ktoré je výsledkom zvýšeného príjmu cukrov. Ako nedávno preskúmal Stanhope [2012]spoločné užívanie cukrov s tukom môže mať značné negatívne metabolické následky. Kombinácie s vysokým obsahom tuku / cukru u ľudí sú tiež relatívne menej uspokojivou diétou (Drewnowski, 1998). So zvýšeným výskytom cukrovky (Cizza, Brown a Rother, 2012) a tukovej pečene (Kohli a kol., 2010), ktorá sa vyskytuje v detskej populácii, je dôležitá dôležitosť zdravej a vyváženej stravy u mládeže. V pubertálnych potkanoch (oproti dospelým potkanom) sme pozorovali signifikantný nárast lisov na inaktívnej páke, hoci počet pákových lisov bol stále veľmi nízky. Je možné, ale zdá sa nepravdepodobné, že by zvýšená aktívna páka mohla byť považovaná za „nešpecifický“ účinok celkovej aktivity, pretože väčšina aktivity bola zameraná na aktívnu páku. Hoci skutočný počet neaktívnych pákových lisov bol zvýšený, pomer relatívne k aktívnym pákovým tlakom bol porovnateľný medzi peri-pubertálnymi a dospelými potkanmi a zvýšené pákové lisy môžu odrážať dlhší aktívny čas v samo-aplikovaných komorách. V inej paradigme (niektoré obmedzenie potravín, použitie potravinových peliet namiesto sladkej odmeny a plán FR1) Sturman, Mandell a Moghaddam [2010] nedávno hlásili zmenený inštrumentálny výkon u dospievajúcich vs. dospelých potkanov. Nepozorovali žiadny rozdiel v nosepokes, ktorý dodával potravinové pelety, medzi mladistvými a dospelými potkanmi. U mladistvých potkanov však pozorovali zvýšené vytrvalostné správanie počas vyhynutia. Zhrnuté, tieto dve štúdie zdôrazňujú vplyv veku a vývojového štádia na motiváciu k jedlu, čo je v súlade s rýchlym rastom pubertálnych potkanov. V tejto štúdii sme hodnotili samce, ale nie samičky potkanov. V súčasnosti sú obmedzené štúdie, ktoré priamo porovnávajú samce a samice potkanov v paradigme potravinovej motivácie a je odôvodnené systematické hodnotenie počas pubertálneho obdobia. Treba poznamenať, že v štúdii (ľudských) adolescentov, Coldwell a kolegovia (2009) pozorovali asociáciu medzi markerom rastu a nie gonádovými steroidmi sama o sebe, Napriek tomu si v tejto vekovej skupine zaslúžia ďalšie skúmanie rodových účinkov.

Na záver, naše štúdie demonštrujú zvýšenú motiváciu pre sacharózu u puberálnych potkanov v porovnaní s dospelými, a to je zvýšené prístupom k diéte s mierne vysokým obsahom tukov. Účinok stravy s vysokým obsahom tuku na motiváciu sacharózy môže byť sprostredkovaný zvýšenou aktivitou AGRP v mediálnom hypotalame. Toto je ďalším dôkazom silnej vnútornej funkčnej pripojiteľnosti obvodov systému CNS, ktorá reguluje energetickú homeostázu s obvodmi, ktoré regulujú odmeňovanie a motiváciu. Zlepšenie motivácie pre sacharózu stredne vysokým obsahom tukov predchádza metabolické poruchy a zjavná obezita a naznačuje, že správanie môže spočiatku spôsobiť metabolické zmeny skôr ako naopak. Požitie vysokých tukov a sladkých potravín obsahujúcich fruktózu by spoločne prispelo k metabolickému profilu, ktorý je vysokým rizikom cukrovky typu2 a kardiovaskulárneho ochorenia. Tieto zistenia zdôrazňujú dôležitosť sústredenia sa na stravovacie návyky a stravovanie počas puberty, pretože sú ovplyvnené nielen sociálno-environmentálnymi vplyvmi, ale aj neurochemickými a behaviorálnymi úpravami CNS, keď sa zviera alebo človek prechádza počas obdobia viacerých zrelých zmien pri získavaní reprodukčnej schopnosti.

Mierna strava s vysokým obsahom tuku zvyšuje motiváciu pre sacharózu u dospelých potkanov.
V tejto štúdii diéta s vysokým obsahom tuku zvyšuje motiváciu sacharózy u peri-pubertálnych potkanov.
Peri-pubertálne potkany mali v porovnaní s dospelými zvýšenú motiváciu k sacharóze.
Zvýšená motivácia k sacharóze môže byť sprostredkovaná hypotalamickým AGRP.
Záver: Diéta s vysokým obsahom tuku poháňa motiváciu pre sladkosti nezávisle od obezity.

Poďakovanie

Tento výskum bol podporený NIH grantom DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann je vedúcou vedeckou pracovníčkou v oblasti výskumu, Biomedicínskym laboratórnym výskumným programom, oddelením pre záležitosti veteránov Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Stephen Benoit bol podporovaný NIH DK066223 a Ethicon Endosurgery Inc. Autori ďakujú Dr. Tami Wolden-Hansonovi za podporu pri meraní zloženia tela; William Banks a Lucy Dillman za podporu pri meraní triglyceridov; a Amalie Alver a Samantha Thomas-Nadler za pomoc pri štúdiách správania.

Referencie

Andersen SL, Teicher MH. Stres, citlivé obdobia a maturačné udalosti v adolescentnej depresii. Trendy v Neuroscience. 2008, 31: 183-191. [PubMed]
Apotte Y, Atasoy D, Sternson SM. AGRP neuróny sú dostatočné na to, aby rýchlo a bez tréningu organizovali kŕmenie. Nature Neuroscience. 2011, 14: 351-355. [Článok bez PMC] [PubMed]
Barnes MJ, Argyropoulos G, Bray GA. U AgRP knockoutovaných myší je preferovaná diéta s vysokým obsahom tuku, ale nie hyperfágia po aktivácii mu opioidných receptorov. Výskum mozgu. 2010, 1317: 100-107. [Článok bez PMC] [PubMed]
Bolaños CA, Barrot M, Berton O, Wallace-Black D, Nestler EJ. Liečba metylfenidátom počas pre- a periadolescencie mení reakcie správania na emocionálne podnety v dospelosti. Biologická psychiatria. 2003, 54: 1317-1329. [PubMed]
Bolaños CA, Glatt SJ, Jackson D. Subsenzitivita na dopaminergné liečivá u periadolescentných potkanov: behaviorálna a neurochemická analýza. Výskum mozgu Vývojový výskum mozgu. 1998, 111: 25-33. [PubMed]
Brandon CL, Marinelli M, Baker LK, biela FJ. Zvýšená reaktivita a zraniteľnosť voči kokaínu po liečbe metylfenidátom u dospievajúcich potkanov. Neuropsychofarmakologie. 2001, 25: 651-61. [PubMed]
Brandon CL, Marinelli M, biela FJ. Expozícia metylfenidátu u adolescentov mení aktivitu dopamínových neurónov potkana stredného mozgu. Biologická psychiatria. 2003, 54: 1338-1344. [PubMed]
Broberger C, Johansen J, Johansson C, Schalling M, Hokfelt T. Mozgový obvod neuropeptidu Y / agouti génu príbuzného proteínu (AGRP) u myší ošetrených normálnym, anorektickým a monosodným glutamátom. Zborník Národnej akadémie vied. 1998, 95: 15043-15048. [Článok bez PMC] [PubMed]
Cason AM, Smith RJ, Tahsili-Fahadan P, Moorman DE, Sartor GC, Aston-Jones G. Úloha orexínu / hypokretínu pri hľadaní odmien a závislosti: dôsledky pre obezitu. Fyziológia a správanie. 2010; 100: 419–428. [Článok bez PMC] [PubMed]
Choi DL, Davis JF, Fitzgerald ME, Benoit SC. Úloha orexínu-A pri potravinovej motivácii, stravovaní založenom na odmeňovaní a aktivácii neurónov vyvolanej potravinami u potkanov. Neuroscience. 2010, 167: 11-20. [PubMed]
Cizza G, Brown RJ, Rother KI. Rastúci výskyt a problémy cukrovky v detstve. Malý prehľad. Journal of Endokrinological Research. 2012 epub Máj 8, 2012. [Článok bez PMC] [PubMed]
Coldwell SE, Oswald TK, Reed DR. Marker rastu sa líši u dospievajúcich s preferenciou vysokej a nízkej hladiny cukru. Fyziológia a správanie. 2009; 96: 574–580. [Článok bez PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Benoit SC. Inzulín, leptín a odmena. Trendy v endokrinológii a metabolizme. 2010, 21: 68-74. [Článok bez PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Fitzgerald MF, Clegg DJ, Lipton JW, Figlewicz DP, Benoit SC. Leptín reguluje energetickú rovnováhu a motiváciu prostredníctvom pôsobenia na odlišné nervové obvody. Biologická psychiatria. 2011; 69: 668-674. [Článok bez PMC] [PubMed]
Davis JF, Choi DL, Schurdak JD, Krause EG, Fitzgerald MF, Lipton JW, Sakai RR, Benoit SC. Centrálne melanokortíny modulujú mezokortikolimbickú aktivitu a správanie pri hľadaní potravy u potkanov. Fyziológia a správanie. 2011b; 102: 491–495. [Článok bez PMC] [PubMed]
Davis JF, Tracy AL, Schurdak JD, Tschop MH, Clegg DJ, Benoit SC, Lipton JW. Expozícia zvýšeným hladinám tuku v strave zmierňuje psychostimulačnú odmenu a mesolimbický obrat dopamínu u potkanov. Behaviorálne neurovedy. 2008, 122: 1257-1263. [Článok bez PMC] [PubMed]
Desor JA, Beauchamp GK. Pozdĺžne zmeny v sladkých preferenciách u ľudí. Fyziológia a správanie. 1987; 39: 639-641. [PubMed]
Desor JA, Greene LS, Maller O. Preferencie pre sladké a slané v 9- pre 15-ročných a dospelých ľudí. Science. 1975, 190: 686-687. [PubMed]
Drewnowski A. Hustota energie, chuť a sýtosť: dôsledky pre reguláciu hmotnosti. Výživa Recenzie. 1998, 56: 347-353. [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett JL, Aliakbari S, Zavosh A, Sipols AJ. Inzulín pôsobí na rôznych miestach CNS, aby sa znížilo akútne podávanie sacharózy a samopodanie sacharózy u potkanov. American Journal of Physiology. 2008, 295: R388-R394. [Článok bez PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett JL, Naleid AM, Davis C, Grimm JW. Intraventrikulárny inzulín a leptín znižujú samopodanie sacharózy u potkanov. Fyziológia a správanie. 2006; 89: 611–616. [PubMed]
Figlewicz DP, Bennett-Jay JL, Kittleson S, Sipols AJ, Zavosh A. Vlastné podávanie sacharózy a aktivácia CNS u potkanov. Am. J. Physiol. 2011, 300: R876-R884. [Článok bez PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Ioannou G, Bennett Jay J, Kittleson S, Savard C, Roth CL. Vplyv mierneho príjmu sladidiel na metabolické zdravie potkanov. Fyziológia a správanie. 2009; 98: 618–624. [Článok bez PMC] [PubMed]
Figlewicz DP, Sipols AJ. Energetické regulačné signály a potravinová odmena. Farmakológia, biochémia a správanie. 2010, 97: 15-24. [Článok bez PMC] [PubMed]
Frangioudakis G, Gyte AC, Loxham SJ, Poucher SM. Test intravenóznej glukózovej tolerancie u kanylovaných potkanov Wistar: Robustný spôsob in vivo stanovenia glukózou stimulovanej sekrécie inzulínu. Časopis farmakologických a toxikologických metód. 2008, 57: 106-113. [PubMed]
Hagan MM, Rushing PA, Pritchard LM, Schwartz MW, Strack AM, Van Der Ploeg LHT, Woods SC, Seeley RJ. Dlhodobé orexigénne účinky AgRP- (83-132) zahŕňajú iné mechanizmy ako blokáda melanokortínového receptora. American Journal of Physiology. 2000, 279: R47-R52. [PubMed]
Hahn TM, Breininger JF, Baskin DG, Schwartz MW. Koexpresia Agrp a NPY v neurotických hypotalamoch aktivovaných nalačno. Nature Neuroscience. 1998, 1: 271-272. [PubMed]
Hodos W. Progresívny pomer ako meradlo sily odmeny. Science. 1961, 134: 943-944. [PubMed]
Ikemoto S, Panksepp J. Disociácie medzi apetitívnymi a konzumnými reakciami farmakologickými manipuláciami oblastí mozgu relevantných pre odmeňovanie. Behaviorálne neurovedy. 1996, 110: 331-345. [PubMed]
Jewett DC, Cleary J, Levine AS, Schaal DW, Thompson T. Účinky neuropeptidu Y, inzulínu, 2-deoxyglukózy a potravinovej deprivácie na správanie motivované potravinami. Psychopharmacology. 1995, 120: 267-271. [PubMed]
Kaushik S, Rodriguez-Navarro JA, Arias E, Kiffin R, Sahu S, Schwartz GJ, Cuervo AM, Singh R. Autofagia v hypotalamických AgRP neurónoch reguluje príjem potravy a energetickú rovnováhu. Bunkový metabolizmus. 2011, 14: 173-183. [Článok bez PMC] [PubMed]
Kelley AE, Berridge KC. Neuroveda prírodných odmien: význam pre návykové drogy. Journal of Neuroscience. 2002, 22: 3306-3311. [PubMed]
Kelley SP, Nannini MA, Bratt AM, Hodge CW. Neuropeptid-Y v paraventrikulárnom jadre zvyšuje self-podanie etanolu. Peptidy. 2001, 22: 515-522. [Článok bez PMC] [PubMed]
Kohli R, Boyd T, Lake K, Dietrich K, Nicholas L, Balistreri WF, Ebach D, Shashidkar H, Xanthakos SA. Rýchly vývoj NASH v detstve. Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 2010, 50: 453-456. [Článok bez PMC] [PubMed]
Krashes MJ, Koda S, Ye CP, Rogan SC, Adams AC, Cusher DS, Maratos-Flier E, Roth BL, Lowell BB. Rýchla reverzibilná aktivácia AgRP neurónov poháňa stravovacie správanie u myší. Journal of Clinical Investigation. 2011, 121: 1424-1428. [Článok bez PMC] [PubMed]
Mennella JA, Pepino MY, Reed DR. Genetické a environmentálne determinanty horkého vnímania a sladkých preferencií. Pediatrics. 2005, 115: 216-222. [Článok bez PMC] [PubMed]
Myers KP, Sclafani A. Vývoj naučených preferencií. Vývojová psychobiológia. 2006, 48: 380-388. [PubMed]
Národný program pre výskum rakoviny. Zdroje kalórií z pridaných cukrov medzi americkou populáciou, 2005-06. Aktualizované 21 December 2010. [Accessed 21 September 2011]; 2010 K dispozícii od: http://riskfactor.cancer.gov/diet/foodsources/added_sugars/
Nixon JP, Zhang M, Wang CF, Kuskowski MA, Novak CM, Levine JA, Billington CJ, Kotz CM. Vyhodnotenie zobrazovacieho systému kvantitatívnej magnetickej rezonancie pre analýzu zloženia celého tela u hlodavcov. Obezita. 2010, 18: 1652-1659. [Článok bez PMC] [PubMed]
Ogden CL, Carroll MD. Divízia prieskumov zdravia a výživy. Prevalencia obezity u detí a adolescentov: Spojené štáty americké, trendy 1963-1965 prostredníctvom 2007-2008. [Prístup 21 September 2011], zdravie E-Stat. 2010 2010 K dispozícii od: http://www.cdc.gov/nchs/fastats/overwt.htm.
Paxinos G, Watson C. Atlas mozgu potkana v stereotaxických súradniciach. 5th. San Diego CA: Elsevier Academic Press; 2005.
Richardson NR, Roberts DC. Postupy progresívneho pomeru v štúdiách o samopodávke liekov u potkanov: metóda na hodnotenie posilňujúcej účinnosti. Journal of Neuroscience Methods. 1996, 66: 1-11. [PubMed]
Roitman MF, Stuber GD, Phillips PE, Wightman RM, Carelli RM. Dopamín funguje ako subsekundový modulátor vyhľadávania potravín. Journal of Neuroscience. 2004, 24: 1265-1271. [PubMed]
Rossi M, Kim M, Morgan D, malý C, Edwards C, Sunter D, Abusnana S, Goldstone A, Russell S, Stanley S, Smith D, Yagaloff K, Ghatei M, Bloom S. A-terminálny fragment Agouti- príbuzný proteín zvyšuje kŕmenie a antagonizuje účinok hormónu stimulujúceho alfa-melanocyty in vivo. Endocrinology. 1998, 139: 4428-4431. [PubMed]
Stanhope KL. Úloha cukrov obsahujúcich fruktózu pri epidémiách obezity a metabolického syndrómu. Ročné recenzie medicíny. 2012, 63: 329-343. [PubMed]
Sturman DA, Mandell DR, Moghaddam B. Adolescenti vykazujú rozdiely v správaní od dospelých počas inšturmetálneho učenia a zániku. Behaviorálne neurovedy. 2010, 124: 16-25. [Článok bez PMC] [PubMed]
Tracy AL, Clegg DJ, Johnson JD, Davidson TL, Woods SC. Antagonista melanokortínu AgRP (83-132) zvyšuje chuťovú odpoveď na tuk, ale nie na sacharid, posilňovač. Farmakologická biochémia a správanie. 2008, 89: 263-271. [Článok bez PMC] [PubMed]
Vartanian LR, Schwartz MB, Brownell KD. Účinky konzumácie nealkoholických nápojov na výživu a zdravie: systematický prehľad a metaanalýza. American Journal of Public Health. 2007, 97: 667-75. [Článok bez PMC] [PubMed]