PSMC5, proteazomska ATPaza 19S, uravnava delovanje kokaina v jedrskih obtokih (2015)

PLoS One. 2015 maj 1110 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710. eCollection 2015.

Ohnishi YH1, Ohnishi YN2, Nakamura T3, Ohno M4, Kennedy PJ5, Yasuyuki O6, Nishi A7, Nikoli8, Tsuzuki T4, Nestler EJ5.

Minimalizem

ΔFosB je stabilen transkripcijski faktor, ki se kopiči v nucleus accumbens (NAc), ključnem delu možganskega nagradnega vezja, kot odgovor na kronično izpostavljenost kokainu ali drugim zlorabam drog. Čeprav je znano, da ΔFosB heterodimerizira z družinskim članom Jun, da tvori aktivni kompleks transkripcijskih faktorjev, do danes še ni bilo odprtega raziskovanja drugih možnih vezavnih partnerjev za ΔFosB v možganih. Tu z uporabo dvo hibridnih testov kvasovk identificiramo PSMC5, znan tudi kot SUG1, podenota proteasomskega kompleksa 19S, ki vsebuje ATPazo, kot novo interakcijsko beljakovino z ΔFosB. Preverimo takšne interakcije med endogenim ΔFosB in PSMC5 v NAc in dokažemo, da oba proteina tvorita tudi komplekse z drugimi regulativnimi proteini kromatina, povezanimi z aktivacijo genov. Nadaljujemo s tem, da kronični kokain poveča jedrske, ne pa tudi citoplazemske ravni PSMC5 v NAc in da prekomerna ekspresija PSMC5 v tej možganski regiji spodbuja gibalne odzive na kokain. Te ugotovitve skupaj opisujejo nov mehanizem, ki prispeva k delovanju ΔFosB in prvič vključuje PSMC5 v molekularno in vedenjsko plastičnost, ki jo povzroča kokain.

Navedba: Ohnishi YH, Ohnishi YN, Nakamura T, Ohno M, Kennedy PJ, Yasuyuki O, et al. (2015) PSMC5, 19S proteazomska ATPaza, uravnava delovanje kokaina v jedrskih obtokih. PLOS ONE 10 (5): e0126710. doi: 10.1371 / journal.pone.0126710

Akademski urejevalnik: James Edgar McCutcheon, Univerza v Leicesterju, ZDRUŽENO KRALJESTVO

Prejeto: December 10, 2014; Sprejeto: April 7, 2015; Objavljeno: Maj 11, 2015

Avtorske pravice: © 2015 Ohnishi et al. To je članek z odprtim dostopom, ki je razdeljen po pogojih Licenca za priznanje Creative Commons, ki dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če sta avtorju in viru pripisana vrednost

Dostopnost podatkov: Vsi relevantni podatki so v dokumentu.

Financiranje: To delo so podprli štipendije Nacionalnega inštituta za zdravje, Nacionalnega inštituta za zlorabo drog ter fundacije Ishibashi in Japonsko društvo za promocijo znanosti (KAKENHI številke: 24591735, 26290064, 25116010). Financerji niso imeli nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranju in analizi podatkov, odločanju za objavo ali pripravi rokopisa.

Konkurenčne koristi: Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi.

Predstavitev

ΔFosB, okrnjen izdelek. \ T FosB gen, spada v družino Fos transkripcijskih faktorjev, ki vključuje tudi c-Fos, FosB, Fra-1 in Fra-2. ΔFosB, tako kot drugi proteini Fos, heterodimerizira z beljakovino iz družine Jun (c-Jun, JunB ali JunD), da oblikuje aktivni kompleks transkripcijskega faktorja AP-1 (aktivator protein-1), ki inducira ali potisne izražanje specifičnih ciljnih genov [1,2].

Pokazalo se je, da ima ΔFosB ključno vlogo pri zasvojenosti z \ t2]. Edinstveno med beljakovinami družine Fos se po večkratnem dajanju zdravila kopiči v nucleus accumbens (NAc) in drugih območjih možganov, povezanih z nagrajevanjem, zaradi visoke stopnje stabilnosti [3,4], ki je posredovana s pomanjkanjem C-terminalnih degronskih domen in s fosforilacijo z več proteinskimi kinazami [5-7]. Takšna indukcija ΔFosB v NAc posreduje povečane vedenjske odzive na zlorabe zdravil. Tako prekomerna ekspresija ΔFosB v tej možganski regiji odraslih živali, bodisi z uporabo virusnih vektorjev ali inducibilnih bitransgeničnih miši, poveča občutljivost živali na lokomotorno aktivirajoče in nagrajevalne učinke kokaina in opiatov ter motivacijo živali za samo-upravljanje. kokain [7-11]. Nasprotno pa čezmerna ekspresija dominantnih negativnih antagonistov ΔFosB povzroča nasprotne vedenjske fenotipe [10-12].

Mi in drugi smo predhodno potrdili, z uporabo testov za premikanje gela, da so JunD in morda drugi proteini iz družine Jun glavni partnerji za vezavo ΔFosB v možganih in vivo [13-15]. Vendar doslej ni bilo odprtega, nepristranskega vrednotenja zavezujočih partnerjev ΔFosB v možganih. Tukaj smo skušali identificirati nove zavezujoče partnerje za ΔFosB z uporabo dvokomponentnega testa kvasovk [16,17]. Naši podatki so pokazali, da je PSMC5, znan tudi kot SUG1, močan partner ΔFosB in vitro in v NAc in vivo, kjer se pridruži ΔFosB kot del kokainsko induciranega aktivacijskega kompleksa za transkripcijo, ki vsebuje tudi CBP (CREB vezavni protein). ) in p300 - oba histonska acetiltransferaza (HAT) - kot BRG1 (beljakovina preoblikovanja kromatina). Še naprej dokazujemo, da kronična izpostavljenost kokainu spreminja jedrske nivoje PSMC5, podenote, ki vsebuje ATPazo proteazomskega kompleksa 19S, v NAc in da PSMC5 nato nadzoruje vedenjske odzive na kokain.

Material in metode

Dvo hibridni pregled kvasa

Celice kvasovk MaV203 (Invitrogen Life Technologies) so bile ko-transfektirane s pDBLeu, ki je vodila različne fragmente proteina ΔFosB, in knjižnica mišjih možganov je bila subklonirana v pPC86 (Invitrogen Life Technologies). Transformirane celice smo gojili na SC-mediju brez levcina, triptofana in histidina in vsebovali 10 mM 3-aminotriazola. Vezava med FosB fragmenti in kandidatnim partnerjem inducira tri reporterske gene (His3, Ura3in LacZin indukcijo naredi transformante sposobne preživeti v uporabljenih kultiviranih pogojih. Pozitivne klonove znova testiramo s svežimi fragmenti pDBLeu-ΔFosB s testi retransformacije v MaV203 celicah.

Celične linije

Mišje celice nevroblastoma Neuro 2A (ATCC) so vzdrževali v Orlovem minimalnem esencialnem mediju (EMEM) (ATCC), dopolnjenem z 10% fetalnim govejim serumom (FBS) pri 37 ° C in 5% CO2. Celice podganjih 1A so bile darilo Yusaku Nakabeppu (Fukuoka, Japonska) [18] in vzdrževana v Dulbeccojevi MEM (DMEM) (Life Technologies), dopolnjeni z 10% FBS pri 37 ° C in 5% CO2. Transfekcijo celic s plazmidno DNA smo izvedli z uporabo Effectene (Qiagen) v skladu z navodili proizvajalca.

Konstrukcije PSMC5 in ΔFosB

Več mutantnih oblik PSMC5, vsak FLAG-označenih na njihovem N-terminalu, so bile proizvedene za uporabo pri imunoprecipitaciji ali eksperimentih prenosa genov, posredovanih z virusom. Ti vključujejo: PSMC5-K196M, PSMC5-Δcoiled-domeno (PSMC5-ΔCC, ki nima aminokislin 27-68), PSMC5-NT (sestavljen iz N-terminalnega fragmenta proteina, aminokislin 1-151) in PSMC5 -CT (sestavljen iz C-terminalnega fragmenta proteina, 172 aminokislin) (glej Slika 1). Uporabili smo tudi N-terminalne MYC-označene oblike divjega tipa ΔFosB kot tudi ΔFosB z mutacijo v domeni levcin-zadrga (mutacija aminokislin 182 v 205, za katero je znano, da uničuje heterodimerizacijo z beljakovinami iz družine Jun [6].

thumbnail
Slika 1. ΔFosB se veže na PSMC5 in vitro.

 

A. Shema ΔFosB, ΔFosB-LZM, v kateri je domena levcinske zadrge mutirana, da bi izbrisala ΔFosB heterodimerizacijo z Jun-proteini, in Δ2ΔFosB, ki nima prvih 78 aminokislin ΔFosB N-terminusa. B. Shema PSMC5, PSMC5-NT, ki vsebuje prve 151 aminokisline PSMC5, PSMC5-CT, ki nima prvih 235 aminokislin PSMC5, in PSMC5-ΔCC, ki nima domene z navitjem (aminokisline 28 – 68) . Domena AAA ustreza motivu, ATPazam, povezanim z različnimi celičnimi aktivnostmi, prisotnimi v mnogih ATPazah. C. 2.4 μg pcDNA3.1-ΔFosB (pasovi 1-4) ali ΔFosB-LZM (pas 5) je bil ko-transfektiran z 2.4 μg FLAG-označenega PSMC5 ali različnimi delecijskimi mutanti v Neuro2a celice. Dva dni po transfekciji so bile celice lizirane in podvržene imunoprecipitaciji z anti-FLAG protitelesom in nato Western blotiranimi z anti-ΔFosB ali anti-FLAG protitelesi. Upoštevajte, da se ΔFosB, ne pa ΔFosB-LZM, robustno veže na PSMC5 ali PSMC5-NT, ne pa na PSMC5-CT ali PSMC5-ΔCC. Podatki, prikazani na sliki, so bili ponovljeni v trojniku v vsakem od treh ločenih poskusov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g001

živali

Za vse eksperimente smo uporabili devet moških C11BL / 57J mišjih samcih (The Jackson Laboratory). Živali so bile nameščene na 6-h svetlo-temnem ciklu z dostopom do hrane in vode ad libitum in so bili navajeni 1 teden pred poskusom. Uporabljena sta bila dva režima kokainskega zdravljenja. Za preučevanje biokemičnih učinkov kokaina so živali dobivale dnevne odmerke kokaina 7 (20 mg / kg) ali fiziološko raztopino in jih ubijale z odsesavanjem 24 h po zadnji injekciji. To je standardni protokol, za katerega se je pokazalo, da proizvaja številne molekularne in celične odzive na zdravilo.7]. Za preučevanje vpliva PSMC5 v jedru accumbens na vedenjske odzive na kokain smo uporabili podpazni odmerek zdravila (7.5 mg / kg; glej spodaj lokomotorno senzibilizacijo), ki temelji na hipotezi, da bi PSMC5 podobno kot ΔFosB povečal občutljivost živali na kokain [8]. Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo živali in uporabo na gori Sinaj.

Imunoprecipitacija in Western blotting

Neuro 2A celice so bile transficirane z divjimi ali mutantnimi oblikami PSMC5. Dva dni po transfekciji smo celice izprali v PBS, lizirali v RIPA pufru (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0.25% natrijev deoksiholat, 10 mM natrijev butirat, koktajl inhibitorja proteaze) . Lizati so bili razdeljeni in inkubirani z bodisi neimunim IgG (Sigma) ali anti-FLAG protitelesi (Sigma) za 3 hr pri 4 ° C. Imunoprecipitacijo smo izvedli z beljakovinami proteina G (Invitrogen), kot je opisano [19]. Na kratko, imunoprecipitirani proteini so bili izpostavljeni SDS-PAGE in analizirani z Western blot-om z uporabo anti-FosB / ΔFosB protitelesa (Cell Signaling Technology) na osnovi objavljenih protokolov [7]. Za in vivo teste za vezavo na beljakovine smo uporabili očiščene jedrske frakcije iz naščene miši po kroničnem zdravljenju s kancerom (20 mg / kg IP dnevno za 7 dni, pri miših pa smo uporabili 24 h po zadnji injekciji). Co-imunoprecipitacijo iz jedrskih frakcij smo izvedli z uporabo Nuclear Complex Co-IP kompleta (Active Motif) po navodilih proizvajalca. Uporabljena so bila naslednja protitelesa: MYC ali ß-aktin, tehnologija celične signalizacije (Danvers, MA), PSMC5 in histon H3, Abcam (Cambridge, MA), CBP, p300 in BRG1, biologija Santa Cruz (Santa Cruz, CA), in ZASTAVA M2, Sigma.

Imunohistokemija

Imunohistokemija je bila izvedena v skladu z objavljenimi postopki [20]. Miši smo anestezirali in perfundirali intrakardialno z 4% paraformaldehidom v PBS. Možgani so bili kriozastopani z 30% saharozo, nato pa zamrznjeni in shranjeni pri -80 ° C do uporabe. Koronalni odseki (40 μm) smo razrezali na kriostatu in obdelali za imunohistokemijo. Prosto plavajoči deli so bili predhodno inkubirani v blokirnem pufru, ki je vseboval 0.3% Triton in 3% normalnega seruma osel. ΔFosB smo odkrili z uporabo kozjega poliklonskega protitelesa, vzetega proti N-terminalnemu delu proteina (1 / 1000 Santa Cruz Biotechnology). PSMC5 smo odkrili z uporabo kunčjega poliklonskega protitelesa (1 / 100 Abcam, Cambridge, MA). Slike so bile posnete s konfokalnim mikroskopom (povečava 60x; Zeiss).

Lokomotorna senzibilizacija

Vse miši so dnevno dobivale injekcije solne raztopine IP za 3 dni, da bi jih prilagodile stresu injekcij. Naslednji dan so miši injicirali IP s fiziološko raztopino ali podpogojno dozo kokaina (7.5 mg / kg; glej pod Živali zgoraj) in takoj dali v nove lokomotorne škatle. Lokomotorna aktivnost miši je bila zabeležena z uporabo sistema fotonapetja, ker se odmikajo ambulantni žarki za 30 min. Ta zdravljenja so se ponavljala vsak dan v času 3 dni.

Virusno posredovan prenos gena

Uporabili smo obširno objavljene metode za prenos virusov z virusom [7,8,11,19]. Na kratko, ekspresijski plazmidi za PSMC5 ali za več njegovih mutantov (glej PSMC5 in ΔFosB konstrukte zgoraj) smo subklonirali v bicistronski p1005 (+) HSV plazmid, ki izraža GFP pod nadzorom CMV promotorja, in PSMC5 ali njegove mutante pod Promotor IE4 / 5. Pod anestezijo s ketaminom (100 mg / kg) / ksilazinom (10 mg / kg) so miši postavili v stereotaksični instrument z majhnimi živalmi in izpostavili površino lobanje. Za dvostransko infundiranje 0.5 μl HSV vektorja v NAc smo uporabili triintrideset igel z injekcijsko brizgo s kotom 10 ° (AP + 1.6; ML + 1.5; DV-4.4) s hitrostjo 0.1 μl / min. Živalim, ki so prejemale HSV injekcije, je bilo dovoljeno, da se opomorejo za 2 dni po operaciji pred poskusom.

Statistika

Uporabljeni so bili ANOVA in študentovi t-testi, popravljeni za večkratne primerjave, s pomembnostjo, nastavljeno na p <0.05.

Rezultati

PSMC5: novi vezni partner ΔFosB

Opravili smo predhodne poskuse za identifikacijo ustreznega fragmenta ΔFosB, ki je služil kot vaba v dvokomponentnem testu kvasovk brez samodejnega aktiviranja sistema. Holo-ΔFosB inducira lastno aktivnost reporterskega gena, prav tako kot N-terminalni aminokislinski fragment proteina 1-78. Vendar pa je N-terminalno okrnjeno ΔFosB (Slika 1A), imenovan Δ2ΔFosB, ki nima prvih aminokislin 78 proteina, ni imel tega učinka. Zato smo kot beljakovino vabe uporabili Δ2ΔFosB.

Za pregled potencialnih partnerjev smo uporabili mišjo možgansko knjižnico, ki je bila subklonirana v pPC86. Identificirali smo kandidate 11 za zavezujoče partnerje. Čeprav so ti proteini vključevali poznane heterodimerizacijske partnerje ΔFosB, c-Jun in JunD (Tabela 1), najbolj razširjen kandidat je bil PSMC5. Čeprav je bilo to presenetljivo, je bila zanimiva ugotovitev, saj je bila PSMC5 pred enim letom že prikazana, da se veže na c-Fos in vitro [21]. Vendar ni bilo predhodnih poročil o vpletenosti PSMC5 v delovanje kokaina. Kljub temu smo zaradi jakosti signala PSMC5 v dvokomponentnem testu kvasovke nadaljevali z raziskavami možnih interakcij ΔFosB-PSMC5.

thumbnail
Tabela 1. Rezultati dvo hibridnega presejanja kvasovk z Δ2ΔFosB.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.t001

Najprej smo za potrditev fizikalne interakcije med ΔFosB in PSMC5 izvedli in vitro eksperimente s soimunoprecipitacijo. Ugotovili smo, da je FLAG-označena PSMC5 (Slika 1B), transfektirane v celice Neuro 2A, učinkovito odstranjene ΔFosB (Slika 1C). Drugič, da bi identificirali regijo v PSMC5, ki je odgovorna za njeno vezavo na ΔFosB, smo ustvarili več mutantov PSMC5, označenih s FLAG (Slika 1B) in ponovili so-imunoprecipitacijski eksperiment. ΔFosB je bil učinkovito potegnjen z aminokislinami N-končnega 151 iz PSMC5 (PSMC5-NT), vendar ne s C-terminalnim 172 aminokislinskim fragmentom proteina (PSMC5-CT) (Slika 1C). PSMC5, ki ni imel domene z zvitim navitjem (PSMC5-ΔCC), je bil prav tako neučinkovit pri obarjanju ΔFosB. Te ugotovitve kažejo, da PSMC5 veže ΔFosB preko domene z navitjem (aminokisline 27 – 68). Še več, FLAG-označeni PSMC5 ni oboril mutantne oblike ΔFosB z mutirano levcinsko zadrgo (ΔFosB-LZM) (Slika 1C), ki kaže, da ΔFosB bodisi veže PSMC5 preko te domene ali, bolj verjetno, da je potrebna heterodimerizacija ΔFosB za vezavo PSMC5.

Vezava PSMC5-ΔFosB v NAc po kronični uporabi kokaina

Na podlagi teh ugotovitev in vitro smo preučevali, ali se ravni PSMC5 v NAc spremenijo kot odziv na kronično uporabo kokaina. S podcelično frakcionacijo in Western blotiranjem smo ugotovili, da kronični kokain poveča jedrske ravni PSMC5 v tej možganski regiji brez spremembe v citoplazemskih ravneh (Slika 2A). Tega učinka niso opazili po enkratnih odmerkih kokaina (podatki niso prikazani). V nadaljevanju smo pregledali lokalizacijo PSMC5 in ΔFosB v NAc s konfokalno imunofluorescenčno mikroskopijo. Analizirali smo miši 24 h po zadnjem ponovljenem odmerku kokaina, časovni točki, ko je ΔFosB edini, ki ga je mogoče zaznati FosB genskega produkta (glej Nestler 2008). Ugotovili smo močno imunoreaktivnost PSMC5 v NAc, vključno z močnim jedrskim signalom. ~ 85% jeder ΔFosB +, ki so bili obarvani za PSMC5 (Slika 2B). Poleg tega smo izvedli eksperimente s soimunoprecipitacijo na ekstraktih NAc in ugotovili, da je bil ΔFosB po kroničnem zdravljenju s kokainom učinkovito potegnjen s protitelesom anti-PSMC5 (Slika 2C). V nasprotju s tem pa analiza NAc, ki še ni bila zdravljena z zdravilom (po ponavljajočih se injekcijah slanice), ni pokazala, da bi se ΔFosB potegnil navzdol (podatki niso prikazani). Ti podatki so skladni z našimi ugotovitvami v celični kulturi in potrjujejo, da ΔFosB in PSMC5 medsebojno delujeta v NAc in vivo.

thumbnail
Slika 2. Regulacija PSMC5 pri mišji NAc.

 

A. Western blotiranje jedrskih in citosolnih frakcij NAc miši, ki so jih 20 dni dnevno zdravili s fiziološko raztopino ali kokainom (7 mg / kg), pri 24-urni analizi živali po zadnji injekciji. Kokain poveča jedrske, vendar ne citosolne ravni PSMC5. Za nadzor nalaganja sta bila uporabljena histon H3 in ß-aktin, na katere kokain ni vplival. Podatki so povprečni ± SEM (n = 8–10 / skupina, * p <0.05). B. Kolokalizacija endogenih PSMC5 (zelena) in ΔFosB (modra) pri NAc miši, ki so bile kronično obdelane s kokainom kot v AC Jedrski lizati miši NAc po kroničnem zdravljenju s kokainom so bili podvrženi imunoprecipitaciji s protitelesom proti PSMC5 ali IgG miši kot kontrolo , nato pa Western popival s protitelesi proti FosB / ΔFosB. Slika prikazuje interakcije PSMC5-ΔFosB v NAc in vivo. Podatki v B in C so bili ponovljeni v treh izvodih v vsakem od treh ločenih poskusov.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g002

PSMC5 poveča ekspresijo ΔFosB in vitro

Ker je PSMC5 znan član proteasomskega kompleksa, smo testirali, ali regulira nivoje ΔFosB s celicami Rat 1A. Prekomerna ekspresija PSMC5 ni vplivala na bazalne ravni ΔFosB, vendar je povzročila majhno, vendar pomembno povečanje indukcije ΔFosB pri serumski stimulaciji celic (Slika 3A). Podoben trend je bil opažen pri polni dolžini FosB, vendar učinek ni dosegel statistične pomembnosti. Nasprotno pa supresija endogene ekspresije PSMC5 v celicah podganjih 1A, doseženih z uporabo siRNA, ki so usmerjene na PSMC5, ni vplivala na bazalne koncentracije ΔFosB, temveč močno inhibirala indukcijo ΔFosB z stimulacijo seruma (Slika 3B). Podobni učinki so bili opaženi pri polni dolžini FosB. Ti podatki kažejo, da PSMC5 ne spodbuja proteasomalne razgradnje ΔFosB, kot bi lahko pričakovali kot jedrno podenoto proteasoma, ampak je potrebna za maksimalno kopičenje FosB in vitro, morda s stabilizacijo proteinov.

thumbnail
Slika 3. Regulacija PSMC5 izražanja FosB / ΔFosB v celicah podganjih 1A.

 

A. Celice podgan 1A so bile transficirane s 4 μg PSMC5 ali kontrolne DNA. Prekomerna ekspresija PSMC5 ni vplivala na ravni bazalne ekspresije beljakovin FosB ali ΔFosB, kot je bilo določeno z Western blottingom, vendar je povzročila majhno, a pomembno povečanje indukcije ΔFosB s serumsko stimulacijo (F (2,21) = 9.75, p = 0.001). B. Celice podgan 1A so bile transficirane s 5 pmol ene od dveh siRNA ali pomešane RNA (kontrola). Obe siRNA sta učinkovito zmanjšali raven beljakovin PSMC5 v primerjavi s kontrolnimi pogoji (siRNA # 1, 23 ± 5% nadzora; siRNA # 2, 18 ± 6%; p <0.05; n = 4). Nošenje PSMC5 ni vplivalo na bazalne ravni FosB ali ΔFosB, vendar je oslabilo indukcijo FosB in ΔFosB s serumsko stimulacijo (FosB: F (2,6) = 20.99, p = 0.002; ΔFosB: F (2,6) = 22.83 p = 0.002).

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g003

ΔFosB in PSMC5 tvorita komplekse s CBP, p300 in BRG1 v NAc \ t

Za boljše razumevanje transkripcijskih mehanizmov, s katerimi bi PSMC5 lahko vplival na funkcijo ΔFosB, smo raziskali možne dodatne zavezujoče partnerje za dva proteina v NAc pri kroničnih pogojih, ki jih zdravimo s kokainom. Obstaja eno poročilo, da se PSMC5 veže na CBP - HAT - in poveča acetilacijo histona H3 na proksimalnem promotorju MHC-II v celicah HeLa [22]. Poleg tega miši s pomanjkanjem CBP kažejo zmanjšano občutljivost na kokain kot tudi zmanjšano acetilacijo histona pri FosB promotor [23]. Tako smo testirali, ali se lahko PSMC5 veže z ΔFosB kot del kompleksov, ki vsebujejo tudi CBP in morda druge transkripcijske aktivatorje.

Najprej smo dokazali, da je ΔFosB v celicah Neuro300A učinkovito odstranil tako CBP kot p2, s tem povezan HAT,Slika 4A). V nasprotju s tem, leucinska zadrga mutantna oblika ΔFosB, kot je bilo pričakovano, ni pokazala te aktivnosti. Podobno je PSMC5 učinkovito odstranil CBP in p300 (Slika 4B). Zanimivo je, da je bil ta učinek opazen tudi za PSMC5-ΔCC, ki ni potegnil ΔFosB, kar kaže, da PSMC5 medsebojno deluje s CBP in p300 preko drugih področij proteina in neodvisno od njegove vezave na ΔFosB.

thumbnail
Slika 4. ΔFosB in PSMC5 medsebojno delujejo s CBP, p300 in BRG1 in vitro in in vivo.

 

A. Neuro2A celice so bile transficirane z 2.4 μg MYC-označenih ΔFosB ali MYC-označenih ΔFosB-LZM. Celične ekstrakte smo imunoprecipitirali z anti-CBP ali anti-p300 protitelesom in precipitati smo Western blotirali z istim protitelesom ali z anti-MYC protitelesom. Tako CBP kot p300 medsebojno delujejo z ΔFosB in takšne interakcije zahtevajo nedotaknjeno levcinsko zadrgo. B. Neuro2A celice so bile transficirane z 2.4 μg FLAG-označenih PSMC5 ali FLAG-označenih PSMC5-DCC. Celične ekstrakte smo imunoprecipitirali z anti-CBP ali anti-p300 protitelesom in precipitati smo Western blotirali z istim protitelesom ali z anti-FLAG protitelesom. Tako CBP kot p300 sodelujeta s PSMC5 in takšne interakcije ne zahtevajo domene CC. C. Jedrski lizati mišjega NAc po kroničnem zdravljenju s kokainom smo imunoprecipitirali z anti-CBP ali anti-p300 protitelesom. Nadaljnje Western blotiranje nastalih oborin z anti-FosB / ΔFosB protitelesom je pokazalo endogene interakcije med ΔFosB in CBP / p300. D. Alikvoti istih jedrnih lizatov smo imunoprecipitirali z anti-BRG1 ali anti-PSMC5 protitelesom, čemur je sledilo Western blotiranje precipitatov z anti-FosB / ΔFosB ali anti-BRG1 protitelesom. Rezultati kažejo endogene interakcije med ΔFosB in BRG1 ter BRG1 in PSMC5. E. Shematska ilustracija transkripcijskega aktivacijskega kompleksa, sestavljenega iz ΔFosB: JunD heterodimerjev, ki sodelujejo s CBP / p300, BRG1 in PSMC5.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g004

Da bi potrdili, da se te interakcije pojavljajo tudi in vivo, smo kronično aplicirali kokain, da induciramo ΔFosB in jedrne nivoje PSMC5, nato imunoprecipitirane NAc ekstrakte s protitelesi proti CBP ali anti-p300. V skladu z našimi podatki o celični kulturi je imunoprecipitacija CBP ali p300 učinkovito odstranila ΔFosB (Slika 4C). Testirali smo, ali se lahko BRG1, jedrna podenota kompleksa preoblikovanja kromatina SWI-SNF, veže tudi na ΔFosB in PSMC5, na podlagi naše prejšnje ugotovitve, da je BRG1 izbran za določene ΔFosB ciljne gene skupaj z njihovo aktivacijo v NAc po kroničnem kokainu [24]. Ugotovili smo, da imunoprecipitacija BRG1 potegne ΔFosB v ekstraktih NAc in da je imunoprecipitacija PSMC5 prav tako koprecipitirala endogeni BRG1 (Slika 4D). Ti rezultati skupaj kažejo, da ΔFosB-PSMC5 tvorijo komplekse v NAc, ki vključujejo tudi CBP / p300 in BRG1 (Slika 4E).

Prekomerna ekspresija PSMC5 poveča lokomotorni odziv na kokain

Izrazita vezava PSMC5 z ΔFosB v NAc nas je spodbudila, da preučimo, ali povečanje ravni PSMC5 v tej regiji možganov uravnava vedenjske odzive na kokain. Ustvarili smo vektor Herpes Simplex Virus (HSV), ki prekomerno izraža bodisi divji tip PSMC5 bodisi enega njegovih mutantov in validiral vektorje v NAc in vivo (Slika 5A). Virusno posredovana ekspresija PSMC5 prevladuje v celičnem jedru (Slika 5B). Miši, ki prekomerno izražajo divji tip PSMC5, niso pokazale spremenjenih odzivov na začetne odmerke kokaina, vendar so pokazale povečano lokomotorno aktivacijo kot odziv na ponavljajoče se odmerke kokaina v primerjavi z kontrolnimi mišmi, ki izražajo GFP. V nasprotju s tem pa miši, ki prekomerno izražajo mutirano obliko PSMC5, ki nima domene z zvitkom (PSMC5-ΔCC), niso pokazale tega učinka (Slika 5B). Zanimivo je, da prekomerna ekspresija PSMC5-K196M, ki nima ATPazne aktivnosti divjega tipa beljakovine, tudi okrepi lokomotorne odzive kokaina.

thumbnail
Slika 5. Prekomerna ekspresija PSMC5 v NAc poveča lokomotorne odzive na kokain.

 

A. Reprezentativna ekspresija transgena s HSV v medialnem NAc. AC, sprednja komisura. Na sliki so zabeležene jedrne in lupinske podregije NAc. B. Reprezentativne večje povečave (60x) imunohistokemičnega obarvanja PSMC5 v NAc nevronih po injiciranju HSV-PSMC5, ki kažejo, da je beljakovina pretežno jedrska, kar označuje obarvanje DAPI. C. Miške so prejemale dvostranske injekcije HSV v NAc, čemur so sledile vsakodnevne injekcije IP podpražnih odmerkov kokaina (7.5 mg / kg). Lokomotorni odzivi so prikazani kot odziv na prvi in ​​zadnji od 3 dnevnih odmerkov zdravila. Prekomerno izražanje PSMC5 ali PSMC5-K196M poveča lokomotorne odzive na ponavljajoč se kokain, kar pri PSMC5-ΔCC ni opaziti. Transgeni niso pomembno vplivali na gibalni odziv na začetne odmerke kokaina. ANOVA F (3,125) = 4.163, * p <0.05 po Dunnettovem posthoc testu.

doi: 10.1371 / journal.pone.0126710.g005

Razprava

Rezultati te študije razkrivajo nov mehanizem, s katerim ΔFosB posreduje njegove učinke na možgane in nov mehanizem, povezan z delovanjem kokaina. Z uporabo nepristranskega pristopa, dvokomponentnega testa kvasovk, smo PSMC5 identificirali kot novega zavezujočega partnerja za ΔFosB. To ugotovitev smo potrdili tako v kultiviranih celicah in vitro kot v NAc in vivo z dokazovanjem robustne vezave PSMC5-ΔFosB. Pomembno je, da se jedrske ravni PSMC5 inducirajo v NAc s kronično kokainsko administracijo. Nadalje smo pokazali, da se vezava PSMC5-ΔFosB dogaja skupaj z več drugimi transkripcijskimi aktivatorskimi beljakovinami, in sicer s CBP in p300 (dvema HATs) in BRG1 (ključno sestavino kompleksov preoblikovanja kromatina SWI-SNF). Naše ugotovitve skupaj potrjujejo hipotezo, da je PSMC5 del transkripcijskega aktivacijskega kompleksa, ki ga v času kronične uporabe kokaina zberejo vsaj nekateri geni, ki jih povzroča ΔFosB.Slika 4E). V skladu s to hipotezo je dodatna ugotovitev, da prekomerna ekspresija PSMC5 v NAc, kot tudi prekomerna ekspresija samega ΔFosB, spodbuja vedenjske odzive na kokain. V prihodnjih študijah bi bilo zanimivo spremljanje teh in vivo opazovanj z karakterizacijo interakcij PSMC5-ΔFosB-HAT-BRG1 z uporabo in vitro reporterskih testov.

Vključevanje PSMC5 v delovanje kokaina je povsem novo. Identificirano na začetku kot član velike družine ATPaz, ki obsega proteasom, je bilo dokazano, da je PSMC5 v preteklih letih interakiral z več transkripcijskimi faktorji, vključno s c-Fos, p53, jedrskimi hormonskimi receptorji in sestavinami kompleksa bazalne transkripcije.25], vendar je bilo nekaj let izvedenih nekaj funkcionalnih študij [26]. Najbolj uveljavljeno delovanje je spodbujanje aktivnosti transkripcijskih faktorjev MYC v kultiviranih celicah [27]. Pomen PSMC5 v transkripcijskih mehanizmih je predlagal potencialno vlogo za ubikvitinacijsko-proteasomalno aktivnost pri regulaciji transkripcije genov, vendar je vključenost PSMC5 v takšno ureditev do sedaj še vedno nepreverjena.28,29].

O funkciji PSMC5 v možganih je znanega zelo malo. Prejšnja študija je pokazala razširjeno izražanje mRNA PSMC5 v možganih [30], vendar je njegova funkcionalna dejavnost ostala neproučena. Naše ugotovitve zdaj zahtevajo nadaljnje raziskave te zanimive beljakovine, da bi bolje razumeli njeno vlogo pri regulaciji transkripcije genov in njeni povezavi z ubiquitination-proteasomalno funkcijo v možganih. Vezava PSMC5 na ΔFosB je posredovana z zvijeno domeno PSMC5. Poleg tega sposobnost PSMC5a za spodbujanje lokomotornih odzivov na kokain, medtem ko zahteva domeno z navitjem, ne zahteva ATPazne aktivnosti, ki je lastna proteinu. Ti rezultati povečujejo možnost, da bi lahko vsaj v našem sistemu glavno aktivnost PSMC5 posredovali preko njegove vezave na ΔFosB in druge transkripcijske regulatorne proteine ​​in ne preko njegove aktivnosti, povezane s proteasomom. Nadaljnje delo je potrebno za neposredno preizkušanje te in alternativne možnosti. Hipoteza, da je virusna prekomerna ekspresija PSMC5 povečala lokomotorne odzive na kokain prek interakcij z ΔFosB, je verjetna kljub uporabi sheme zdravljenja s kokainom 3 dan, ker je znano, da se v tem času v možganih kopičijo občutne ravni ΔFosB3].

Sedanje ugotovitve dodatno utemeljujejo koristnost uporabe nepristranskih, odprtih eksperimentalnih pristopov pri proučevanju molekularne osnove regulacije možganov. Naša začetna pozornost na PSMC5 je temeljila izključno na njeni vidni vezavi na ΔFosB v dvokomponentnem testu kvasovk, vendar se zdi, da je pomembna sestavina transkripcijskih sprememb, ki se v NAc zaposlijo s ponavljajočo uporabo kokaina. Boljše razumevanje podrobnih mehanizmov, s katerimi se jedrske ravni PSMC5 inducirajo s kokainom, in s tem, da PSMC5 nato prispeva k kokainom induciranim transkripcijskim aktivacijskim kompleksom, so v središču trenutnih raziskav. Medtem pa sta naša dva hibridna testa za kvas odkrila več dodatnih domnevnih veznih partnerjev ΔFosB (Tabela 1), ki prav tako upravičujejo neposreden pregled modelov kokaina. To delo skupaj prispeva k večjemu razumevanju kompleksnih molekularnih mehanizmov, prek katerih kokain spreminja funkcijo NAc.

Priznanja

To delo so podprli štipendije Nacionalnega inštituta za zlorabo drog ter fundacija Ishibashi in Japonsko društvo za promocijo znanosti (KAKENHI številke: 24591735, 26290064, 25116010).

Prispevki avtorjev

Zasnovali in oblikovali so eksperimente: YHO YNO EJN. Izvedeni poskusi: YHO YNO PJK RN. Analizirani podatki: YHO YNO EJN. Prispevani reagenti / materiali / orodja za analizo: TN MO OY AN RN TT. Napisal je članek: YHO EJN.

Reference

  1. 1. Morgan JI, Curran T (1995) Takojšnji zgodnji geni: deset let pozneje. Trendi Neurosci 18: 66 – 67. pmid: 7537412 doi: 10.1016 / 0166-2236 (95) 80022-t
  2. 2. Nestler EJ (2008) Transkripcijski mehanizmi odvisnosti: vloga deltaFosB. Philos Trans R Soc London B Biol Sci 363: 3245 – 3255. doi: 10.1098 / rstb.2008.0067. pmid: 18640924
  3. Poglej članek
  4. PubMed / NCBI
  5. Google Scholar
  6. Poglej članek
  7. PubMed / NCBI
  8. Google Scholar
  9. Poglej članek
  10. PubMed / NCBI
  11. Google Scholar
  12. Poglej članek
  13. PubMed / NCBI
  14. Google Scholar
  15. Poglej članek
  16. PubMed / NCBI
  17. Google Scholar
  18. Poglej članek
  19. PubMed / NCBI
  20. Google Scholar
  21. Poglej članek
  22. PubMed / NCBI
  23. Google Scholar
  24. Poglej članek
  25. PubMed / NCBI
  26. Google Scholar
  27. Poglej članek
  28. PubMed / NCBI
  29. Google Scholar
  30. Poglej članek
  31. PubMed / NCBI
  32. Google Scholar
  33. Poglej članek
  34. PubMed / NCBI
  35. Google Scholar
  36. Poglej članek
  37. PubMed / NCBI
  38. Google Scholar
  39. Poglej članek
  40. PubMed / NCBI
  41. Google Scholar
  42. Poglej članek
  43. PubMed / NCBI
  44. Google Scholar
  45. Poglej članek
  46. PubMed / NCBI
  47. Google Scholar
  48. Poglej članek
  49. PubMed / NCBI
  50. Google Scholar
  51. Poglej članek
  52. PubMed / NCBI
  53. Google Scholar
  54. Poglej članek
  55. PubMed / NCBI
  56. Google Scholar
  57. Poglej članek
  58. PubMed / NCBI
  59. Google Scholar
  60. Poglej članek
  61. PubMed / NCBI
  62. Google Scholar
  63. Poglej članek
  64. PubMed / NCBI
  65. Google Scholar
  66. Poglej članek
  67. PubMed / NCBI
  68. Google Scholar
  69. Poglej članek
  70. PubMed / NCBI
  71. Google Scholar
  72. Poglej članek
  73. PubMed / NCBI
  74. Google Scholar
  75. Poglej članek
  76. PubMed / NCBI
  77. Google Scholar
  78. Poglej članek
  79. PubMed / NCBI
  80. Google Scholar
  81. Poglej članek
  82. PubMed / NCBI
  83. Google Scholar
  84. Poglej članek
  85. PubMed / NCBI
  86. Google Scholar
  87. Poglej članek
  88. PubMed / NCBI
  89. Google Scholar
  90. 3. Hope BT, Nye HE, Kelz MB, Self DW, Iadarola MJ, Nakabeppu Y, et al. (1994) Indukcija dolgotrajnega kompleksa AP-1, ki ga sestavljajo spremenjeni Fos-podobni proteini v možganih s kroničnim kokainom in drugimi kroničnimi zdravljenji. Nevron 13: 1235 – 1244. pmid: 7946359 doi: 10.1016 / 0896-6273 (94) 90061-2
  91. 4. Hiroi N, Brown J, Haile C, Ye H, Greenberg ME, Nestler EJ (1997) FosB mutirane miši: Izguba kronične indukcije kokaina proteinov, povezanih s Fosom, in povečana občutljivost na psihomotorične in koristne učinke kokaina. Proc Natl Acad Sci USA 94: 10397–10402. pmid: 9294222 doi: 10.1073 / pnas.94.19.10397
  92. 5. Ulery PG, Rudenko G, Nestler EJ (2006) Regulacija stabilnosti ΔFosB s fosforilacijo. J Neurosci 26: 5131 – 5142. pmid: 16687504 doi: 10.1523 / jneurosci.4970-05.2006
  93. 6. Carle TL, Ohnishi YN, Ohnishi YH, Alibhai IN, Wilkinson MB, Kumar A, et al. (2007) Odsotnost konzervirane C-terminalne degronske domene prispeva k edinstveni stabilnosti ΔFosB. Eur J Neurosci 25: 3009 – 3019. pmid: 17561814
  94. 7. Robison AJ, Vialou V, Mazei-Robison M, Feng J, Kourrich S, Collins M, et al. Vedenjski in strukturni odzivi na kronični kokain zahtevajo povratno zanko, ki vključuje ΔFosB in CaMKII v lupini nucleus accumbens. J Neurosci 2013: 33 – 4295 doi: 4307 / JNEUROSCI.10.1523-5192. pmid: 12.2013
  95. 8. Kelz MB, Chen J, Carlezon WA Jr, Whisler K, Gilden L, Beckmann AM, et al. (1999) Izražanje transkripcijskega faktorja ΔFosB v možganih nadzoruje občutljivost na kokain. Narava 401: 272 – 276. pmid: 10499584
  96. 9. Colby CR, Whisler K, Steffen C, Nestler EJ, Self DW (2003) ΔFosB povečuje spodbudo za kokain. J Neurosci 23: 2488 – 2493. pmid: 12657709
  97. 10. McClung CA, Nestler EJ (2003) Regulacija izražanja genov in kokainske nagrade s strani CREB in DFosB. Nat Neurosci 11: 1208 – 1215. pmid: 14566342 doi: 10.1038 / nn1143
  98. 11. Zachariou V, Bolanos CA, Selley DE, Theobald D, Cassidy MP, Kelz MB, et al. (2006) ΔFosB: Bistvena vloga ΔFosB v nucleus accumbens v delovanju morfina. Narava Neurosci 9: 205 – 211. pmid: 16415864 doi: 10.1038 / nn1636
  99. 12. Peakman MC, Colby C, Perrotti LI, Tekumalla P, Carle T, Ulery P, et al. (2003) Specifična ekspresija dominantnega negativnega mutanta c-Jun v transgenih miših na področju možganske regije zmanjša občutljivost na kokain. Brain Res 970: 73 – 86. pmid: 12706249 doi: 10.1016 / s0006-8993 (03) 02230-3
  100. 13. Chen J, Nye HE, Kelz MB, Hiroi N, Nakabeppu Y, et al. (1995) Regulacija delta FosB in FosB podobnih beljakovin z elektrokonvulzivnim napadom in zdravljenjem s kokainom. Mol Pharmacol 48: 880-889. pmid: 7476919
  101. 14. Hiroi N, Marek GJ, Brown J, Ye H, Saudou F, Vaidya VA, et al. (1998) Bistvena vloga gena fosB v molekularnem, celičnem in vedenjskem delovanju elektrokonvulzivnih napadov. J Neurosci 18: 6952 – 6962. pmid: 9712664
  102. 15. Perez-Otano I, Mandelzys A, Morgan JI (1998) MPTP Parkinsonizem spremlja trajna ekspresija D-FosB podobnega proteina v dopaminergičnih poteh. Mol Brain Res 53: 41 – 52. pmid: 9473580 doi: 10.1016 / s0169-328x (97) 00269-6
  103. 16. Ma J, Ptashne M (1988) Pretvorba evkariontskega transkripcijskega inhibitorja v aktivator. Celica 55: 443 – 446. pmid: 3180218 doi: 10.1016 / 0092-8674 (88) 90030-x
  104. 17. Chien CT, Bartel PL, Sternglanz R, Fields S (1991) Dvo-hibridni sistem: metoda za identifikacijo in kloniranje genov za beljakovine, ki medsebojno delujejo z zanimanim beljakovinam. Proc Natl Acad Sci ZDA 88: 9578 – 9582. pmid: 1946372 doi: 10.1073 / pnas.88.21.9578
  105. 18. Nakabeppu Y 1, Oda S, Sekiguchi M (1993) Proliferativna aktivacija mirujočih celic Rat-1A z delto FosB. Mol Cell Biol 13: 4157 – 4166. pmid: 8321220
  106. 19. Scobie KN, Damez-Werno D, Sun H, Shao N, Gancarz A, Panganiban CH, et al. (2014) Bistvena vloga poli (ADP-ribozila) v delovanju kokaina. Proc Natl Acad Sci ZDA 111: 2005 – 2010. doi: 10.1073 / pnas.1319703111. pmid: 24449909
  107. 20. Perrotti LI, Weaver RR, Robison B, Renthal W, Maze I, Yazdani S, et al. (2008) Različni vzorci indukcije ΔFosB v možganih zaradi zlorabe drog. Synapse 62: 358 – 369. doi: 10.1002 / syn.20500. pmid: 18293355
  108. 21. Wang WL, Chevray PM, Nathans D (1996) Sesalski Sug1 in c-Fos v jedrskem 26S proteasomu. Proc Natl Acad Sci ZDA 93: 8236 – 8240. pmid: 8710853 doi: 10.1073 / pnas.93.16.8236
  109. 22. Koues OI 1, Dudley RK, Truax AD, Gerhardt D, Bhat KP, McNeal S, et al. (2008) Regulacija acetilacije pri glavnem proksimalnem promotorju kompleksa histokompatibilnosti II s 19S proteasomalno ATPazo Sug1. Mol Cell Biol 28: 5837 – 5850. doi: 10.1128 / MCB.00535-08. pmid: 18662994
  110. 23. Levine AA, Guan Z, Barco A, Xu S, Kandel ER, Schwartzov JH (2005) CREB-vezavni protein nadzoruje odziv na kokain z acetiliranjem histonov na fosB promotorju v striatumu miške. Proc Natl Acad Sci ZDA 102: 19186 – 19191. pmid: 16380431 doi: 10.1073 / pnas.0509735102
  111. 24. Kumar A, Choi KH, Renthal W, Tsankova NM, Theobald DEH, Truong HT, et al. (2005) Preoblikovanje kromatina je ključni mehanizem, ki temelji na plastičnosti v striatumu, ki jo povzroča kokain. Nevron 48: 303 – 314. pmid: 16242410 doi: 10.1016 / j.neuron.2005.09.023
  112. 25. St-Arnaud R (1999) Dvojne funkcije za transkripcijske regulatorje: mit ali resničnost. J Cell Biochem Suppl 32/33: 32–40. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4644 (1999) 75: 32+ <32 :: aid-jcb5> 3.0.co; 2-x
  113. 26. Ferrell K, Wilkinson CRM, Dubiel W, Gordon C (2000) Interakcije regulativne podenote proteazoma 26S, kompleksen problem. Trendi Biochem Sci 25: 83 – 88. pmid: 10664589 doi: 10.1016 / s0968-0004 (99) 01529-7
  114. 27. von der Lehr N, Johansson S, Larson LG (2003) Vpliv ubiquitin / proteasome sistema v myc-regulirano transkripcijo. Cikel celice 2 – 5: 403 – 407. doi: 10.4161 / cc.2.5.484
  115. 28. Geng FQ, Wenzel S, Tansey WP (2012) Ubiquitin in proteasomi v transkripciji. Annu Rev Biochem 81: 177 – 201. doi: 10.1146 / annurev-biochem-052110-120012. pmid: 22404630
  116. 29. Collins GA, Tansey WP (2006) Proteasom: uporabno orodje za transkripcijo? Op. Gen. Dev 16: 197 – 202. pmid: 16503126
  117. 30. Sun DH, Swaffield JC, Johnston SA, Milligan CE, Zoeller RT, Schwartz LM (1997) Identifikacija filogenetsko ohranjenega družinskega člana Sug1 CAD, ki je različno izražen v živčnem sistemu miši. Dev Neurobiol 33: 877–890. doi: 10.1002 / (sici) 1097-4695 (199712) 33: 7 <877 :: aid-neu2> 3.0.co; 2-5