DeltaFosB posredno ureja aktivnost promotorja Cck (2010)

Možgani Res. 2010 maj 6; 1329: 10 – 20.

Objavljeno v spletu 2010 marec 11. doi: 10.1016 / j.brainres.2010.02.081

PMCID: PMC2876727

John F. Enwright, III,¹ Megan Wald,¹ Madison Paddock,¹ Elizabeth Hoffman,¹ Rachel Arey,² Scott Edwards,² Sade Spencer,² Eric J. Nestler,³ in Colleen A. McClung^{2, *}

Podatki o avtorju ► Informacije o avtorskih pravicah in licenci ►

Končno urejena različica tega članka založnika je na voljo na Brain Res

Oglejte si druge članke v PMC quote objavljeni članek.

Minimalizem

Kaže, da nekatere pomembne biokemične, strukturne in vedenjske spremembe, ki jih povzroča kronična izpostavljenost zlorabam drog, posredujejo z zelo stabilnim transkripcijskim faktorjem ΔFosB. Prejšnje delo je pokazalo, da prekomerna ekspresija ΔFosB pri miših za 2 tedne povzroči povečanje ekspresije številnih genov v striatumu, večina pa jih je kasneje znižana po 8 tednih izražanja ΔFosB. Zanimivo je, da je bilo veliko teh genov uregulirano tudi pri miših, ki so prekomerno izražale transkripcijski faktor CREB. Vendar iz te študije ni bilo jasno, ali kratkoročno ΔFosB uravnava te gene preko CREB. Tu ugotovimo, da 2 tedni prekomerne ekspresije ΔFosB povečajo izražanje CREB v striatumu, učinek, ki se razširi z 8 tedni. Zgodnja indukcija je povezana s povečano vezavo CREB na določene promotorje ciljnih genov na tem območju možganov. Presenetljivo je, da je en gen, ki je bil osumljen CREB tarča na podlagi predhodnih poročil, holecistokinin (Cck), ni nadzoroval CREB v striatumu. Nadaljnja preiskava ureditve Cck Po pretiranem izražanju ΔFosB smo potrdili, da kratkotrajna ΔFosB prekomerna ekspresija povečuje oboje Cck promocijska aktivnost in ekspresija genov. Poveča tudi aktivnost vezave na domnevnem vezivnem mestu CREB (CREB) v Cck promotor. Vendar pa je mesto CRE potrebno za normalno bazalno izražanje Cck, za indukcijo ΔFosB ne potrebuje Cck. Skupaj ti rezultati kažejo, da čeprav kratkotrajna indukcija ΔFosB poveča izražanje in aktivnost CREB pri določenih genskih promotorjih, to ni edini mehanizem, s katerim se geni pod temi pogoji uregulirajo.

ključne besede: nucleus accumbens, prepisovanje, zasvojenost

UVOD

Kronična izpostavljenost zlorabi drog povzroča biokemične in strukturne spremembe v več možganskih regijah. Menijo, da te spremembe vključujejo spremembe v profilih izražanja genov v mezolimbičnem sistemu. Ta sistem je sestavljen iz dopaminergičnih nevronov, ki štrlijo iz ventralnega tegmentalnega območja (VTA) v srednjem možganu do srednjih bodicastih nevronov v nukleus acumbens (NAc) (ventralni striatum), pa tudi iz številnih drugih možganskih regij. Spremenjene aktivnosti dveh transkripcijskih faktorjev, proteina za vezavo odzivnosti cAMP (CREB) in ΔFosB (beljakovine družine Fos), so bile predlagane za posredovanje številnih biokemičnih, strukturnih in vedenjskih sprememb, ki se kažejo pri kronični izpostavljenosti zlorabam drog ( pregledal Nestler, 2005).

CREB je vseprisotno izražen faktor transkripcije, ki je član družine CREB / ATF. CREB homodimeri se vežejo na različice CRE zaporedja (soglasje: TGACGTCA), ki jih najdemo v promotorjih številnih genov. Fosforilacija CREB (večinoma pri serinu 133, čeprav so bila določena druga mesta) lahko spodbudimo z več signalnimi kaskadami, vključno s tistimi, ki so navzdol od receptorjev za dopamin (Cole in sod., 1995). Po fosforilaciji na serin 133 CREB najame koaktivatorski CREB vezavni protein (CBP) ali sorodne beljakovine, kar vodi do večje ekspresije gena (pregledal Johannessen in sod., 2004). Kronična izpostavljenost zlorabi opiatov ali psihostimulantov povzroči prehodno povečanje aktivnosti CREB v jedrih (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), prilagajanje misli, da zmanjša koristne lastnosti teh zdravil in prispeva k negativnemu čustvenemu stanju odvzema drog (Nestler, 2005).

Ldomnevno trajne prilagoditve zlorabe mamil delno posreduje ΔFosB, zelo stabilna varianta fosB (Nestler et al., 1999; McClung et al., 2004; Nestler, 2008). Člani družine Fos se pomnožijo s člani družine Jun, da tvorijo aktivatorski protein 1 (AP-1) kompleks. Transkripcijski kompleksi AP-1 se vežejo na različice odzivnega elementa AP-1 (soglasje: TGACTCA) za uravnavanje prepisovanja (pregledal Chinenov in Kerppola, 2001). Medtem ko akutna izpostavljenost zlorabi drog vodi k kratkotrajni indukciji (ur) članov družine Fos (pa tudi do povečane aktivnosti CREB), ponavljajoča izpostavljenost drogam vodi do kopičenja visoko stabilnega ΔFosB (Hope et al., 1994; Perrotti et al., 2008), katerega izraz vztraja več tednov.

Bi transgenegene miši, ki inducirano prekomerno izražajo ΔFosB ali CREB, v odraslem striatumu odraslih prikazujejo številne biokemične in vedenjske fenotipe, ki so jih opazili pri živalih, ki so večkrat izpostavljene psihostimulantom ali drugim zlorabam. Analiza sprememb sprememb genske ekspresije pri teh transgenih živalih je odkrila številne gene, ki jih je kratkotrajna (2 tedna) prekomerna ekspresija ΔFosB, spremembe, povezane s sočasnim znižanjem nagrajevanja z zdravili. Spremembe izražanja genov in vedenjskega odziva s kratkoročnim ΔFosB so bile izjemno podobne tistim, ki so jih opazili pri živalih, ki so čez tedne 2 ali 8 čezmerno izražale CREB (McClung in Nestler, 2003). V presenetljivem nasprotju je dolgotrajna prekomerna ekspresija (8 tednov) ΔFosB zmanjšala izražanje mnogih teh istih genov in povzročila povečanje nagrajevanja z zdravili (Kelz et al., 1999; McClung in Nestler, 2003).

En gen, ugotovljen v teh raziskavah, je holecistokinin (Cck), nevropeptid, proizveden v več možganskih regijah, vključno s striatumom (Hokfelt in sod., 1980). CCK lahko modulira dopaminergični prenos (Vaccarino, 1992), sodeluje pri nagrajevanju in okrepitvi drog (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton in sod., 2000; Beinfeld in sod., 2002; Rotzinger in sod., 2002) in ga v striatumu sproži kronični kokain (Ding in Mocchetti, 1992). Poleg tega Cck Pokazalo se je, da je promotor odziven tako na komplekse CREB kot AP-1 (Haun in Dixon, 1990; Deavall in sod., 2000; Hansen, 2001). Ker je veliko genov (tudi Cck), ki so pokazali povečano izražanje po CREB in kratkotrajni ΔFosB ekspresiji, so bili znani ali sumljivi ciljni geni CREB (McClung in Nestler, 2003), želeli smo ugotoviti, ali kratkoročno izražanje ΔFosB vodi do regulacije teh genov (s poudarkom na Cck) z regulacijo CREB ali s pomočjo bolj zapletenih mehanizmov regulacije genov.

REZULTATI

ΔFosB prekomerna ekspresija prehodno poveča raven CREB

Z uporabo Western blottinga smo raziskovali, ali prekomerna ekspresija ΔFosB povečuje raven beljakovin CREB v striatumu miši. Za to študijo smo uporabili bi-transgene miši (linija 11A), ki prenašajo transgen NSE-tTA in transgen TetOp-ΔFosB. Ker niso doksiciklina, te miši kažejo močan porast ΔFosB izražanja v dinorfin pozitivnih nevronih v striatumu (Kelz et al., 1999). Ta metoda prekomernega izražanja ΔFosB je bila obsežno dokumentirana in omogoča prekomerno ekspresijo, specifično za regijo, ki je primerljiva z indukcijo ΔFosB, opaženo pri živalih, ki so bile izpostavljene kroničnemu kokainu (Hope et al., 1994; Kelz et al., 1999). Ugotovili smo, da so bile pri miših 11A prekomerno izražanje ΔFosB ravni CREB beljakovin po tednih izražanja 2 bistveno povišane in so se te vrednosti po tednih izražanja 8 vrnile na izhodiščne vrednosti (Slika 1A, n = 8). Da bi ugotovili, ali bi lahko spremembe ravni CREB s kratkotrajno čezmerno izražanjem ΔFosB ponovili v drugem sistemu, smo začasno prekomerno izrazili ΔFosB v celicah PC12 in ugotovili, da so se ravni CREB znatno povečale (p <0.05) v primerjavi s kontrolami (Slika 1B, n = 4). Ti rezultati kažejo, da kratkotrajno ΔFosB izražanje poveča raven beljakovin CREB.

Ravni CREB naraščajo s prekomerno izražanjem ΔFosB. Western blot analiza lizatov iz () mišje strije iz mišk 11A off dox za 2 ali 8 tedne oz (B) PC12 celice prekomerno izražajo ΔFosB. Podatki v A so prikazani kot odstotek spremembe v primerjavi z dox v primerjavi ...

Tako ΔFosB kot CREB se vežeta na promotorje specifičnih ciljnih genov v striatumu po kratkotrajni prekomerni ekspresiji ΔFosB

Z analizami ChIP (kromatinske imunoprecipitacije) strijnega tkiva smo ugotovili, ali je pri določenih promotorjih ciljnih genov prišlo do vezave ΔFosB ali CREB in če se je ta vezava po kratkotrajni ΔFosB prekomerni ekspresiji povečala. Analizirali smo vezavo na BDNF in Cck promotorji, ker sta oba gena zelo kratko regulirana zaradi kratkotrajne prekomerne ekspresije ΔFosB, prekomerne ekspresije CREB ali kroničnega zdravljenja s kokainom (McClung in Nestler, 2003). Analizirali smo tudi vezavo na CDK5 promotor, saj je znana neposredna tarča ΔFosB (Chen et al., 2000; Bibb et al., 2001; Kumar et al., 2005). Na koncu smo meritev vezali na prodinnorfin promotor, saj so v prejšnjih raziskavah ugotovili, da ga lahko zavezujeta ΔFosB in CREB pod različnimi pogoji (Andersson et al., 2001; Zachariou et al., 2006).

Analiza ChIP je bila izvedena na strijah iz miši 11A, ki so prekomerno stiskale ΔFosB v tednih 2 z uporabo protiteles, ki prepoznajo CREB ali ΔFosB. V normalnih pogojih smo ugotovili, da se ΔFosB veže na CDK5 in prodinnorfin promotorjev, medtem ko na BDNF or Cck promotorji (Tabela 1). Poleg tega je prekomerna ekspresija ΔFosB povečala vezavo ΔFosB na CDK5 promotor, vendar ne na prodinnorfin promotor. Nato smo na teh promotorjih izmerili vezavo CREB in ugotovili, da se CREB veže na CDK5, BDNF in prodinnorfin promotorji, toda ne Cck promotor v normalnem striatumu in da prekomerna ekspresija ΔFosB za tedne 2 poveča vezavo CREB na BDNF in prodinnorfin promotorji, ne pa tisti CDK5 promotor. Skupaj ti rezultati kažejo, da se ΔFosB in CREB lahko vežeta na določene genske promotorje, kot sta prodinnorfin in CDK5vendar je vezava CREB značilna za druge promotorje, kot so BDNF. Poleg tega prekomerna ekspresija ΔFosB povzroči povečanje vezave ΔFosB na določenih promotorjih, kot bi bilo pričakovati, pa tudi do vezave CREB na specifične promotorje, skladno z indukcijo CREB, posredovane z ΔFosB, opaženo v tem trenutku.

Vezava domnevnih regulativnih beljakovin na različne promotorje pri miših, ki so dva tedna prekomerno izražali ΔFosB.

Prejšnje delo je pokazalo, da so spremembe v ekspresiji genov, ki jih povzroča dolgotrajna prekomerna ekspresija ΔFosB, povezane s spremembami kromatina, zlasti z acetiliranjem histona H3, pri specifičnih genskih promotorjih (Kumar et al., 2005). Da bi ugotovili, ali bi to lahko povzročilo spremembe v ekspresiji genov ob kratkotrajni ΔFosB prekomerni ekspresiji, smo izmerili vezavo acetiliranega histona H3 (histonska sprememba, povezana s transkripcijsko aktivnim kromatinom) ali metiliranega histona H3 (Lys9, histonska sprememba, povezana s transkripcijsko neaktivni kromatin). Ugotovili smo, da prekomerna ekspresija ΔFosB za 2 tedne ni povzročila sprememb vezave acetiliranega H3 na nobenem od preučenih genskih promotorjev (Tabela 1). Ugotovili smo znatno zmanjšanje vezave metiliranega histona H3 pri prodinnorfin promotor, vendar brez vezave na Cck promotor in brez spremembe vezave na CDK5 in BDNF promotorji, kar kaže, da to ni splošen mehanizem, s katerim ΔFosB kratkoročno uravnava gensko izražanje. Presenečeni in zainteresirani smo bili nad dejstvom, da v naših testih ChIP nismo našli razlik, ki bi lahko prispevale k povečanju števila Cck ekspresija mRNA v miših 11A po 2 tednih izražanja ΔFosB in so se odločili, da bodo ta mehanizem raziskali še naprej.

KratkoročnoΔFosB se poveča Cck izražanje v več sistemih

Mikroarzijska karakterizacija bi-transgenih miši 11A, ki so prekomerno pritiskale ΔFosB, v striatumu ugotovila, da Cck stopnje ekspresije se po tednih prekomerne ekspresije 2 povečajo in se nato z daljšimi obdobji izražanja ΔFosB postopoma zmanjšujejo (Slika 2A, n = 3). Ta učinek smo potrdili Cck z uporabo PCR v realnem času na ločeni skupini živali v tednih 2 in 8 in ugotovili, da so bili rezultati v obeh časovnih točkah podobni analizi mikroraščanja (podatki niso prikazani).

Kratkotrajna prekomerna ekspresija ΔFosB se poveča Cck genska ekspresija. (A) Cck ekspresija mRNA v striatumu po prekomerni ekspresiji ΔFosB pri miših 11A v tednih 1, 2, 4 ali 8. Mikroraščna analiza je bila izvedena na striatalnih vzorcih in Cck ravni ...

Nadaljnja preiskava sposobnosti ΔFosB za regulacijo Cck izrazili smo uporabljene PC12 celice, ki so prehodno transficirane z a Cck-reciferazni reporterski plazmid in bodisi ΔFosB ekspresivni plazmid bodisi enaka količina pCDNA. Oba dva (n = 5-9) in tri (n = 11-13) dneva prekomerne ekspresije ΔFosB sta povzročila znatno povečanje Cck-luciferazna ekspresija. Poleg tega so tri dni prekomerne ekspresije ΔFosB povzročile bistveno več Cck-uciferazna indukcija v primerjavi z dvodnevnim čezmernim izražanjem (Slika 2B). Prekomerna ekspresija ΔFosB ni povzročila izražanja luciferaraznega konstrukta brez promotorja (podatki niso prikazani). Pod nobenim pogojem zdravljenja ni bilo zmanjšanja Cck-luciferazna aktivnost navidezna. Ti rezultati kažejo, da kratkotrajno ΔFosB izražanje poveča aktivnost Cck promotor, in ne odzove mehanizma, s katerim dolgotrajna ΔFosB prevelika ekspresija zatira Cck izraz.

Prevelika ekspresija ΔFosB poveča vezavo na domnevnem mestu vezave CREB v Cck promotorja

Naše analize so to ugotovile Cck izražanje se poveča po kratkotrajnem izražanju ΔFosB, vendar so v naših testih ChIP ugotovili, da se niti CREB niti ΔFosB ne vežeta na Cck promotor. Da bi ugotovili, ali obstajajo spremembe v vezavi beljakovin na Cck promotor po pretiranem izražanju ΔFosB, smo uporabili teste premika elektroforetske mobilnosti (EMSA) s sondo, ki vsebuje domnevno CRE podobno mesto, prisotno znotraj Cck promotor. Z uporabo jedrskih izvlečkov iz strij miši 11A miši, ki so prekomerno pritiskali ΔFosB v tednih 2, smo ugotovili povečanje vezave na domnevno CRE mesto v Cck promotor (Slika 3 A, C, n = 4). Zanimivo je, da miši 11A prekomerno izražajo ΔFosB za 8 tedne, ki kažejo zmanjšanje Cck izražanje, tudi na tem mestu je pokazala povečano vezavo (Slika 3B, C, n = 4). Za primerjavo smo pregledali vezavo na konsenzusno mesto CRE pri miših, ki so prekomerno eksprimirali ΔFosB v tednih 2 in ugotovili trdno vezavo CRE v strijatalnih ekstraktih, vendar ni bilo povečanja vezave po indukciji ΔFosB (Slika 3F, n = 4). Kljub temu, da je skupna raven CREB, ki jo povzroča ΔFosB, v tem času, so ti rezultati v skladu z našimi testi ChIP, ki ugotavljajo, da je povečana vezava CREB pri promotorjih po prekomerni ekspresiji ΔFosB značilna samo za nekatere gene in ni svetovni pojav . Če želite ugotoviti, ali je CREB vezan na Cck promotor v naši EMSA analizi, smo izvedli preobratni test s protitelesom, specifičnim za CREB. V dogovoru z našimi testi ChIP nismo ugotovili nobene vezave CREB na a Cck sonda, ki vsebuje domnevno CRE mesto v analizah EMSA, medtem ko je CREB bistveno zavezal in prestavil strnjeno mesto CRE (Slika 3D, E, n = 4). Aktivnost vezave DNA na Cck protitelo na ΔFosB tudi na promotorja ni vplivalo (pod pogojem, da ni prikazano) pod pogoji, ki so jih pokazali v več predhodnih študijah za blokiranje vezave ΔFosB na navidezna mesta AP-1 (Hope in sod., 1994a, 1994b; Chen et al., 1995, Hiroi et al., 1998). Opravljali smo tudi ChIP teste na strijami živali 11A po 8 tednih izražanja ΔFosB in še vedno ne najdemo vezave CREB ali ΔFosB na Cck promotor (podatki niso prikazani). Tako izražanje ΔFosB povzroči povečanje vezave beljakovin na Cck promotor po 2 in 8 tednih izražanja; vendar identiteta teh dejavnikov ostaja neznana.

Vezava beljakovin na Cck promotor. (A, B) Analiza premika elektroforetske mobilnosti z uporabo Cck CRE podobno mesto s progastim tkivom pri živalih, ki čez teden 2 (A) ali 8 (B) prekomerno pritiskajo ΔFosB. V (A) konkurenca s presežkom nepriznanega konkurenta ...

Predvidena spletna stran CRE v Cck promotor ne odgovarja za povečano promocijsko aktivnost

Ker smo ugotovili povečanje vezave na beljakovine z uporabo drobca Cck promotor, ki vsebuje domnevno CRE spletno mesto, po pretiranem izražanju ΔFosB, smo želeli ugotoviti, ali je to spletno mesto potrebno za povečano Cck izraz, ki sledi pretiranemu izražanju ΔFosB. Da bi preizkusili to možnost, smo prenesli celice PC12 z a Cck-luciferazni plazmid, ki vsebuje njegovo nepoškodovano CRE mesto, ali tisto, ki vsebuje mutacijo na mestu, ki bi odpravilo kakršno koli interakcijo s CREB. Zanimivo je, da se je mutacija mesta, podobnega CRE, zmanjšala bazalno Cck promocijska aktivnost za 32% (Slika 4A, n = 9), vendar ni vplivalo na Cck indukcija promotorja s čezmerno izražanjem ΔFosB (Slika 4B, n = 11-13). To kaže, da čeprav Cck promotor potrebuje nepoškodovano CRE podobno mesto za polno bazalno aktivnost, povečana promotorska aktivnost, ki jo povzroča prekomerna ekspresija ΔFosB, ne potrebuje zaporedja, podobnega CRE.

O Cckspletno mesto v obliki CRE ni potrebno za Cck indukcija z ΔFosB. (A) CckAktivnost -luciferaze je bila izmerjena 2 dni po transfekciji bodisi z normalno Cck-luciferaza ali tista, pri kateri je bilo mutirano CRE-podobno mesto. * p <0.05 (B) Cck-luciferaza ...

cFos se veže na Cck promotorja

Prejšnje študije so to ugotovile cFos mRNA se poveča s kratkotrajno ΔFosB izražanjem, vendar se po dolgotrajni ekspresiji ΔFosB sposobnost zdravljenja s kokainom inducira cFos v striatumu zmanjša (McClung in Nestler, 2003; Renthal et al., 2008). Zato je mogoče, da cFos prispeva k povečanju Cck izraz po kratkoročnem ΔFosB izražanju. Opravili smo ChIP teste s protitelesom, specifičnim za cFos, in izmerili vezavo cFos pri Cck promotor s in brez kratkoročnega izražanja ΔFosB. Medtem ko smo ugotovili, da se cFos veže na Cck promotor, se ta prekomerna ekspresija ΔFosB ni znatno povečala (Slika 5, n = 5). To kaže, da se cFos veže Cck predlagatelj, lahko prispeva k splošni ureditvi Cck izraza, vendar najverjetneje ne sodeluje pri urejanju Cck promotor s strani ΔFosB.

cFos se veže na Cck promotor. Imunoprecipitacijski testi kromatina so bili izvedeni s specifičnim protitelesom za cFos z uporabo progastega tkiva pri miših, ki so prekomerno eksprimirali ΔFosB, bodisi na doxu, bodisi po 2 tednih odstranjevanja dox. Analiza PCR v realnem času je bila ...

DISKUSIJA

Ta študija potrjuje in razširja prejšnje ugotovitve, ki kažejo, da ΔFosB uravnava izražanje genov v striatumu in ugotovimo, da to stori prek več mehanizmov po kratkotrajni ekspresiji. Pokažemo, da se ΔFosB po nekaterih tednih prekomerne ekspresije 2 veže neposredno na promotorje v določenih genih, kar vodi do sprememb v izražanju (tj. CDK5). Poleg tega povečuje raven beljakovin CREB, učinek, opažen v gojenih celicah, pa tudi v striatumu, kar vodi do povečane vezave CREB na druge genske promotorje (tj. dynorphin in BDNF). V prejšnji študiji smo ugotovili, da kratkotrajna prekomerna ekspresija ΔFosB v striatumu vodi k številnim enakim spremembam izražanja genov, ki jih najdemo, kadar je CREB prekomerno izražen, in vodi do podobnih vedenjskih odzivov pri ukrepih preferenci kokaina (McClung in Nestler, 2003). Tako sedanja ugotovitev, da ΔFosB vodi v indukcijo CREB, kot tudi vezava CREB na določene genske promotorje, pomaga razložiti, zakaj sta se ta dva faktorja transkripcije strnila toliko sprememb genske ekspresije.

Indukcija CREB s ΔFosB je zanimiva, saj je bilo dokazano, da zloraba drog povzroči spremembe ravni serumskih 133-fosforiliranih CREB (Mattson et al., 2005) in povečajte CRE-posredovanje (Barrot et al., 2002; Shaw-Lutchman et al., 2002, 2003), ne da bi spremenili splošne ravni CREB. Možno je, da so spremembe ravni CREB lahko prehodne in jih zato v drugih študijah zlahka zamudimo. V svojih rokah smo opazili povečanje mRNA CREB, ki ga povzroča kokain, vendar je ta učinek zelo variabilen (neobjavljeno opazovanje). Ker tako transgenične miši 11A kot PC-12 celice kažejo indukcijo CREB po kratkotrajni ΔFosB prekomerni ekspresiji, to kaže na to, da CREB res povzroča ΔFosB (ali tarčo ΔFosB), kar zagotavlja še en mehanizem za razlago sprememb, ki jih povzročajo zdravila izraz.

Presenetljivo smo ugotovili, da se na CREB niti ΔFosB ne veže Cck promotor, čeprav Cck po kratkoročnem izražanju ΔFosB je izraz izrazito reguliran. Cck je obilen nevropeptid, izražen tako v VTA kot NAc (Hokfelt in sod., 1980) in je verjetno vključen v vedenjske odzive na zlorabe drog (Josselyn et al., 1996; Josselyn et al., 1997; Hamilton in sod., 2000; Beinfeld in sod., 2002; Rotzinger in sod., 2002). V analizah celične kulture je Cck promotor je bil obsežno značilen in dokazano je, da se odziva na člane družine CREB in AP-1 (pregledal Hansen, 2001). Haun in Dixon (1990) pokazala, da se lahko kompleksi AP-1 vežejo na Cck CRE podobno spletno mesto in vitroin kasneje se je s pomočjo nevroblastoma celic SK-N-MC pokazalo, da je mutacija mesta, podobnega CRE, zmanjšala odzivnost promotorja na prekomerno izražen cFos / cJun (Rourke in sod., 1999). Dejansko se nam zdi tudi povečano Cck promocijska dejavnost (Slika 2) in vezava na elementu podobnem CRE ali okoli njega (Slika 3) po preveliki ekspresiji ΔFosB, še enega člana družine AP-1, vendar ne najdemo neposredne vezave ΔFosB na Cck promotorja vivo or in vitro, tudi ob pretiranem izražanju.

Veliko dela je pokazalo vlogo CREB pri ureditvi Cck promocijska aktivnost. The Cck CRE podobno spletno mesto ohranja med vretenčarji (Hansen, 2001) in v nekaterih analizah celične kulture se tako kompleksi CREB kot AP-1 vežejo na to mesto in so potrebni za Cck promocijska dejavnost (Haun in Dixon, 1990; Deavall in sod., 2000; Hansen, 2001). Poleg tega več znanih aktivatorjev Cck pokazalo se je, da izraz (vključno z bFGF, PACAP, peptoni in depolarizacijo) deluje preko CREB (Hansen in sod., 1999; Deavall in sod., 2000; Bernard in sod., 2001; Gevrey in sod., 2002; Hansen in sod., 2004). Naše CckPodatki o genihferazah reporterjev podpirajo ključno vlogo za CRE podobno mesto pri urejanju Cck promocijska aktivnost, saj mutacija tega mesta zmanjšuje bazalno Cck promocijska aktivnost in Cckizražanje -luciferaze, ki ga povzroča VP16-CREB, konstitutivno aktivna oblika CREB, se izgubi, ko je to mesto mutirano (neobjavljeno opazovanje). Tako smo presenečeni ugotovili, da se zdi, da se CREB ne veže na Cck promotor v striatalnih ekstraktih bodisi izhodiščno bodisi po kratkotrajni ΔFosB prekomerni ekspresiji, kadar se zvišajo ravni CREB To trdi, da so ravni CREB po sebi niso edini dejavnik pri določanju količine vezave na tem mestu in to podpira delo drugih (Cha-Molstad in sod., 2004). Ker so promotorji drugih, prej identificiranih CREB ciljnih genov, kot so BDNF in prodinnorfin, ali je CREB zavezal, prepričani smo, da smo ugotovili, da CREB ni zavezujoč Cck promotor v striatalnih jedrskih izvlečkih. Poleg tega indukcija Cck-luciferazna aktivnost z ΔFosB ni bila odvisna od nedotaknjenega CRE podobnega mesta, kar kaže na to, da ΔFosB ne uravnava Cck izražanje z uravnavanjem neposredne vezave CREB na Cck promotor.

Naša nezmožnost zaznavanja CREB-a, ki deluje v stiku z Cck promotorja podpira Renthal et al. (2009), ki je uporabil pristop ChIP-čipa za pregled globalnih sprememb fosforilirane CREB (pCREB) in vezave ΔFosB v striatumu po kronični izpostavljenosti kokainu. V teh poskusih smo DNA-beljakovinske komplekse imunoprecipitirali z protitelesi ΔFosB ali pCREB in oborjeno DNK po označevanju hibridizirali na mikro matriko promotorja. Medtem ko so bili številni prej značilni CREB ciljni geni identificirani s tem pristopom (npr. BDNF, prodinnorfin), Cck ni bil identificiran. Poleg tega je bilo dokazano, da se vezava CREB na konsenzusno CRE mesto zelo razlikuje med gojenimi celičnimi linijami (Cha-Molstad in sod., 2004). Vse prejšnje študije, v katerih so bile ugotovljene interakcije CREB z Cck promotorji so bili izvedeni v celični kulturi (ne možganih, iz katerih so bili dobljeni naši vzorci EMSA in ChIP) in uporabili teste za premik gela za raziskovanje interakcij proteina in DNK. Medtem ko lahko EMSA oceni potencial faktorja, ki se veže na zaporedje DNK, analiza ChIP zagotavlja nov pogled na te interakcije vivo. Poleg tega je večina podatkov, ki kažejo bodisi na indukcijo Cck promocijska aktivnost ali CREB vezava na Cck promotorji so bili pridobljeni iz celic, ki so jih spodbudili dejavniki, kot so peptoni (Bernard et al., 2001), depolarizacija (Hansen in sod., 2004) ali različne aktivatorje znotrajceličnih signalnih kaskad, vključno s cAMP in ERK (Hansen in sod., 1999). V naših poskusih je bil edini uporabljeni "dražljaj" prekomerna ekspresija ΔFosB, ki je dovolj za sprožitev Cck izraz. Skupaj to kaže na sposobnost CREB, da se veže na (in potencialno uravnava) Cck promotor je zelo odvisen od vrste celice in aktiviranja določenih signalnih poti. Poleg tega Cck CRE podoben promotorski element (vsaj v nenaročenih celicah PC12 in mišjem striatumu) ni neposredna tarča ne CREB ne ΔFosB. Zanimivo je, da uredba o FosB izražanje s CREB je značilno tudi za tip celice in vrsto stimulacije. Študija Anderssona sod. ugotovili, da injiciranje CREB antisenskega oligonukleotida v mišji striatum delno zavira indukcijo FosB po uporabi kokaina (Andersson et al., 2001). Vendar pa so tudi ugotovili, da sposobnost L-Dopa inducirati FosB na izražanje v striumu s 6-OHDA ni vplivala prisotnost antisenskih oligonukleotidov CREB.

Ker se zdi, da CREB in ΔFosB posredno urejata Cck promotor in spremembe v strukturi kromatina so dokumentirane kot odziv na različne dražljaje, ki povzročajo ΔFosB (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2008), smo sklenili, da lahko ΔFosB posredno modulira aktivnost promotorjev s spreminjanjem kromatinske strukture. Vendar pa pri miših, ki so prekomerno izražale ΔFosB za 2 tedne, ni bilo sprememb acetilacije histona H3 na Cck promotor (Tabela 1). To podpirajo podatki ChIP-čipov v Renthal et al. (2009), ki so poročali o spremembi acetilirane H3 vezave na Cck promotor pri miših, ki so izpostavljene kroničnemu kokainu. Od takrat Cck promotor je aktiven v striatumu, ni bilo pričakovati ali opaziti represivne metilirane histonske H3 povezave. Zanimivo je, da tudi nismo opazili sprememb zaradi prekomerne ekspresije ΔFosB v vezavi acetilirane H3 na BDNF promotor (ki je pokazal povečano CREB vezavo) ali pri CDK5 in prodinnorfin promotorji (ki so pokazali povečano vezavo ΔFosB). Ker obstaja ogromno sprememb histona, povezanih s spremembami promocijske aktivnosti (pregledal: Rando in Chang, 2009) verjetno obstajajo tudi druge kromatinske modifikacije, ki so povezane z indukcijo teh genov. Vsaka posamezna modifikacija kromatina, čeprav pogosto napoveduje raven promocijske aktivnosti, se med aktivacijo določenega gena ne bo spremenila. V prihodnjem delu bi bilo zanimivo pogledati še druge možne spremembe v strukturi kromatina v okolici Cck promotor po pretiranem izražanju ΔFosB. Zanimivo je, da je kronični kokain (verjetno preko Dokazano je, da indukcija ΔFosB) povzroča izražanje sirtuina 1 in 2, histonske deacetilaze razreda III, za katere se zdi, da spreminjajo nevronsko fiziologijo, signalizacijo ERK in vedenjske odzive na kokain (Renthal et al., 2009). Indukcija histonske deacetilaze bi lahko istočasno uravnavala ekspresijo velikega števila genov preko globalne spremembe v strukturi kromatina.

En možni kandidat, vpleten v Cck regulacija po pretiranem izražanju ΔFosB je bila član družine AP-1 cFos. Izražanje cFos uravnava CREB (Sheng in sod., 1990; Impey in sod., 2004), in prekomerno izražanje cFos (skladno s čezmerno ekspresijo njenega vezavnega partnerja cJun) se poveča Cck promocijska dejavnost (Rourke in sod., 1999). Zato bi lahko povečana raven CREB zaradi kratkotrajne prekomerne ekspresije ΔFosB lahko zvišala ravni cFos in povzročila povečano vezavo na Cck CRE podobno spletno mesto. cfos mRNA se inducira pri miših po dveh tednih prekomerne ekspresije ΔFosB (McClung in Nestler, 2003) in zmanjšano pri miših, ki so bile izpostavljene kroničnemu kokainu ali dolgotrajni ΔFosB prekomerni ekspresiji (Renthal et al., 2008). Tu ugotovimo, da se cFos veže neposredno na Cck promotor v striatalnem tkivu, vendar prekomerna ekspresija ΔFosB ne povečuje bistveno povezovanja. To kaže, da bi se lahko cFos vključil v regulacijo Cck izražanje na splošno sprememba vezave samo cFos verjetno ni mehanizem, s katerim ΔFosB uravnava Cck izraz. Mogoče pa je, da lahko ΔFosB sproži bodisi posttranslacijske spremembe cFos (npr. Spremenjeno fosforilacijo) ali sproži ekspresijo vezivnega partnerja (kot je cJun) ali proteina koaktivatorja. Ker pa je nedotaknjeno CRE podobno mesto (za katerega se je že prej izkazalo, da je zavezujoče mesto za komplekse AP-1, glejte Haun in Dixon, 1990) za povečane ni potrebno Cck promocijska aktivnost, ki jo opazimo s prekomerno ekspresijo ΔFosB (kot je bilo ocenjeno v naših poskusih z reporterji na genih), zagotovo utemeljuje, da tudi drugi transaktivni dejavniki urejajo ΔFosB.

O Cck fragment promotorja, uporabljen v naših poskusih z luciferaznimi reporterski geni, vsebuje ohranjeno mesto za vezavo Sp1 in E-škatlo (pregledal Hansen, 2002). Zlasti se je pokazalo, da so sekvence E-box vezale številne faktorje transkripcije (pregledal jih je Forrest in McNamara, 2004). Z uporabo celic PC12 smo videli, da se mutacija polja E zmanjšuje Cck aktivnost promotorja, vendar ne spremeni odziva promotorja na ΔFosB (podatki niso prikazani). Zanimivo je, da Cck-luciferazni poročevalec, ki vsebuje mutacije tako na mestu CRE kot tudi v E-boxu, ne zazna bazalne aktivnosti in se ne odziva na prekomerno izražanje ΔFosB (neobjavljeno opazovanje). Še en potencialni posrednik delovanja ΔFosB na Cck promotorji so ATF, za katere je znano, da jih kronična izpostavljenost psihostimulantom povzroča v striatumu (Green et al., 2008). Vendar nismo našli nobenih dokazov za ΔFosB indukcijo teh ATF (podatki niso prikazani), od ATF-jev pa ne bi bilo pričakovati, da se bodo povezali na mutirano CRE podobno mesto na Cck promotor.

Eden od razlogov te študije je, da uporabljamo bi-transgeni sistem za prekomerno izražanje ΔFosB, zato moramo biti konservativni pri vzpostavljanju vzporednic med to paradigmo in uporabo kroničnega kokaina. Vendar transgenične miši 11A dajejo edinstveno priložnost za pregled specifičnih učinkov ΔFosB v striatumu, saj je prekomerna ekspresija omejena na to možgansko območje (Chen et al., 1998), medtem ko uporaba kokaina povzroči spremembe v številnih drugih možganskih regijah, ki lahko nato posredno vplivajo na striatum. Poleg tega je več raziskav dokumentiralo podobne vedenjske in molekularne fenotipe pri miših 11A v primerjavi z neprenosnimi živalmi, zdravljenimi s kroničnim kokainom (Kelz et al., 1999; McClung in Nestler, 2003; Renthal et al., 2009). Poleg tega Bibb et al. (2001) poročali o podobnih stopnjah striatal Cdk5 mRNA in indukcija beljakovin v istem sevu 11A v primerjavi s kogene, ki niso bili transgeni, in podobne spremembe ciljev CDK5, p35 in DARPP-32.

Za zaključek ugotovimo, da kratkotrajna ΔFosB ekspresija vodi do indukcije genov v striatumu z več mehanizmi. Ti vključujejo neposredno vezavo promotorja, indukcijo CREB proteina in aktivnost, modifikacijo kromatina, poleg poti, ki jih je treba še določiti.

EKSPERIMENTALNI POSTOPKI

živali

V tej raziskavi so bili uporabljeni samski trans-transgeni živali 11A (NSE-tTA x TetOP-ΔFosB), za katere so značilne: Kelz et al., 1999. Za prekomerno izražanje ΔFosB smo miši odstranili iz doksiciklina med starostjo 3 in 6, medtem ko smo kontrolne miši vzdrževali na doksiciklinu. Vse miši so bile nameščene v skupini in vzdrževane na ciklu 12: 12 svetloba / temna, prižgejo se luči ob 7 zjutraj in luči ugasnejo ob 7 popoldne, z ad lib dostop do hrane in vode. Vsi poskusi na miših so bili v skladu s protokoli, ki jih je odobril odbor za nego in uporabo živali Univerzitetnega teksaškega medicinskega centra v Dallasu.

Reporterski in ekspresijski plazmidi

Wildtype (WT) Cck promotor-luciferazni reporter smo pripravili tako, da smo v pGL200-luc vektor (Promega) vstavili približno 3 bp PCR fragment. Ta fragment je bil pridobljen iz mišje genomske DNK (primeri: 5 'TATCCTCATTCACTGGGACGC 3' gorvodno in 5 'TACCTTTGGATGGGGAAATCG 3' navzdol) in na začetku vstavljen v pGEM-T Easy vektor (Promega, #A1360). Fragment promotorja smo nato klonirali na mesta restrikcijskega encima Kpn1 / Xho1 pGL3-luc.

Če želite ustvariti mutacijo točke CRE v Cck promotor, mutageni primer, usmerjen proti predhodno prijavljenemu mestu, podobnemu CRE (smiselni primer: 5'CGTGTCCTGCTGGACTGAGCTCGCACTGGGTAAACA 3 ', antisense primer: 5'CTGTTTACCCAGTGCGCGCTGAGTCCAGCAGGACACG 3 . To pretvori prijavljeno spletno mesto, podobno CRE (ACTGCGTCAGC), v ACTGAGCTCC. Vsi poročevalski plazmidi so bili potrjeni z zaporedjem DNA. Ekspresijski plazmid ΔFosB vsebuje zaporedje ΔFosB v celotni dolžini, vstavljeno v večkratno mesto kloniranja pCDNA 3.1 in je že opisano (Ulery in Nestler, 2007).

Celična kultura in transfekcija DNA

Celice feokromocitomov (PC12) so hranili v Dulbeccovem spremenjenem Eaglejevem mediju F-12, dopolnjenem z 10% konjskega seruma, 5% fetalnega govejega seruma in 1% penicilina / streptomicina pri 37 ° C in 5% CO₂. Celice so bile transficirane z elektroporacijo z uporabo elektroporatorja BTX 360 (350 V, 0 ohmov in 850 μF) v 800 μL fiziološke raztopine Dulbeccovega fosfatnega pufra v 4-milimetrskih kivetah z 10 μg poročevalca in 5 μg ekspresijskega konstrukta. Za normalizacijo celotne količine DNA smo uporabili prazen vektorski plazmid (pCDNA). Po transfekciji so celice gojili na 35 mm prekritih posodah s kolagenom v določenem času.

Analize luciferaze

Dva ali tri dni po transfekciji so celice 3-krat sprali v Dulbeccovi slanici s fosfatnim puferjem, lizirali (z uporabo 25 mM glicilglicina, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1% Triton X-100, pH 7.8, 1 mM DTT), zbrani in očiščeni s centrifugiranjem. 30 μL lizata smo združili s pufrom za testiranje luciferaze 140 μL (25 mM glicilglicin, 15 mM MgSO₄, 4 mM EGTA, 1 mM DTT, 1 mM ATP, 1 mM kalijev fosfat, 1 mM koencim A, pH 7.8). Aktivnost luminescence je bila izmerjena z uporabo FLx-800 čitalca fluorescence mikroplastik po avtomatiziranem injiciranju luciferina 40 μL 1 mM luciferina na vdolbinico. Aktivnost luciferaze je bila normalizirana na skupno vsebnost beljakovin, kot je določeno z bioRad testom beljakovin.

Elektroforetski test premika mobilnosti

Jedrski izvlečki iz dvostranskih rezin striatuma iz bi-transgenih miši 11A (ki se hranijo v doksiciklinu 2 ali 8 v tednu ali iz njega) (McClung in Nestler, 2003) so bili pripravljeni v skladu z Huang in Walters (1996). ³²Dvojne verige oligonukleotidnih sond z oznako P so bile pripravljene s sistemskim protokolom Promega Gel Shift Assay (#E3300) in sonde so bile očiščene z uporabo Roche Quick Spin Column. Konsenzusna sekvence CRE in AP-1 sonde sta bila iz podjetja Promega (#E328A in E320B) in Cck CRE-sekvence so bile (Cck-CRE smisel: CTAGCGAGCTCTGGACTGCGTCAGCACTGGGTTCCA; Cck-CRE antisense: CCCAGTGCTGACGCAGTCCAGAGCTCGCTAGCTTT).

Reakcije vezave in elektroforeza so bile izvedene z uporabo sprememb postopka analize sistema Promega Gel Shift (#E3300). 50,000 CPM označene sonde je bil kombiniran s strijalnim jedrskim ekstraktom 10 μg. Pred uvedbo radioaktivno označenih sond smo dodali hladno konkurenčno DNK ali protitelesa. Za poskuse premeščanja smo uporabili 2 μg CREB protiteles (upstate Biotechnology # 06-083). Reakcije smo elektroforezirali na 4% poliakrilamidnih gelih, posušili in bili izpostavljeni filmu (z uporabo intenzivnih zaslonov za 1 uro do 2 dni).

Imunobloting

Za celice PC12 smo 35 mm plošče transficiranih celic sprali v ledeno mrzlo fiziološko raztopino, puferirano z Dulbeccovim fosfatom, lizate pa pripravili v ledeno mrzlem liznem pufru RIPA (50 mM Tris pH 7.4, 5 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1% deoksiholat, 1 % Triton X-100, 0.1% natrijev dodecil sulfat), ki vsebuje zaviralce proteaze. Po ultrazvočni obdelavi, čiščenju in Bradfordovem testu beljakovin so bili lizati v celoti denaturirani in 50 μg vsakega vzorca je bilo elektroforezirano na 10% SDS poliakrilamidnih gelih. Beljakovine smo prenesli na PVDF membrano, 1 uro blokirali v 3% nemastnem suhem mleku v fiziološki raztopini, pufrirani s Tris, ki je vsebovala 0.1% Tween-20 (mleko TBS-T), in jih čez noč sondirali pri 4 ° C s primarnimi protitelesi (CREB- Upstate Biotechnology # 06-083, uporabljeno pri 1: 1,000; GAPDH-Sigma # G8795, uporabljeno pri 1: 80,000), razredčeno v mleku TBS-T. Po večkratnih izpiranjih s TBS-T so blotoze eno uro sondirali pri sobni temperaturi z uporabo sekundarnih protiteles, konjugiranih z alkalno fosfatazo (Sigma), razredčenih 1: 5,000 v mleku TBS-T. Po večkratnih pranjih s fiziološko raztopino, pufrirano s Trisom, smo barvno reakcijo izvedli v skladu z navodili BioRad (# 170-6432). Membrane smo posušili čez noč, skenirali na ploščatem skenerju in denzitometrijo izvedli z uporabo ImageJ (glej spodaj).

Za striptične izvlečke smo izvedli teste Western blot, kot smo že objavili (Hope et al., 1994). Tkivo smo odstranili z obglavljenih miši, postavili na led in odsekali na možganski matrici v debelini 1 mm. Nato so odstranjeni tkivni udarci in zamrznjeni pri -80 ° C, dokler niso uporabljeni. Tkivo smo sonicirali na ledu v modificiranem puferju na osnovi detergenta, ki je vseboval zaviralce fosfataze in proteaze (Roche, Sigma). Po sončenju smo vzorce denaturirali v vreli vodi in centrifugirali pri 15,000xg 15 minut; supernatant je bil pozneje zbran in predelan; Količine koncentracije beljakovin smo nato količinsko opredelili z Bradfordovim testom (Bio-Rad). Vzorce smo uporabili na 10% akrilamid / bisakrilamidnem gelu, prenesli na membrano PVDF, blokirali v 5% mleku in inkubirali s primarnimi protitelesi (Anti-CREB, Upstate, Lake Placid, NY). Slepi so bili naknadno vizualizirani s pomočjo kemiluminiscenčnega sistema (Pierce). Vsi vzorci so bili normalizirani na GAPDH (Fitzgerald, Concord, MA). Izvedene so bile standardne krivulje, da se zagotovi, da smo v linearnem območju preizkusa.

Analiza denzitometrije

Za imunoblote PC12 smo izvedli denzitometrijsko analizo s pomočjo ImageJ s kalibracijo palice. Pri vsaki meritvi se je odšteval povprečni signal v ozadju in za vsak vzorec je bilo izračunano razmerje med CREB in GAPDH signalom. Za strijatalne imunoblote in analizo EMSA smo uporabili Scion Image 1.62c z odštevanjem ozadja.

Kromatinska imunoprecipitacija (ChIP)

ChIP teste smo izvedli po metodah Tsankova et al. (2004) in Kumar in sod. (2005). Na kratko, dvostranski vzorci striat iz miši 11A, ki so jih vzdrževali na ali zunaj doksiciklina, so bili zamreženi z 1% formaldehida in zamreženje ugasnili z glicinom (končna koncentracija 0.125 M). Ti vzorci so bili iz celotnih možganskih rezin, odvzetih na ravni nucleus accumbens z odstranjeno skorjo. Kromatin je bil s ultrazvočno obdelavo razrezan na približno 0.2 do 1 kb fragmentov, očiščen s kroglicami Protein G (Thermo Scientific # 22852) in vhodni vzorci, zamrznjeni pri -80 ° C. Za vsako padavino smo uporabili od 60 do 100 μg kromatina. Uporabljeno je bilo 5-10 μg vsakega primarnega protitelesa (CREB: Upstate Biotechnology # 06-863, ΔFosB: Santa Cruz Biotechnology # SC-48x, acetilirani H3: Upstate Biotechnology # 06-599, metilirani H3 (LYS9): Cell Signalling Technology, cFos: Biotehnologija Santa Cruz # SC-7202x). Komplekse protiteles in kromatina smo imunoprecipitirali s kroglicami Protein G plus v skladu z navodili proizvajalca (Thermo Scientific # 22852). Po povratnem zamreževanju vhodnih in oborjenih vzorcev je bil vsak vzorec izpostavljen kvantitativni PCR (qPCR). Uporaba vseh teh protiteles za ChIP je bila obsežno potrjena (Tsankova et al., 2004; Kumar et al., 2005; Renthal et al., 2009).

Ravni vezave na beljakovine na vsakem zanimivem promotorju genov so bile določene z merjenjem količine povezane DNA z qPCR (Applied Biosystems (ABI) Prism 7700, Foster City, CA). Vhodno ali skupno DNK (neimunoprecipitirano) in imunoprecipitirano DNA smo amplificirali v treh izvodih v prisotnosti SYBR Green (Applied Biosystems, CA). Vrednosti Ct iz vsakega vzorca so bile pridobljene s programsko opremo za zaznavanje zaporedja 1.1. Izvedli smo relativno količinsko določitev šablonske DNA po metodi ΔΔCt (Tsankova et al., 2004). Uporabljeni temeljni premazi: BDNF promotor 4: CTTCTGTGTGCGTGAATTTGCT; Promotor AGTCCACGAGAGGGCTCCA CDK5: GCTGAAGCTGTCAGGAGGTC; GTGCCCCGCTCTTGTTATTA Cck promotor: CTTGGGCTAGCCTCATTCACTG; TTAAATAGCTCCTCCCGGTTCG promotor prodinnorfina: GGCTTCCTTGTGCTTCAGAC; GCGCTGTTTGTCACTTTCAA.

Statistična analiza

Vsi podatki so predstavljeni kot povprečje ± standardna napaka povprečja. Statistično razliko smo ugotovili s študentovim dvostranskim t-testom (p <0.05). Ko so bile narejene več primerjav, so bile vrednosti p prilagojene z Bonferronijevo korekcijo.

Priznanja

Radi bi se zahvalili Willu Renthalu in Arvindu Kumarju za koristne razprave. Prav tako bi se radi zahvalili NIDA za financiranje teh poskusov.

Opombe

Omejitev odgovornosti založnika: To je PDF datoteka neurejenega rokopisa, ki je bil sprejet za objavo. Kot storitev za naše stranke nudimo to zgodnjo različico rokopisa. Rokopis bo podvržen kopiranju, stavljanju in pregledu dobljenega dokaza, preden bo objavljen v končni obliki. Upoštevajte, da se med proizvodnim procesom lahko odkrijejo napake, ki bi lahko vplivale na vsebino, in vse pravne omejitve, ki veljajo za revijo.

Pogoji razvrstitve:

Oddelek: #1 Celična in molekularna biologija živčnih sistemov

Reference

Andersson M, Konradi C, MA Cenci. Protein, ki veže elemente cAMP, je potreben za ekspresijo gena, odvisnega od dopamina, v nepoškodovanem striatumu, ki ga ne dopamin ne povzroča. J Nevrosci. 2001; 21: 9930 – 43. [PubMed]
Barrot M, Olivier JD, Perrotti LI, DiLeone RJ, Berton O, Eisch AJ, Impey S, Storm DR, Neve RL, Yin JC, Zachariou V, Nestler EJ. CREB aktivnost v lupini jezgra nadzira nadziranje vedenjskih odzivov na čustvene dražljaje. Proc Natl Acad Sci US A. 2002; 99: 11435 – 40. [PMC brez članka] [PubMed]
Beinfeld MC, Connolly KJ, Pierce RC. Zdravljenje s kokainom poveča zunajcelični kolecistokinin (CCK) v lupini jedra budnih, prosto gibajočih se podgan, učinek, ki je povečan pri podganah, ki so vedenjsko občutljive na kokain. J Nevrokem. 2002; 81: 1021 – 7. [PubMed]
Bernard C, Sutter A, Vinson C, Ratineau C, Chayvialle J, Cordier-Bussat M. Peptoni spodbujajo transkripcijo gena za celecistokinin v črevesju s cikličnimi faktorji, ki zavezujejo odziv monofosfata na adenozin. Endokrinologija. 2001; 142: 721 – 9. [PubMed]
Bibb JA, Chen J, Taylor JR, Svenningsson P, Nishi A, Snyder GL, Yan Z, Sagawa ZK, Ouimet CC, Nairn AC, Nestler EJ, Greengard P. Učinki kronične izpostavljenosti kokainu ureja nevronska beljakovina Cdk5. Narava. 2001, 410: 376 – 80. [PubMed]
Cha-Molstad H, Keller DM, Yochum GS, Impey S, Goodman RH. Za celico značilno vezavo transkripcijskega faktorja CREB na element cAMP-odziva. Proc Natl Acad Sci US A. 2004; 101: 13572 – 7. [PMC brez članka] [PubMed]
Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, Hope BT, Nestler EJ. Uravnavanje delta FosB in FosB podobnih beljakovin z elektrokonvulzivnimi napadi in zdravljenjem s kokainom. Mol Pharmacol. 1995; 48: 880 – 9. [PubMed]
Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene živali z inducibilno, usmerjeno ekspresijo gena v možganih. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
Chen J, Zhang Y, Kelz MB, Steffen C, Ang ES, Zeng L, Nestler EJ. Indukcija ciklin odvisne kinaze 5 v hipokampusu s kroničnimi elektrokonvulzivnimi napadi: vloga ΔFosB. J Nevrosci. 2000; 20: 8965 – 71. [PubMed]
Chinenov Y, Kerppola TK. Tesna srečanja številnih vrst: interakcije Fos-Jun, ki posredujejo pri regulativni specifičnosti transkripcije. Onkogen. 2001; 20: 2438 – 52. [PubMed]
Cole RL, Konradi C, Douglass J, Hyman SE. Prilagoditev nevronov amfetaminu in dopaminu: molekularni mehanizmi regulacije gena prodinnorfina v striatumu podgane. Neuron. 1995; 14: 813 – 23. [PubMed]
Deavall DG, Raychowdhury R, Dockray GJ, Dimaline R. Nadzor transkripcije genov CCK s PACAP v celicah STC-1. Am J Physiol Gastrointest jeter Fiziol. 2000; 279: G605 – 12. [PubMed]
Ding XZ, Mocchetti I. Dopaminergična regulacija vsebnosti mRNA holecististokinina v striatumu podgane. Brain Res Mol Brain Res. 1992; 12: 77 – 83. [PubMed]
Forrest S, McNamara C. Družina transkripcijskih faktorjev in vaskularne lezije. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004; 24: 2014 – 20. [PubMed]
Gevrey JC, Cordier-Bussat M, Némoz-Gaillard E, Chayvialle JA, Abello J. Zahteva cikličnih AMP- in kalcijem odvisnih beljakovinskih kinaz za transkripcijsko aktivacijo holesterokininskega gena s proteinskimi hidrolizati. J Biol Chem. 2002; 277: 22407 – 13. [PubMed]
Green TA, Alibhai IN, Unterberg S, Neve RL, Ghose S, Tamminga CA, Nestler EJ. Indukcija aktivirajočih transkripcijskih faktorjev (ATF) ATF2, ATF3 in ATF4 v akumuliranih jedrih in njihova regulacija čustvenega vedenja. J Nevrosci. 2008; 28: 2025 – 32. [PubMed]
Hamilton ME, Redondo JL, Freeman AS. Preliv dopamina in holecistokinina v jedru podgan se pojavlja kot odziv na akutno dajanje zdravil. Sinopsija. 2000; 38: 238 – 42. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. Mitogen aktivirana protein kinaza in protein kinaza A signalne poti stimulirajo transkripcijo holecistokinina z aktivacijo cikličnega adenozin 3 ', 5'-monofosfatnega odzivnega proteina, ki veže element. Mol endokrinola. 1999; 13: 466–75. [PubMed]
Hansen TV, Nielsen FC. Uravnavanje transkripcije genov za nevronski holecistokin. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 2001; 234: 61 – 7. [PubMed]
Hansen TV. Transkripcija gena za kolecistokinin: promotorski elementi, transkripcijski faktorji in signalne poti. Peptidi. 2001; 22: 1201 – 11. [PubMed]
Hansen TV, Rehfeld JF, Nielsen FC. KCl in forskolin sinergistično nadzirata izražanje gena za holecistokinin z koordinacijsko aktivacijo CREB in koaktivatorja CBP. J Nevrokem. 2004; 89: 15 – 23. [PubMed]
Haun RS, Dixon JE. Pospeševalec transkripcije, ki je bistven za ekspresijo gena za kolecitokinin pri podganah, vsebuje zaporedje, identično elementu -296 človeškega gena c-fos. J Biol Chem. 1990; 265: 15455 – 63. [PubMed]
Hiroi N, Marek GJ, Brown JR, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, Duman RS, Greenberg ME, Nestler EJ. Bistvena vloga gena fosB pri molekularnih, celičnih in vedenjskih dejanjih kroničnih elektrokonvulzivnih napadov. J Nevrosci 1998. 1998; 18: 6952 – 62. [PubMed]
Hokfelt T, Rehfeld JF, Skirboll L, Ivemark B, Goldstein M, Markey K. Dokazi za soobstoj dopamina in CCK v mezo limbičnih nevronih. Narava. 1980; 285: 476 – 8. [PubMed]
Hope BT, Kelz MB, Duman RS, Nestler EJ. Zdravljenje s kroničnim elektrokonvulzivnim napadom (ECS) povzroči izražanje dolgotrajnega kompleksa AP-1 v možganih s spremenjeno sestavo in lastnostmi. J Nevrosci. 1994; 14: 4318 – 28. [PubMed]
Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, Duman RS, Nestler EJ. Indukcija dolgotrajnega kompleksa AP-1, sestavljenega iz spremenjenih Fos-podobnih beljakovin v možganih s kroničnim kokainom in drugimi kroničnimi zdravljenji. Neuron. 1994, 13: 1235 – 44. [PubMed]
Huang KX, Walters JR. Dopaminergična regulacija aktivnosti vezave DNA na transkripcijski faktor AP-1 v podganu striatum. Nevroznanost. 1996; 75: 757 – 75. [PubMed]
Impey S, McCorkle SR, Cha-Molstad H, Dwyer JM, Yochum GS, Boss JM, McWeeney S, Dunn JJ, Mandel G, Goodman RH. Določitev CREB regulalona: analiza na celotnem genomu regulativnih regij transkripcijskih faktorjev. Celica. 2004; 119: 1041 – 54. [PubMed]
Johannessen M, poslanec Delghandi, Moens U. Kaj vklopi CREB? Celični signal. 2004; 16: 1211 – 27. [PubMed]
Josselyn SA, Vaccarino FJ. Nasprotni učinki antagonistov CCK (A) in CCK (B) na razvoj kondicijske aktivnosti pri podganah. Behav Pharmacol. 1996; 7: 505 – 512. [PubMed]
Josselyn SA, De Cristofaro A, Vaccarino FJ. Dokazi o vpletenosti receptorjev CCK (A) v pridobivanje kondicijske aktivnosti, ki jo proizvaja kokain pri podganah. Možgani Res. 1997; 763: 93 – 102. [PubMed]
Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr., Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR , Nestler EJ. Izražanje transkripcijskega faktorja deltaFosB v možganih nadzoruje občutljivost na kokain. Narava. 1999; 401: 272 – 6. [PubMed]
Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DE, Truong HT, Russo SJ, Laplant Q, Sasaki TS, Whistler KN, Neve RL, Self DW, Nestler EJ. Preoblikovanje kromatina je ključni mehanizem, ki je podlaga za plastičnost kokaina v striatumu. Neuron. 2005, 48: 303 – 14. [PubMed]
Mattson BJ, Bossert JM, Simmons DE, Nozaki N, Nagarkar D, Kreuter JD, Hope BT. Fosforilacija CREB, ki jo povzroča kokain, v nukleusnih jezmih podgan, občutljivih na kokain, je omogočena z izboljšano aktivacijo zunajcelične signalno kinaze, ne pa tudi s proteinsko kinazo A. J Neurochem. 2005; 95: 1481 – 94. [PubMed]
McClung CA, Nestler EJ. Regulacija izražanja genov in kokainske nagrade s strani CREB in DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208 – 15. [PubMed]
McClung CA, Ulery PG, Perrotti LI, Zachariou V, Berton O, Nestler EJ. DeltaFosB: molekularno stikalo za dolgoročno prilagoditev v možganih. Brain Res Mol Brain Res. 2004, 132: 146 – 54. [PubMed]
Nestler EJ, Kelz MB, Chen JS. ΔFosB: Molekularni mediator dolgoročne nevronske in vedenjske plastičnosti. Možgani Res. 1999; 835: 10 – 17. [PubMed]
Nestler EJ. Ali obstaja skupna molekularna pot za zasvojenost? Nat Neurosci. 2005, 8: 1445 – 9. [PubMed]
Nestler EJ. Transkripcijski mehanizmi zasvojenosti: vloga DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008; 363: 3245 – 55. [PMC brez članka] [PubMed]
Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različni vzorci indukcije DeltaFosB v možganih zaradi zlorabe drog. Synapse. 2008, 62: 358 – 69. [PMC brez članka] [PubMed]
Rando OJ, Chang HY. Pogledi na strukturo kromatina v celotnem genomu. Annu Rev Biochem. 2009; 78: 245 – 71. [PMC brez članka] [PubMed]
Renthal W, Carle TL, Maze I, Covington HE, 3rd., Truong HT, Alibhai I, Kumar A, Montgomery RL, Olson EN, Nestler EJ. Delta FosB posreduje epigenetsko desenzibilizacijo gena c-fos po kronični izpostavljenosti amfetaminom. J Nevrosci. 2008; 28: 7344 – 9. [PMC brez članka] [PubMed]
Renthal W, Kumar A, Xiao G, Wilkinson M, Covington HE, 3rd, Maze I, Sikder D, Robison AJ, LaPlant Q, Dietz DM, Russo SJ, Vialou V, Chakravarty S, Kodadek TJ, Stack A, Kabbaj M, Nestler EJ. Genomska analiza kromatinskega uravnavanja s kokainom kaže na vlogo sirtuinov. Neuron. 2009, 62: 335 – 48. [PMC brez članka] [PubMed]
Rotzinger S, Bush DE, Vaccarino FJ. Modulacija holecistokinina mezolimbične funkcije dopamina: regulacija motiviranega vedenja. Pharmacol Toxicol. 2002; 91: 404 – 13. [PubMed]
Rourke IJ, Hansen TV, Nerlov C, Rehfeld JF, Nielsen FC. Negativna kooperativnost med sestavljenim E-boxom in elementi, ki so odzivni na cAMP / TPA, v promotorju gena za holecistokinin. FEBS Lett. 1999; 448: 15 – 8. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Barrot M, Wallace T, Gilden L, Zachariou V, Impey S, Duman RS, Storm D, Nestler EJ. Regionalno in celično preslikavanje transkripcije, posredovane s CRE, med odvzemom morfina, oborjenega z naltreksonom. J Nevrosci. 2002; 22: 3663 – 3672. [PubMed]
Shaw-Lutchman TZ, Impey S, Storm D, Nestler EJ. Uravnavanje CRE-posredovane transkripcije v mišjih možganih z amfetaminom. Sinopsija. 2003; 48: 10 – 7. [PubMed]
Sheng M, McFadden G, Greenberg ME. Membranska depolarizacija in kalcij povzročata transkripcijo c-fos s fosforilacijo transkripcijskega faktorja CREB. Neuron. 1990; 4: 571 – 82. [PubMed]
Tsankova NM, Kumar A, Nestler EJ. Spremembe histona na območjih promotorjev genov v hipokampusu podgan po akutnih in kroničnih elektrokonvulzivnih napadih. J Nevrosci. 2004; 24: 5603 – 10. [PubMed]
Ulery PG, Nestler EJ. Regulacija transkripcijske aktivnosti DeltaFosB s fosforilacijo Ser27. Eur J Nevrosci. 2007; 25: 224 – 30. [PubMed]
Vaccarino FJ. Nucleus acunens dopamin-CCK interakcije pri nagrajevanju psihostimulantov in s tem povezanih vedenj. Neurosci Biobehav Rev. 1992; 18: 207 – 14. [PubMed]
Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchmann T, Berton O, Sim-Selley LJ, DiLeone RJ, Kumar A, Nestler EJ. ΔFosB: Bistvena vloga ΔFosB v jedru se pojavlja pri delovanju morfija. Narava Nevrosci. 2006; 9: 205 – 11. [PubMed]