Am J Physiol Regul Integ Comp Physiol, 2011 Apr; 300 (4): R876 – R884.
Publikované online 2011 Feb 9. doi: 10.1152 / ajpregu.00655.2010
PMCID: PMC3075076
1,2 abstraktné
Doteraz sme uviedli, že podávanie inzulínu do oblúkového jadra hypotalamu znižuje u potkanov motiváciu pre sacharózu, ktorá sa hodnotí na základe vlastného podávania. Pretože vzor aktivácie centrálneho nervového systému (CNS) v spojení so samopodaním sacharózy nebol hodnotený, v tejto štúdii sme merali expresiu c-Fos ako indexu neuronálnej aktivácie. Vyškolili sme potkany na stlačenie sacharózy, podľa plánu fixného pomeru (FR) alebo progresívneho pomeru (PR) a mapovanej expresie c-Fos imunoreaktivity v CNS v porovnaní s expresiou c-Fos v ovládaných kontrolách. Pozorovali sme jedinečnú expresiu c-Fos v mediálnom hypotalame (oblúkovité, paraventrikulárne, retrochiasmatické, dorsomediálne a ventromediálne jadrá) v spojení s nástupom PR výkonu a expresiou c-Fos v laterálnom hypotalame a jadre lôžka stria terminálu v spojení s nástupom výkonu FR. Expresia c-Fos bola zvýšená v nucleus accumbens u potkanov FR aj PR. Naša štúdia zdôrazňuje dôležitosť oboch hypotalamických energetických homeostázových obvodov a limbických obvodov pri plnení úlohy potravinovej odmeny. Vzhľadom na úlohu mediálneho hypotalamu pri regulácii energetickej bilancie naša štúdia naznačuje, že tento obvod môže prispieť k regulácii odmeňovania v širšom kontexte energetickej homeostázy.
mezolimbické dopaminergné (DA) obvody, vrátane ventrálnej tegmentálnej oblasti (VTA) a projekcie striatového a kortikálneho miesta, boli identifikované ako faktory, ktoré zohrávajú rozhodujúcu úlohu v motivujúcich alebo odmeňujúcich aspektoch mnohých tried drog zneužívania (13, 22-24, 26, 48). Nedávne výskumy z nášho laboratória a iných naznačujú, že tento obvod tiež zohráva významnú úlohu v motivačných alebo odmeňovacích aspektoch potravín. Funkčné a anatomické interakcie s obvodmi, ktoré regulujú energetickú homeostázu, navrhujú správy o modulácii potravinovej odmeny výživovým stavom zvierat (10, 14, 16, 43). Modulácia odmeny, vrátane potravinovej odmeny, podľa nutričného alebo metabolického stavu, je silne ovplyvnená neurálnymi a endokrinnými signálmi, vrátane inzulínu (15), leptín (11, 18, 21, 30, 32), ghrelín (35), hormón koncentrujúci melanín (MCH) (45) a orexínu (5, 7): prítomnosť receptorov, biochemická a bunková účinnosť a in vivo alebo behaviorálna účinnosť týchto signálov v centrálnom nervovom systéme (CNS) boli v posledných rokoch hojne preukázané.
Ukázalo sa, že rozšírené obvody limbických obvodov zohrávajú významnú úlohu pri kŕmení a odmeňovaní potravín (2, 19, 28). Existujú však ďalšie prispievajúce miesta CNS. Pozoruhodné je, že laterálny hypotalamus (LH) je už dlho známe, že je miestom sprostredkujúcim stravovacie a samo-stimulačné správanie (4, 31). Orexinergné neuróny a leptínová signalizácia v LH boli identifikované ako dôležité pre výživu a potravinovú odmenu (5, 29, 30). Nedávno sme zistili, že inzulín podávaný buď do tretej mozgovej komory alebo do oblúkového jadra hypotalamu (ARC) by mohol znížiť podávanie sacharózy, ale podávanie inzulínu do VTA alebo nucleus accumbens nemalo žiadny vplyv na túto špecifickú paradigmu odmeňovania (15). Zdá sa teda, že viaceré miesta hypotalamu môžu zohrávať významnú úlohu v motivovanom vyhľadávaní a získavaní potravy a v súlade s tým by sa dalo predpokladať, že oblasti hypotalamu sú v podstate aktivované v spojení so samo-podávaním potravy. Ak chcete začať testovať túto hypotézu, zmapovali sme expresiu c-Fos v CNS u potkanov, ktorí boli vycvičení v paradigme samopodania sacharózy, po tréningu s fixnými pomermi (FR) alebo po tréningu progresívnych pomerov (PR). na hodnotenie motivácie (20).
MATERIÁLY A METÓDY
Predmety.
Subjektmi boli samce potkanov albínov (325–425 g) zo Simonsenu (Gilroy, CA). Potkany sa nechali chow ad libitum. Boli udržiavané v cykle svetlo-tma 12:12 h so zapnutými svetlami o 6:7 a boli trénovaní a testovaní medzi XNUMX:XNUMX a poludním v postprandiálnom a postabsorpčnom stave. Všetky postupy uskutočňované na potkanoch sa riadili pokynmi National Institutes of Health pre starostlivosť o zvieratá a boli schválené subkomisiou pre starostlivosť a použitie zvierat Výboru pre výskum a vývoj v systéme VA Puget Sound Health Care.
Samopodávanie sacharózy.
Postupy boli založené na našej publikovanej metodike (15) a boli uskutočnené na kŕmených potkanoch. Experiment zahŕňal tri fázy: autoshaping na začatie tréningu, FR tréning a progresívny tréning (PR) s použitím PR algoritmu Richardsona a Robertsa (38). PR algoritmus vyžaduje 1, 2, 4, 6, 9, 12, 16, 20, 28, 36, 48, 63, 83, 110, 145, 191, 251, 331, 437, 575, 759, 999, 999, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX, XNUMX a XNUMX atď.) pákové tlačidlá pre úspešné doručenie odmien v rámci relácie (38). Potkany sa vyškolili, aby si sami podali 5% sacharózu (0.5 odmena), ktorá sa podala do nádoby na kvapky tekutiny. Operantné boxy, kontrolované systémom Med Associates (Georgia, VT), mali dve páky, ale iba jedna páka (aktívna, zatiahnuteľná páka) aktivovala infúznu pumpu. Zaznamenali sa aj stlačenia druhej páky (neaktívna, stacionárna páka). Ako sme už predtým pozorovali, počet lisov na neaktívnej páke bol veľmi nízky (menej ako 10 lisy / relácie). Roztok sacharózy bol dodaný do nádoby na kvapky tekutiny na orálnu spotrebu (Med Associates, St. Albans, VT). Počiatočný tréning sa uskutočňoval počas 1-h sedení v rámci nepretržitého posilňovacieho plánu (FR1: každý pákový lis bol zosilnený). Každé sedenie začalo vložením aktívnej páky a osvetlením svetla bieleho domu, ktoré zostalo počas celej relácie. Tón 5-u (2900 Hz, 20 dB nad pozadím) a svetlo (7.5 W biele svetlo nad aktívnou pákou) diskrétne zložené cue sprevádzalo každú dodávku odmeny s časovým limitom 20-s začínajúcim dodaním sacharózy. FR výcvik bol uskutočňovaný počas 10 dní; stabilná reakcia sa dosiahne piatym zasadnutím. PR tréning bol vykonaný pre maximálne možné 3 h / deň počas 10 dní. PR relácie sa skončili po 30 min bez aktívnej páky stlačiť, v tomto okamihu sa domáce svetlo automaticky vyplo a aktívna páka sa zatiahla; potkany boli vybraté z komôr a vrátené do svojich domácich klietok. "Stop čas" hlásené v Tabuľka 2 predstavuje čas, kedy bol systém vypnutý; posledný aktívny pákový lis by teda nastal 30 min pred časom zastavenia. Údaje o správaní (Tabuľka 2) predstavujú priemerné hodnoty sedenia 6-10 pre výcvik FR a. \ t sedenia 1-9 pre PR tréning. Kontrolné potkany sa odobrali z ustajňovacej miestnosti a umiestnili sa do čistej prevádzkovej komory s domovým svetlom po dobu 60 min., V rámci procedurálnej miestnosti, aby sa simulovali skúsenosti s manipuláciou a laboratórnymi skúsenosťami potkanov, ktorým sa podávala sacharóza. V operatívnych boxoch nedostali nič na jedenie ani pitie a nemali prístup k pákam.
Posledný deň sa potkany umiestnili do komôr podľa tréningových dní a nechali sa v komore 90 minút, potom sa vybrali, kvôli anestézii, premývaniu a následnej imunohistochémii. Kontrolné potkany boli taktiež privedené do miestnosti s procedúrami a držané v čistej operatívnej komore podľa výcvikových dní po dobu 90 minút, potom boli anestetizované a premyté. Bezprostredne po tomto poslednom 90-minútovom sedení boli potkany hlboko anestetizované inhaláciou izofluránu a premyté 0.9% NaCI a potom studeným 4% roztokom paraformaldehydu. Načasovanie anestézie a eutanázie bolo založené na známom časovom priebehu vrcholovej expresie proteínu c-Fos 90 - 120 minút po udalosti. Expresia c-Fos by teda odrážala aktiváciu CNS na začiatku behaviorálnej úlohy, skôr než by bola výsledkom toho, že zvieratá túto úlohu zažili a prijali sacharózu. Mozgy sa vybrali a postfixovali sa v paraformaldehyde niekoľko dní; potom sa následne umiestnili do 20% sacharózy-PBS, potom sa umiestnili do 30% roztoku sacharózy-PBS. Mozgy sa rezali na kryostatu (Leica CM 3050S kryostat) na imunohistochémiu.
c-Fos imunohistochémia a kvantifikácia.
Použili sme našu zavedenú metodiku na kvantifikáciu imunoreaktívneho proteínu c-Fos v rezoch mozgu (12). Počiatočná kvalitatívna kontrola celého mozgu sa uskutočnila na expresiu c-Fos. Koronálne rezy 12-μm s nasunutým sklíčkom boli premyté 3 krát v PBS (Oxoid, Hampshire, UK). Rezy boli potom blokované pre 1 h pri laboratórnej teplote v PBS obsahujúcom 5% normálneho kozieho alebo oslového séra. Rezy sa potom niekoľkokrát premyli v PBS a inkubovali cez noc pri 4 ° C v roztokoch primárnych protilátok pripravených v PBS. Rezy sa trikrát premyli v PBS a potom sa inkubovali v tme pri laboratórnej teplote v roztoku sekundárnej protilátky pripravenom v PBS pre 1 h. Rezy sa potom znova premyli v PBS a nasadili sa a zakryli sa sklíčkom v montážnom médiu Vectashield pre tvrdé nastavenie (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Digitálne snímky rezov boli získané s použitím fluorescenčného mikroskopu Nikon Eclipse E-800 pripojeného k fotoaparátu Optiphot a pomocou softvéru Image Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
Následne sme sa zamerali na obmedzený počet oblastí vykazujúcich zjavný rozdiel medzi stavmi, na kvantifikáciu a na fenotypizáciu neurónov. Konkrétne sme sa zamerali na jadro nucleus accumbens a shell (NAc); jadro predného a zadného lôžka stria terminalis (aBNST, pBNST); mediálne hypotalamické oblasti [ventromediálne jadro (VMH), dorsomediálny hypotalamus (DMH), paraventrikulárne jadro (PVN), retrochiasmatická oblasť (RCh) a ARC]; laterálny hypotalamus (LH), vrátane dorzálnych a ventrálnych oblastí a perifornickej (peF) oblasti; VTA; mozgový kmeň [nižšie olivové, hypoglosálne (nXII) jadro solitárneho traktu, laterálne retikulárne jadro a jadrá C1 / A1 adrenalín / noradrenalín]. Rezy 12-μm zodpovedajúce atlasu boli hodnotené na expresiu c-Fos a kvantifikáciu v zhodných sekciách a oblastiach na základe atlasu Paxinos a Watson (34). Prosím pozri Tabuľka 1 pre špecifické stereotaxické súradnice. Primárnym zameraním testov bolo porovnať každú úlohu správania s jej príslušnou kontrolou (PR vs. PRC; FR vs. FRC). Na optimalizáciu možných rozdielov založených na podmienkach správania v porovnaní s kontrolnými podmienkami sa na analýzu vybrali špičkoví pracovníci z PR a FR skupín. Analyzovali sa teda potkany 4 / 12 PR a 3 / 12 FR: Tieto potkany mali aktívny počet stlačení páky (konečný koncový bod správania), ktorý bol väčší ako jedna štandardná odchýlka nad priemerom pre príslušnú skupinu správania. Bola tiež analyzovaná subhorta kontrolných potkanov (potkany 5 PRC a 3 FRC potkany, prítomné v procedúrnej miestnosti v rovnakom čase ako FR alebo PR potkany). Ďalšia skupina troch potkanov sa odobrala pomocou FR procedúry („FRext“), aby sa napodobnila pridaná doba trvania PR postupu (tj celkovo 20 dní, keď sa PR potkany odoberali prostredníctvom FR a potom PR), aby sa vyhodnotilo, či rozdiely medzi FR a PR boli spôsobené úlohou správania alebo trvaním procedúry. FRext mozgy neboli analyzované a systematicky testované, ale špecifické oblasti záujmu boli testované s ďalšími štyrmi skupinami, aby sa umožnila komparatívna kvantifikácia, ako je špecificky uvedené vo výsledkoch.
Na kvantifikáciu (pri zväčšení 40 ×) boli vybrané atlasové oblasti. Softvér ImagePro Plus (Media Cybernetics) sa použil na zachytenie obrazu požadovanej oblasti. Bola vymedzená oblasť na počítanie a stanovil sa prah pre počet pozitívnych buniek. Rovnaká oblasť a pozadie (prah) boli použité pre rezy z príslušných experimentálnych skupín a počítanie pozitívnych buniek (kvantifikácia) bolo uskutočnené v tej istej relácii pre všetky experimentálne skupiny, aby sa zabránilo zmenám medzi reláciami v pozadí. Na štatistickú analýzu boli počty odobraté z jednotlivých potkanov, iba ak zodpovedajúce alebo úplné úseky prešli cez každú oblasť (ako je definované v bode 3). \ T Tabuľka 1) boli k dispozícii; údaje pre konkrétnu oblasť neboli odobraté od potkana, ak pre túto oblasť neboli úplné dvojstranné zastúpenia.
Kvalitatívna dvojito značená imunofluorescenčná analýza.
Mozgové rezy sa odobrali potkanom, u ktorých sa kvantifikoval c-Fos, na dvojito označenú imunohistochémiu. Pretože sme si nepriali narušiť behaviorálny výkon zvierat, neboli vopred ošetrené kolchicínom, aby sa optimalizovala vizualizácia peptidových neurotransmiterov. Preto bola vizualizácia neurónových fenotypov aktivovaných v súvislosti s úlohou samopodávania obmedzená. Avšak aby sa začalo hodnotenie fenotypov aktivovaných neurónov na mnohých miestach CNS, boli digitálne obrazy (získané, ako je opísané v časti vyššie) urobené pri 20 ×, 40 × alebo 60 × (ako je znázornené na obrázkových legendách) zväčšení . Postup dvojitého farbenia glutamát dekarboxylázy (GAD), tyrozínhydroxylázy (TH), CRF, neuropeptidu Y (NPY), peptidu príbuzného aggouti (AgRP) a tryptofán hydroxylázy bol porovnateľný so stanovením imunoreaktivity c-Fos. vlastné, s tým rozdielom, že zmes c-Fos-Ab a jednej z ďalších primárnych protilátok sa použila na inkubáciu cez noc pri 4 ° C; rovnako boli obe sekundárne protilátky v rovnakom roztoku a inkubovali sa 1 hodinu v tme pri izbovej teplote. Pre skúšku orexínom sa použilo 20-minútové premytie 50% etanolom pred blokovacím krokom. Uskutočnili sa počiatočné optimalizačné testy na stanovenie vhodného zriedenia primárnych protilátok. Použité primárne protilátky boli králičie anti-c-Fos (1: 500) (sc-52) a myšie anti-c-Fos (1: 800) (obe od Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA); myšia anti-GAD (1: 1,000 1), myšia anti-tyrozínhydroxyláza (500: 1) a ovčia anti-tryptofánhydroxyláza (všetky od Chemicon, Temecula, CA); králičie anti-CRF (500: 1) (dar od Dr. Wylie Vale, Salk Institute, CA); králičie anti-NPY (1,000: 1 1,000), králičie anti-AGRP (1: 5,000 3) a kozie anti-orexín A (488: 1 500), všetko od spoločnosti Phoenix Pharmaceutical (St. Joseph, MO). Použitými sekundárnymi protilátkami boli kozie anti-králičie alebo anti-myšacie protilátky konjugované s Cy1 (Jackson Immunoresearch; West Grove, PA), kozie anti-myšie alebo králičie alebo somárske anti-ovčie IgG Alexa Fluor 2,500 (Molecular Probes, Eugene, OR) ; všetky sekundárne protilátky boli zriedené v pomere 488: 1. duálne imunofarbenie c-Fos / MCH sa testovalo sériovo; po prvé, pre MCH (500: 5 1 primárnych protilátok, Millipore) so sekundárnou protilátkou Alexa-500-kozí anti-králičí (3: 20). Sklíčka sa opätovne blokovali 50% normálnym kozím sérom a farbili sa na anti-c-Fos (XNUMX: XNUMX) a cyXNUMX-kozie anti-králiky ako sekundárne protilátky. Pre test MCH sa použilo XNUMX-minútové premytie XNUMX% etanolom pred blokovacím krokom.
Štatistické analýzy.
Skupinové údaje sú prezentované ako priemer ± SE v texte, tabuľkách a obrázkoch. Význam je definovaný ako P ≤ 0.05. Štatistické porovnania sa uskutočňujú medzi experimentálnymi skupinami (FR vs. PR) alebo medzi experimentálnymi skupinami a zodpovedajúcimi kontrolami (PR vs. PRC; FR vs. FRC) pomocou nepárového Studentovho súboru. t-test. Pearsonove korelačné koeficienty medzi aktívnymi pákovými lismi a expresiou c-Fos v rôznych oblastiach mozgu, ako aj korelácia expresie c-Fos medzi rôznymi oblasťami mozgu za rovnakých experimentálnych podmienok, boli vypočítané pomocou programu štatistickej analýzy StatPlus: mac LE pre verziu Mac OS 2009 spoločnosťou AnalystSoft. Testovali sme lineárne korelácie (Pearsonova R medzi expresiou c-Fos v rôznych oblastiach CNS. Tiež sme skúmali korelácie medzi expresiou c-Fos v rôznych aktivovaných oblastiach CNS a správaním. Na tieto korelácie sa použili FR a PR údaje od potkanov, pre ktoré sa uskutočnila c-Fos kvantifikácia.
VÝSLEDKY
c-Fos kvantifikácia.
Ako sme už predtým pozorovali, počet aktívnych pákových lisov bol výrazne vyšší pri výkone PR oproti FR (Tabuľka 2) a počet odmien sacharózy bol väčší pri výkone FR. Dĺžka relácie pre PR potkanov bola približne 90 min (čas zastavenia - 30). Tabuľka 3 uvádza zoznam imunoreaktívnych buniek c-Fos vo všetkých oblastiach CNS, kde sa uskutočnila kvantifikácia. Vzor expresie c-Fos pre FR a PR potkany je zhrnutý v Obr. 1, Došlo k významnej aktivácii stredného hypotalamu (MHpanák, kompozícia ARC, PVN, RCh, DMH a VMH) krýs zapojených do PR páčkového lisovania na sacharózu, ale žiadna celková aktivácia u krýs zapojených do FR páčkového lisovania na sacharózu, v porovnaní s príslušnými kontrolami. V rámci stredného hypotalamu PR potkanov sa táto aktivácia vyskytla v PVN, ARC a VMH (Obr. 2). Stlačenie páky FR, ale nie stlačenie páky PR, bolo spojené s významnou aktiváciou v LH (založené hlavne na aktivácii v perifornickej oblasti). Ako aktívne pákové lisy, tak hypotalamická expresia c-Fos boli porovnateľné medzi skupinami FRext a FR (MHpanák, 946 ± 26 a 911 ± 118; ARC, 176 ± 18 a 186 ± 10; LHpanák, 468 ± 79 a 378 ± 34; LHpeF, 200 ± 31 a 173 ± 15, v uvedenom poradí), čo naznačuje, že rozdiel vo vzorci expresie medzi skupinami FR a PR nesúvisí s trvaním výcviku / skúsenosti, ale s povahou inštrumentálnej úlohy. V prípade skupiny FR došlo k významnému zvýšeniu expresie c-Fos v BNST, čo bolo pozorované u aBNST aj pBNST. Stlačenie páky FR a PR bolo spojené so zvýšenými c-Fos-imunopozitívnymi neurónmi v plášti NAc; Počty c-Fos boli významne zvýšené v jadre NAc u potkanov zapojených do stlačenia páky FR, s nevýznamným trendom smerom k zvýšenej expresii c-Fos u potkanov zapojených do stlačenia páky PR. c-Fos sa nezvýšil vo VTA s úlohou PR, hoci pri úlohe FR sa pozoroval nevýznamný trend k zvýšeniu. Nakoniec bol c-Fos významne zvýšený v jadre hypoglossálu (kraniálny nerv XII) v mozgovom kmeni potkanov trénovaných na PR, ale nie na FR.
Expresia c-Fos bola pozorovaná v iných oblastiach CNS, vrátane amygdaly a mozgovej kôry (Obr. 3). Expresia sa však pozorovala tak v kontrolných podmienkach, ako aj v spojení s úlohami PR a FR, čo naznačuje, že nešpecifické aspekty postupu (manipulácia, presun do miestnosti procedúry) mohli mať za následok túto aktiváciu. Kvantifikácia v týchto regiónoch sa neuskutočnila. Podobne sa pozorovala aktivácia v oblastiach mozgového kmeňa iného ako nXII, ale vyskytla sa v spojení s podmienkami kontroly a úlohy, čo tiež naznačuje úlohu pri nešpecifickej aktivácii vzrušenia alebo správania.
Testovali sme korelácie medzi expresiou c-Fos v rôznych oblastiach CNS. Kombináciou údajov z pákových lisovacích skupín sme našli negatívnu koreláciu medzi expresiou c-Fos v LH a VMH; teda aktivácia VMH bola spojená so zníženou celkovou aktiváciou LH (Pearsonova R, -0.7986; t = -3.7534; P = 0.0056). Tiež sme pozorovali významnú pozitívnu koreláciu medzi expresiou c-Fos v periférnej oblasti LH a VTA (Pearsonova R, 0.7772; t = 3.493; P = 0.0082), v súlade so známou monosynaptickou konektivitou medzi týmito dvoma regiónmi (pozri diskusiu v ref. 2 a 13). Našli sme významnú negatívnu koreláciu medzi expresiou c-Fos vo VTA vs. NAc-škrupinou, či už sa testovala samostatne na výkon FR (Pearsonova R, -0.9262; t = -4.9125; P = 0.008) alebo na výkon PR (Pearson R, -0.9897; t = -9.7624; P = 0.0103), v súlade so známymi recipročnými vstupmi medzi striatálnymi regiónmi do substantia nigra a VTA (2, 13). Testovali sme tiež korelácie medzi expresiou c-Fos v rôznych oblastiach CNS a správaním. Kombináciou údajov zo skupín lisujúcich páku sme pozorovali významnú pozitívnu koreláciu medzi c-Fos v ARC a aktívnymi pákovými lismi (Pearson R, 0.8208; t = 3.8017; P = 0.0067).
Identifikácia neurónov aktivovaných príjemom sacharózy a motivácia pre sacharózu.
V mozgovom kmeni nevykazovali c-Fos-pozitívne neuróny pozitívne imunofarbenie na TH, enzým obmedzujúci rýchlosť epinefrínu a norepinefrínu (a dopamínu); preto sa nezdalo, že by tieto katecholaminergné neuróny boli aktivované úlohami FR alebo PR. Niektoré c-Fos-pozitívne neuróny však vykazovali pozitívne imunofarbenie na tryptofánhydroxylázu, čo naznačuje, že populácia serotonínových neurónov bola aktivovaná. Ako je uvedené v Obr. 4v ARC boli c-Fos-pozitívne bunkové telieska obklopené vláknami zafarbenými AGRP a bol pozorovaný podobný obrazec imunofarbenia NPY vlákien / c-Fos (nie je znázornené). V PVN sa zdá, že c-Fos-pozitívne neuróny obklopujú CRF-pozitívne neuróny, ale nepozorovala sa žiadna kolokalizácia (údaje nie sú uvedené). Obr. 5 1 ukazuje imunofarbenie orexínu aj MCH v LH. Orexínové neuróny sa našli v dLH aj peLH. Aj keď sme v peLH pozorovali MCH-pozitívne neuróny, v tejto oblasti LH nedošlo v podstate k žiadnej kolokalizácii s c-Fos. Pozorovali sme však kolokalizáciu c-Fos v neurónoch pozitívnych na orexín v rámci peLH (Obr. 6, top) a veľmi obmedzená kolokalizácia c-Fos s MCH v vLH (Obr. 6, spodnej). Malo by sa zdôrazniť, že tak lokalizácia, ako aj kolokalizácia s c-Fos, môžu byť podhodnotené pre peptidové neurotransmitery, ako je CRH, pretože potkany neboli vopred ošetrené kolchicínom. Nakoniec, v jadre accumbens jadro a škrupina (Obr. 7), c-Fos koimunostné farbenie s GAD, syntetickým enzýmom pre neurotransmiter GABA, sa pozorovalo u FR a PR krýs. V rámci VTA bolo robustné zafarbenie TH; avšak c-Fos-pozitívne neuróny sa však zriedkavo pozorovali a nezdalo sa, že by sa výlučne kolokalizovali s TH.
DISKUSIA
V súčasnej štúdii sme použili expresiu okamžitého skorého génu, c-Fos, na vyhodnotenie modelu akútnej aktivácie CNS spojenej s nástupom samovoľnej lisovacej aktivity na sacharózu, buď ako relatívne nenáročnú úlohu (FR) alebo progresívne náročnejšia úloha odrážajúca motivované hľadanie odmeny, napríklad sacharózy, a silne zapojiť limbické obvody (22, 24, 49) (PR). Hypotalamické vzorce aktivácie sa medzi týmito dvoma úlohami líšili, pričom v úlohe FR prevládala aktivácia LH / limbická a v úlohe PR prevládala mediálna hypotalamická / limbická aktivácia (pozri časť Obr. 1). Existuje niekoľko možných dôvodov. Po prvé, tieto paradigmy sa môžu „zmapovať“ ako kvalitatívne odlišné skúsenosti s CNS. Potkany trénované vo výkone FR by očakávali ľahkú aktivitu s vysokou odmenou. Očakávanie prospešného jedla by malo výrazne ovplyvniť štruktúru c-Fos pozorovanú u potkanov FR. Zjavný kvalitatívny rozdiel v aktivačnej štruktúre naznačuje, že druhá možnosť - že PR zvieratá majú jednoducho viac skúseností s touto úlohou - je menej pravdepodobná, čo bolo podporené naším meraním c-Fos v hypotalame potkanov, ktoré dostali relácie 20 FR. , ktorý vykazoval aktivitu podobnú skupine FR, nie skupine PR. Obe tieto možnosti by sa mohli testovať systematickým zvyšovaním náročnosti tréningu FR a hodnotením zmien v aktivácii CNS, v takom prípade by sa dala predpovedať kvalitatívna zmena v aktivačnom modeli. Zatiaľ čo počet tréningových skúseností nemusí zodpovedať za model aktivácie CNS, priemerný počet odmien sacharózy v relácii by sa mohol: Úloha PR sa môže jednoducho naučiť ako „menej prospešná“ skúsenosť, a to môže byť funkčne spojené s nedostatok aktivácie LH. Vzor aktivácie CNS na začiatku relácie by teda mohol odrážať interoceptívny stav, ako je napríklad paradigma podmieneného miesta: sila aktivácie v limbických obvodoch je spojená s učením a motiváciou. Pozorovali sme variabilitu expresie c-Fos v strednom hypotalame zvierat FRC. Najmä v rámci PVN by táto variabilita mohla maskovať aktiváciu u potkanov FR, u ktorých sa pozoroval trend smerom k zvýšeným potkanom c-Fos verzus FRC (Tabuľka 3). Celková mediálna aktivácia hypotalamu sa však medzi zvieratami FR a FRC nelíšila.
Je potrebné poznamenať, že hoci naším cieľom bolo identifikovať weby CNS, ktoré prispievajú k začiatku správania, dočasné riešenie je do istej miery v úvahu. Ako je uvedené nižšie, teraz sa oceňuje, že rôzne subkomponenty inštrumentálneho alebo operatívneho správania sú sprostredkované aktiváciou rôznych populácií neurónov (13, 23, 33, 49). Nemôžeme úplne vylúčiť, že aktivácia v dôsledku veľmi okamžitého stláčania barov alebo lízania odmien mohla do istej miery prispieť k aktivačným modelom, ktoré sme pozorovali. Naše zistenia poskytujú základ pre ďalšie skúmanie úloh konkrétnych miest CNS v rôznych aspektoch alebo zložkách úlohy samo-administrácie a pre takéto štúdie meranie ďalších okamžitých skorých génov s rôznymi časmi „zapnuté“ a „vypnuté“ (36) bude veľmi užitočná.
Korelácie, ktoré sme našli pri expresii c-Fos medzi rôznymi oblasťami mozgu, podporujú známu funkčnú konektivitu hypotalamických a primárnych limbických oblastí pre túto konkrétnu úlohu odmeňovania, napríklad medzi LH a VMH a medzi perifornickou oblasťou LH a VTA. (pozri diskusiu v odkazoch č. 2 a 13). Skúmali sme tiež korelácie medzi expresiou c-Fos v rôznych aktivovaných oblastiach a správaním. Korelácia medzi c-Fos v ARC a aktívnymi pákovými lismi vyhovuje dobre definovanej úlohe aktivity ARC v príjme potravy (1); s naším predchádzajúcim pozorovaním, že inzulínová injekcia špecificky do ARC znížila samoaplikáciu sacharózy (15); s predchádzajúcimi správami o kritickej úlohe ARC a jeho endorfínových neurónov pri získavaní a vykonávaní samoaplikácie kokaínu (40-42); as identifikovanými projekciami ARC na NAc (17). ARC teda pravdepodobne zohráva kľúčovú úlohu v motivovanom správaní pri hľadaní a získavaní mnohých druhov odmeňovacích stimulov vrátane, ale nielen, potravín. Nakoniec sme pozorovali významnú aktiváciu PVN a VMH s nástupom hľadania PR sacharózy. Je to v súlade s dobre charakterizovanými úlohami týchto stredných hypotalamických jadier pri regulácii príjmu potravy, priamou synaptickou konektivitou s ARC a identifikovanými väzbami na limbické obvody (1, 27, 37).
Zistili sme významnú negatívnu koreláciu medzi expresiou c-Fos vo VTA verzus NAc-shell, či už boli testované na výkonnosť FR alebo PR. Bolo trochu prekvapujúce, že silnejšia aktivácia VTA sa nepozorovala v spojení so samoaplikáciou PR alebo FR sacharózy (oproti príslušným kontrolám). Možno toto zistenie odráža načasovanie nášho merania so zameraním na potenciálne miesta CNS aktívne na začiatku úlohy, na ktorú boli tieto zvieratá dobre vyškolené. To by bolo v súlade s pozorovaniami a tézou Schultza (44), že dopamínová neurónová aktivácia slúži ako marker neočakávaných stimulov alebo odmien a táto aktivácia klesá v spojení s tréningom. Ukázalo sa však, že uvoľňovanie striatálneho dopamínu počas užívania sacharózy u trénovaných zvierat sa vyskytuje ako veľmi presná a dočasne diskrétna udalosť (39). Je teda možné, že trendy, ktoré sme pozorovali, by boli silne významné pri väčšej študijnej skupine (tj väčšia štatistická sila). Pozorovali sme aktiváciu NAc v súvislosti s nástupom užívania FR a PR sacharózy. Aktivácia aj inhibícia neurónov NAc boli hlásené v súvislosti s výkonmi inštrumentálnej odmeny a vzor aktivácie / aktivity závisí od tréningu a prostredia a je spojený s rôznymi zložkami správania (napr. Orientácia, prístup, príjem) (6, 33, 50). Ako je uvedené vyššie, meranie c-Fos by nezachytilo takú špecifickú aktivitu. Carlezon navrhol, že „odmena“ je spojená predovšetkým so znížením aktivity neurónov NAc, tj neurónov so strednou ostnatosťou (3). To nie je v súlade s našimi pozorovaniami - podstatne zvýšené NAc c-Fos v porovnaní s kontrolnými kontrolami a c-Fos-pozitívne neuróny kolokalizované s GAD, konzistentné s aktiváciou stredne ostnatých neurónov (GABAergické) - ale my sme špecificky neposúdili „inhibíciu neurónov NAc“ ". Aktivácia a inhibícia NAc sa môžu vyskytnúť počas inštrumentálnych úloh, s anatomickou aj časovou špecifickosťou. Z hľadiska tejto štúdie je možné dospieť k záveru, že NAc sa podieľa na začiatku inštrumentálneho prijímania sacharózy, pričom jadro NAc prispieva k motorickej aktivácii a shell NAc prispieva tak k motorickým, ako aj k motivačným aspektom úlohy.
Pozorovali sme tiež aktiváciu oboch hlavných oblastí BNST (prednej a zadnej) u FR potkanov. BNST je časť limbických obvodov, ktorá moduluje neuroendokrinné odpovede na opakované stimulačné zážitky (8, 9) a vo väčšom zmysle je spojená s učením sa o opakujúcich sa podnetoch. Hoci jeho úloha bola objasnená najkomplexnejšie v súvislosti s opakovanými stresovými skúsenosťami, naše zistenie naznačuje širšiu úlohu BNST: BNST môže modulovať reakcie CNS na opakujúce sa pozitívne, ako aj negatívne alebo stresujúce stimuly. Pretože sme túto aktiváciu pozorovali na začiatku výkonu FR, ale nie PR, výkon náboru BNST môže byť spojený so zvýšenými výhodami sacharózy pri školení FR. Naše pozorovanie žiadnej priamej aktivácie neurónov CRF naznačuje, že inštrumentálna reakcia na sacharózu nie je hlavným stresorom; expresia c-Fos v iných neurónoch PVN je však v súlade s moduláciou stresových obvodov (46). Ulrich-Lai a jeho kolegovia v skutočnosti uviedli, že pri použití odlišného spôsobu stravovania / kŕmenia moduluje príjem sacharózy PVN funkciu (47). Nakoniec sme pozorovali aktiváciu jadra hypoglossálneho nervu v spojení s PR, ale nie s FR účinkom. O význame tohto možno len uvažovať; jednou z možností je, že chuťová relevantnosť sacharózy sa môže zvýšiť u potkanov, ktoré požívajú menej sacharózy.
Hľadanie sacharózy a prijímanie sacharózy by sa mali považovať za multimodálny zážitok, dynamický v čase, pretože požitie by malo za následok periférne signály súvisiace s kalorickým obsahom sacharózy, ako aj návyky a alliestéziu v rámci relácie (25). Aj keď sa náš výskum zameriava na vplyv periférnych endokrinných signálov, tj inzulínu a leptínu, na moduláciu potravinovej odmeny, ich účinky môžu byť zase priamo sprostredkované centrálne prostredníctvom vysielačov a neuropeptidov, ktoré zohrávajú úlohu v krátkodobom alebo dlhodobom horizonte. stravovanie alebo odmena za jedlo (pozri diskusiu v č. 14). Súčasná štúdia poskytuje určitý pohľad na to; pozorovali sme určitú aktiváciu neurónov, ktoré exprimujú buď MCH alebo orexín, dva neuropeptidy, ktoré sú orexigénne. Tieto nálezy môžu v skutočnosti podceňovať úlohu MCH alebo orexínu v potravinách, pretože imunocytochémia u potkanov bez kolchicínu nepochybne obmedzuje vizualizáciu obidvoch týchto neuropeptidov. Identifikácia aktivovaných orexínových neurónov v LH je celkovo konzistentná s početnými štúdiami, ktoré sa zaoberajú neurónmi orexínu pri kŕmení, odmeňovaní jedlom a všeobecnejšou stimulačnou odmenou (napr. 5, 7, 29). Pozorovali sme aktiváciu peFLH orexínových neurónov. Aston-Jones a jeho kolegovia (5) rozobrali úlohy rôznych populácií LH orexínových neurónov v odmeňovacom správaní a zapojili peFLH orexínové neuróny do vzrušenia, na rozdiel od odmeny ako takej. Naše zistenie teda naznačuje úlohu LH orexínu v vzrušení a možno orientáciu na aktívnu páku alebo narážky na prijímanie sacharózy.
Budúcnosť si zaslúži jedinečnosť alebo zovšeobecniteľnosť sacharózy ako odmeňujúceho stimulu. Zostáva určiť, či vzorec skorej aktivácie CNS, ktorý uvádzame, je špecifický pre jedlo ako stimul alebo či sa zovšeobecňuje na ďalšie prospešné stimuly. Ako už bolo uvedené vyššie, najmä pri úlohe FR by sa malo očakávať, že požitie viacerých dávok sacharózy bude mať metabolické následky, s moduláciou uvoľňovania hormónov (napríklad cholecystokinín, ghrelín, inzulín) a zmenami periférnej a CNS nervovej aktivácie. Neočakáva sa, že tieto zmeny budú hrať priamu úlohu v počiatočných vzorcoch aktivácie CNS, ktoré sme merali, ale môžu hrať úlohu pri učení sa o sacharózovej odmene počas tréningu. Neuropeptidy, ako napríklad orexín, môžu byť opäť kriticky zapojené.
Naša štúdia predstavuje, podľa našich vedomostí, prvú demonštráciu aktivácie špecifických stredných hypotalamických jadier na začiatku samoaplikácie sacharózy, vrátane PVN, ktorá sa podieľa na homeostáze a reakcii na stres, a ARC, ktorá je rozhodujúca pre energetickú homeostázu, snímanie živín a regulácia príjmu potravy. Dôležité je, že sme pozorovali aktiváciu stredného hypotalamu a NAc v spojení s nástupom PR, čo naznačuje, že pri začatí sacharózového podania hrajú úlohu homeostatické aj niektoré limbické miesta. Ďalšie limbické obvody sa môžu získavať v neskoršom časovom bode úlohy.
Perspektívy a význam
Zatiaľ čo v minulosti by štúdie motivačného a odmeňovacieho správania najsilnejšie zapríčinili limbické obvody CNS, objavili sa veľké dôkazy, ktoré zdôrazňujú kritickú funkčnú interakciu medzi limbickými a energetickými homeostázovými obvodmi. Súčasná štúdia teraz naznačuje pravdepodobný význam špecifických mediálnych jadier hypotalamu v motivovanej práci na sacharóze. Na základe tejto štúdie môžu budúce štúdie vyhodnotiť, či je nevyhnutná úloha mediálneho hypotalamu a či je jeho aktivácia implikovaná pri motivovanom hľadaní ďalších výhod, ako sú drogy zneužívané. Zistenia tejto štúdie navyše odôvodňujú štúdium zmien motivovaného správania za okolností sprevádzajúcich zmenenú mediálnu fyziológiu hypotalamu, ako je napríklad obezita.
DOTÁCIE
Tento výskum podporili Národné ústavy zdravotníctva Grant DK40963. Dianne Figlewicz Lattemann je vedecká pracovná pracovníčka pre vedecký výskum, výskumný program biomedicínskych laboratórií, oddelenie veterinárnych záležitostí Puget Sound Health Care System, Seattle, Washington. Dr. Sipols je podporovaný lotyšskou vedeckou radou Grantom 04.1116.
Poďakovanie
Ďakujeme Drs. Yavin Shaham, Stephen Benoit, Christine Turenius a JE Blevins za radu a užitočné diskusie.
REFERENCIE
;