(HUMAN) Vedenjski in strukturni odzivi na kronični kokain zahtevajo povratno zanko, ki vključuje ΔFosB in beljakovinsko kinazo, odvisno od kalcija / kalmodulina II, v lupini jedrskih obtokov (2013)

Transkripcijski faktor ΔFosB in možgansko obogatena s kalcijem / kalmodulinom odvisna beljakovinska kinaza II (CaMKIIα) se v jedru jedra (NAc) sprožijo s kronično izpostavljenostjo zlorabi kokaina ali drugih psihostimulantnih drog, pri katerih oba proteina posredujeta občutljivo odzivnim drogam. . Čeprav ΔFosB in CaMKIIα uravnavata ekspresijo in delovanje receptorjev glutamatnih receptorjev AMPA v NAc, tvorbo dendritične hrbtenice na srednjih bodicastih nevronih NAc (MSN) in lokomotorno preobčutljivost na kokain, do zdaj še ni bilo raziskano neposredne povezave med temi molekulami. Tukaj prikazujemo, da je ΔFosB fosforiliran s CaMKIIα na proteinu stabilizirajočega Ser27 in da je CaMKII potreben za kopičenje kokaina ΔFosB v NAc pri podganah.

Po drugi strani pa pokažemo, da je ΔFosB potreben in zadosten za indukcijo kokainske ekspresije gena CaMKIIα in vivo, učinek selektiven za D₁tipa MSN v podregiji lupine NAc.

Poleg tega sta indukcija dendritičnih bodic na NAc MSN in povečana vedenjska odzivnost na kokain po pretiranem izražanju NAc ΔFosB odvisna od CaMKII.

Pomembno je, da prvič pokažemo indukcijo ΔFosB in CaMKII v NAc človeški odvisniki od kokaina, kar predlaga možne cilje za prihodnje terapevtsko posredovanje. Ti podatki dokazujejo, da ΔFosB in CaMKII sodelujeta v celičnem tipu in specifični pozitivni povratni zanki, specifični za celico in možgansko regijo, kot ključni mehanizem za uravnavanje možganskega kroga nagrad pri odzivu na kronični kokain.

Predstavitev

Vse več dokazov podpira stališče, da spremembe v izražanju genov prispevajo k mehanizmom odvisnosti od drog (Robison in Nestler, 2011). Pomemben posrednik teh sprememb je ΔFosB, faktor transkripcije družine Fos (Nestler, 2008). Kronično jemanje skoraj katerega koli zlorabe drog povzroči dolgotrajno kopičenje ΔFosB v jedrnih jezerih (NAc), limbičnem območju, ki je ključnega pomena za vedenjsko vedenje. Such indukcija se zdi značilna za razred NAc srednjega bodicastega nevrona (MSN), ki izraža D1 dopaminske receptorje. Inducibilna prekomerna ekspresija ΔFosB v teh MSN-jih tipa D1 povečuje lokomotorno in koristno odzivanje na kokain in morfij (Kelz et al., 1999; Zachariou et al., 2006), vključno s povečano samoupravljanjem kokaina (Colby et al., 2003). Poleg tega genetska ali virusna blokada transkripcijske aktivnosti ΔFosB zmanjšuje koristne učinke teh zdravil (Zachariou et al., 2006), kar kaže na to, da je ta trajna indukcija ΔFosB kritični mediator trajnih sprememb, ki jih povzroči NAc s kroničnim dajanjem zdravil.

Nenavadna stabilnost ΔFosB (glede na vse druge beljakovine iz družine Fos) je tako lastnost molekule zaradi okrnjenja domenskih degron, ki so prisotne v fosB v celotni dolžini (Carle et al., 2007) in urejen postopek. ΔFosB je fosforiliran in vitro in vivo pri Ser27 in ta reakcija nadalje stabilizira ΔFosB, ~ 10 krat, v celični kulturi in NAc vivo (Ulery-Reynolds et al., 2009). Čeprav se je pokazalo, da je Ser27-ΔFosB substrat za kazein kinazo-2 in vitro (Ulery et al., 2006), njegov mehanizem vivo fosforilacija ostaja neznana.

Kalcijeva / kalmodulinsko odvisna protein kinaza II (CaMKII) je močno izražena serin / treonin kinaza, katere izo in β izoformi tvorita dodekamerne homo- in hetero-holoencime vivoin so bistvenega pomena za več oblik nevroplastičnosti (Lisman in sod., 2002; Colbran in Brown, 2004). CaMKIIα se selektivno inducira v lupini NAc s kroničnim amfetaminom (Loweth et al., 2010) in farmakološka blokada aktivnosti CaMKII v lupini NAc zmanjšuje vedenjsko preobčutljivost za amfetamin (Loweth et al., 2008) in kokain (Pierce et al., 1998), medtem ko virusna prekomerna ekspresija CaMKIIα v tej podregiji NAc poveča lokomotorno preobčutljivost za amfetamin in njegovo samostojno uporabo (Loweth et al., 2010). CaMKIIα lahko vpliva na vedenje nagrajevanja z modulacijo podenot receptorja glutamata AMPA (Pierce et al., 1998), saj je aktivnost CaMKIIα že dolgo povezana z delovanjem receptorjev AMPA in s sinaptičnim ciljanjem v več oblikah nevroplastičnosti (Malinow in Malenka, 2002).

Ta literatura prikazuje več vzporednic med ΔFosB in CaMKII: oboje je potrebno in zadostno za večkratne vedenjske učinke zlorabe zdravil, oboje uravnava dendritične bodice v različnih vrstah nevronskih celic vivo (Jourdain in sod., 2003; Maze et al., 2010) in oba izvajata vsaj nekatere svoje vedenjske učinke z modulacijo AMPA receptorjev (Kelz et al., 1999; Malinow in Malenka, 2002; Vialou et al., 2010). Kljub tem vzporednikom ni znana funkcionalna povezava med ΔFosB in CaMKII. Tu vzpostavimo vzajemno regulacijo med ΔFosB in CaMKII in dokažemo, da oba beljakovina tvorita D1 tipa MSN, specifična dovodna zanka v lupini NAc, ki jo inducira kokain in uravnava vrsto odziva na kokain. vivo.

Pojdi na:

Materiali in metode

Eksperiment 1: iTRAQ proteomska analiza NAc lupine in jedra po zdravljenju s kokainom (Slika 1A)

Odraslim samcem (8 tednov) so podeljevali 20 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan sedem dni. 24 h po zadnji injekciji, lupina in jedro NAc so bili mikrosekcionirani (Slika 1A) in bliskovito zamrznjeno. iTRAQ analize so bile izvedene, kot je opisano prej (Ross et al., 2004; Davalos in sod., 2010).

Slika 1

Specifična lupinska indukcija CaMKII v NAc s kokainom

Preizkus 2: Količinsko določanje sprememb beljakovin v podganah in jedru podgana po zdravljenju s kokainom (Slika 1B – D)

Odraslim samcem (8 tednov) so podarjali 10 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan sedem dni v lokomotornih komorah. Lokomotorni odzivi na enkratno injiciranje kokaina (5 mg / kg IP) so bili zabeleženi pri živalih, ki so prej kokain (imenovane "kronično"), in delu tistih, ki so jih zdravili s fiziološko raztopino (imenovane "akutne"), in lokomotorni odzivi na fiziološko raztopino sam je bil zabeležen pri preostalih kronično fizioloških živalih (imenovanih „fiziološka raztopina“). Preskusi lokomotorne aktivnosti so bili izvedeni, kot je opisano (Hiroi et al., 1997). Na kratko so odrasle samce podgane postavile v prostore za snemanje odprtega polja 18 "× 24" PAS (San Diego Instruments), da bi se 30 minil, da bi se navadile, prejeli so eno samo IP injekcijo fiziološke raztopine in spremljali dodatne 30 min. enkratno IP injiciranje kokaina 5 mg / kg in spremljano 30 min.

Po tej končni injekciji so podgane obglavili brez anestezije, da bi se izognili učinkom anestetikov na raven beljakovin in fosfo stanja nevronov. Možgani so bili serijsko narezani v matrico 24 mm (Braintree Scientific), ciljno tkivo pa smo odstranili v fosfatni fiziološki raztopini, ki vsebuje proteazo (Roche) in fosfatazo (Sigma Aldrich) z uporabo 1.2 merilnega luknjice za jedro NAc in 14 merilno ploščico preostalih tkivo za lupino NAc (Glej Slika 1A) in takoj zamrznjena na suhem ledu. Vzorce smo homogenizirali s svetlobno sonikacijo v modificiranem puferju RIPA: 10 mM Tris baza, natrijev klorid 150 mM, 1 mM EDTA, 0.1% natrijev dodecil sulfat, 1% triton X-100, 1% natrijevega deoksiholata, pH XNUMha, proteaza in zaviranje proteaze in fosfori kot zgoraj. Po dodajanju pufra Laemmli smo proteine ​​ločili na 7.4 – 4% poliakrilamaidni gradientni geli (Criterion System, BioRad) in Western blot izvedli s sistemom Odyssey (Li-Cor) po protokolih proizvajalca.

Eksperiment 3: Količinsko določanje sprememb beljakovin v podganah NAc in lupina po odvzemu kokaina (Slika 1E)

Odraslim samcem (8 tednov) so podeljevali 10 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan sedem dni. Dne 14 po končni injekciji so živali, zdravljene s fiziološko raztopino, dobile še eno injekcijo fiziološke raztopine (živali), živali, zdravljene s kokainom, pa so dobile še drugo injekcijo fiziološke raztopine (imenovano odvzem dneva 14 ali "14d WD") ali eno samo injekcijo kokaina ( imenovan "14d WD Chal" za izziv). En uro po končni injekciji so živali obglavili, Western blot pa izvedli kot pri poskus 2.

Preizkus 4: Količinsko določanje sprememb beljakovin v jedru in lupini podgana podcina po samoupravi kokaina (Slika 2A – C)

Podgane so bile usposobljene za samo-dajanje 0.5 mg / kg / infundiranje kokaina v enournih sejah po devetdnevnem urniku s fiksnim razmerjem 1. Po devetih izhodiščih so podgane razdelili v dve skupini, ki sta bili na zadnjih dveh sejah uravnoteženi z vnosom kokaina. Eni skupini podgan je bilo dovoljeno samo-dajati kokain (0.5 mg / kg / infuzija) v enournih sejah (kratek dostop, ShA), druga skupina podgan pa je sama kokain podirala v šesturnih sejah (daljši dostop, LgA ) za deset dodatnih dni (stopnjevanje).

Odseki možganov so bili obdelani za imunohistokemijo, kot je opisano (Perrotti et al., 2004). Po zadnji izpostavljenosti zdravilu so možgani prelili 18 – 24 h, kar je povzročilo razgradnjo katerega koli preostalega fosB proteina v celotni dolžini, tako da vsa preostala imunoreaktivnost odraža ΔFosB. To razgradnjo je potrdilo Western blotting, ki ni pokazalo bistvenega obarvanja s protitelesom, usmerjenim proti C terminusu celotne fosB, ki ne prepozna ΔFosB (podatki niso prikazani). Po rezanju na 35 µm odseke je slepi opazovalec količinsko določil število imunopozitivnih celic ΔFosB v dveh odsekih skozi NAc vsake podgane, nato pa so bile povprečne vrednosti na polju 40 × izračunane po regijah za vsako žival. Vsaka žival je za statistično analizo veljala za individualno opazovanje. Regije zanimanja so bile ugotovljene z uporabo Paxinosa in Watsona (Paxinos in Watson, 2007).

Kvantifikacija imunoreaktivnosti CaMKIIα je bila izvedena s sistemom Licor, kot je opisano (Covington et al., 2009). Integrirana intenzivnost CaMKII in GAPDH je bila določena s programsko opremo Odyssey. Rezultati so predstavljeni kot integrirane vrednosti intenzivnosti na mm² in so predstavljeni kot sredstva ± sem (n = 4 – 10 na skupino). Vrednosti za GAPDH so bile uporabljene kot referenca za normalizacijo intenzitete CaMKII za debelino in pogoje rezine.

Slika 2

Indukcija CaMKII v lupini NAc samoupravljajočih podgan in človeških odvisnikov od kokaina

Preizkus 5: Količinsko določanje ravni beljakovin v ljudeh, odvisnih od kokaina (Slika 2D)

Postopek

Postmortem možganska tkiva ljudi so bila pridobljena iz banke možganov Quebec Suicide Brain (Univerzitetni inštitut za duševno zdravje Douglas, Montreal, Quebec, Kanada). Ohranjanje tkiva je potekalo v bistvu, kot je opisano (Quirion in sod., 1987). Na kratko, ko so izvlečeni, se možgani položijo na mokri led v škatlo iz stiroporja in odpeljejo v prostore banke Quebec Suicide Brain Bank. Hemisfere se takoj ločijo s sagitalnim rezom na sredini možganov, možganskem steblu in možganskem deblu. Krvne žile, pinealna žleza, koreroidni pleksus, polovica možganskega debla in polovica možganskega stebla se običajno razsekajo iz leve poloble, ki jo nato pred zamrzovanjem kronično razrežemo na rezine 1 cm. Slednjo polovico možganca se pred zamrzovanjem sagitalno razreže na rezine debeline 1cm. Tkiva se hitro zamrznejo v 2-metilbutanu pri –40 ° C v ~ 60 sek. Vsa zamrznjena tkiva se hranijo ločeno v plastičnih vrečkah pri –80 ° C za dolgotrajno skladiščenje. Specifične možganske regije sesekljajo iz zamrznjenih koronarnih rezin na plošči iz nerjavečega jekla s suhim ledom po vsem, da nadzorujejo temperaturo okolja. Western blot je bil izveden, kot je opisano v poskus 2.

Kohorta

Kohorto so sestavljali moški 37 in ženske osebe 3, ki so bili stari med letoma 15 in 66. Vsi preiskovanci so umrli nenadoma brez dolgotrajnega agonalnega stanja ali dolgotrajne zdravstvene bolezni. V vsakem primeru je vzrok smrti ugotovil preiskovalni urad Quebeca, izvedli pa so toksikološki pregled z vzorci tkiv, da bi dobili informacije o zdravilih in uporabi prepovedanih snovi v času smrti. Predmetno skupino so sestavljali posamezniki 20, ki so izpolnjevali merila SCID-I za odvisnost od kokaina. Kontrolno skupino so sestavljali preiskovanci 20 brez zgodovine odvisnosti od kokaina in brez večjih psihiatričnih diagnoz. Vsi preiskovanci so umrli nenadoma zaradi vzrokov, ki niso neposredno vplivali na možgansko tkivo. Skupine so se ujemale glede na povprečno starost, zamudo pri hlajenju in pH. Pri vseh preiskovancih so bile opravljene psihološke obdukcije, kot je opisano prej (Dumais in sod., 2005), kar nam omogoča dostop do podrobnih informacij o primerih psihiatrične in zdravstvene anamneze, pa tudi do drugih ustreznih kliničnih in sociodemografskih podatkov. Na kratko, usposobljeni anketar je vodil ta Strukturiran klinični intervju za DSM-IV Psihiatrične motnje (SCID-I) z enim ali več informatorji pokojnika. Skupina klinikov je pregledala ocene SCID-I, poročila o primerih, poročila mrtvorodnika in medicinsko kartoteko, da bi pridobila soglasne psihiatrične diagnoze.

Preizkus 6: Imunoprecipitacija kromatina za NAc podgane (Slika 3A – C)

Odraslim samcem (8 tednov) so podeljevali 10 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan sedem dni. 24 h po zadnji injekciji, luska in jedro NAc smo mikrosiscirali. Izvedena je bila imunoprecipitacija s kromatinom (ChIP), ki je združila dvostranske NAc udarce lupine ali jedra iz sedmih podgan na skupino v skupnih skupinah 14 (skupaj živali 98, bazeni kokaina 7, slani bazeni 7). Tkiva so bila umrežena, oprana in shranjena pri –80 ° C do striženja kromatina z ultrazvokom. Rezani kromatin smo inkubirali čez noč s protitelesi, predhodno vezanimi na magnetne kroglice (Dynabeads M-280, Invitrogen). Kot kontrolo smo uporabili neimunski IgG. Po povratni navzkrižni povezavi in ​​čiščenju DNK smo uporabili qPCR za merjenje ravni CaMKIIa promotorjeve DNA. Primeri so bili zasnovani tako, da so razširili območje, ki vsebuje soglasno zaporedje AP-1, ki se nahaja ~ 450 bp pred začetnim mestom prepisovanja (naprej: ACTGACTCAGGAAGAGGGATA; obratno: TGTGCTCCTCAGAATCCACAA).

Slika 3

Indukcija CaMKIIa za tip celice in za regijo specifično ΔFosB vivo

Eksperiment 7: Merjenje prepisov CaMKII in ekspresije beljakovin s prekomerno ekspresijo ΔFosB, specifično za celico (Slika 3D)

Moški bitransgene miši izvirajo iz NSE-tTA (vrstica A) × TetOp-ΔfosB (vrstica 11) in NSE-tTA (vrstica B) × TetOp-FLAG-ΔfosB (vrstica 11) miši (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002; Zachariou et al., 2006) so bili zasnovani in vzgojeni na 100 µg / ml doksiciklina za zatiranje izražanja ΔFosB med razvojem. Litermate smo razdelili pri odstavljanju: polovica je ostala na doksiciklinu, polovica pa je prešla na vodo, živali pa so bile uporabljene 8 v 11 tedne kasneje, ko so transkripcijski učinki ΔFosB največji (Kelz et al., 1999; McClung in Nestler, 2003). Za transkripcijske analize so miši hitro obglavili, možgane pa odstranili in postavili na led. Sekcije NAc so bile odstranjene z igle za merjenje 14 in hitro zamrznjene na suhem ledu, dokler RNA ni bila ekstrahirana. Izolacija RNA, qPCR in analiza podatkov so bili izvedeni, kot je opisano prej (LaPlant et al., 2009). Na kratko smo RNA izolirali z reagentom TriZol (Invitrogen), nadalje očistili z mikrokompletom RNAeasy iz podjetja Qiagen in preverili kakovost s Bioanalizatorjem Agilent. Reverzno prepisovanje smo izvedli s pomočjo iScript (BioRad). qPCR smo izvedli s PCR sistemom Applied Biosystems 7900HT RT z naslednjimi parametri cikla: 10 min pri 95 ° C; 40 cikli 95 ° C za 1 min, 60 ° C za 30 sek, 72 ° C za 30 sek; stopnjevano ogrevanje na 95 ° C, da ustvari krivulje disociacije za potrditev posameznih PCR izdelkov. Izvedene so bile imunohistokemijske analize izražanja proteina ΔFosB in CaMKIIα, kot je opisano v poskus 4.

Preizkus 8: Učinki antagonistov receptorjev dopamina Intra-NAc D1 in D2 na spremembe beljakovin, posredovanih s kokainom (Fig 3H)

Odraslim samcem (8 tednov) so podeljevali 10 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine (skupina „vozila“) IP enkrat na dan sedem dni. 30 min pred vsako injekcijo kokaina so podganam IP dajali antagonist receptorja D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg, skupina "D1 Ant") ali etikloprid antagonista D2 receptorja (0.5 mg / kg, "skupina D2 Ant") ali injekcijo fiziološke raztopine (skupina "kokain"). 24 h po končni injekciji so živali obglavili in proteine ​​količinsko opredelili z Western blot per poskus 2.

Eksperiment 9: Učinki prekomerne ekspresije z AAV ΔFosB na ekspresijo beljakovin (Slika 4 A – C)

Stereotaksična operacija je bila izvedena na odraslih samskih podganah (tedni 8), da so vbrizgali AAV-GFP (zeleni fluorescentni protein) ali AAV-GFP-ΔFosB (Maze et al., 2010). Za vse operacije so bile uporabljene merilne igle 33 (Hamilton), med katerimi je bilo 0.5 µl očiščenega virusa z visoko titri dvostransko infuzirano v minuto časovnem obdobju 5, čemur je sledilo dodatno obdobje 5 min po infuzijskem počitku. Vse razdalje se merijo glede na Bregmo: 10 ° kot, AP = + 1.7 mm, Lat = 2.5 mm, DV = −6.7 mm. Dne 14 po operaciji so živali v komorah za lokomotorno spremljanje prejemale en sam IP injekcije 10 mg / kg kokaina za oceno vedenjskih učinkov prekomerne ekspresije ΔFosB. 24 h po končni injekciji so podgane obglavili, kakor je navedeno na poskus 2in mikrosisekcijo tkiva smo izvedli pod fluorescentno mikroskopsko smernico, da smo dobili tkivo NAc-pozitivno NAc. Western blot je bil nato izveden po per Poskus 2.

Slika 4

ΔFosB je potreben in zadosten za indukcijo CaMKIIα, odvisne od receptorja D1, v lupini NAc

Poskus 10: Učinki prekomerne ekspresije z AAV ΔJUND na ekspresijo proteina, odvisne od kokaina (Slika 4 D – F)

Stereotaksično injiciranje AAV-GFP ali AAV-GFP-ΔJunD je bilo izvedeno po Poskus 8. 14 dni po operaciji so živali dajale 10 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan sedem dni v lokomotornih komorah. Zabeleženi so bili lokomotorni odzivi na enkratno injiciranje kokaina (5 mg / kg IP) ali fiziološke raztopine. 24 h po končni injekciji so podgane obglavili, tkivo pobrali in Western blot izvedli kot Poskus 9.

Eksperiment 11: In vitro Proteinski kinazni testi (Slika 5A – D)

Rekombinantna CaMKIIα in ΔFosB smo očistili iz celic žuželk (Brickey in sod., 1990; Jorissen in sod., 2007) in bili opravljeni testi proteinov kinaze (Colbran, 1993), kot je predhodno opisano. Na kratko, CaMKII smo predhodno inkubirali na ledu z 2.5 µM ​​(ali navedeno koncentracijo) ΔFosB, 1 mM Ca²⁺, 40 mM Mg²⁺, 15 µM ​​kalmodulin in 200 mM HEPES pH 7.5. Fosforilacija se je začela z dodatkom 200 µM ​​ATP z ali brez [γ-³²P] ATP in je dovoljeno nadaljevati 10 min pri sobni temperaturi (Slika 5A in B) ali 2 min na ledu (Slika 5C & D). Izdelke je rešil Western blotting (Slika 5A in B) ali z avtoradiogramom in scintilacijskim štetjem (slika B-D).

Slika 5

ΔFosB je močan substrat za CaMKIIα

Preizkus 12: Identifikacija fosforilacije Ser27 ΔFosB (Slika 5E)

In vitro kinazni testi so bili opravljeni v skladu s per poskus 11, beljakovine smo ločili s SDS-PAGE in izrezali pasove, ki ustrezajo ΔFosB, in jih podvrgli tandemski masni spektrometriji. M / z dodelitve ustreznih ionskih fragmentov na vseh ploščah so označene na ionskih konicah. Zaradi omejenosti prostora niso označeni vsi ioni fragmentov. Na splošno je besedilo nalogov ionskih fragmentov obarvano črno, razen če neposredno potrjujejo ali dodajajo dokaze o prisotnosti zanimivih mest fosforilacije, v tem primeru pa so označene z rdečo barvo. Dokazi za produkte drobljenja hrbtenice so predstavljeni v odčitku zaporedja fosfopeptida, pri čemer je odkrito mesto fosforilacijskega ostanka, označeno rdeče, z eno samo črko aminokisline. Številčni opis opazovanih fragmentnih ionov je tudi na peptidnem zaporedju označen kot b in y ioni. Faktorji zooma za odseke m / z osi za prikaz fragmentov ionov nižje intenzivnosti so označeni na vrhu vsakega masnega spektra fragmenta. Fragmenti ioni, prikazani na plošči H, potrjujejo prisotnost fosforilirane izoforme Ser27 znotraj mešanice drugih fosforiliranih izoform na mestih Ser28, Ser31, Ser34 in Thr37. Prisotnost ionov pa5, pa5-P, pb5 in pb5-P edinstveno potrjuje fosforilacijo ostankov Ser27.

Eksperiment 13: količinsko določanje fosforilacije Ser27 (Slika 5F)

Standardni peptidi so bili zasnovani tako, da posnemajo fosfo in nefosfo oblike Ser27 ΔFosB. Po sintezi in čiščenju smo vsak "težak" idiotipski peptid raztopili v puferju 50 / 50 acetonitril / voda in poslali na analizo aminokislin, da bi določili absolutno koncentracijo v osnovni raztopini sintetičnega peptida. Vsak "težak" peptid je bil nato neposredno infuziran v masni spektrometer 4000 QTRAP (MS), da se določi najboljša energija trčenja za fragmentacijo MS / MS in dva do štiri MRM prehode. Nato smo čiste "težke" peptide podvrgli LCMS na 4000 QTRAP, da smo zagotovili ločitev peptidov. Instrument se je poganjal v načinu trojnega kvadrupola, pri čemer je Q1 nastavljen na specifično vrednost m / z predhodnika (Q1 ne skenira), Q3 pa na specifično m / z vrednostjo, ki ustreza določenemu fragmentu tega peptida. V načinu MRM smo zaporedoma izmerili serijo posameznih reakcij (prehodi ionskih prehodov / fragmentov, pri katerih je energija trčenja nastavljena za optimizacijo intenzitete zanimivih ionov fragmenta) in cikel (običajno 1 – 2 sec) je bil zanko v celotnem zanki celoten čas ločitve HPLC. MRM prehode smo določili iz spektra MS / MS obstoječih peptidov. Nato sta bila izbrana dva prehoda na peptid, ki ustrezata fragmentom ionov visoke intenzivnosti, in trčna energija je bila optimizirana za povečanje jakosti signala prehodov MRM s pomočjo programske opreme za avtomatizacijo. Nato smo primerjali vrhove, dobljene iz standardnih peptidov in vzorcev ΔFosB, izpostavljenih CaMKII ali kontroli, da smo določili absolutno številčnost vsake peptidne oblike v reakciji. Analiza podatkov o LC-MRM se izvaja z uporabo programske opreme AB Multiquant 1.1.

Eksperiment 14: indukcija ΔFosB v CaMKII prekomernih pritiskih (Slika 5G & H)

Transgenične miši, ki prekomerno izražajo T286D CaMKII (Mayford in sod., 1996; Kourrich et al., 2012) in divji mladiči so bili vzgojeni v odsotnosti doksiciklina, ki bi omogočil ekspresijo transgena. Odraslim mišem so dajali 20 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine IP enkrat na dan v 14 dneh. 24 h po končni injekciji so živali obglavili, imunohistokemijo in količinsko določanje ekspresije ΔFosB izvedli kot pri poskus 4.

Preizkus 15: Učinki prekomerne ekspresije ΔFosB, posredovane s HSV, in zaviranja CaMKII na dendritične bodice NAc (Slika 6A – E)

Moškim odraslim mišem (tedni 8) smo stereotaksično injicirali v NAc s HSV-GFP, HSV-GFP-ΔFosB (Olausson et al., 2006), HSV-GFPAC3I ali HSV-GFPAC3I-ΔFosB. V teh konstruktih se AC3I, peptidni inhibitor aktivnosti CaMKII, zlije na C-konec GFP. GFPAC3I smo klonirali s PCR z uporabo vektorja pMM400, ki vsebuje GFPAC3I kot predlogo z naslednjimi prajmeni: GFP-AC3I-F: 5 'CC GCTAGC GCCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGGGGGGAGCTNTTTTTTTTTTTT " GFP-AC3I-R: 3 'CC TCCGGA TTACAGGCAGTCCACGGCCT 5' (clampBspEIstop). Nastali PCR produkt smo vstavili v p3 + in p1005 + -Δ FosB vektorje s pomočjo NheI in BspEI mest. Konstrukt je bil potrjen s sekvenciranjem. Stereotaksične koordinate so bile: 1005 ° kot, AP = + 10 mm, Lat = + 1.6 mm, DV = −1.5 mm (Barrot in sod., 4.4). Perfuzija in presek možganov je bila izvedena po per poskus 4.

Analiza hrbtenice je bila izvedena, kot je opisano (Christoffel et al., 2011). Na kratko, dendritični segmenti 50 – 150 µm stran od soma so bili naključno izbrani iz celic, okuženih s HSV, ki izražajo GFP. Slike so bile pridobljene na konfokalnem LSM 710 (Carl Zeiss) za morfološko analizo z uporabo NeuronStudio z algoritmom rayburst. NeuronStudio razvršča bodice kot tanke, gobe ali trmaste na podlagi naslednjih vrednosti: (1) razmerje stranic, (2) razmerje med glavo in vratom in (3) premer glave. Trnčke z vratom lahko razvrstimo med tanke ali gobe, tiste, ki nimajo pomembnega vratu, pa so razvrščene kot trmaste. Trnci z vratom so glede na premer glave označeni kot tanki ali gobji.

Slika 6

Blokada CaMKII aktivnosti preprečuje morfološke in vedenjske učinke ΔFosB pri NAc

Poskus 16: Učinki prekomerne ekspresije ΔFosB, posredovane s HSV, in zaviranja CaMKII na odziv na kokain (Slika 6F)

Odraslim moškim mišem so injicirali viruse, kot je navedeno na poskus 15in lokomotorni odzivi so bili izmerjeni na eno samo injekcijo kokaina 5 mg / kg, kot je bilo po Poskus 9. Podatki o lokomotorju so izraženi kot skupni preboji žarka v 30 min po vbrizgavanju kokaina.

Dodatne informacije

Ohišje živali

Moške podgane Sprague Dawley (250 – 275 g; Charles River Laboratories) so bile nameščene v paru. Osem tednov stari samci C57BL / 6J (laboratorij Jackson) so bili nameščeni v skupino z največ petimi živalmi na kletki. Vse živali so bile pred poskusnimi manipulacijami navajene v objekt za živali ≥1 teden in so bile nameščene v klimatsko nadzorovanih prostorih (23 – 25 ° C) v ciklusu svetlobe in temnosti 12 hr (luči pri 7: 00 AM) z dostopom do hrane in vodo ad libitum. Poskusi so bili izvedeni v skladu s smernicami Društva za nevroznanost in institucionalnega odbora za oskrbo in uporabo živali (IACUC) na gori Sinaj.

Droge

Zdravila so dajali IP in jih raztopili v sterilni fiziološki raztopini, vključno s kokainom (5 – 20 mg / kg na 10 µl za miši, na 1 ml za podgane, NIDA) in SCH 23390 ali etikloprid hidrokloridom (0.5 mg / kg na 1 ml, Tocris) . Za stereotaksično operacijo smo miši anestezirali s "koktajlom" ketamina (100 mg / kg) in ksilazina (10 mg / kg) (Henry Schein) v sterilni fiziološki raztopini.

Protitelesa

CaMKIIα (skupaj): Upstate 05 – 532, 1: 5,000

CaMKII fosfo-Thr286: Promega V111A, 1: 1,000

ΔFosB (skupaj): signalizacija celic 5G4, 1: 250

ΔFosB fosfo-Ser27: Fosfosolucije, 1: 500

GluA1 (skupaj): Abcam, Ab31232, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser831: Millipore N453, 1: 1,000

GluA1 fosfo-Ser845: Chemicon Ab5849, 1: 2,000

GluA2: Millipore 07 – 598, 1: 2,000

NR2A: Sigma HPA004692, 1: 2,500

NR2B: Millipore Ab1557P, 1: 1,000

Statistične analize

Vse statistične analize so bile izvedene z uporabo programskega paketa Prism 6 (GraphPad). Študentovi t-testi so bili uporabljeni za vse parne primerjave (označeno v rezultatih, kjer je podana vrednost t), enosmerne ANOVA pa so bile uporabljene za vse več primerjav (označeno v razdelku z rezultati, kjer je podana vrednost F).

Pojdi na:

Rezultati

Kronični kokain povzroča CaMKII v lupini NAc

Številne študije so pokazale, da imajo MSN v lupini in jedru NAc različne biokemične in fiziološke odzive na kronično izpostavljenost zlorabi drog (Kourrich in Thomas, 2009; Loweth et al., 2010) in da obe podregiji različno urejata vedenja, ki iščejo droge (Ito et al., 2004). Za določitev diferenčnih učinkov kokaina na beljakovinske sestavine lupine NAc vs jedro, uporabili smo večkratno izobarno označevanje (iTRAQ) in tandemsko masno spektroskopijo (MS / MS). Odraslim moškim podganam so injicirali IP s kokainom (20 mg / kg) ali s fiziološko raztopino na dan 7 dni; 24 h po zadnji injekciji, lupina in jedro NAc so bili mikrosekcionirani (Slika 1A) in bliskovito zamrznjeno. Beljakovine v teh vzorcih smo nato količinsko opredelili s pomočjo iTRAQ. Vsi štirje CaMKII izoformi so po zdravljenju s kokainom pokazali velik porast izražanja, ki je bil specifičen za lupino NAc v primerjavi z jedrom. Več beljakovinskih fosfataz, vključno s katalitičnimi in regulativnimi podenotami PP1 in PP2A, ki so bile prej povezane z različnimi substrati CaMKII v drugih sistemih (Colbran, 2004), sledil je podobnemu vzorcu. Te ugotovitve so prinesle nove, nepristranske dokaze, da je signalna pot CaMKII vidno urejena s kokainom v NAc na poseben način.

Da bi količinsko potrdili to ugotovitev, smo podgane obravnavali kot zgoraj s kokainom (v različnih odmerkih) ali s fiziološko raztopino in izmerili lokomotorne odzive na odmerek kokaina (5 mg / kg) ali fiziološke raztopine. Ponavljajoča izpostavljenost kokainu 10 mg / kg je povzročila značilni vzorec preobčutljivosti lokomotorja (Slika 1B). Nadaljnje študije s tem režimom odmerjanja so z uporabo Western blottinga pokazale, da ponavljajoči kokain selektivno inducira CaMKIIα v lupini NAc 24 hr po končni injekciji kokaina (Fig 1C in D; p = 0.0019; F = 7.943; df = 29). Poleg tega se je fosforilacija kanonične CaMKII substrata Ser831 podenote GluA1 receptorja AMPA znatno povečala v lupini NAc in ne jedru (p = 0.0261; F = 4.208; df = 28), medtem ko je CaMKIIα Thr286 avtofosforilacija imela močan butosforilacijo pomemben trend le do indukcije v lupini (Slika 1D). Več drugih receptorjev za glutamat ni prizadeto. V nasprotju s temi ukrepi CaMKII so isti vzorci tkiv pokazali indukcijo ΔFosB v obeh lupinah (p = 0.0260; F = 4.189; df = 29) in jedru (p = 0.0350; F = 3.807; df = 29) NAc. (Fig 1C in D), skladno s prejšnjimi ugotovitvami (Perrotti et al., 2008).

Ker je več predhodnih raziskav regulacije kokaina z receptorji AMPA živali analiziralo po ~ 14 dneh odtegnitve kroničnega kokaina (glej razpravo), smo v tem času te biokemijske analize ponovili. Ugotovili smo, da 14 dni po končni injekciji kokaina ΔFosB ostane zvišan v NAc (p = 0.0288; F = 4.258; df = 22), medtem ko niti CaMKII niti fosforilacija GluA1 Ser831 ostaneta povečana (Slika 1E). Vendar pa je 1 h po enem samem odmerku kokaina 10 mg / kg, ravni skupnega CaMKII (p = 0.0330; F = 3.947; df = 26) in GluA1 Ser831 (p = 0.0213; F = 4.509; df = 27) fosforilacija je povišana do stopnje, podobne stopnji, ugotovljeni po začetni kronični izpostavljenosti kokainu (Slika 1E). Ti podatki kažejo, da se nevroni lupine NAc polnijo za indukcijo CaMKII v daljšem obdobju abstinence, morda z neposrednim polnjenjem promotorja gena CaMKII (glejte razpravo). Poleg tega dejstvo, da je indukcija ΔFosB bolj obstojna od indukcije CaMKII, kaže na obstoj dodatnih mehanizmov, ki temeljijo na kromatinu ali kako drugače, ki sprožijo "zaviranje" za regulacijo CaMKII, kot je zajeto v razpravi.

Za nadaljnjo krepitev teh opazovanj smo raziskovali modele samoupravljanja s kokainom, ki vključujejo voljni vnos drog. Odrasli moški podgane so imeli dostop do kokaina kratek ali dolg; kot je bilo pričakovano (Ahmed in Koob, 1998), le daljši pogoji dostopa so privedli do vse večjega dajanja zdravila (Slika 2A). ΔFosB se je v večjem obsegu sprožil dolgo vs kratek dostop do kokaina v obeh lupinah NAc (p = 0.0011; F = 11.12; df = 17) in jedru (p = 0.0004; F = 13.86; df = 17). V nasprotju s tem je CaMKIIα povzročil v lupini NAc le dolg dostop do kokaina (Fig 2B in C; p = 0.0236; F = 4.957; df = 16). Zanimivo je primerjati povprečni dnevni vnos kokaina pri živalih s kratkim dostopom (~ 12 mg / kg IV), živali z dolgim ​​dostopom (~ 70 mg / kg IV) in živali, ki jih izvajajo eksperimentatorji (10 mg / kg), in vprašajte se, zakaj slednji povzroča močno indukcijo ΔFosB in CaMKII, medtem ko kratek dostop ne. To odstopanje je verjetno posledica razlik v najvišji ravni kokaina (kokain, ki ga izvajajo eksperimentatorji, dajemo kot en sam bolus IP, medtem ko se kokain, ki se daje sam, daje v več odmerkih IV) ali razlike v dolžini izpostavljenosti drogam (7 dni za eksperimentatorja dajanje, dnevi 19 za samostojno dajanje).

Kljub obsežni literaturi o ΔFosB in CaMKII o delovanju kokaina, nobenih študij teh beljakovin pri uporabnikih človeškega kokaina ni. Tukaj predstavljamo prve dokaze, da se ravni ΔFosB (p = 0.0316; t = 1.921; df = 34) in CaMKII (p = 0.0444; t = 1.755; df = 32) zvišajo pri NAc ljudi, odvisnih od kokaina (Slika 2D, Tabela 1). Ti podatki kažejo, da je naša preiskava indukcije ΔFosB in CaMKII s kokainom pri glodavcih NAc klinično pomembna za človeško odvisnost od kokaina.

Tabela 1

Karakterizacija vzorcev odvisnikov od človeka s kokainom in izravnana kontrolna skupina

ΔFosB ureja prepisovanje CaMKII selektivno v MSN-jih tipa D1 tipa NAc Shell

Ugotovitev, da sta tako CaMKII kot ΔFosB regulirana s kokainom v glodavcu NAc, je pokazala, ali ΔFosB lahko uravnava transkripcijo gena CaMKII. Pred tem smo CaMKIIα kot možno tarčo za ΔFosB poročali v nepristranski analizi mikroarray NAc (McClung in Nestler, 2003), vendar ta ugotovitev v tej študiji ni bila dodatno potrjena. Najprej smo uporabili kvantitativni ChIP (qChIP — ChIP, ki mu sledi kvantitativni PCR), da smo ugotovili, ali se ΔFosB veže na promotor gena CaMKIIα pri NAc odraslih moških podgan in presenetljivo smo ugotovili, da se ta vezava s kronično uporabo kokaina v lupini znatno poveča ( p = 0.0133; t = 2.901; df = 12), ne pa jedro, podregija (Slika 3A). Za nadaljnje razumevanje mehanizmov, povezanih s to razliko v specifični podregiji za vezavo ΔFosB na promotorja CaMKIIα, smo uporabili qChIP za karakterizacijo stanja histonskih sprememb v tej genomski regiji. Predhodne študije so pokazale kokainsko indukcijo acetilacije H3 na promotorju CaMKIIa v skupnem mišjem NAc (Wang et al., 2010). V nasprotju s tem smo ugotovili, da kokain selektivno zmanjšuje acetilacijo H3 na promotorju CaMKIIa v jedru NAc (Slika 3B; p = 0.0213; t = 2.726; df = 10), brez sprememb na lupini, kar je skladno s subregijsko specifičnimi spremembami kromatina, ki presegajo vezavo ΔFosB. qChIP za represivno znamko, dimetilirani H3 lizin 9 (H3K9me2), je razkril trende za zmanjšanje tako podregij lupine kot jedra (Slika 3C).

Za določitev, ali ΔFosB uravnava prepisovanje CaMKIIα vivo, smo uporabili dve bitransgeni mišičini liniji, ki v D1-ju inducirano prekomerno izražajo ΔFosB vs MSN tipa D2 na način, ki ga nadzira uporaba doksiciklina v pitni vodi (Chen et al., 1998; Kelz et al., 1999; Werme et al., 2002). Pri odraslih samcih, ki so prekomerno izražali ΔFosB samo v MSN-jih tipa D1, so se občutno zvišale koncentracije mRNA CaMKIIα v NAc (p = 0.0337; t = 1.996; df = 13), učinek, ki ga miši niso opazile pri pretiranem izražanju ΔFosB pretežno na D2-tipu (MSXsums-tip)Slika 3D). Povečanje mRNA CaMKIIa, ki jo povzroči izražanje ΔFosB v MSN-jih tipa D1, je spremljalo sočasno povečanje proteina CaMKIIα v lupini NAc (p = 0.0030; t = 3.578; df = 14) in jedru (p = 0.0392; t = 2.275; df = 14; Figs 3E in F). Ti podatki kažejo, da je ΔFosB sposoben poganjati ekspresijo genov CaMKIIα v MSN-jih tipa D1 v obeh podregijah, čeprav Slika 3B kaže, da spremembe kokaina, posredovane s kromatinom na promotorju CaMKIIa (npr. zmanjšana acetilacija), preprečujejo ΔFosB ureguliranje CaMKII v jedrnem podregiji po kokainu.

Ker so naši podatki o transgenih miših pokazali, da je indukcija ΔFosB ekspresije gena CaMKII specifična za MSN tipa D1 v NAc, smo nato želeli ugotoviti, ali od kokaina odvisna povišana regulacija CaMKII zahteva aktivacijo dopaminskega receptorja D1. Odraslim samcem podgan so dajali kronični kokain ali fiziološko raztopino kot prej, a 30 minut pred vsako injekcijo so podgane v skupini, ki je prejemala kokain, prejeli IP injekcijo fiziološke raztopine, antagonista D1 SCH 23390 (0.5 mg / kg) ali antagonista D2 receptorja etikloprid (0.5 mg / kg). Živali so analizirali 24 ur po zadnji injekciji kokaina. Western blot je razkril, da je antagonist D1, ne pa tudi D2, popolnoma blokiral povečanje ΔFosB, ki ga povzroča kokain (p <0.0001; F = 18.96; df = 18), kot smo že poročali (Nye et al., 1995), kot tudi v CaMKII (p = 0.0005; F = 10.99; df = 18; Fig 3G in H). Ti podatki podpirajo hipotezo, da kokain povzroči ΔFosB-posredovano povečanje izražanja genov CaMKII, zlasti v MSN-ju tipa NAc tipa D1. V prihodnjih študijah bi bilo pomembno neposredno dokazati učinek kokaina na ekspresijo CaMKII v tej možganski regiji.

ΔFosB je tako potreben in zadosten za indukcijo kokaina CaMKII v školjki NAc

Za dopolnitev uporabe bitransgenih miši smo nadalje preučili vlogo ΔFosB pri posredovanju kokainske indukcije CaMKIIα z uporabo virusno posredovanega prenosa genov pri podganah. Dvostransko vbrizgamo adeno-povezane virusne delce (AAV) v lupino NAc odraslih samcev podgan (kjer je lupina lahko selektivno usmerjena), da prekomerno pritisnemo ΔFosB plus samo GFP ali GFP. Živalim so nato v enkratni IP injicirali kokain 10 mg / kg. Pri živalih, ki so prekomerno izražale ΔFosB / GFP, je bil povečan lokomotorni odziv v primerjavi z živalmi, ki prekomerno izražajo GFP (Slika 4A). 24 h po enkratni injekciji kokaina je bilo iz teh živali izločeno tkivo NAc pozitivno NAc z disekcijo pod fluorescentnim svetlobnim virom. Western blotting tega tkiva (Fig 4B in C) je pokazala močno prekomerno izražanje ΔFosB kot tudi znatno povečanje skupnega proteina CaMKIIα v primerjavi z živalmi z GFP (p = 0.0070; t = 2.894; df = 30), podobno kot indukcija, ki jo opažamo pri kronični uporabi kokaina. Poleg tega se je s prekomerno ekspresijo ΔFosB (p = 286; t = 0.0330; df = 2.243) povečala avtomatskoforilacija CaMKIIα pri Thr28 (kar kaže na fosforilacijo substrata CaMKII, Ser831 iz GluA1 (pX0.0540); 2.012; df = 28), znova oponaša delovanje kroničnega kokaina (Fig 1C in D). TČe dobimo skupaj, ti podatki zagotavljajo nadaljnje dokaze, da je izražanje ΔFosB v lupini NAc zadostno za lokomotorno preobčutljivost na kokain ter za indukcijo in aktivacijo CaMKII v tej podregiji.

Podoben pristop smo ugotovili, ali je ΔFosB potreben tudi za induciranje kokaina CaMKIIα v lupini NAc. AAV smo uporabili za prekomerno izražanje okrnjenega proteina JunD, imenovanega ΔJunD, ki je negativen regulator transkripcijske aktivacije ΔFosB (Winstanley et al., 2007) in samo GFP ali GFP. Dva tedna kasneje, ko je ekspresija transgena največja, so živali prejemale kokain (10 mg / kg) ali fiziološko raztopino dnevno 7 dni in testirale lokomotorne odzive na izziv na kokain (5 mg / kg) 24 hr po zadnji kronični injekciji (Slika 4D). ΔJunD prekomerna ekspresija je preprečila lokomotorno preobčutljivost na kokain in tudi preprečila indukcijo in aktivacijo CaMKIIα v lupini NAc (Fig 4E in F; p = 0.0437; F = 2.997; skupno df = 38), kar kaže, da je transkripcijska aktivnost ΔFosB potrebna v indukciji CaMKIIa, posredovane s kokainom, v tej podregiji. Zanimivo je, da smo ugotovili, da je ΔJunD zmanjšal raven ΔFosB tako pod raztopino fiziološke raztopine kot s kokainom (p = 0.0004; F = 8.110; df = 35), kar je povečalo novo možnost, da je ΔFosB odvisen od aktivnosti AP-1 za lastne ravni izražanja.

CaMKII fosforilira ΔFosB pri Ser27

Uporaba in vitro preskusi proteina kinaze smo ugotovili, da je prečiščen ΔFosB močan substrat za CaMKIIα. Inkubacija njegovega₆-ΔFosB s CaMKIIα in ATP je povzročil premik elektroforetske gibljivosti ΔFosB navzgor (Slika 5A); več dobljenih pasov je nakazovalo več mest fosforilacije. Podobno in vitro kinazni testi z uporabo [γ-³²P] ATP je pokazal vključitev radioaktivno označenega fosfata v premaknjene pasove ΔFosB (Slika 5B), ki prikazuje direktno fosforilacijo proteina. Generirali smo fosfo specifično protitelo proti prej označenemu Ser27 ΔFosB (Ulery et al., 2006). Medtem ko to protitelo ne odda signala proti možganskim ekstraktom, ki vsebujejo Ser27-fosforiliran ΔFosB (podatki niso prikazani), smo uspeli zaznati fosforilacijo Ser27 v in vitro kinazni test z uporabo CaMKII (Slika 5B). Kinetične analize fosforilacije CaMKII ΔFosB kažejo, da je močan substrat za kinazo (Slika 5C), z navidezno K_M od 5.7 ± 2.0µM in K_CAT od 2.3 ± 0.3min^-1. Ti rezultati so primerljivi z mnogimi dobro opisanimi vivo substrati CaMKII (Colbran in Brown, 2004). Poleg tega smo ugotovili, da CaMKII fosforilira ΔFosB s stehiometrijo 2.27 ± 0.07 mol / mol (Slika 5D), kar kaže na to, da so znotraj His vsaj tri mesta fosforilacije CaMKII₆-ΔFosB protein, v dogovoru z Slika 5A.

Za raziskovanje posameznih mest fosforilacije smo uporabili analize MS iz vzorcev in vitro kinazni testi. Slika 5E prikazuje ΔFosB fosforilacijo na prej označenem Ser27 in na več dodatnih mestih (podatki niso prikazani). Glede na predhodno funkcionalno karakterizacijo Ser27 smo se osredotočili na to mesto z ustvarjanjem označenih sintetičnih peptidov, ki posnemajo fosfo- in nefosfo-stanja Ser27, nato pa smo uporabili znane količine teh peptidov kot standard v MRM analizah ΔFosB pred in po in vitro fosforilacija s CaMKII. Kasnejše določanje (Slika 5F) potrjuje, da je Ser27 močan substrat za CaMKII. Ti rezultati kažejo, da je Ser27 med več fosforiliranimi ostanki znotraj ΔFosB posebno učinkovit substrat za CaMKII.

CaMKII posreduje kopičenje kokaina ΔFosB v lupini NAc

Ker lahko CaMKII fosforilira ΔFosB in vitro na mestu, ki močno poveča njegovo stabilnost in vitro in vivo (Ulery et al., 2006; Ulery-Reynolds et al., 2009) smo ugotovili, ali aktivnost CaMKII nadzira ravni ΔFosB v NAc vivo. Za reševanje tega vprašanja smo najprej uporabili mišičino linijo, ki je prekomerno izrazila kalcijev neodvisen mutant CaMKIIα (T286D) v več možganskih regijah, vključno z NAc (Mayford in sod., 1996; Kourrich et al., 2012). Odraslim mutantom mutantom in divjim vrstam injicirali smo 20 mg / kg kokaina ali fiziološke raztopine enkrat na dan 14 dni, nato pa živali analizirali dan po končni injekciji. Ugotovili smo, da se je bazalna raven ΔFosB pri mutiranih živalih zvišala v lupini NAc (p = 0.0001; F = 9.207; df = 37), ne pa v jedru (Fig 5G in H). Presenetljivo je, da je bila od kokaina odvisna indukcija ΔFosB pri mutantnih živalih v lupini in jedru blokirana, kar kaže na to, da čeprav CaMKII lahko neposredno uravnava stabilnost ΔFosB v lupini NAc, lahko leži tudi pred ΔFosB v potkah, aktiviranih s kokainom, v obeh podregijih NAc .

Za strukturno in vedenjsko plastičnost je potrebna aktivnost CaMKII

Kokainska indukcija dendritičnih bodic na NAC MSN je ena najbolje uveljavljenih prilagoditev zaradi drog v tej možganski regiji in takšna indukcija hrbtenice je bila povezana s senzibiliziranimi vedenjskimi odzivi na to zdravilo (Robinson in Kolb, 2004; Russo et al., 2010) in poročali, da so izbirni za MSN-je tipa D1 (Lee et al., 2006). Nedavno smo dokazali, da je indukcija kokaina dendritičnih bodic v NAc odvisna od ΔFosB in njegovega transkripcijskega programa na nižji stopnji (Maze et al., 2010). Čeprav obstaja obsežna literatura o vpletenosti CaMKII v morfologijo in indukcijo dendritične hrbtenice v drugih možganskih regijah in eksperimentalnih sistemih (Jourdain in sod., 2003; Penzes et al., 2008; Okamoto et al., 2009), njegova vloga pri tvorbi hrbtenice NAc MSN ni bila raziskana. Zato smo ugotovili, ali je potrebna aktivnost CaMKII za indukciju z ΔFosB indukcijo dendritičnih bodic MSN z uporabo prekomerne ekspresije, posredovane s HSV, peptida zaviralca CaMKII AC3I, spojenega z GFP, konstrukta, ki je bil prej prikazan, da zavira aktivnost CaMKII vivo (Zhang et al., 2005; Klug in sod., 2012). Virusna prekomerna ekspresija ΔFosB v lupini NAc odraslih miši je povzročila znatno povečanje dendritične gostote hrbtenice MSN (p <0.0001; F = 8.558; df = 59; Fig 6A in B) kot je bilo že poročano (Maze et al., 2010), ta porast pa je vplival predvsem na tanke (p = 0.0027; F = 5.319; df = 59) in trmaste (p = 0.0378; F = 2.988; df = 59) vrste hrbtenice (obe sta mislili, da sta nezreli trni) (Slika 6C – E). Na zrelejših gobah v obliki gob ni bilo opaziti učinka. Ko pa smo sočasno izrazili GFP-AC3I, je bila indukcija ΔFosB bodic popolnoma razveljavljena (Slika 6A – E), kar kaže, da je za indukcijo ΔFosB dendritičnih bodic v lupini NAc potrebna aktivnost CaMKII.

Nato smo uporabili ista virusna orodja, da smo ugotovili, ali je za učinke ΔFosB na vedenjsko občutljivost na kokain potrebna aktivnost CaMKII. 72 h po vbrizganju virusa v lupino NAc, so živali dobile eno injekcijo kokaina 5 mg / kg in zabeležile so njihovo lokomotorno aktivnost. Kot je bilo že razvidno z večjo ekspresivno vrednostjo AAV ΔFosB (Slika 4A), HSV-posredovana prekomerna ekspresija ΔFosB je povečala lokomotorno občutljivost na kokain (p = 0.0002; F = 8.823; df = 37; Slika 6F). Tako kot pri indukciji dendritičnih bodic je tudi zaviranje aktivnosti CaMKII s sooblikovanjem GFP-AC3I popolnoma blokiralo povečanje občutljivosti na kokain, ki ga povzroča ΔFosB, kar kaže, da je potrebna aktivnost CaMKII za spremembe, ki jih povzročajo ΔFosB, pri vplivih kokaina na vedenje.

Pojdi na:

Razprava

V pričujoči študiji je predstavljen nov mehanizem prenosa, kjer kokain inducira ΔFosB v NAc, ki selektivno nadzira transkripcijo gena CaMKIIα v lupini NAc. CaMKIIα nato fosforilira in stabilizira ΔFosB, kar vodi do večjega kopičenja ΔFosB in do nadaljnje indukcije CaMKIIα (Slika 6G). Kohezijska raven obeh beljakovin med kronično izpostavitvijo kokainu nato bistveno prispeva k občutljivemu vedenjskemu odzivu na drogo. To je še posebej privlačna hipoteza, saj je bilo za ΔFosB in CaMKII že predhodno dokazano, da sta potrebna za povečan vedenjski odziv na kokain (Pierce et al., 1998; Peakman et al., 2003) in to ugotovitev za ΔFosB ponovimo v lupini NAc, posebej z uporabo virusnega pristopa (Figs 4 in In66).

Čeprav transgena prekomerna ekspresija ΔFosB v MSN-jih tipa D1 lahko povzroči indukcijo CaMKII tako v lupini NAc kot v jedru živali, ki ne uživajo kokaina, kopičenje endogenega ΔFosB, ki se pojavlja v obeh podregijah, poganja indukcijo CaMKII posebej v lupini NAc . Ta razlika bi se lahko nanašala na višje ravni ΔFosB, ki jih povzroča naš bitransgeni model, vendar pa lahko odraža tudi sposobnost kokaina, da različno spreminja promotor CaMKIIα v lupini vs osrednja MSN bodisi spodbujajo vezavo ΔFosB v prvem ali pa ga izključijo v drugem podregiji. Pravzaprav naši podatki o ChIP, ki razkrivajo kokainsko posredovano deacetilacijo histonov samo v promotorju gena CaMKIIα v jedru NAc, podpirajo morebitno vključitev kromatinskega mehanizma. V skladu s to hipotezo je prekomerna ekspresija ΔFosB v MSN-jih tipa D1 lahko povzročila indukcijo CaMKIIα v jedru NAc, če ni bilo kokaina (Slika 3F), kar kaže, da obstajajo aktivne spremembe promotorja CaMKIIα, ki preprečujejo to indukcijo med kronično izpostavljenostjo kokainu. Urejanje kromatinske pokrajine na promotorju CaMKII lahko tudi razloži, zakaj CaMKII povzroča izzivni odmerek kokaina v lupini NAc kroničnih podgan, ki odstranjujejo kokain (Slika 1E), vendar ne za živali, ki niso na drog (Slika 1D). To lahko predstavlja epigenetski učinek primFosB primFingB (Robison in Nestler, 2011) in je tako lahko en molekularni mehanizem inkubacije hrepenenja po kokainu (Pickens in sod., 2011). Da pa bi bila ta sprememba kromatina vzročno povezana z inkubacijo hrepenenja, bi se morala sčasoma povečati. Zanimivo bo ugotoviti, ali je to tako, in preučiti, ali drugi geni po kokainu kažejo ΔFosB odvisno od podregije. Pomembno je tudi opozoriti, da zanka, ki jo opisujemo, ne vodi do nenehnega kopičenja CaMKII ali ΔFosB (Slika 1E); pomemben cilj prihodnjih študij je razkritje molekularne „zavore“, ki je odgovorna za to.

Znane funkcije ΔFosB in CaMKII v več eksperimentalnih sistemih in možganskih regijah se zbližujejo na številnih ravneh (Slika 6F). Obe molekuli sta tesno povezani z rastjo dendritične hrbtenice: CaMKII sodeluje s citoskeletom iz aktina (Okamoto et al., 2009), uravnava velikost hrbtenice (Matsuzaki et al., 2004) in je potrebna in zadostna za povečanje filopodije in sinapse v kulturah hipokamponskih organotipskih rezin, ki jih povzroča plastičnost (Jourdain in sod., 2003), while ΔFosB je potreben in zadosten za nastanek dendritične hrbtenice, ki jo povzroča kokain v MSN z NAc (Maze et al., 2010). Poleg tega sta bili obe molekuli povezani z uravnavanjem receptorjev za glutamat AMPA. CaMKII ne ureja skupnih ravni podenot receptorjev AMPA, ampak poganja vstavljanje AMPA receptorjev v sinapse in poveča prevodnost AMPA kanalov s fosforiliranjem GluA1 na Ser831 v hipokampalnih piramidalnih nevronih v kulturi in vivo (pregledano v (Malinow in Malenka, 2002; Colbran in Brown, 2004)). Tako povečana trgovina z zdravilom GluA1 v sinago je bila vpletena tudi v kronično delovanje kokaina (Boudreau in Wolf, 2005). Poleg tega se vedenjski odzivi na aktivacijo AMPA receptorjev v NAc izboljšajo s prekomerno ekspresijo CaMKIIα na način D1 dopaminski receptor (Singer et al., 2010). Pokazalo se je, da dolgotrajna D1 specifična prekomerna ekspresija ΔFosB povzroča prepisovanje GluA2 v NAc (Kelz et al., 1999), ki duši odzive AMPA, posredovane s pomočjo GluA1, medtem ko tukaj prikazujemo, da kratkotrajna prekomerna ekspresija ΔFosB - kot tudi kratkotrajna izpostavljenost kokainu - na to podenoto nimajo vpliva (Slika 1). Kljub temu smo pred kratkim ugotovili, da kratkotrajna prekomerna ekspresija ΔFosB kljub temu zmanjšuje odzive AMPA v MSN-jih tipa D1 v NAc (Grueter et al., 2013). Ti podatki kažejo na časovno različne mehanizme, ki bi lahko pomenili časovno odvisen niz nevroadaptacij na kokain, ki so podlaga za različne vidike napredovanja odvisnosti, ki še niso dobro razumljeni. Na vedenjski ravni sta za lokomotorno preobčutljivost na kokain potrebna (tako glej zgoraj), tako CaMKII kot ΔFosB, oba pa sta potrebna za trajno samokokacijo kokaina pri glodalcih (Colby et al., 2003; Wang et al., 2010), kar kaže na to, da sta oba proteina pomembna tako za kratkoročno kot dolgoročno vedenjsko prilagoditev izpostavljenosti drogam, čeprav prek delno različnih osnovnih mehanizmov. Domnevno ΔFosB in CaMKII urejata tako zapletene vedenjske prilagoditve s spremembami sinaptične funkcije NAc, čeprav je potrebno veliko nadaljnjega dela za neposredno povezavo sinaptičnih pojavov s spremembo vedenja.

Holoencim CaMKII hkrati deluje z različnimi proteini, povezanimi s sinapsijo (Robison in sod., 2005), za katere se domneva, da uravnavajo ciljanje na postsinaptično gostoto (PSD), pojav, za katerega se zdi, da je pomemben za sinaptično plastičnost. Predvsem se je pokazalo, da je medsebojno delovanje CaMKII z GluN2B podenoto receptorja glutamata tipa NMDA urejalo sinaptično plastičnost in učenje (Halt in sod., 2012). Medtem ko peptid AC3I posnema avtoinhibicijsko domeno CaMKII in tako zavira katalitsko aktivnost encimov, blokira tudi več interakcij beljakovin in beljakovin (Strack in sod., 2000; Robison in sod., 2005). Tako se lahko vedenjski in morfološki učinki HSV-GFP-AC3I poročajo tukaj z zmanjšano fosforilacijo ciljno beljakovin CaMKII, spremembami ciljanja na CaMKII ali spremembo predlagane strukturne vloge CaMKII pri sinapsah (Lisman in sod., 2002).

Omejitev predlagane zanke ΔFosB-CaMKII na lupino NAc je posebna pozornost, saj je nedavno delo pokazalo več fizioloških razlik med lupino NAc in jedrom kot odziv na dajanje kokaina, kar potrjujejo naši nepristranski podatki iTRAQ (Tabela S1) . MSN-ji v lupini NAc kažejo na upad zmogljivosti streljanja po kroničnem kokainu, ki se zadrži tedne, medtem ko osnovni MSN-ji istih živali kažejo prehodno povečanje strelske zmogljivosti (dan 1 – 3), ki se vrne na bazne ravni v 2 tednih (Kourrich in Thomas, 2009). Poleg tega se v lupini NAc različno uravnavajo številni sinaptični proteini vs jedro živali, ki so izpostavljene kroničnemu kokainu, vključno z GluA2 (Knackstedt in sod., 2010). Ker kronični amfetamin inducira CaMKIIα posebej v lupini NAc (Loweth et al., 2010), ne preseneča, da ugotovimo podoben učinek s kokainom. Ker pa ΔFosB v krožnici NAc in jedru povzroča kronični kokain (Perrotti et al., 2008), in ker pokažemo, da je indukcija CaMKIIα v lupini odvisna od ΔFosB, naše ugotovitve zagotavljajo nove dokaze za različne mehanizme transkripcije na CaMKIIα promotorju med tema dvema podregijama, ki sta odgovorna za selektivno indukcijo CaMKIIα v lupini.

Veliko nedavnega dela se je osredotočilo na določitev razlik med NAc MSN tipa D1 in D2. Čeprav sta receptorja D1 in D2 vključena v koristne učinke kokaina (Self, 2010), nedavno delo kaže, da optogenetska aktivacija MSN-jev tipa D1 povečuje vedenjske odzive na kokain, medtem ko ima MSN aktivacija tipa D2 nasproten učinek (Lobo et al., 2010). V skladu s temi ugotovitvami miši izločanje D1-receptorjev primanjkljajo pri pridobivanju kokaina (Caine et al., 2007), medtem ko izločitve D2 niso (Caine et al., 2002). Aplikacija agonistov D1 neposredno v NAc sproži vedenje, ki išče kokain, v paradigmih o ponovni vzpostavitvi (Self, 2010). Zanimivo je, da ta učinek zahteva povečanje aktivnosti CaMKII v lupini NAc, odvisno od receptorja D1, ne pa tudi v jedru (Anderson et al., 2008), rezultat, ki se lepo poveže z zanko D1 in zanko ΔFosB-CaMKII, ki je specifična za lupino, tukaj.

Prej smo poročali, da lahko Ser27 v ΔFosB fosforiliramo s kazein kinazo-2 (Ulery et al., 2006), vendar tu ugotavljamo, da CaMKII fosforilira ΔFosB na tem in drugih mestih z veliko večjo kinetiko in stehiometrijo in lahko posnema višji navidezni M_r opaženo za ΔFosB (Slika 5A) z izpostavljenostjo kokainu vivo (Nestler, 2008). Že vemo, da fosforilacija Ser27 poveča stabilnost ΔFosB in aktivnost transkripcije (Ulery et al., 2006; Ulery in Nestler, 2007; Ulery-Reynolds et al., 2009). Prihodnje delo se bo zdaj osredotočilo na identifikacijo in funkcionalne posledice novih mest fosforilacije ΔFosB, ki jih je pokazala ta študija.

Tu opisana zanka za premikanje naprej ponuja nov verjeten mehanizem, s katerim večkratno dajanje kokaina poganja progresivne nepravilnosti v NAc. Kot taka lahko ta biokemična pot predstavlja pomemben cilj za prihodnje terapevtsko posredovanje pri zasvojenih motnjah. Ker je CaMKII vseprisoten in je potreben za številne bazalne nevronske in vedenjske funkcije, se je neposrednemu uživanju zaviralcev CaMKII izognilo kot zdravljenje odvisnosti. Naši podatki kažejo, da bi lahko bolj subtilno ciljanje mehanizma indukcije CaMKII, ki je značilno za posamezni tip celice in podregijo možganskega nagrajevalnega vezja, zagotovilo terapevtski cilj, ki bi se izognil zapletom sistemske inhibicije CaMKII.

Pojdi na:

Priznanja

To delo so podprle štipendije Nacionalnega inštituta za zlorabo drog (EJN), NIDA-Yale proteomskega centra DA018343 (AJR in EJN) in Hartwell Foundation (AJR). Avtorja se želita zahvaliti Gabbyju Rundenku za velikodušno darilo očiščenega ΔFosB in Rogerju Colbranu za velikodušno darilo očiščenega CaMKIIα.

Pojdi na:

Reference

1. Ahmed SH, Koob GF. Prehod z zmernega na pretiran vnos droge: sprememba v hedonični nastavljeni vrednosti. Znanost. 1998, 282: 298 – 300. [PubMed]
2. Anderson SM, znani KR, Sadri-Vakili G, Kumaresan V, Schmidt HD, Bass CE, Terwilliger EF, Cha JH, Pierce RC. CaMKII: biokemični most, ki povezuje sisteme dopamina in glutamata pri iskanju kokaina. Nat Neurosci. 2008; 11: 344 – 353. [PubMed]
3. Boudreau AC, Wolf ME. Vedenjska preobčutljivost za kokain je povezana s povečano površinsko ekspresijo receptorjev AMPA v jedru jedra. J Nevrosci. 2005; 25: 9144 – 9151. [PubMed]
4. Brickey DA, Colbran RJ, Fong YL, Soderling TR. Izražanje in karakterizacija alfa podenote Ca2 + / kalmodulinsko odvisne proteinske kinaze II z uporabo ekspresionega sistema bakulovirus. Biochem Biophys Res Commun. 1990; 173: 578 – 584. [PubMed]
5. Caine SB, Negus SS, Mello NK, Patel S, Bristow L, Kulagowski J, Vallone D, Saiardi A, Borrelli E. Vloga receptorjev, ki so podobni dopaminu D2, pri samodejni uporabi kokaina: študije z mutantnimi mišmi D2 receptorja in novimi receptorji D2 antagonisti. J Nevrosci. 2002; 22: 2977 – 2988. [PubMed]
6. Caine SB, Thomsen M, Gabriel KI, Berkowitz JS, Gold LH, Koob GF, Tonegawa S, Zhang J, Xu M. Pomanjkanje samo-dajanja kokaina pri miših, ki izvirajo iz receptorja dopamina D1. J Nevrosci. 2007; 27: 13140 – 13150. [PMC brez članka] [PubMed]
7. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, Nestler EJ. Proteasomsko odvisni in neodvisni mehanizmi za destabilizacijo FosB: identifikacija degronskih domen FosB in posledice za stabilnost DeltaFosB. Eur J Neurosci. 2007, 25: 3009 – 3019. [PubMed]
8. Chen J, Kelz MB, Zeng G, Sakai N, Steffen C, Shockett PE, Picciotto MR, Duman RS, Nestler EJ. Transgene živali z inducibilno, usmerjeno ekspresijo gena v možganih. Mol Pharmacol. 1998; 54: 495 – 503. [PubMed]
9. Christoffel DJ, Golden SA, Dumitriu D, Robison AJ, Janssen WG, Ahn HF, Krishnan V, Reyes CM, Han MH, Ables JL, Eisch AJ, Dietz DM, Ferguson D, Neve RL, Greengard P, Kim Y, Morrison JH , Russo SJ. IkappaB kinaza uravnava sinaptično in vedenjsko plastičnost, ki jo povzroča družbeni poraz. J Nevrosci. 2011; 31: 314 – 321. [PMC brez članka] [PubMed]
10. Colbran RJ. Inaktivacija Ca2 + / kalmodulinsko odvisna protein kinaza II z bazalno avtofosforilacijo. J Biol Chem. 1993; 268: 7163 – 7170. [PubMed]
11. Colbran RJ. Proteinske fosfataze in sinaptična plastičnost, odvisna od kalcijev / kalmodulina, odvisna od proteinske kinaze II. J Nevrosci. 2004; 24: 8404 – 8409. [PubMed]
12. Colbran RJ, Brown AM. Od kalcija / kalmodulina odvisna protein kinaza II in sinaptična plastičnost. Curr mnenje Neurobiol. 2004; 14: 318 – 327. [PubMed]
13. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW. Steratalno specifična prekomerna ekspresija DeltaFosB-a povečuje spodbudo za kokain. J Neurosci. 2003, 23: 2488 – 2493. [PubMed]
14. Covington HE, 3rd, Maze I, LaPlant QC, Vialou VF, Ohnishi YN, Berton O, Fass DM, Renthal W, Rush AJ, 3rd, Wu EY, Ghose S, Krishnan V, Russo SJ, Tamminga C, Haggarty SJ, Nestler EJ. Antidepresivno delovanje zaviralcev histone deacetilaze. J Nevrosci. 2009; 29: 11451 – 11460. [PMC brez članka] [PubMed]
15. Davalos A, Fernandez-Hernando C, Sowa G, Derakhshan B, Lin MI, Lee JY, Zhao H, Luo R, Colangelo C, Sessa WC. Kvantitativna proteomika proteinov, ki jih urejata jamolin-1: karakterizacija polimeraze i in faktorja sproščanja transkripta / CAVIN-1 IN endotelijskih celic. Mol celična proteomika. 2010; 9: 2109 – 2124. [PMC brez članka] [PubMed]
16. Dumais A, Lesage AD, Alda M, Rouleau G, Dumont M, Chawky N, Roy M, Mann JJ, Benkelfat C, Turecki G. Dejavniki tveganja za zaključek samomorov v veliki depresiji: študija primera impulzivnega in agresivnega vedenja v kontroli primera moški. Am J Psihiatrija. 2005; 162: 2116 – 2124. [PubMed]
17. Grueter BA, Robison AJ, Neve RL, Nestler EJ, Malenka RC. ΔFosB različno modulira delovanje jedra in neposredne funkcije poti. Proc Natl Acad Sci ZDA. 2013 v tisku. [PMC brez članka] [PubMed]
18. Halt AR, Dallapiazza RF, Zhou Y, Stein IS, Qian H, Juntti S, Wojcik S, Brose N, Silva AJ, Hell JW. Med konsolidacijo pomnilnika je ključna vezava CaMKII na GluN2B. EMBO J. 2012; 31: 1203 – 1216. [PMC brez članka] [PubMed]
19. Hiroi N, Brown JR, Haile CN, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ. Mutirane miši FosB: izguba kronične kokainske indukcije proteinov, povezanih s Fosom, in povečana občutljivost na psihomotorične in koristne učinke kokaina. Proc Natl Acad Sci US A. 1997; 94: 10397–10402. [PMC brez članka] [PubMed]
20. Ito R, Robbins TW, Everitt BJ. Diferencialni nadzor nad vedenjem kokaina, ki ga povzroča jedro in lupina nucleus accumbens. Nat Neurosci. 2004, 7: 389 – 397. [PubMed]
21. Jorissen HJ, Ulery PG, Henry L, Gourneni S, Nestler EJ, Rudenko G. Dimerizacija in DNA-vezavne lastnosti transkripcijskega faktorja DeltaFosB. Biokemija. 2007; 46: 8360 – 8372. [PubMed]
22. Jourdain P, Fukunaga K, Muller D. S kalcijem / kalmodulinom odvisna proteinska kinaza II prispeva k rasti, odvisni od aktivnosti in nastanku hrbtenice. J Nevrosci. 2003; 23: 10645 – 10649. [PubMed]
23. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA, Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, Steffen C, Zhang YJ, Marotti L, Self DW, Tkatch T, Baranauskas G, Surmeier DJ, Neve RL, Duman RS, Picciotto MR, Nestler EJ. Izražanje transkripcijskega faktorja deltaFosB v možganih nadzoruje občutljivost na kokain. Narava. 1999, 401: 272 – 276. [PubMed]
24. Klug JR, Mathur BN, Kash TL, Wang HD, Matthews RT, Robison AJ, Anderson ME, Deutch AY, Lovinger DM, Colbran RJ, Winder DG. Genska inhibicija CaMKII v dorzalnih strijskih nevronih zmanjšuje funkcionalne ekscitatorne sinapse in povečuje notranjo vzdražljivost. PLOS One. 2012; 7: e45323. [PMC brez članka] [PubMed]
25. Knackstedt LA, Moussawi K, Lalumiere R, Schwendt M, Klugmann M, Kalivas PW. Trening izumiranja po samo-dajanju kokaina sproži glutamergično plastičnost, da zavira iskanje kokaina. J Nevrosci. 2010; 30: 7984 – 7992. [PMC brez članka] [PubMed]
26. Kourrich S, Thomas MJ. Podobni nevroni, nasprotne prilagoditve: izkušnja psihostimulantov različno spreminja lastnosti streljanja v jedru v primerjavi z lupino. J Nevrosci. 2009; 29: 12275 – 12283. [PMC brez članka] [PubMed]
27. Kourrich S, Klug JR, Mayford M, Thomas MJ. AMPAR-Neodvisen učinek Striatal alphaCaMKII Spodbuja občutljivost na kokain. J Nevrosci. 2012; 32: 6578 – 6586. [PMC brez članka] [PubMed]
28. LaPlant Q, Chakravarty S, Vialou V, Mukherjee S, Koo JW, Kalahasti G, Bradbury KR, Taylor SV, Maze I, Kumar A, Graham A, Birnbaum SG, Krishnan V, Truong HT, Neve RL, Nestler EJ, Russo SJ . Vloga jedrskega faktorja kappaB pri stresni preobčutljivosti zaradi jajčnikov pri ženskih miših. Biološka psihiatrija. 2009; 65: 874 – 880. [PMC brez članka] [PubMed]
29. Lee KW, Kim Y, Kim AM, Helmin K, Nairn AC, Greengard P. Nastanek dendritične hrbtenice, povzročen s kokainom, v D1 in D2-dopaminskih receptorskih srednjih živčnih nevronih v nucleus accumbens. Proc Natl Acad Sci US A. 2006, 103: 3399-3404. [PMC brez članka] [PubMed]
30. Lisman J, Schulman H, Cline H. Molekularna osnova CaMKII deluje v sinaptičnem in vedenjskem spominu. Nat Rev Neurosci. 2002; 3: 175 – 190. [PubMed]
31. Lobo MK, Covington HE, 3rd, Chaudhury D, Friedman AK, Sun H, Damez-Werno D, Dietz DM, Zaman S, Koo JW, Kennedy PJ, Mouzon E, Mogri M, Neve RL, Deisseroth K, Han MH, Nestler EJ. Za celice izguba signala BDNF posnema optogenetsko kontrolo nagrade kokaina. Znanost. 2010; 330: 385 – 390. [PMC brez članka] [PubMed]
32. Loweth JA, Baker LK, Guptaa T, Guillory AM, Vezina P. Inhibicija CaMKII v lupini jedra accumens zmanjšuje povečan vnos amfetamina pri senzibiliziranih podganah. Nevrosci Lett. 2008; 444: 157 – 160. [PMC brez članka] [PubMed]
33. Loweth JA, Singer BF, Baker LK, Wilke G, Inamine H, Bubula N, Alexander JK, Carlezon WA, Jr, Neve RL, Vezina P. Prehodna prekomerna ekspresija alfa-Ca2 + / kalmodulinsko odvisne proteinske kinaze II v lupini nukleusa acumbens krepi vedenjsko odzivanje na amfetamin. J Nevrosci. 2010; 30: 939 – 949. [PMC brez članka] [PubMed]
34. Malinow R, Malenka RC. Trgovanje z receptorji AMPA in sinaptična plastičnost. Annu Rev Neurosci. 2002; 25: 103 – 126. [PubMed]
35. Matsuzaki M, Honkura N, Ellis-Davies GC, Kasai H. Strukturne osnove dolgoročnega potenciranja v posameznih dendritičnih hrbtenicah. Narava. 2004, 429: 761 – 766. [PubMed]
36. Mayford M, Bach ME, Huang YY, Wang L, Hawkins RD, Kandel ER. Nadzor tvorbe spomina s pomočjo reguliranega izražanja transgene CaMKII. Znanost. 1996; 274: 1678 – 1683. [PubMed]
37. Maze I, Covington HE, 3rd, Dietz DM, LaPlant Q, Renthal W, Russo SJ, Mehanik M, Mouzon E, Neve RL, Haggarty SJ, Ren Y, Sampath SC, Hurd YL, Greengard P, Tarakhovsky A, Schhefer Y, Nestler EJ. Bistvena vloga histonske metiltransferaze G9a pri plastičnosti, ki jo povzroča kokain. Znanost. 2010, 327: 213 – 216. [PMC brez članka] [PubMed]
38. McClung CA, Nestler EJ. Regulacija izražanja genov in kokainske nagrade s strani CREB in DeltaFosB. Nat Neurosci. 2003, 6: 1208 – 1215. [PubMed]
39. Nestler EJ. Pregled. Transkripcijski mehanizmi odvisnosti: vloga DeltaFosB. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2008, 363: 3245 – 3255. [PMC brez članka] [PubMed]
40. Nye HE, Hope BT, Kelz MB, Iadarola M, Nestler EJ. Farmakološke študije regulacije kronične indukcije antigena, povezane s FOS, s kokainom v striatumu in nucleus accumbens. J Pharmacol Exp Ther. 1995, 275: 1671 – 1680. [PubMed]
41. Okamoto K, Bosch M, Hayashi Y. Vloge CaMKII in F-aktina v strukturni plastičnosti dendritičnih bodic: potencialna molekularna identiteta sinaptične oznake? Fiziologija (Bethesda) 2009; 24: 357 – 366. [PubMed]
42. Olausson P, Jentsch JD, Tronson N, Neve RL, Nestler EJ, Taylor JR. DeltaFosB v nucleus accumbens uravnava instrumentalno vedenje in motivacijo, okrepljeno s hrano. J Neurosci. 2006, 26: 9196 – 9204. [PubMed]
43. Paxinos G, Watson C. Možgani podgane v stereotaksičnih koordinatah. 6th izdaja. Amsterdam; Boston: Academic Press / Elsevier; 2007.
44. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, Chao J, Duman C, Steffen C, Monteggia L, Allen MR, Stock JL, Duman RS, McNeish JD, Barrot M, Self DW, Nestler EJ , Schaeffer E. Inducibilna ekspresija dominantnega negativnega mutanta c-Jun v transgenih miših, specifična za možgansko regijo, zmanjša občutljivost na kokain. Brain Res. 2003, 970: 73 – 86. [PubMed]
45. Penzes P, Cahill ME, Jones KA, Srivastava DP. Konvergentni CaMK in RacGEF signali nadzorujejo dendritično strukturo in funkcijo. Trends Cell Biol. 2008; 18: 405 – 413. [PubMed]
46. Perrotti LI, Hadeishi Y, Ulery PG, Barrot M, Monteggia L, Duman RS, Nestler EJ. Indukcija deltaFosB v možganskih strukturah, povezanih z nagrajevanjem, po kroničnem stresu. J Neurosci. 2004, 24: 10594 – 10602. [PubMed]
47. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, Elmore RG, Knapp DJ, Selley DE, Martin BR, Sim-Selley L, Bachtell RK, Self DW, Nestler EJ. Različni vzorci indukcije DeltaFosB v možganih zaradi zlorabe drog. Synapse. 2008, 62: 358 – 369. [PMC brez članka] [PubMed]
48. Pickens CL, Airavaara M, Theberge F, Fanous S, Hope BT, Shaham Y. Nevrobiologija inkubacije hrepenenja po drogah. Trendi Nevrosci. 2011; 34: 411 – 420. [PMC brez članka] [PubMed]
49. Pierce RC, Quick EA, Reeder DC, Morgan ZR, Kalivas PW. Drugi sporočilci s kalcijem modulirajo izražanje vedenjske preobčutljivosti na kokain. J Pharmacol Exp Ther. 1998; 286: 1171 – 1176. [PubMed]
50. Quirion R, Robitaille Y, Martial J, Chabot JG, Lemoine P, Pilapil C, Dalpe M. Avtoradiografija človeških možganskih receptorjev z uporabo celih odsekov: splošna metoda, ki zmanjšuje artefakte v tkivih. Sinopsija. 1987; 1: 446 – 454. [PubMed]
51. Robinson TE, Kolb B. Strukturna plastičnost, povezana z izpostavljenostjo zlorabam drog. Nevrofarmakologija. 2004; 47 (dodatek 1): 33 – 46. [PubMed]
52. Robison AJ, Nestler EJ. Transkripcijski in epigenetski mehanizmi odvisnosti. Nat Rev Neurosci. 2011; 12: 623 – 637. [PMC brez članka] [PubMed]
53. Robison AJ, Bass MA, Jiao Y, MacMillan LB, Carmody LC, Bartlett RK, Colbran RJ. Multivalentne interakcije protein-kinaze II, odvisne od kalcija / kalmodulina, z proteini postinaptične gostote NR2B, denzin-180 in alfa-aktinin-2. J Biol Chem. 2005; 280: 35329 – 35336. [PubMed]
54. Ross PL, Huang YN, Marchese JN, Williamson B, Parker K, Hattan S, Khainovski N, Pillai S, Dey S, Daniels S, Purkayastha S, Juhasz P, Martin S, Bartlet-Jones M, He F, Jacobson A, Pappin DJ. Količinsko kvantitativno določanje beljakovin v Saccharomyces cerevisiae z uporabo aminskih reaktivnih izobarnih reagentov za označevanje. Mol celična proteomika. 2004; 3: 1154 – 1169. [PubMed]
55. Russo SJ, Dietz DM, Dumitriu D, Morrison JH, Malenka RC, Nestler EJ. Zasvojena sinapsa: mehanizmi sinaptične in strukturne plastičnosti v jedrih jeder. Trendi Nevrosci. 2010; 33: 267 – 276. [PMC brez članka] [PubMed]
56. Self DW. V: Dopaminski receptorji. Neve KA, urednica. New York: Humana Press; 2010. strani 479 – 524.
57. Singer BF, Loweth JA, Neve RL, Vezina P. Prehodna virusno posredovana prekomerna ekspresija alfa-kalcijeve / kalmodulinsko odvisne beljakovinske kinaze II v lupini nukleusov se pripelje do dolgotrajne funkcionalne uregulacije alfa-amino-3-hidroksil-5 receptorji -metil-4-izoksazol-propionati: odvisnost dopaminskih receptorjev-1 in protein kinaze A. Eur J Nevrosci. 2010; 31: 1243 – 1251. [PMC brez članka] [PubMed]
58. Strack S, McNeill RB, Colbran RJ. Mehanizem in regulacija kalcijeve / kalmodulinsko odvisne proteinske kinaze II, usmerjena na NR2B podenoto receptorja N-metil-D-aspartata. J Biol Chem. 2000; 275: 23798 – 23806. [PubMed]
59. Ulery-Reynolds PG, Castillo MA, Vialou V, Russo SJ, Nestler EJ. Fosforilacija DeltaFosB posreduje njegovo stabilnost in vivo. Nevroznanost. 2009; 158: 369 – 372. [PMC brez članka] [PubMed]
60. Ulery PG, Nestler EJ. Regulacija transkripcijske aktivnosti DeltaFosB s fosforilacijo Ser27. Eur J Nevrosci. 2007; 25: 224 – 230. [PubMed]
61. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ. Regulacija stabilnosti DeltaFosB s fosforilacijo. J Neurosci. 2006, 26: 5131 – 5142. [PubMed]
62. Vialou V, et al. DeltaFosB v nagradnih sklopih možganov posreduje odpornost na stres in antidepresivne odzive. Nat Neurosci. 2010; 13: 745 – 752. [PMC brez članka] [PubMed]
63. Wang L, Lv Z, Hu Z, Sheng J, Hui B, Sun J, Ma L. Kronično acetiliranje H3, ki ga povzroča kokain, in transkripcijsko aktiviranje CaMKIIalpha v jezgrih je ključnega pomena za motivacijo za okrepitev drog. Nevropsihoparmakologija. 2010; 35: 913 – 928. [PMC brez članka] [PubMed]
64. Werme M, Messer C, Olson L, Gilden L, Thoren P, Nestler EJ, Brene S. Delta FosB ureja tek koles. J Neurosci. 2002, 22: 8133 – 8138. [PubMed]
65. Winstanley CA, LaPlant Q, Theobald DE, Green TA, Bachtell RK, Perrotti LI, DiLeone RJ, Russo SJ, Garth WJ, Self DW, Nestler EJ. Indukcija DeltaFosB v orbitofrontalnem korteksu posreduje toleranco pri kognitivni disfunkciji, ki jo povzroča kokain. J Neurosci. 2007, 27: 10497 – 10507. [PubMed]
66. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, Shaw-Lutchman T, Berton O, Sim-Selley LJ, Dileone RJ, Kumar A, Nestler EJ. Bistvena vloga za DeltaFosB v nucleus accumbens v delovanju morfina. Nat Neurosci. 2006, 9: 205 – 211. [PubMed]
67. Zhang R, Khoo MS, Wu Y, Yang Y, Grueter CE, Ni G, Cena EE, Jr, Thiel W, Guatimosim S, Song LS, Madu EC, Shah AN, Vishnivetskaya TA, Atkinson JB, Gurevich VV, Salama G, Lederer WJ, Colbran RJ, Anderson ME. Zaviranje kalmodulin kinaze II ščiti pred strukturnimi boleznimi srca. Nat Med. 2005; 11: 409 – 417. [PubMed]