Cdk5 Fosforilatni receptor dopamina D2 in zmanjša signalizacijo v smeri toka (2013)

Komentarji: Videti je, da Cdk5 povzroča regulacijo dopaminskih receptorjev D2. Presenetljivo je, da translacijski faktor deltafosb povzroči proizvodnjo Cdk5. Spodnji del Deltafosb igra pomembno vlogo tako pri preobčutljivosti kot pri preobčutljivosti

Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Minimalizem

Receptor dopamin D2 (DRD2) je ključni receptor, ki posreduje možganske funkcije, povezane z dopaminom, kot so razpoloženje, nagrada in čustva. Ciklin-odvisna kinaza 5 (Cdk5) je prolin-usmerjena serin / treonin kinaza, katere funkcija je bila vključena v vezje za nagrajevanje možganov. V tej študiji smo razkrili, da je serinski 321 ostanek (S321) v tretji znotrajcelični zanki DRD2 (D2i3) novo regulativno mesto Cdk5. Cdk5-odvisna fosforilacija S321 v D2i3 je bila opažena v in vitro in celične kulture.

Nadalje smo opazili, da je fosforilacija S321-a oslabila agonistično stimulirano površinsko izražanje DRD2 in zmanjšala vezavo G proteina na DRD2. Še več, spodnja cAMP pot je bila prizadeta v heterolognem sistemu in v primarnih nevronskih kulturah iz p35-emboržentov za izločanje, verjetno zaradi zmanjšane inhibitorne aktivnosti DRD2. Ti rezultati kažejo, da fosforilacija S5, posredovana s Cdk321, inhibira funkcijo DRD2, kar zagotavlja nov regulativni mehanizem za signalizacijo dopamina.

Številke

12

Navedba: Jeong J, Park YU, Kim DK, Lee S, Kwak Y, et al. (2013) Cdk5 Fosforilirajo dopamin D2 receptorje in slabijo signalizacijo v smeri toka. PLOS ONE 8 (12): e84482. doi: 10.1371 / journal.pone.0084482

Editor: James Porter, Univerza v Severni Dakoti, Združene države Amerike

Prejeto: Maj 20, 2013; Sprejeto: November 14, 2013; Objavljeno: December 31, 2013

Avtorske pravice: © 2013 Jeong et al. To je članek z odprtim dostopom, ki je razdeljen pod pogoji iz. \ T Licenca za priznanje Creative Commons, ki dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če sta avtorju in viru pripisana vrednost.

Financiranje: To delo so podprle subvencije (NRF-2012R1A2A2A01012923 in NRF-2012R1A4A1028200) korejske vlade (MSIP), podprto pa je bilo tudi v okviru programa mednarodnega sodelovanja, ki ga upravlja NRF Koreje (2012K2A1A2033117) in Korejski inštitut za raziskave možganov (KBRI). Osnovni raziskovalni program MSIP (2031-415). SKP je bila prejemnica nagrade 2004 in nacionalne zveze za raziskave na področju shizofrenije in depresije (NARSAD) za mlade raziskovalce. Financerji niso imeli nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranju in analizi podatkov, odločanju za objavo ali pripravi rokopisa.

Konkurenčne koristi: Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi.

Predstavitev

Signalizacija dopamina je vključena v različne možganske funkcije, vključno z motoričnim usklajevanjem, nadzorom razpoloženja in mehanizmi nagrajevanja [1]. Glavno sestavino dopaminskega signaliziranja v vretenčarjih izvajajo strijni srednji živčni nevroni (MSN), ki selektivno izražajo podmnožico dopaminskih receptorjev in prejemajo dopaminergični vnos predvsem iz ventralnega tegmentalnega območja (VTA) in substitucije nigra (SN).) [2]. Dopaminski receptorji so G protein-vezani receptorji (GPCR) s sedmimi transmembranskimi domenami in so sestavljeni iz dveh podtipov, D1-podobne in D2-podobne receptorje, ki posredujejo vzajemno delovanje pri dopaminskem signaliziranju [1]. Na primer, receptorji, podobni dopamin D1 (D1, D5) aktivirajo adenilil ciklazo skozi Gαs in poveča intracelularno raven cAMP, vendar dopamin D2-podobni receptorji (D2, D3, D4) zavirajo adenilil ciklazo skozi Gαi in zmanjša intracelularno raven cAMP [1], [3].

Med dopaminskimi receptorji je D2 receptor (DRD2) vpleten v patofiziologijo večjih večjih psihiatričnih motenj, vključno s shizofrenijo in odvisnostjo od drog [4], tako da je veliko antipsihotičnih zdravil vsaj delno ciljno usmerjenih DRD2. Znano je tudi, da se aktivnost DRD2 dobro ujema z vedenjskimi posledicami zlorabe drog na živalskih modelih [5]. Antidepresivi in ​​učinkovitost stabilizatorja razpoloženja sta bili povezani tudi s spremembami v izražanju celic na površini celic DRD2 ali navznoter znotrajcelične signalizacije, ki jo posredujejo PKA, ERK in GSK3. [1], [4], [6]. Kljub tem kritičnim vlogam za DRD2 v možganih podrobni regulativni mehanizmi, ki podeljujejo heterogenost in kompleksnost lastnostim DRD2, niso povsem razumljivi.

Konvergentne vrste dokazov kažejo, da so v fino uravnavanje dejavnosti DRD2 vključene več posttranslacijskih sprememb. V zgodnjih študijah foto-afinitetnega označevanja so odkrili obsežno glikozilacijo DRD2 [7]in tvorba disulfidne vezi v DRD2 je bila prav tako identificirana kot pomembna modifikacija za vezavo liganda [8]. Poleg tega so bila fosforilacijska mesta DRD2 sprva identificirana z in vitro test z radioizotopi, ki zagotavlja poti za različne regulativne poti, ki jih posredujejo različne kinaze [9]. Dejansko protein-kinaza C (PKC) uravnava mobilizacijo intracelularnega kalcija, ki jo posreduje DRD2, in modulira interakcijo DRD2 s citoskeletnimi beljakovinami [10]. Fosforilacija z GPCR kinazo 2 (GRK2) regulira agonistično inducirane resenzibilizacijske vzorce DRD2. [11].

Ciklin-odvisna kinaza 5 (Cdk5) je prolin-usmerjena serin / treonin kinaza, ki ima prednostno aktivnost zaradi možgansko specifične ekspresije njenih bistvenih aktivatorjev, p35 in p39 [12]. Cdk5 je vključen v različne nevronske procese, vključno z nevronalno migracijo in usmerjanjem aksona, Cdk5 in p35 null miši pa kažejo napake v kortikalnem nanosu [13]. Nedavno je bilo dokazano, da fosforilacija WAVE1a in epheksina s Cdk5 uravnava morfogenezo dendritične hrbtenice [14]. Poleg tega Cdk5 tudi uravnava nivoje površinskega izražanja NMDA receptorjev, NR2B in NR2A-posredovanih NMDA tokov [15], [16]. Omeniti je treba, da več dokazov kaže na intimno razmerje med Cdk5 in dopaminskim sistemom. Cdk5 fosforilira tirozinsko hidroksilazo (TH), uravnava njeno stabilnost in tako vzdržuje dopaminergično homeostazo [17]. V postsinaptičnih nevronih, ko je T75 ostanek dopamina in fosfoprotein-32kD, reguliran s cikličnim AMP-om (DARPP-32) fosforiliran s Cdk5, lahko inhibira aktivnost PKA in s tem antagonizira dopaminsko PDA signalizacijo, ki jo povzroča DRD1. [18]. Zanimivo je, da se pri kokainu, posrednem agonistu dopaminskih receptorjev, kronično aplicira pri podganah, mRNA in proteinske ravni Cdk5 povečajo v srednjih živčnih nevronah [19]. Skupaj se zdi, da je Cdk5 vključen v sinaptične prilagoditve, ki jih povzroča zdravilo. V tej študiji smo prikazali funkcionalno interakcijo med DRD2 in Cdk5, ki dodatno razširja vlogo Cdk5 v dopaminskem signaliziranju.

Materiali in metode

Protitelesa

Anti-kunčje serume smo dvignili proti peptidom, ki je vseboval fosfo-serinski 321 (pS321) tretje znotrajcelične zanke DRD2 (D2i3). Fosfo-peptid, CNPDpSPAKPEK (PEPTRON), smo uporabili za izdelavo peptidno konjugirane kolone za afinitetno čiščenje (20401, PIERCE). Protitelo proti pS321 smo obogatili s sistemom afinitetnega čiščenja po navodilih proizvajalca. Očiščeno fosfo-protitelo smo shranili v PBS z 0.1% natrijevim azidom in 0.1% želatino. Za Western blot in imunocitokemijo Cdk5 / p249 smo uporabili anti-mišja protitelesa proti Cdk35 (sc-820) in anti-kunčje protitelo proti p5 (sc-35). Za imunoprecipitacijo in Western blotiranje DRD9996-GFP smo uporabili anti-mišje anti-GFP protitelo (sc-2). Anti-kunčja anti-FLAG protitelesa (sc-807), anti-kunčja anti-HA protitelesa (sc-805), anti-mišje anti-GST protitelo (sc-138) in anti-mišje anti-GAPDH protitelo (sc- 32293) so bili kupljeni pri Biotehnologiji Santa Cruz.

živali

P35 knockout miška je bila prijazno darilo dr. Katsuhiko Mikoshibe na RIKEN Brain Science Institute na Japonskem in uporabljena za primarno nevronsko kulturo. Primerni seti za genotipizacijo so bili 5′-GGTCTCCTCTTCTGTCAAGAAG, 5′-GCTCTGCTAGACACATACTGTAC in 5′-TCCATCT GCACGAGACTAGT, kot je opisano zgoraj [20]. ICR miši in Sprague Dawley podgane so bile uporabljene za pripravo možganskega lizata. Vse živalske postopke je odobril Pohang univerzitetni odbor za znanstveno in tehnološko oskrbo in uporabo živali.

Konstrukti plazmida

Uporabili smo dolgo izoformo DRD2 v plazmidnem vektorju EGFP-N1 in tretjo intracelularno zanko DRD2 (aminokislinski ostanki 212-373 vključno z dodatnimi aminokislinskimi ostanki 29, ki so edinstveni za dolgo izoformo DRD2) v plazmidnem vektorju pFLAG-CMV-2. Človeški Cdk5 je bil vstavljen v pCMV-HA plazmidni vektor in humani p35 je bil vstavljen v plazmidni vektor pcDNA 3.1. Človeški Cdk5 je bil vstavljen pod promotor citomegalovirusa (CMV) skupaj s humanim p35 v vektorju pcDNA 3.1, da bi tvoril konstrukcijo z dvojno ekspresijo (Cdk5 / p35) za imunocitokemijo, test internalizacije receptorjev, [35S] -GTPγAnaliza vezave S, test vezave na radioligand in cAMP encimski imunski preskus.

In vitro Kinazni test

IP-povezava in vitro Kinaznega testa smo izvedli kot sledi. En cel mišji možgan je liziran v pufru za lizo eritrocitov 3 mL (ELB) (50 mM Tris (pH 8.0), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0.1% NP-40) z 20 udarci homogenizatorja Dounce, da dobijo homogenizirane lizate možganov . Lizate inkubiramo na ledu za 30 min, sonificiramo in centrifugiramo pri 16,000 × g za 10 min. Supernatante smo imunoprecipitirali z anti-kunčjim anti-p35 protitelesom, da smo dobili aktivni Cdk5 / p35 kompleks. Kompleks Cdk5 / p35 in očiščeni fuzijski protein GST smo zmešali z adenozinskim 5′-triposfatom,32P] (NEG-502H, PerkinElmer) in inkubira v kinaznem pufru (30 mM HEPES (pH 7.2), 10 mM MgCl)2, 0.2 mM DTT) za 1 h pri sobni temperaturi [18], [21]. Prečiščen kompleks Cdk5 / p25 (14 – 516, Millipore) je bil uporabljen tudi za in vitro testu kinaze, kot je opisano zgoraj. V reakcijsko zmes smo dodali pufer za polnjenje vzorca 2 × in kuhali pri 100 ° C. Vzorce smo nato izpostavili SDS-PAGE in sušeni gel ocenili z avtoradiografijo.

Tekoča kromatografija (LC) - masna spektrometrija (MS) / MS analiza

Rekombinantni protein GST-D2i3 je bil analiziran z LC-MS / MS po IP-povezanem in vitro test kinaze. Izvedli smo peptidno identifikacijo LC-MS / MS podatkov z uporabo X !! Tandem (različica Dec-01-2008). Vsaka podatkovna datoteka RAW je bila najprej pretvorjena v mzXML z uporabo trans-proteomskega cevovoda (TPP; različica 4.3). MS / MS skeniranja v pretvorjenih mzXML so bili nato podvrženi iskanju proti podatkovni bazi zaporedja proteina mišje UniProt (izpust 2010_07) vključno z zaporedjem GST-D2i3 z uporabo X !! Tandem. Toleranca je bila nastavljena na 3 Da za predhodne ione in 2 Da za fragmentne ione. Uporabili smo encimsko specifičnost za tripsin. Možnosti variabilne modifikacije so bile uporabljene za karbamidometilacijo cisteina (57.021 Da), oksidacijo metionina (15.995 Da), hidrolizo asparagina (0.987 Da) in fosforilacijo serina (79.966 Da).

Imunoprecipitacija

Imunoprecipitacijo smo izvedli na celičnih lizatih v ELB liznem pufru. Anti-GFP protitelo dodamo lizatom in inkubiramo 3 h pri 4 ° C. Imunokompleksi smo očistili z uporabo agaroze protein-A. Oborine inkubiramo s puferjem za vzorčenje SDS za 30 min pri 37 ° C in izpostavimo SDS-PAGE in Western blotu.

GST Pull-down test

10 µg očiščenega GST in GST-D2i3 smo inkubirali z lizatom možganske podgane za 1.5 h pri 4 ° C. Dodali smo 30 µL zrnc glutationa (GSH), konjugiranega s sefarozo 4B (17-0756-01, GE Healthcare), uravnotežene z liznim pufrom in inkubirali za dodatne 1 h. Kroglice smo zbrali s centrifugiranjem pri 2,000xg in speremo z liznim pufrom 4-krat [22], [23]. Oborine smo analizirali z Western blot-om z uporabo anti-Cdk5 in anti-p35 protiteles.

Imunocitokemija

Transfektirane HEK 293 celice in striatni nevroni, ki so bili kultivirani na krovnih stekelcih, so bili enkrat oprani s fosfatnim pufrom (PBS) in fiksirani z potopitvijo v hladni 4% paraformaldehid / PBS za 30 min. Primarno protitelo smo razredčili v blokirni raztopini (2% konjski serum in 1% Triton X-100 v PBS). Kot sekundarna protitelesa smo uporabili anti-mišja protitelesa (A647, Invitrogen), konjugirana z Alexafluor-20990 in proti-kunčjim protitelesom, konjugiranim z Alexafluor-568 (A11011, Invitrogen). Hoechst smo uporabili za barvanje jedra. Slike so bile pridobljene z konfokalno mikroskopijo (Olympus, FluoView-1000).

Analiza internalizacije receptorjev

24 h po transfekciji, celice obdelamo s 1 uM quinpirolom (Q102, Sigma) za 30 min in 90 min pri 37 ° C. Celice smo ponovno suspendirali v 2 mL hladnih PBS in za vsako reakcijo smo uporabili alikvote 200 uL. Zdravljenje z zdravili smo izvedli pri sobni temperaturi za 3 h pri naslednjih koncentracijah; 3 nM [3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer), 3 uM sulpirid (895, TOCRIS), 10 µM ​​haloperidol (H1512, Sigma). Hidrofobni3H] -spiperon je bil uporabljen za označevanje celotno izraženih receptorjev in za nadomestitev membranskega receptorsko vezanega je bil uporabljen hidrofilni sulpirid;3H] -spiperonski signali. Membransko povezane receptorske signale smo izračunali z odštevanjem vrednosti znotrajceličnega receptorja od celotne izražene receptorske vrednosti. Celice smo filtrirali na GF / B (Millipore) filter in sprali 3 krat s pufrom za spiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtre smo posušili in preostalo radioaktivnost merili s tekočinskim scintilacijskim števcem [24].

Priprava celične membrane

Konfluentne celice v posodah za kulturo 100 mm po transfekciji smo izprali z ledeno hladnim PBS in pobrali v puferu 1 mL HME (25 mM HEPES (pH 7.5), 2 mM MgCl21 mM EDTA). Homogenizirane lizate centrifugiramo z 500 x g za 15 min in supernatante nato centrifugiramo z 36,000 × g za 30 min. Za analizo smo uporabili pelete, ponovno suspendirane v HME pufru.

[35S] -GTPγS test vezave

Frakcije celične membrane so bile predhodno inkubirane z 1 µM ​​kvinpirolom (Q102, Sigma) v testnem pufru (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl2100 mM NaCl, 1 mM EDTA in 0.01 mM BDP) za 10 min. [35S] -GTPγS (NET-030H, PerkinElmer) smo dodali končno koncentracijo 3 nM v 30 uL in nadalje inkubirali za 90 min. 170 µL ledeno hladnega pufra (10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2dodamo 0.1 mM GTP), da ustavimo reakcijo. Membrane smo filtrirali na GF / B filtru (Millipore) in sprali 3-krat s pufrom za spiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Filtre smo posušili in izmerili radioaktivnost z uporabo scintilacijskega števca [25], [26].

Test vezave radijske ligande

Pripravljene celične membrane smo inkubirali z 0.01 nM [3H] -spiperon (NET-565, PerkinElmer) in naraščajoče koncentracije kvinpirola (Q102, Sigma) za 30 min v testnem pufru (25 mM HEPES (pH 7.5), 1.5 mM MgCl)2100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Membrane smo filtrirali na GF / B filtru (Millipore) in sprali 3-krat s pufrom za spiranje (50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 100 mM NaCl). Reakcijo smo zaključili s hitro filtracijo skozi GF / C filtre. Preostalo radioaktivnost smo izmerili s tekočinskim scintilacijskim števcem [27]-[29].

cAMP Enzyme Immunoassay

Transfektirane celice HEK 293 so bile predhodno obdelane z 10 uM rolipramom (R6520, Sigma) za 1 h in nato obdelane z 0.1 µM ​​forskolinom (F6886, Sigma) in naraščajočimi koncentracijami quinpirole (Q102, Sigma) za 30 min. Primarni kultivirani striatni nevroni so bili zdravljeni z 10 µM ​​rolipramom za 1 h in nato z 1 µM ​​dopaminom za 1 h [22]. Celične lizate smo pripravili z 0.1 M HCl in cAMP nivoje smo odkrili s cAMP enzimskim imunskim testom (Sapphire Bioscience) po navodilih proizvajalca.

Primarna kultivirana stratatalna nevrona

Striatalno območje smo izolirali iz možganskih zarodkov miši (E15). Disekirano tkivo je bilo disocirano v minimalnem bistvenem mediju (MEM) (11095, Invitrogen), ki je vseboval 0.25% tripsina (T4549-100, Sigma) in 0.1% DNaza I za 6 min pri 37 ° C. Celice smo ponovno suspendirali v mediju (MEM z 0.01 M HEPES (pH 7.4) in 10% (vol / vol) konjskem serumu (16050-122, GIBCO)). Nevrone so gojili za 7 dni in vitro (DIV 7) v MEM z dopolnilom B27 (17504-044, Invitrogen), preden jih uporabimo za imunoanalize cAMP encimov.

Rezultati

Cdk5 Fosforilat Serin 321 v tretji znotrajcelični zanki DRD2 in vitro

Za identifikacijo novih substratov Cdk5 smo izvedli sistematično iskanje z uporabo (S / T) PX (K / H / R) kot soglasne sekvence Cdk5. [30] in identificirala DRD2 kot kandidatni substrat. Soglasno zaporedje, vključno s serinom 321, se nahaja v tretji znotrajcelični zanki DRD2 (D2i3), kjer so vključeni različni regulativni mehanizmi [3], [10], [11]. Zaporedje je evolucijsko shranjeno v DRD2 v vretenčarjih, kar pomeni funkcionalni pomen ostanka (Slika 1A).

thumbnail

Slika 1. Cdk5 fosforilira serin 321 v tretji znotrajcelični zanki DRD2 in vitro.

(A) Usmeritev aminokislinskega zaporedja, ki prikazuje ohranjene regije DRD2 iz različnih vrst (v senci). Potencialno mesto fosforilacije Cdk5 je označeno z zvezdico. (B) IP-povezan in vitro testu kinaze z rekombinantnimi mutantnimi proteini GST-D2i3 in GST-D2i3. Za reakcije kinaze smo uporabili Cdk5 / p35 kompleks, obogaten z ekstraktom mišjih možganov z anti-p35 imunoprecipitacijo. Avtoradiograf fosforiliranih beljakovin je prikazan skupaj z Coomassie briljantno modrim barvanjem istega gela. Puščica označuje radioaktivni signal, ki ustreza GST-D2i3 in odprta puščična glava prikazuje radioaktivne signale od p35. (C) MS / MS spekter fosforiliranega peptidnega fragmenta D2i3. Teoretični vzorci razdrobljenosti so prikazani pod spektrom. Med vsemi fragmenti ioni so zaznani y- in b-ioni označeni v spektru. Y6 in y7 Ioni močno kažejo na fosforilacijo serina 321. (D) In vitro test kinaze s prečiščenim Cdk5 / GST-p25 kompleksom z uporabo mutantnih proteinov GST-D2i3 in GST-D2i3. Fosforilirani proteini so bili prikazani v avtoradiografu, skupaj s Coomassie briljantnim modrim barvanjem. Puščica označuje radioaktivni signal, ki ustreza GST-D2i3 in odprta puščična glava prikazuje radioaktivne signale iz GST-p25.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g001

Za oceno zmogljivosti Cdk5 za fosforiranje D2i3 smo izvedli IP-povezavo in vitro Kinazne teste z uporabo aktivnega Cdk5 / p35 kompleksa, obogatenega z mišjim lizatom možganov s p35 imunoprecipitacijo s prečiščenimi rekombinantnimi GST-D2i3 (aminokislinskimi ostanki 212-373) beljakovin. Opazili smo fosforilacijske signale v očiščenih beljakovinah GST-D2i3 in GST-D2i3 S297A, vendar je bil signal znatno zmanjšan z uporabo GST-D2i3 S321A (Slika 1B). Za nadaljnje preverjanje fosforilacije serin 321 v GST-D2i3 smo izvedli LC-MS / MS analizo vzorcev iz IP-povezanega in vitro testih kinaze z LTQ XL masno spektrometrijo. Dosledno smo našli fosfo-peptide, ki ustrezajo masi fosfo-serinskih peptidov 321 (Slika 1C). Glede na to, da pridobivanje podatkov, odvisno od podatkov, pri analizi LC-MS / MS kaže na odkrivanje številnih beljakovin v vzorcu [31]Ti podatki kažejo, da je serinski 321 ostanek prevladujoče mesto fosforilacije Cdk5 v regiji D2i3. Da bi dokazali neposredno fosforilacijo serina 321 v GST-D2i3 po Cdk5, in vitro Kinaznega testa z uporabo prečiščenega Cdk5 / GST-p25 kompleksa z očiščenimi rekombinantnimi GST-D2i3 proteini. Ugotovili smo pomemben fosforilacijski signal v GST-D2i3, ki ga ni bilo v GST-D2i3 S321A (Slika 1D). Ti rezultati skupaj kažejo, da je D2i3 S321 ostanek prednostni cilj Cdk5-posredovanega fosforiliranja.

Cdk5 Fosforilat Serin 321 v tretji znotrajcelični zanki DRD2 v celicah

Za identifikacijo fosforilacije serina 321 smo povišali protitelesa, specifična za fosfo-serinski 321 (pS321). Vzorci iz IP-povezanega in vitro Analiza kinaze smo analizirali z Western blot-om z uporabo anti-pS321 protitelesa. Blot je pokazal ločeno trak v kinazni reakciji, ki je bila odvisna od GST-D2i3 (Slika 2A). Da bi preverili potencialno fosforilacijo serina 321 v DRD2 s Cdk5 v celicah, smo analizirali anti-GFP imunoprecipitate iz HEK 293 celic, ki izražajo DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP z ali brez HA-Cdk5 in p35 in s anti-GFP in protiteles proti pS321. Karakteristični razmazani signali z anti-GFP protitelesom, za katere je znano, da so posledica prekomerne glikozilacije DRD2, so opaženi samo v prisotnosti DRD2-GFP, protitelesa proti pS321 pa so odkrila podobne signale DRD2 samo s ko-izražanjem Cdk5 / p35 (Slika 2B) [7]. Za nadaljnje preverjanje fosforilacije serina 321 s Cdk5 so nastali D2i3 (FLAG-D2i3) in mutantna oblika D2i3 (FLAG-D2i3 S321A). FLAG-D2i3 in FLAG-D2i3 S321A, izražene z ali brez HA-Cdk5 in p35 v HEK 293 celicah, smo analizirali z analizo premika mobilnosti SDS-gela. Za FLAG-D5i2 so opazili pomemben premik mobilnosti, odvisen od Cdk3, vendar ne za FLAG-D2i3 S321A (Slika 2C). Ocenili smo tudi raven fosforilacije DRD2 na ser321 po stimulaciji agonistov. HEK 293 celice, ki izražajo DRD2-GFP in Cdk5 / p35 kompleks, stimuliramo s kvinpirolom in anti-GFP imunoprecipitate iz celičnih lizatov analiziramo z Western blot-om z uporabo anti-GFP in anti-pS321 protiteles. Ugotovili smo, da Cdk5-posredovana fosforilacija DRD2 na Ser321 ni vplivala na agonistično stimulacijo, ki se zdi drugačna od fosforilacij, posredovanih s GRK in PKC (Slika 2D) [32], [33]. Ti rezultati skupaj kažejo, da lahko Cdk5 fosforilira serinski 321 ostanek DRD2 v celičnem okolju.

thumbnail

Slika 2. Cdk5 fosforilira serin 321 v tretji znotrajcelični zanki DRD2 v celicah.

Fosforilacijo serina 5, posredovano s Cdk321, smo analizirali z uporabo anti-pS321 protitelesa. (A) Vzorci iz IP-povezanega in vitro Analiza kinaze z uporabo GST-D2i3 beljakovin je bila analizirana z Western blot (WB) z navedenimi protitelesi. Puščice kažejo GST-D2i3. (B) DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP smo izrazili z ali brez HA-Cdk5 in p35 v HEK 293 celicah. Anti-GFP imunoprecipitate smo analizirali z Western blot-om z uporabo anti-GFP in anti-pS321 protiteles. Nosilec označuje signale DRD2 in odprta puščična glava kaže nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitatov. "% input" je volumenski delež skupnega lizata za reakcijo IP. Šibke endogene Cdk5 signale so označene z zvezdicami. (C) Test premika mobilnosti gela. HEK 293 celice, transficirane, kot je bilo navedeno, smo analizirali z Western blot-om. (D) Transficirane celice HEK 293 smo obdelali s kvinpirolom in anti-GFP imunoprecipitati analiziramo z Western blot-om z anti-GFP in anti-pS321 protitelesi. Odprta puščica kaže nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitatov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g002

Kompleks Cdk5 / p35 in DRD2 sta fizično povezana

Preučili smo potencialno fizično interakcijo med kompleksom Cdk5 / p35 in DRD2, ker je znano, da je veliko substratov Cdk5 fizično povezano s kompleksom Cdk5 / p35 [23], [34], [35]. Najprej je bil izveden GST spustni poskus. Prečiščen rekombinantni protein GST-D2i3 je bil inkubiran s lizatom možganov podgane in GST razpadajoči precipitati so bili analizirani za Western blot. Kot je prikazano v Slika 3A, endogeni Cdk5 in p35 so bili identificirani v padajočih oborinah, kar kaže na fizično interakcijo med DRD2 in kompleksom Cdk5 / p35 (Slika 3A). Poleg tega so bili HA-Cdk5 in p35 odkriti v anti-GFP imunoprecipitatih iz celičnih lizatov HEK 293, ki izražajo DRD2-GFP in Cdk5 / p35 (Slika 3B). Poleg tega smo izvedli imunocitokemične analize in ugotovili, da DRD2-GFP, HA-Cdk5 in p35 kažejo pomembne signale za lokalizacijo na membranskem območju celic HEK 293 (Slika 3C, zgornje plošče). Raziskali smo tudi lokalizacijo DRD2 in Cdk5 / p35 v nevronskem kontekstu. Dosledno je DRD2-GFP pokazal tudi pomembno lokalizacijo z endogenim Cdk5 in p35 v kultiviranih striatnih nevronih (DIV7), kar je nadalje podpiralo funkcionalne povezave med DRD2 in Cdk5 / p35 (Slika 3C, spodnje plošče). Rezultati kažejo, da lahko DRD2 in Cdk5 / p35 tvorita kompleks in tako podpirajo idejo, da je DRD2 fiziološki substrat Cdk5.

thumbnail

Slika 3. Cdk5 / p35 lahko oblikuje kompleks z DRD2.

(A) GST pull-down test z uporabo prečiščenega rekombinantnega GST-D2i3 proteina z izvlečkom možganov podgan. GST razgradne oborine so bile podvržene Western blot analiz. „Kroglica“ označuje padajočo oborino brez GST beljakovin. (B) Imunoprecipitacija kompleksa DRD2 in Cdk5 / p35. Anti-GFP IP iz lizatov iz transficiranih celic smo analizirali Western blot analizo. Nosilec označuje signale DRD2 in odprta puščična glava kaže nespecifične signale iz anti-GFP imunoprecipitatov. Na desni je prikazan tudi preveč osvetljen vložek za vnose. (C) Imunocitokemijske analize DRD2 in Cdk5 / p35. HEK 293 celice, ki izražajo DRD2-GFP in Cdk5 / p35, smo obarvali s protitelesi proti Cdk5 in anti-p35 (zgornje plošče). DRD2-GFP je bil izražen sam v kultiviranih striatnih nevronih in obarvan z anti-Cdk5 in anti-p35 protitelesi (spodnji paneli). Hoechst smo uporabili za barvanje jedra. Vrstica merila je 5 µm. Vse slike smo dobili z uporabo konfokalne mikroskopije (Olympus, FluoView-1000).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g003

Cdk5-posredovana fosforilacija DRD2 atenuirane receptorske aktivnosti

Poročali so, da fosforilacija modulira kritične lastnosti GPCR-jev, kot je vezava G proteina, internalizacija receptorjev, znotrajcelična lokalizacija in povezava z modulatorskimi beljakovinami. [9], [11], [24]. internaliziranje receptorjev, ki ga povzročajo gonisti, je kritičen regulativni proces prenosa signala. Raziskali smo modulacijo internalizacije DRD5, ki jo posreduje Cdk2. HEK 293 celice, ki izražajo DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP z ali brez Cdk5 / p35 so bile inkubirane z 1 µM ​​quinpirolom, da bi inducirali internalizacijo DRD2, ki jo stimulira agonist (Slika 4A). [3H] -spiperonski signali celic, ki eksprimirajo DRD2-GFP, so bile znatno zmanjšane pri 30 min quinpirolni obdelavi in ​​izterjane pri 90 min. Zanimivo je,3H] -spiperonski signali celic, ki eksprimirajo DRD2-GFP in Cdk5 / p35, so prav tako zmanjšali pri 30 min quinpirolni obdelavi, vendar niso izterjani pri 90 min (Slika 4A, drugi del). Po drugi strani, [3H] -spiperonski signali celic, ki eksprimirajo DRD2 S321A-GFP so zmanjšali pri 30 min in izterjali pri 90 min, ne glede na sosledno izražanje s Cdk5 / p35. Prejšnje študije so pokazale, da internalizirani DRD2 reciklira nazaj na plazemsko membrano pri podaljšani agonistični stimulaciji [11]. TZdi se, da je fosforilacija DRD5, ki jo povzroča Cdk2, vključena v procese resenzitizacije po internalizaciji DRD2, induciranih z agonistom.

thumbnail

Slika 4. Fosforilacija, ki jo posreduje Cdk5, zmanjša površinsko ekspresijo DRD2 in signalizacijo v smeri toka.

(A) Izraz površine DRD2, izmerjen z [3H] -spiperon test vezave. Transficirane celice HEK293 so bile stimulirane z 1 µM ​​quinpirolom za navedeni čas in žetev, nato pa je sledil 3 nM [3Zdravljenje s H] -piperonom 3 ure. Izmerili smo radioaktivnost in izračunali površinske signale. Vrstice napak predstavljajo povprečje ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01; Enosmerna ANOVA s Dunnettovim post hoc testom: primerjaj vse stolpce v primerjavi s kontrolnim stolpcem). (B) [35S] -GTPγS test vezave. Celične membrane smo pripravili iz transficiranih celic, kot je navedeno. Membranske pripravke smo inkubirali z 1 µM ​​kvinpirolom, ki mu je sledil 3 nM [35S] -GTPγS 90 minut. Vrstice napak predstavljajo povprečje ± SE (n = 8; * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001; Enosmerna ANOVA s testom Bonferroni post hoc: primerjaj vse pare stolpcev). (C) Konkurenčni kvinpirol [3H] -spiperon test vezave. Membranski preparati iz transficiranih celic so bili inkubirani z 0.01 nM [3H] -spiperon in naraščajoče koncentracije kinpirola 30 minut. Nelinearno regresijo smo dobili z GraphPad. Vrstice napak kažejo povprečje ± SE (n = 3). (D) encimski imunski test cAMP v transficiranih celicah HEK 293. Transficirane celice smo predhodno obdelali z 10 µM roliprama 1 uro in nato sočasno obdelali z 0.1 µM forskolina in 30 minut povečevali koncentracije kvinpirola. Nelinearno regresijo smo dobili z GraphPad. Vrstice napak predstavljajo povprečje ± SE (n = 4; ** p <0.01; dvostranski t-preskusi). (E) Kultivirani striatni nevroni iz divjih tipov in p35 zarodkov (DIV 7) smo obdelali z 10 µM ​​rolipramom za 1 h, ki mu je sledil 1 µM ​​dopamin za 1 h. Vrstice napak predstavljajo srednjo vrednost ± SE (n = 4; **p<0.01; dvostranski t-preskusi).

doi: 10.1371 / journal.pone.0084482.g004

Nadalje smo ovrednotili potencialno spremembo agonistično stimuliranega G-proteinskega vezanja na DRD2, povezano s fosforilacijo, ki jo posreduje Cdk5 z uporabo [35S] -GTPγS test vezave [25], [26]. DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP z ali brez Cdk5 / p35 so bili izraženi v celicah HEK 293. Membrane smo pripravili in stimulirali z 1 µM ​​quinpirolom in nadalje dovolili [35S] -GTPγS vključitev. Celična membrana, ki je izražala celuloze DRD2-GFP in Cdk5 / p35, je pokazala pomembno poslabšanje [35S] -GTPγS vezavo v primerjavi z vsemi drugimi celičnimi membranami (Slika 4B). Ti rezultati kažejo, da Cdk5-posredovana fosforilacija navzdol uravnava agonistično stimulirano vezavo G proteina na DRD2.

Poleg tega je konkurenčna3H] -spiperonske teste za vezanje smo izvedli, da bi raziskali morebitno spremembo afinitete agonista pri DRD2 s fosforilacijo, ki jo povzroča Cdk5. Konkurenčna zavezanost [3H] -spiperona smo izmerili po zdravljenju naraščajočih koncentracij kvinpirolov v pripravku membrane iz transfektiranega. Konkurenčna vezava quinpirole in [\ t3H] -spiperon pri DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP naredil podoben logKi vrednosti (-9.789 za DRD2-GFP; -9.691 za DRD2 S321A-GFP), kar kaže, da na afiniteto liganda na DRD2 bistveno ne vpliva fosforilacija, ki jo povzroča Cdk5 pri DRD2 (Slika 4C).

Fosforilacija, ki jo posreduje Cdk5, uravnava signalizacijsko pot DRD2-cAMP

Nato smo raziskali, ali sprememba DRD2 s Cdk5 vpliva na signalne poti v smeri toka. Spremljali smo DRD2-posredovano inhibicijo forskolinom-stimulirane cAMP produkcije z adenilil ciklazo v celicah, ki izražajo DRD2-GFP in DRD2 S321A-GFP z uporabo cAMP encimskega imunskega testa. Celice, ki eksprimirajo DRD2, so pokazale zmanjšanje nivojev cAMP v odziv na kinipil na odvisen od odmerka. Pomembno je, da so-izražanje Cdk5 / p35 znatno zmanjša maksimalno inhibicijo nastanka cAMP (Slika 4D, leva plošča). Po drugi strani, v celicah, ki eksprimirajo DRD2 S321A-GFP, so cAMP formacije učinkovito zavrle kot odziv na zdravljenje z quinpirolom ne glede na izražanje Cdk5 / p35 (Slika 4D, desna plošča). Ti rezultati kažejo, da Cdk5-posredovana fosforilacija DRD2 zmanjša inhibitorno aktivnost DRD2 na spodnji cAMP signalni poti. Za nadaljnjo potrditev pojavov v bolj fiziološko pomembnem okolju smo uporabili primarne kultivirane nevrone iz zarodkov z izločitvijo, ki so bili pomanjkljivi pri p35, bistvenem Cdk5 aktivatorju. Primarni kultivirani striatni nevroni so bili obdelani z 1 µM ​​dopaminom in analizirani s cAMP encimskim imunskim testom. Nevroni iz p35 miši za izločanje so pokazali zmanjšano raven cAMP v primerjavi z divjimi nevroni, ko so jih stimulirali z dopaminom (Slika 4E). Tskupaj smo ugotovili, da Cdk5-posredovana fosforilacija DRD2 povzroči zmanjšanje inhibitornega tona na cAMP poti, ki jo izvaja DRD2.

Razprava

DRD2 smo identificirali kot nov substrat Cdk5. Zdi se, da fosforilacija uravnava površinsko ekspresijo DRD2, tako da vpliva na usodo DRD2 po internalizaciji receptorja in tako zmanjša DRD2 Gi-povezava in nadaljnja cAMP pot. Ker fosforilacijski ostanek S321 obstaja tako v dolgih kot v kratkih izooblikih DRD2, je mehanizem, predlagan v tej študiji, lahko splošni način regulacije signalizacije, posredovane z DRD2..

DRD2 v srednjih živčnih nevronah ni bil samo obravnavan kot glavni podtip dopaminskega receptorja, temveč je bil priznan tudi za njegovo dovzetnost za spremembe razpoložljivosti kot odziv na okoljske dražljaje. Agonistično inducirana desenzibilizacija in resenzibilizacija DRD2 so bili obsežno raziskani [11], [24]. Še posebej so številne študije pokazale, da učinke kronične izpostavljenosti psihostimulantom, kot so kokain in amfetamin, ki povečujejo zunajcelično raven dopamina v striatni sinapsi, spremljajo dinamične spremembe postsinaptične DRD2. [36]. Za kronične uporabnike kokaina je znano, da imajo zmanjšano raven DRD2 v striatnem območju, in razpoložljivost DRD2 v nucleus accumbens (NAcc) kaže negativno povezavo z iskanjem in okrepitvijo vedenja pri miših in primatih. [37]-[39]. Te ugotovitve kažejo, da je funkcionalnost DRD2-a zelo dovzetna za prilagodljivo ali kompenzacijsko ureditev kot odziv na različne dražljaje, vključno s kronično izpostavljenostjo zdravilom. Naši rezultati kažejo, da lahko S321 ostanek v tretji znotrajcelični zanki DRD2 fosforiliramo s Cdk5, kar povzroči zmanjšanje inhibitornega vpliva DRD2 na cAMP poti. Ta interakcija predlaga nov regulativni mehanizem, povezan s Cdk5 v dopaminoceptivnih nevronih, ki bi lahko bil povezan z dinamično naravo razpoložljivosti površine DRD2.

Treba je omeniti, da je znano, da je Cdk5 ključna sestavina pri posredovanju prilagodljivih sprememb nevronskega okolja. Strukturne in funkcionalne spremembe dendritičnih hrbtenic v nevronih limbičnega vezja so na primer ena od posledic ponavljajoče izpostavljenosti psihostimulantom. [40]. Te spremembe spremljajo različne molekularne spremembe, vključno z indukcijo veznega proteina cAMP odgovora (CREB) in ΔFosB, transkripcijskih faktorjev, ki kažejo trajno up-regulacijo kot odziv na kronično uporabo kokaina. [41], [42]. Pomembno je, da je Cdk5 tarča ΔFosB [19], in mnoge kritične komponente, ki so vključene v dinamiko dendritične hrbtenice, kot so PSD-95, p21-aktivirana kinaza (PAK), β-katenin in spinofilin, so bile opisane kot substrati Cdk5 [43]-[46]. Dosledno, genetske ali farmakološke manipulacije aktivnosti Cdk5 povzročajo spremembe morfologije dendritične hrbtenice in vedenjskih odzivov na kokain, kar pomeni kritično vlogo Cdk5 pri molekularnih in morfoloških spremembah mezolimbičnih vezij dopamina. [47], [48]. Naši rezultati, ki kažejo, da je DRD2 nov cilj Cdk5, daje dodaten vpogled v prilagoditvene spremembe dopaminskega sistema kot odziv na kronično izpostavljenost zdravilu zaradi poznejše regulacije Cdk5, ki jo povzroča ΔFosB, lahko povzroči tonično povečanje fosforilacije DRD2. . Poleg tega je znano, da DRD2 vpliva na številne celične procese, vključno z ureditvijo poti cAMP in MAP kinaze ter nadaljnjimi transkripcijskimi dogodki. [42], [49]. Tako ugotovitve v tej študiji morda ne samo prikazujejo neposredno regulacijo DRD2 s Cdk5, temveč tudi nov vpogled v adaptivne odzive dopaminskega sistema na kronično izpostavljenost zdravilom.

Prispevki avtorjev

Zasnovali in oblikovali so eksperimente: JJ YUP DH SKP. Izvedeni poskusi: JJ YUP DKK YK. Analizirani podatki: JJ YUP DKK SL YK SAL HL YSG DH SKP. Prispevani reagenti / materiali / orodja za analizo: YHS. Papir je napisal: JJ SKP.

Reference

  1. 1. Missale C, Nash SR, Robinson SW, Jaber M, Caron MG (1998) Dopamin receptorji: od strukture do delovanja. Physiol Rev 78: 189 – 225.
  2. 2. Wise RA (2002) Struktura za nagrajevanje možganov: vpogledi v nezaslužene spodbude. Nevron 36: 229 – 240. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00965-0
  3. Poglej članek
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Poglej članek
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Poglej članek
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Poglej članek
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Poglej članek
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Poglej članek
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Poglej članek
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Poglej članek
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Poglej članek
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Poglej članek
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Poglej članek
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Poglej članek
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Poglej članek
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Poglej članek
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Poglej članek
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Poglej članek
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Poglej članek
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Poglej članek
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Poglej članek
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Poglej članek
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Poglej članek
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Poglej članek
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Poglej članek
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Poglej članek
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Poglej članek
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Poglej članek
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Poglej članek
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Poglej članek
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Poglej članek
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. Poglej članek
  91. PubMed / NCBI
  92. Google Scholar
  93. Poglej članek
  94. PubMed / NCBI
  95. Google Scholar
  96. Poglej članek
  97. PubMed / NCBI
  98. Google Scholar
  99. Poglej članek
  100. PubMed / NCBI
  101. Google Scholar
  102. Poglej članek
  103. PubMed / NCBI
  104. Google Scholar
  105. Poglej članek
  106. PubMed / NCBI
  107. Google Scholar
  108. Poglej članek
  109. PubMed / NCBI
  110. Google Scholar
  111. Poglej članek
  112. PubMed / NCBI
  113. Google Scholar
  114. Poglej članek
  115. PubMed / NCBI
  116. Google Scholar
  117. Poglej članek
  118. PubMed / NCBI
  119. Google Scholar
  120. Poglej članek
  121. PubMed / NCBI
  122. Google Scholar
  123. Poglej članek
  124. PubMed / NCBI
  125. Google Scholar
  126. Poglej članek
  127. PubMed / NCBI
  128. Google Scholar
  129. Poglej članek
  130. PubMed / NCBI
  131. Google Scholar
  132. Poglej članek
  133. PubMed / NCBI
  134. Google Scholar
  135. Poglej članek
  136. PubMed / NCBI
  137. Google Scholar
  138. Poglej članek
  139. PubMed / NCBI
  140. Google Scholar
  141. Poglej članek
  142. PubMed / NCBI
  143. Google Scholar
  144. 3. Neve KA, Seamans JK, signaliziranje dopaminskega receptorja H (2004) Trantham-Davidson. J Sprejem signala Prenos Res 24: 165 – 205. doi: 10.1081 / lrst-200029981
  145. 4. Amar S, Shaltiel G, Mann L, Shamir A, Dean B, et al. (2008) Možna vključitev signalizacijskih komponent D2 receptorjev po dopaminu v patofiziologijo shizofrenije. Int J Neuropsihofarmakol 11: 197 – 205. doi: 10.1017 / s1461145707007948
  146. 5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, et al. (2002) Vloga dopaminskih D2-podobnih receptorjev pri samo-dajanju kokaina: študije z mutiranimi mišmi D2 receptorja in novimi antagonisti D2 receptorjev. J Neurosci 22: 2977 – 2988.
  147. 6. Lee S, Jeong J, Park YU, Kwak Y, Lee SA, et al. (2012) Valproat spremeni signalizacijo dopamina v povezavi z indukcijo ekspresije proteina Par-4. PLoS One 7: e45618. doi: 10.1371 / journal.pone.0045618
  148. 7. Fishburn CS, Elazar Z, Fuchs S (1995) Diferencialna glikozilacija in znotrajcelično trgovanje za dolge in kratke izoforme dopaminskega receptorja D2. J Biol Chem 270: 29819 – 29824. doi: 10.1074 / jbc.270.50.29819
  149. 8. Čitalnik TA, Molina-Holgado E, Lima L, Boulianne S, Dewar KM (1992) Specifični [3H] raclopride, ki se veže na neostriatne receptorje dopamin D2: vloga disulfidnih in sulfhidrilnih skupin. Neurochem Res 17: 749 – 759. doi: 10.1007 / bf00969008
  150. 9. Ng GY, O'Dowd BF, Caron M, Dennis M, Brann MR, et al. (1994) Fosforilacija in palmitoilacija humanega D2L dopaminskega receptorja v celicah Sf9. J Neurochem 63: 1589 – 1595. doi: 10.1046 / j.1471-4159.1994.63051589.x
  151. 10. Li M, Bermak JC, Wang ZW, Zhou QY (2000) Modulacija signalnega receptorja dopamina D (2) z aktin-veznim proteinom (ABP-280). Mol Pharmacol 57: 446-452.
  152. 11. Cho D, Zheng M, Min C, Ma L, Kurose H, et al. (2010) Agonistično inducirana endocitoza in receptorska fosforilacija posredujeta z resenzibilizacijo receptorjev dopamina D (2). Mol Endocrinol 24: 574 – 586. doi: 10.1210 / me.2009-0369
  153. 12. Tsai LH, Delalle I, Caviness VS Jr, Chae T, Harlow E (1994) p35 je živčno-specifična regulativna podenota ciklin-odvisne kinaze 5. Narava 371: 419 – 423. doi: 10.1038 / 371419a0
  154. 13. Dhavan R, Tsai LH (2001) Desetletje CDK5. Nat Rev Mol Cell Biol 2: 749 – 759. doi: 10.1038 / 35096019
  155. 14. Fu AK, Ip NY (2007) Ciklin-odvisna kinaza 5 povezuje zunajcelične indikacije za aktin citoskelet med razvojem dendritične hrbtenice. Cell Adh Migr 1: 110 – 112. doi: 10.4161 / cam.1.2.4617
  156. 15. Wang J, Liu S, Fu Y, Wang JH, Lu Y (2003) Aktivacija Cdk5 inducira smrt celic hipokampusa CA1 z direktno fosforilacijo NMDA receptorjev. Nat Neurosci 6: 1039 – 1047. doi: 10.1038 / nn1119
  157. 16. Zhang S, Edelmann L, Liu J, Crandall JE, Morabito MA (2008) Cdk5 regulira fosforilacijo tirozina 1472 NR2B in površinsko ekspresijo NMDA receptorjev. J Neurosci 28: 415 – 424. doi: 10.1523 / jneurosci.1900-07.2008
  158. 17. Moy LY, Tsai LH (2004) Kinaza, odvisna od ciklina, 5 fosforilira serin 31 tirozinske hidroksilaze in uravnava njegovo stabilnost. J Biol Chem 279: 54487 – 54493. doi: 10.1074 / jbc.m406636200
  159. 18. Bibb JA, Snyder GL, Nishi A, Yan Z, Meijer L, et al. (1999) Fosforilacija DARPP-32 z Cdk5 modulira dopaminsko signalizacijo v nevronih. Narava 402: 669 – 671.
  160. 19. Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, et al. (2001) Učinke kronične izpostavljenosti kokainu regulira nevronski protein Cdk5. Narava 410: 376 – 380.
  161. 20. Ohshima T, Ogawa M, Veeranna, Hirasawa M, Longenecker G, et al. (2001) Sinergični prispevki ciklin-odvisne kinaze 5 / p35 in Reelin / Dab1 pri pozicioniranju kortikalnih nevronov v razvijajočih se mišjih miših. Proc Natl Acad Sci ZDA 98: 2764 – 2769. doi: 10.1073 / pnas.051628498
  162. 21. Morabito MA, Sheng M, Tsai LH (2004) Ciklin-odvisna kinaza 5 fosforilira N-terminalno domeno postsinaptične gostote protein PSD-95 v nevronih. J Neurosci 24: 865 – 876. doi: 10.1523 / jneurosci.4582-03.2004
  163. 22. Park SK, Nguyen MD, Fischer A, Luke MP, Affar el B, et al. (2005) Par-4 povezuje dopaminsko signalizacijo in depresijo. Celica 122: 275 – 287. doi: 10.1016 / j.cell.2005.05.031
  164. 23. Niethammer M, Smith DS, Ayala R, Peng J, Ko J, et al. (2000) NUDEL je nov substrat Cdk5, ki se veže na LIS1 in citoplazmatski dinein. Nevron 28: 697 – 711. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 00147-1
  165. 24. Kim KM, Valenzano KJ, Robinson SR, Yao WD, Barak LS, et al. (2001) Diferencialna regulacija receptorjev dopamin D2 in D3 z receptorskimi kinazami, vezanimi z G proteinom, in beta-arestinomi. J Biol Chem 276: 37409 – 37414. doi: 10.1074 / jbc.m106728200
  166. 25. Waldhoer M, Bofill-Cardona E, Milligan G, Freissmuth M, Nanoff C (1998) Diferencialno ločevanje A1 adenozinskih in D2 dopaminskih receptorjev s suraminom in didemetiliranim suraminom (NF037). Mol Pharmacol 53: 808-818.
  167. 26. Bofill-Cardona E, Kudlacek O, Yang Q, Ahorn H, Freissmuth M, et al. Vezava kalmodulina na D2000-dopaminski receptor zmanjša receptorsko signalizacijo z zaustavitvijo aktivacijskega stikala G proteina. J Biol Chem 2: 275 – 32672. doi: 32680 / jbc.m10.1074
  168. 27. Seznam SJ, Seeman P (1981) Ločevanje dopaminskih in serotoninskih receptorskih komponent [3H] spiperona, ki se veže na podgane regije možganov. Proc Natl Acad Sci ZDA 78: 2620 – 2624. doi: 10.1073 / pnas.78.4.2620
  169. 28. Gardner B, Strange PG (1998) Agonistično delovanje pri D2 (dolgih) dopaminskih receptorjih: vezava liganda in funkcionalni testi. Br J Pharmacol 124: 978-984. doi: 10.1038 / sj.bjp.0701926
  170. 29. Seeman P, Tallerico T, Ko F (2003) Dopamin izpodrine [3H] domperidon iz visoko afinitetnih mest receptorja dopamin D2, ne pa [3H] racloprida ali [3H] spiperona v izotoničnem mediju: Posledice za humano pozitronsko emisijsko tomografijo. Synapse 49: 209 – 215. doi: 10.1002 / syn.10232
  171. 30. Obenauer JC, Cantley LC, Yaffe MB (2003) Scansite 2.0: Napovedovanje interakcij celične signalizacije na celotni ravni s kratkimi motivi zaporedja. Nukleinske kisline Res 31: 3635 – 3641. doi: 10.1093 / nar / gkg584
  172. 31. Liu H, Sadygov RG, Yates JR 3rd (2004) Model za naključno vzorčenje in oceno relativne številčnosti beljakovin v proteomiki. Anal Chem 76: 4193-4201. doi: 10.1021 / ac0498563
  173. 32. Ito K, Haga T, Lameh J, Sadee W (1999) Sekvestracija receptorjev dopamin D2 je odvisna od koekspresije G-protein-vezanih receptorskih kinaz 2 ali 5. Eur J Biochem 260: 112 – 119. doi: 10.1046 / j.1432-1327.1999.00125.x
  174. 33. Namikung Y, Sibley DR (2004) Proteinska kinaza C posreduje fosforilacijo, desenzibilizacijo in trgovanje z D2 dopaminskim receptorjem. J Biol Chem 279: 49533 – 49541. doi: 10.1074 / jbc.m408319200
  175. 34. Wong AS, Lee RH, Cheung AY, Yeung PK, Chung SK, et al. (2011) Fosforilacija endofilina B5, ki jo povzroča Cdk1, je potrebna za inducirano avtofagijo pri modelih Parkinsonove bolezni. Nat Cell Biol 13: 568 – 579. doi: 10.1038 / ncb2217
  176. 35. Kesavapany S, Lau KF, McLoughlin DM, Brownlees J, Ackerley S, et al. (2001) p35 / cdk5 se veže in fosforilira beta-katenin in uravnava interakcijo beta-katenin / presenilin-1. Eur J Neurosci 13: 241 – 247. doi: 10.1046 / j.1460-9568.2001.01376.x
  177. 36. Kuhar MJ, Ritz MC, Boja JW (1991) Dopaminska hipoteza o krepilnih lastnostih kokaina. Trendi Neurosci 14: 299 – 302. doi: 10.1016 / 0166-2236 (91) 90141-g
  178. 37. Volkow ND, Fowler JS, Wolf AP, Schlyer D, Shiue CY, et al. (1990) Učinki kronične zlorabe kokaina na postsinaptične dopamske receptorje. Am J Psihiatrija 147: 719 – 724.
  179. 38. Dalley JW, Fryer TD, Brichard L, Robinson ES, Theobald DE, et al. (2007) Nucleus accumbens D2 / 3 receptorji napovedujejo impulzivnost lastnosti in okrepitev kokaina. Znanost 315: 1267 – 1270. doi: 10.1126 / science.1137073
  180. 39. Nader MA, Morgan D, Gage HD, Nader SH, Calhoun TL, et al. (2006) PET slikanje dopaminskih D2 receptorjev med kronično samo-dajo kokaina pri opicah. Nat Neurosci 9: 1050 – 1056. doi: 10.1038 / nn1737
  181. 40. Robinson TE, Kolb B (1997) Stalne strukturne spremembe v nucleus accumbens in prefrontalnih nevronih skorje, ki jih proizvajajo predhodne izkušnje z amfetaminom. J Neurosci 17: 8491 – 8497.
  182. 41. Robinson TE, Kolb B (1999) Spremembe morfologije dendritov in dendritičnih hrbtenic v nucleus accumbens in prefrontalnem korteksu po večkratnem zdravljenju z amfetaminom ali kokainom. Eur J Neurosci 11: 1598 – 1604. doi: 10.1046 / j.1460-9568.1999.00576.x
  183. 42. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacija izražanja genov in kokainske nagrade s strani CREB in DeltaFosB. Nat Neurosci 6: 1208 – 1215. doi: 10.1038 / nn1143
  184. 43. Feng J, Yan Z, Ferreira A, Tomizawa K, Liauw JA, et al. (2000) Spinophilin uravnava nastajanje in delovanje dendritičnih bodic. Proc Natl Acad Sci ZDA 97: 9287 – 9292. doi: 10.1073 / pnas.97.16.9287
  185. 44. Prange O, Murphy TH (2001) Modularni transport grozdov X X X X NUMX in povezovanje s stabilnimi hrbteničnimi prekurzorji med zgodnjim razvojem kortikalnih nevronov. J Neurosci 95: 21 – 9325.
  186. 45. Murase S, Mosser E, Schuman EM (2002) Depolarizacija poganja beta-katenin v nevronske bodice, ki spodbujajo spremembe sinaptične strukture in funkcije. Nevron 35: 91 – 105. doi: 10.1016 / s0896-6273 (02) 00764-x
  187. 46. Hayashi ML, Choi SY, Rao BS, Jung HY, Lee HK, et al. (2004) Spremenjena kortikalna sinaptična morfologija in okrepljena spominska konsolidacija pri dominantno negativnih PAK transgenih miših, specifičnih za možgane. Nevron 42: 773 – 787. doi: 10.1016 / j.neuron.2004.05.003
  188. 47. Benavides DR, Quinn JJ, Zhong P, Hawasli AH, DiLeone RJ, et al. (2007) Cdk5 modulira kokainsko nagrajevanje, motivacijo in striatno nevronsko razdražljivost. J Neurosci 27: 12967 – 12976. doi: 10.1523 / jneurosci.4061-07.2007
  189. 48. Meyer DA, bogatiji E, Benkovic SA, Hayashi K, Kansy JW, et al. Striatalna disregulacija Cdk2008 spremeni lokomotorne odzive na kokain, motorično učenje in dendritično morfologijo. Proc Natl Acad Sci ZDA 5: 105 – 18561. doi: 18566 / pnas.10.1073
  190. 49. Impey S, Obrietan K, Storm DR (1999) Ustvarjanje novih povezav: vloga signalizacije ERK / MAP kinaze v nevronski plastičnosti. Nevron 23: 11 – 14. doi: 10.1016 / s0896-6273 (00) 80747-3