PLoS One. 2013 Nov 25; 8 (11): e81245. doi: 10.1371 / journal.pone.0081245.
Nishijima T, Kawakami M, Kita I.
vir
Laboratorij za vedenjsko fiziologijo, Fakulteta za humanistične vede, Tokyo Metropolitan University, Tokio, Japonska.
Minimalizem
Fizična vadba izboljša več vidikov funkcije hipokampusa. V skladu z idejo, da je nevronska aktivnost ključna za spodbujanje nevronskih funkcij, je prejšnja literatura dosledno pokazala, da akutni napadi vadbe sprožijo nevronsko aktivacijo v hipokampusu. Ponavljajoči aktivirni dražljaji vodijo do kopičenja transkripcijskega faktorja ΔFosB, ki posreduje dolgoročno neuralno plastičnost.
V tej študiji smo testirali hipotezo, da dolgoročno prostovoljno tečenje koles povzroča izražanje ΔFosB v hipokampusu in preučuje potencialno specifične regijske učinke znotraj hipokampalnih podpoljev vzdolž dorso-ventralne osi. Moške C57BL / 6 miši so bile nameščene s kolesom ali brez njega za 4 tedne. Dolgoročno delovanje kolesa je znatno povečalo imunoreaktivnost FosB / ΔFosB v vseh merjenih hipokampalnih regijah (v podpoljih DG, CA1 in CA3 obeh hrbtnih in ventralnih hipokampusov). Rezultati so potrdili, da je vožnja s kolesi povzročila regijsko specifično izražanje imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB v korteksu, kar kaže, da enakomerno povečanje FosB / ΔFosB v hipokampusu ni nespecifična posledica teka. Podatki Western blot so pokazali, da je bila povečana hipokampalna FosB / ΔFosB imunoreaktivnost predvsem posledica povečanega ΔFosB. Ti rezultati kažejo, da je dolgotrajna vadba močan sprožilec za indukcijo ΔFosB v celotnem hipokampusu, kar bi pojasnilo, zakaj lahko vadba izboljša tako hrbtne kot ventralne funkcije, odvisne od hipokampusa. Zanimivo je, da smo ugotovili, da je bila ekspresija FosB / ΔFosB v DG pozitivno povezana s številom dvojno-kortinskih imunoreaktivnih (tj. Nezrelih) nevronov.
Čeprav mehanizmi, s katerimi ΔFosB posreduje v telesu inducirano nevrogenezo, še niso znani, ti podatki nakazujejo, da je nevrogeneza, ki jo povzroča vadba, vsaj odvisna od aktivnosti. Vsi naši trenutni rezultati kažejo, da je ΔFosB nov molekularni cilj, ki sodeluje pri uravnavanju gibljivosti hipokampalne indukcije.
Predstavitev
Vadba prinaša različne koristi za molekularne, strukturne in funkcionalne vidike hipokampusa pri glodalcih.1,2], od katerih so bile nekatere podprte s študijami na ljudeh [3,4]. Vendar pa mehanizmi, na katerih temeljijo gibalne hipotampične spremembe, niso dovolj razumljeni. Prejšnja literatura je dosledno pokazala, da vadba sproži hipokampalno nevronsko aktivacijo pri glodalcih. Imunohistokemične študije z uporabo c-Fos, markerja prehodne nevronske aktivacije, so pokazale, da tako prisilno kot prostovoljno povečanje izražanja c-Fos v podpatih zobatih girusov (DG), CA1 in CA3 v hipokampusu glodalcev [5-7]. Poleg tega je prejšnja študija, ki je uporabljala lasersko-Dopplerjevo merjenje pretoka (LDF), pokazala, da se pri podzemlju CA1 v podpolju uporablja blagi tek, ki je povečal regionalni cerebralni krvni pretok (rCBF), alternativni marker nevronske aktivacije.8]. Imunohistokemijske študije omogočajo podrobno analizo specifičnih regij po prenehanju vadbe, LDF pa v realnem času spremlja rCBF na lokaliziranem območju med vadbo. Kljub prednostim in omejitvam vsake študije so te študije na podoben način pokazale učinek akutnih vajah na aktivnost hipokampalnih nevronov. Ti rezultati kažejo na mehanizem, pri katerem dolgoročna redna vadba spodbuja plastičnost hipokampusa z večkratnim sprožanjem nevronske aktivacije.9].
Transkripcijski faktor ΔFosB, izoforma skrajšanega spoja FosB celotne dolžine, se inducira z različnimi vrstami ponavljajočih se dražljajev v določenih regijah možganov, kjer se postopoma kopiči zaradi svoje edinstvene stabilnosti (razpolovni čas tednov)10-12]. Vse več dokazov dokazuje, da povišane ravni ΔFosB posredujejo dolgotrajno živčno in vedenjsko plastičnost, povezano s posebnimi dražljaji.11,13]. Na primer, kronično dajanje drog, kot so kokain in morfij, običajno poveča izražanje ΔFosB v nucleus accumbens, ki predstavlja enega od molekularnih mehanizmov, ki so podlaga za povečano občutljivost za ta zdravila. [11,14,15]. Spodobnih drugih nagradnih nagrad, vključno z visoko vsebnostjo maščob in spolnimi izkušnjami [16,17], lpravočasna prostovoljna vožnja koles je povečala tudi imunoreaktivnost FosB / ΔFosB v podganah jedrca accumbens, kar kaže na to, da je prostovoljna vožnja naravna nagrada za glodalce [18,19]. Vendar pa, kolikor nam je znano, v nobeni literaturi ni raziskano, ali ponavljajoča se izpostavljenost telesni dejavnosti povzroča izražanje ΔFosB v hipokampusu. Ker vadba sproži nevronsko aktivacijo v hipokampusu, smo domnevali, da bi dolgoročno prostovoljno tečenje koles povzročilo tudi izražanje ΔFosB v hipokampusu. Medtem ko natančni mehanizmi, s katerimi ΔFosB uravnava plastičnost hipokampusa, ostajajo negotovi, so študije pokazale, da miši brez fosB gena kažejo oslabljeno hipokampalno nevrogenezo in povečano depresijsko20,21]. jazVaja je znano, da krepi nevrogenezo in ima antidepresivne lastnosti [22-25]. jazČe je naša hipoteza pravilna, bi bil ΔFosB nov potencialni molekularni cilj, ki posreduje hipokampalno plastičnost.
Hipokampus ima anatomski in funkcionalni gradient vzdolž vzdolžne (dorso-ventralne) osi.26]. Hrbtni hipokampus ima ključno vlogo pri učenju in spominu v prostoru.27,28], medtem ko je ventralni hipokampus prednostno vključen v uravnavanje čustvenega vedenja [29,30]. Poleg tega so študije pokazale, da fiziološki dražljaji sprožajo različne vzorce izražanja c-Fos v hrbtnem in ventralnem delu hipokampusa [31-33]. Ker vadba izboljša obe hrbtni34-37] in ventralne funkcije, odvisne od hipokampusa [24,25,38], je pomembno preveriti, ali dolgotrajno prostovoljno teka povzroča specifično izražanje ΔFosB v hipokampusu.
Primarna hipoteza te študije je bila, da bi dolgoročno prostovoljno tečenje koles povzročilo izražanje ΔFosB v mišjem hipokampusu. To hipotezo so raziskovali imunohistokemijo FosB / ΔFosB v hrbtnem in ventralnem hipokampalnem podpodročju, DG, CA1 in CA3, z dodatnim poudarkom na identifikaciji specifične indukcije. Rezultate smo potrdili z Western blot-om, ki smo ga uporabili za identifikacijo izoforma fosB genskih produktov, induciranih v hipokampusu. Prav tako smo pregledali korteks za indukcijo FosB / ΔFosB, specifično za regijo, da bi izključili možnost, da bi dolgoročna vadba ne-specifično povečala imunoreaktivnost FosB / ΔFosB v možganih. Končno je bila raziskana korelacijska povezava med ekspresijo FosB / ΔFosB in nevrogenezo kot prvi korak pri iskanju funkcionalnih posledic indukcije z vadbo ΔFosB pri uravnavanju plastičnosti hipokampusa.
Materiali in metode
1: Živali in etična izjava
Dvajset samcev C57BL / 6 miši (starost 8 tednov) je bilo kupljenih pri komercialnem gojitelju (SLC, Shizuoka, Japonska). Za eksperiment 1 smo uporabili deset miši, preostalih deset pa eksperiment 2. Miši so bile nameščene pod nadzorovanimi temperaturnimi pogoji (22 – 24 ° C) in lahkimi (cikel svetlobe / temne 12 / 12-h, svetloba pri 0500) in so dobivale hrano in vodo. ad libitum. Vse eksperimentalne postopke je odobril Odbor za etično preizkušanje živali pri Tokijski metropolitanski univerzi.
V vsakem poskusu so miši po prihodu naključno razporedili v kontrolno skupino (Control, n = 5) ali v tekočo skupino (Runner, n = 5). V prvem tednu so vse miši namestili v standardne plastične kletke v skupinah (miši 5 / kletka) za začetno aklimatizacijo. Nato smo miši Runnerja prenesli v kletko, opremljeno z tekočim kolesom (ENV-046, Med Associate Inc., Georgia, VT, USA). Ker je znano, da socialna izolacija zavira nevrogenezo, ki jo povzroči vadba v hipokampusu [39Runner miši so bile nameščene kot skupina (5 miši / kletka) za dodatne 4 tedne. Število vrtljajev koles je bilo zabeleženo vsako jutro in telesna teža (g) je bila merjena tedensko.
2: Eksperiment 1. Imunohistokemična preiskava izražanja FosB / ΔFosB in hipokampalne nevrogeneze
2.1: Perfuzija in obdelava tkiv
Zjutraj (0900 – 1100) po zadnjem dnevu teka so miši globoko anestezirali z natrijevim pentobarbitalom in transkardialno perfundirali s hladno slanico. Možgane smo hitro odstranili in po fiksiranju v 4% paraformaldehidu v 0.1 M fosfatnem pufru (PBS, pH 7.4) čez noč. Nato so možgani kriozaščiteni v 30% saharozi v PBS in zamrznjeni do nadaljnje obdelave. Odseke koronalnih možganov (40 μm) poloble smo dobili z zamrzovalnim mikrotomom in zbrali v PBS z 0.01% natrijevim azidom.
2.2: Imunohistokemija
Serija odsekov ena v šest je bila naključno izbrana za imunobarvanje FosB / ΔFosB. Za označevanje dvojnega kortina (DCX), markerja nezrelih nevronov, potrjenih za ocenjevanje nevrogeneze, je bila uporabljena sosednja serija.40,41]. Po zaustavitvi endogene peroksidazne aktivnosti z 1% H2O2 v PBS, prosto plavajoči odseki predhodno inkubiramo z blokirno raztopino, ki vsebuje 10% normalni konjski serum v PBS za 2 h. Po izpiranju v PBS, sekcije inkubiramo s kunčjim poliklonskim pan-FosB protitelesom (1: 1000, sc-48, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA), razredčene v PBS z 0.5% Triton X-100 in 0.5% BSA (PBST). -BSA) za 24 h pri 4 ° C. Druge serije sekcij smo inkubirali s kozjim poliklonskim anti-DCX protitelesom (1: 500, sc-8066, Santa Cruz) v PBST-BSA za 48 h pri 4 ° C. Odseki so nadalje inkubirani z ustreznim biotiniliranim sekundarnim protitelesom (anti-kunčji IgG, 1: 1000, AP182B; anti-kozji IgG, 1: 1000, AP180B, oba protitelesa od EMD Millipore, Billerica, MA, ZDA) v PBST-BSA za 2 h pri sobni temperaturi. Odseki so bili nato obdelani s kompleksom avidin-biotin-peroksidaza (komplet Vectastain ABC peroksidaze, Vector Laboratories Inc, Burlingame, CA, ZDA) za 90 min po navodilih proizvajalca. Končno smo antigene vizualizirali z 0.02% 3,3-diaminobenzidin (DAB) v 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), ki je vseboval 0.01% H2O2. Za imunobarvanje FosB / ΔFosB je bila reakcija okrepljena z nikljevim amonijevim sulfatom. Za barvanje z DCX smo celična jedra obarvali z Nisslovim barvanjem. Na želatinasto prevlečene diapozitive smo namestili sekcije in jih postavili.
2.3: Kvantifikacija imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB z uporabo praga slike
AntifosB-protitelesa, uporabljena v tej študiji, so bila sprožena proti notranji regiji, ki je bila deljena s FosB in ΔFosB N-terminalno regijo, tako da ni mogoče razlikovati med dvema izoformama. Zato smo imunostvorene strukture opisali kot FosB / ΔFosB imunoreaktivne (FosB / ΔFosB-ir) jedra. Za nepristransko kvantifikacijo slepih preparatov smo kodirali pred analizo. Atlas mišjih možganov42] je bila uporabljena za določitev lokacije naslednjih interesnih območij (ROI): plast granulnih celic (GCL) oddelkov DG (3), piramidne celične plasti CA1 (sekcije 3) in CA3 (odseki 2 – 3) v hrbtnem hipokampusu (zaprto do -2.2 mm od bregme); DG (sekcije 2), CA1 (sekcije 2) in CA3 (sekcije 2) v ventralnem hipokampusu (zaprte do -3.4 mm od bregme) (Slika 4, levo). Kaudalni odseki vsebujejo dorzalni in ventralni del hipokampusa, toda ventralni del je bil usmerjen. V DG, so bile ločeno analizirane suprapiramidne (DGsp) in infrapramidne (DGip) rezila. Motorna skorja (sekcije 2 – 3, zaprte do -0.6 mm od bregme), somatosenzorična cev skorje (odseki 2 – 3, zaprti do -0.6 mm od bregme), vizualna skorja (odseki 3, zaprti do -2.9 mm od analizirana je bila tudi slušna skorja (odseki 3, zaprti za -2.9 mm od bregme) in vohalna čebulica (sekcije 3, zaprte do + 4.3 mm od bregme) (Slika 6, levo).
Digitalne slike (2070 × 1548 slikovnih pik) vsakega ROI so bile posnete z optičnim mikroskopom (BX-51, Olympus, Tokio, Japonska), opremljeno s CCD kamero (DP-73, Olympus) in slikovno programsko opremo (cellSens, Olympus). Povečanje objektivne leče je bilo 10 × za hipokampalni ROI in 4 × za kortikalne ROI. Da bi ugotovili zmerno do močno FosB / ΔFosB imunoreaktivnost (Slika 1D – G), z uporabo več delov vnaprej, so bile nastavitve zajemanja slike (jakost svetlobe, velikost zaustavitve polja, čas izpostavljenosti in ravnovesje beline) in mejne vrednosti za vsako od komponent RGB optimizirane za hipokampalne in kortikalne ROI. Naslednjo analizo smo nato izvedli pod optimiziranimi pogoji (1). ROI so bile izbrane s poligonom nepravilnih oblik (Slika 1A, B) (2). Slika je bila prag, ki je pretvorila jedra FosB / ΔFosB-ir v rdečo barvo (Slika 1C-G) (3). Vrednost% ROI je bila nato samodejno izračunana na naslednji način:% ROI = (predelano območje (v rdeči) / skupno območje ROI) × 100.
Za potrditev analize praga slike so bile regije 20 naključno izbrane iz različnih možganskih področij z različnimi velikostmi regij. Poleg kvantifikacije mejnih vrednosti slike smo ročno prešteli število jeder FosB / ΔFosB-ir v izbranih regijah in pridobili gostoto jeder FosB / ΔFosB-ir z deljenjem števila jeder FosB / ΔFosB-ir z izmerjenim jedrom. območje (mm2).
2.4: Kvantifikacija DCX-ir nezrelih nevronov v zobatem girusu
DCX-ir nezreli nevroni v miših DG Runner so bili obilni in se prekrivajo, zaradi česar je bilo težko natančno šteti diskretno število DCX-ir soma z uporabo optičnega mikroskopa. Vendar pa je v prejšnji študiji Sholl analiza za morfološko oceno pokazala, da ima vsak DCX-ir nevron v povprečju en dendrit, izmerjen znotraj 40 μm soma [43]. Zato smo razvili naslednjo izvirno analizo, ki omogoča kvantifikacijo DCX-ir nevronov specifično za regijo.
- (1) Slika GCL je bila projicirana na računalniški zaslon s programsko opremo za slikanje in objektivom 40 × (2). Na sliki v živo je bil na sredini GCL narisan segment (150 ± 0.1 μm) (Slika 2) (3). S spreminjanjem goriščne globine se je štelo, kolikokrat je bil prečni prerez DCX-ir dendritov (4). ROI (dorzalni DGsp, dDGsp; dorzalni DGip, dDGip; ventralni DGsp, vDGsp; ventralni DGip, vDGip) je ustrezal regijam, kjer je bila analizirana FosB / ΔFosB imunoreaktivnost (5). V vsakem ROI so bili segmenti črte 2 – 3 narisani na oddelek, število prehodov pa je bilo povprečeno na dele 2 – 3 na miško. Ker je debelina GCL približno 60 – 80 μm, mora število prehodov odražati število nevronov DCX-ir v analiziranem omejenem območju.
3. Poskus 2. Identifikacija izooblike FosB / ΔFosB, ki jo povzroči tek kolesa
3.1: Perfuzija in obdelava tkiv
Dodatno kohorto miši smo obdelali kot zgoraj v eksperimentu 1. Po 4 tednih tekočega posega so bile miši transkardialno perfundirane s hladno slanico pod globoko anestezijo. Hipokampus je bil hitro razrezan in zamrznjen s tekočim dušikom in shranjen pri -80 ° C. Hipokampi vsake miši smo homogenizirali v RIPA pufru (150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCl pH 7.6, 1% NP-40, 1% natrijev deoksiholat, 0.1% SDS, #8990, Thermo Scientific, IL, USA), ki vsebuje proteazo (cOmplete Mini, Roche, Manheim, Nemčija). Lizate centrifugiramo za 15 min pri 5000 rpm pri 4 ° C in zberemo supernatante. Koncentracije beljakovin smo izmerili s kompletom za testiranje proteina BCA (# 23227, Thermo Scientific, IL, ZDA).
3.2: Western bloting
Enake količine proteina (30 μg / lane) smo elektroforezirali na 10% poliakrilamidnem gelu, nato prenesli v PVDF membrano (Immun-Blot, 0.2 μm, Bio-Rad, MD, ZDA). Nespecifično vezavo smo blokirali s predinkubacijo membrane za 1 h v TBST (0.5 M NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 0.1% Tween-20), ki je vsebovala 3% BSA. Membrano smo inkubirali s pan-FosB protitelesom (1: 1000), ki smo ga uporabili zgoraj za imunohistokemijo, raztopimo v TBST, ki vsebuje 3% BSA. Po pranju s TBST smo membrano inkubirali s HRP-konjugiranim anti-kunčjim IgG protitelesom (1: 5000 v TBST, NA934, GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) za 1 h pri sobni temperaturi. Po pranju s TBST so bili proteinski trakovi vizualizirani z inkubacijo z Enhanced Chemiluminescence (Western Lightning Plus-ECL, PerkinElmer, MA, ZDA) in zajeti z uporabo Image Quant LAS 4000 mini (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK). Membrana je bila nato ponovno testirana z anti-gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaznim (GAPDH) protitelesom (# 2275, 1: 5000 v TBS-T, Trevigen, MD, USA) kot nalagalno kontrolo. Optično gostoto beljakovinskih pasov smo kvantificirali z uporabo Image-J in normalizirali na raven GAPDH.
4: Statistična analiza
Spremembe telesne mase miši smo analizirali z dvosmerno ANOVA (skupina × čas). Neparni t-test je bil uporabljen za določitev statističnih razlik med skupinami (Control vs Runner). Pearsonova korelacijska analiza je bila uporabljena za potrditev FosB / ΔFosB analize imunoreaktivnosti (ročno štetje proti pragom slike) in za preučitev povezave med nivojem izražanja FosB / ΔFosB in številom DCX prehodov v DG. Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SEM. Prag za statistično pomembnost je bil določen na P <0.05.
Rezultati
1: Telesna teža in razdalja v teku v eksperimentih 1 in 2
Spremembe telesne teže miši Control in Runner v poskusih 1 in 2 so združene in prikazane v Slika 3. Dvosmerna ANOVA za ponavljajoče se meritve je pokazala pomembno interakcijo (skupina × čas, F(4, 72) = 13.6, P <0.001) in glavni učinek skupine F(1, 18) = 6.07, P <0.05), kar kaže na znatno nižjo telesno težo miši Runner. Tekaška razdalja na kletko je prikazana v Tabela 1. Čeprav je bila natančna razdalja med vožnjo pri vsaki miši negotova, ker so bile miši nastanjene skupaj, je redno opazovanje potrdilo, da so vse miši pogosto izvajale kolo. Runner miši v eksperimentu 2 so tekle dlje kot tiste v eksperimentu 1, vendar je bila srednja razdalja med vožnjo (m / dan / kletka) dosledna med vsakim poskusom.
2: Potrjevanje kvantifikacije imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB z uporabo praga slike
Obstaja pomembna korelacija med območjem FosB / ΔFosB-ir, dobljenim s pragom slike in gostoto jeder FosB / ΔFosB-ir, dobljenih z ročnim štetjem (r = 0.941, P <00001, Slika 4).
3: imunoreaktivnost FosB / ΔFosB v hipokampusu
Reprezentativne podobe imunske barve FosB / ΔFosB v hrbtnem in ventralnem hipokampalnem podpodročju so bile prikazane v Slika 5. V vseh analiziranih ROI imunoaktivnost FosB / ΔFosB pri miših Runner (Slika 5, desno) je bila kvalitativno višja od tiste pri kontrolnih miših (Slika 5, center). Pri miših Runner je kvantitativna analiza pokazala znatno povečanje območja FosB / ΔFosB-ir v obeh hrbtnih (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.01; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05) in ventralno hipokampalno podpolje (DGsp: P <0.01; DGip: P <0.05; CA1: P <0.05; CA3: P <0.05; Slika 6).
4: FosB / ΔFosB imunoreaktivnost v skorji
Reprezentativne podobe FosB / ΔFosB imunske barve v kortikalnih ROI so prikazane v Slika 7. Kvantitativna analiza je pokazala, da so FosB / ΔFosB imunoreaktivnosti odvisne od regije z dolgotrajnim tekom (Slika 8). Pri miših Runner je bila površina FosB / ΔFosB-ir bistveno višja v motorni skorji (P <0.05) in somatosenzorični sodček (P <0.05), vendar ne v vidni skorji (P = 0.662) ali vohalne žarnice (P = 0.523). V slušni skorji je območje FosB / ΔFosB-ir skušalo povečati število miši Runner (P =
5: Nevrogeneza
Prikazane so reprezentativne podobe imunskega barvanja z DCX Slika 9. V hrbtnem hipokampusu je imunoreaktivnost DCX pri miših Runner (Slika 9, desno) je bila kvalitativno višja v primerjavi s kontrolnimi mišmi (Slika 9, levo). V primerjavi z dorzalnim hipokampusom je bila imunoreaktivnost DCX v ventralnem hipokampusu slabša tako pri kontrolnih kot v miših Runner. Pri miših Runner je bilo število prehodov znatno večje v dDGsp (P <0.01) in dDGip (P <0.01; Slika 10). V ventralnem hipokampusu se je število prehodov v miših Runner povečalo, vendar med skupinami ni bilo pomembnih razlik (vDGsp, P = 0.101; vDGip, P = 0.257; Slika 10).
6: Korelacija med izražanjem FosB / ΔFosB in nevrogenezo
Izvedena je bila korelacijska analiza med območjem FosB / ΔFosB-ir in številom prehodov DCX (Slika 11). Ker so vsi podatkovni nizi (npr. Dorzalni DGsp v kontrolnih miših) sestavljeni le iz parov 5, je bila analiza najprej izvedena z vsemi pari 40. Zanimivo je obstajala pomembna povezava med območjem FosB / ΔFosB-ir in številom prehodov DCX (r = 0.885, P <0.0001). Poleg tega so bile ugotovljene tudi pomembne korelacije, ko je hrbtni DG (r = 0.762, P <0.05) in trebušni DG (r = 0.816, P <0.01) analizirali ločeno.
7: Identifikacija izooblike FosB / ΔFosB, ki jo povzroči dolgoročno delovanje
Nazadnje, za identifikacijo izoforma fosB genske produkte, inducirane v hipokampusu kot odziv na dolgoročno delovanje, so hipokampi iz dodatne kohorte miši izpostavili Western blot z uporabo istega pan-FosB protitelesa. Več pasov 35 – 37 kDa, ki predstavljajo modificirane izoforme ΔFosB [44], so bile znatno povečane pri miših Runner proti Control (Slika 12, P <0.01). Po drugi strani pa izoform 48 kDa FosB ni bilo mogoče zaznati v nobeni skupini. Še en rahlo viden pas nad 25 kDa verjetno predstavlja izoformo Δ2ΔFosB (27 kDa). Obstajala sta še dva pasova, nad 50 kDa in 37 kDa, ki sta bila najverjetneje zaradi nespecifične vezave. Ko so bili količinsko opredeljeni, v teh pasovih, ki niso ΔFosB, med skupinami niso našli razlik (podatki niso prikazani).
Razprava
Če povzamemo, ta študija je najprej izvedla imunohistokemijsko analizo za preučevanje 1-a, ali dolgoročno prostovoljno tečenje koles povzroča izražanje FosB / ΔFosB v hipokampusu; in 2), ali obstaja regionalno specifičen odziv vzdolž njene dorso-ventralne osi.
Štiri tedne prostovoljnega teka kolesa so povzročile znatno povečanje imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB v vseh analiziranih hipokampalnih regijah (tj. Podpolja DG, CA1 in CA3 obeh hrbtnih in ventralnih delov hipokampusa). Potrdili smo, da je izoforma 35 – 37kDa ΔFosB glavna fosB genski produkt, ki se kopiči kot odziv na dolgoročno delovanje. Ti rezultati jasno podpirajo hipotezo, da je dolgotrajna redna vadba močan sprožilec za indukcijo ΔFosB v celotnem hipokampusu in da je njegova indukcija lahko nov molekularni mehanizem, s katerim vpliv vpliva na različne vrste hrbtnih in / ali ventralnih funkcij, odvisnih od hipokampusa.
1: Validacija in omejitve kvantifikacije imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB z uporabo praga slike
V tej študiji je bila sprejeta tehnika slikovnega praga, ki se široko uporablja v imunohistokemičnih študijah za štetje števila ciljnih celic in za ovrednotenje morfologije celic, za specifično kvantifikacijo imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB v regiji.15,45,46]. Dokazana je bila pomembna korelacija med ravnmi imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB, ki so bile izmerjene s pragom slike in ročnim štetjem (\ tSlika 4). Ker pa gostota in prekrivanje preprečujeta štetju števila jeder FosB / ΔFosB-ir na zelo gostih območjih, dokazana korelacija pomeni le natančnost metode praga slike, kadar območja FosB / ΔFosB-ir predstavljajo <~ 40% celotne ROI območje. Zato je potrebna natančna razlaga za območja FosB / ΔFosB-ir> 40% celotne površine ROI.
Zlasti pri miših DG (Runner)Slika 4) Izraz FosB / ΔFosB je bil močno induciran s tekom kolesa in večina jeder FosB / ΔFosB-ir se je prekrivala. Na teh področjih povečana indukcija izražanja FosB / ΔFosB vodi k večjemu podcenjevanju ravni izražanja, ne glede na uporabljeno metodo kvantifikacije (mejna vrednost slike ali ročno štetje). Vendar je kljub tveganju podcenjevanja pomembno omeniti, da je ta študija uspešno pokazala znatno povečanje območja FosB / ΔFosB-ir pri miših DG Runner. To nakazuje, da metodološke omejitve ne ogrožajo naših ugotovitev. Namesto tega potencialno podcenjevanje poveča zanesljivost ugotovitve, da dolgoročno povečana imunoreaktivnost FosB / ΔFosB v hipokampusu.
2: Enotna indukcija ΔFosB v hipokampusu z dolgotrajnim tekom
Hipokampus ima anatomske in funkcionalne gradiente vzdolž svoje vzdolžne osi [26], zato je bila za to študijo analizirana ločeno FosB / ΔFosB imunoreaktivnost v hrbtnem in ventralnem delu hipokampusa. Podatki so pokazali, da so izmerili dolgoročno enakomerno povečano izražanje FosB / ΔFosB v vseh hipokampalnih ROI. Ta enotna indukcija imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB je lahko nespecifično posledica sistemskih presnovnih sprememb, povezanih z dolgotrajnim tekom. Pomembno pa je omeniti, da je bilo v korteksu značilno povečanje imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB v regiji. Ta rezultat je podprt z nedavnimi ugotovitvami, ki kažejo, da je akutni tek tekalne steze povečal regionalni cerebralni krvni pretok v hipokampusu, ne pa tudi v vohalni čebulici.8]. Nadalje, Rhodes et al. (2003) je pokazala, da je 7 dni prostovoljnega teka kolesa povzročilo izražanje c-Fos v DG in CA2 / 3 hipokampusa (CA1 ni bil izmerjen) in v senzorični skorji, vendar ne v vidnem korteksu [47]. Te študije kažejo, da enotna indukcija izražanja FosB / ΔFosB v hipokampusu ni nespecifična posledica dolgotrajnega delovanja. Zanimivo je, da Hawley et al. nedavno poročali, da je kronični nepredvidljiv stres povečal izražanje FosB / ΔFosB v hrbtni, ne pa tudi v \ t48]. Z nadaljnjimi preiskavami bodo različni vzorci indukcije FosB / ΔFosB, kot so tisti, ki so jih sprožili vadba ali stres, zagotovili nadaljnji vpogled v učinke, ki so odvisni od dražljajev na hipokampus.
Znano je, da primarno protitelo pan-FosB, uporabljeno v tej študiji, prepozna vse izoforme FosB proteinov. Po Western blotting analizi smo ugotovili, da so edine izooblike, ki so se v hipokampusu povečale po dolgotrajnem teku, spremenjene izoforme ΔFosB (35-37 kDa), edine stabilne izoforme med proteini družine Fos [11]. Ta ugotovitev je v skladu s prejšnjim delom, ki je uporabljalo pan-Fos protitelesa, da bi dokazali, da je 35-37 kDa ΔFosB prevladujoči protein Fos družine, ki ga povzroča kronični stres v čelni skorji44]. Zato je povečanje imunoreaktivnosti hipokampusa FosB / ΔFosB, ki jo tukaj povzroča dolgotrajno delovanje, verjetno odražala raven ΔFosB.
Manj je znanih o specifičnih učinkih vadbe na molekularne in strukturne vidike hipokampusa. Vendar pa številne vedenjske študije kažejo na velik potencial za izboljšanje vadbe v hrbtnih in ventralnih funkcijah hipokampusa. Dokazano je bilo, da je vadba izboljšala prostorsko učenje in spomin.34-38] in prostorska in kontekstualna obdelava je odvisna predvsem od hrbtnega hipokampusa [27,28]. V nasprotju s tem je znano, da izvaja tudi anksiolitične in antidepresivne lastnosti.24,25,38] in ti čustveni odzivi večinoma ureja ventralni hipokampus [29,30]. Enotna indukcija ΔFosB z dolgotrajnim tekanjem, ki smo jo opazili v tej študiji, kaže, da se je v celotnem hipokampusu pojavila neka oblika nevroplastičnih sprememb. To bi pojasnilo, zakaj lahko vaja vpliva na hrbtne in ventralne funkcije, ki so odvisne od hipokampusa.
3: Regijska specifična analiza nevrogeneze, povzročene z vadbo
Funkcionalna disociacija nevrogeneze med hrbtnim in ventralnim hipokampusom je prav tako deležna vse večje pozornosti.49]. V tej študiji so izkoristili morfološke značilnosti DCX-ir nezrelih nevronov.43], smo prešteli število presečišč med DCX-ir dendriti in odsekom črte, ki je bil narisan vzdolž sredine GCL. Ta meritev ni zagotovila celotnega števila DCX-ir nevronov v DG, vendar je omogočila kvantifikacijo, specifično za regijo, ki je potrebna za izvedbo korelacijske analize s podatki o izražanju FosB / ΔFosB (glej spodaj). Po dolgotrajnem trčenju se je v dorzalni obliki znatno povečalo število nevronov DCX-ir, ne pa tudi ventralne, DG. To nakazuje, da lahko vadba stimulira nevrogenezo bolj izrazito v hrbtu v primerjavi z ventralnim delom DG. Vendar pa so prejšnje študije poročale o nasprotujočih si rezultatih, pri katerih je kolo povečalo nevrogenezo v hrbtni in \ t50,51]. V tej študiji se je število prehodov DCX-ir v ventralnem DG povečalo s tekom, čeprav bi lahko majhna velikost vzorca (miši 5 na skupino) omejila sposobnost za odkrivanje statistično pomembnih razlik med skupinami. Zato je verjetno prezgodaj, da bi izključili možnost, da lahko prostovoljno tečenje koles spodbudi ventralno hipokampalno nevrogenezo. Potrebne so nadaljnje podrobne študije, da bi razumeli specifičnost regije pri vadbi inducirane nevrogeneze glede na večstopenjski proces (celična proliferacija, diferenciacija, migracija in preživetje).
4: Funkcionalne posledice indukcije z vadbo ΔFosB za uravnavanje plastičnosti hipokampusa
Nazadnje, kot prvi korak pri prepoznavanju funkcionalnih posledic indukcije ΔFosB, povzročene z vadbo v hipokampusu, smo raziskali razmerje imunoreaktivnosti FosB / ΔFosB na DCX-ir prehodih v hrbtnem in ventralnem DG in ugotovili pomembno, pozitivno korelacijo med spremenljivki. Čeprav natančni mehanizmi, s katerimi ΔFosB uravnava gibalno-inducirano nevrogenezo, ostajajo negotovi, je pokazala nedavna študija fosBnične miši, ki nimajo FosB, ΔFosB in Δ2ΔFosB (vse fosB primanjkljaj bazalne hipokampalne nevrogeneze, vključno z zmanjšano proliferacijo nevronskih progenitorskih celic, povečano ektopično migracijo novorojenih nevronov in nenormalnih struktur DG [20]. Vendar te spremembe niso bile opažene v letu 2007. \ T fosB(d / d) miši, ki nimajo FosB, vendar ne ΔFosB / Δ2ΔFosB. Zanimivo je, da fosBnične miši, vključno z nekaterimi geni, povezanimi z nevrogenezo Vgf (Inducirni faktor rasti živčevja VGF) in Gal (Galanin prepropeptid) so bile znižane20]. Ker so VGF in GAL sekretorne molekule, eden od predlogov, ki obetajo, meni, da lahko nevroni, ki izražajo ΔFosB, uravnavajo nevrogenezo s pomočjo avtokrine / parakrine aktivnosti [20].
Poleg tega je treba opozoriti, da se območje, kjer se ΔFosB inducira s prostorskim prekrivanjem s področjem, kjer je nevrogena aktivnost visoka. Ta ugotovitev nakazuje, da je nevrogeneza, ki jo povzroča vadba, na minimalni aktivnosti odvisna. Aktivacija nevronov je ključna za vzdrževanje in izboljšanje funkcije osrednjega živčnega sistema [9], prek mehanizmov, ki vključujejo izražanje in sproščanje nevrotrofnega faktorja iz možganov (BDNF) [52,53], prevzemanje serumskega insulinu podobnega rastnega faktorja 1 (IGF-1) skozi krvno-možgansko \ t54,55], zatiranje apoptoze [56] in regulacijo mitohondrijske gibljivosti [57]. Zato ta študija kaže, da je dolgotrajna vadba sprožila ponavljajočo se aktivacijo nevronov, ki se kaže v povečani izraženosti ΔFosB, kar prispeva k povečanju plastičnosti hipokampusa, potencialno s pomočjo zgoraj opisanih večkratnih mehanizmov.
V tej študiji je bila le ocenjena nevrogeneza, ki je bila inducirana z vadbo, in njena povezanost z izražanjem FosB / ΔFosB v DG. Vendar je imunoreaktivnost FosB / ΔFosB inducirana tudi v podpodročjih CA1 in CA3. Medtem ko so potrebne nadaljnje študije za boljše razumevanje funkcionalnih vlog izražanja z gibanjem ΔFosB v teh podpoljih, je prejšnja literatura obetavna možnost. Guan et al. (2011) je pokazal, da je specifična ablacija ciklin odvisne kinaze 5 (Cdk5) v CA1 ali CA3 piramidnih nevronih poslabšala konsolidacijo spomina ali ponovno pridobivanje,58]. Zanimivo je, da je Cdk5 cilj nižjega ΔFosB [59] in je vključen v urejanje sinaptične plastičnosti [60]. Zato je lahko ekspresija ΔFosB, inducirana z vadbo, vključena v reguliranje sinaptične plastičnosti s pomočjo aktivacije Cdk5 v podpoljih CA1 in CA3.
zaključek
Medtem ko je bilo znano, da akutni napadi vadbe povzročajo ekspresijo takojšnjih genskih proteinov v hipokampusu, ta študija zagotavlja prvi dokaz, da dolgotrajna redna vadba bistveno inducira izražanje ΔFosB v celotnem hipokampusu. Thje enotna indukcija ΔFosB podpira sedanje razumevanje, da je vadba učinkovita nefarmakološka intervencija, ki lahko izboljša več funkcij hipokampusa. Skupaj s pomembno povezavo med ekspresijo FosB / ΔFosB in nevrogenezo so ti podatki provokativni in kažejo na potrebo po nadaljnjih študijah, ki opredeljujejo vlogo ΔFosB pri posredovanju učinkov vadbe na funkcijo hipokampusa, vključno z nevrogenezo.
Izjava o financiranju
Reference