Umik povzroči različne vzorce ekspresije FosB / BFosB pri samcih s poreklom iz Švice, ki so uvrščene kot dovzetne in odporne na lokomotorno senzibilizacijo, povzročeno z etanolom (2014).

Farmakol Biochem Behav. 2014 Feb; 117: 70-8. doi: 10.1016 / j.pbb.2013.12.007. Epub 2013 Dec 16.

De Pauli RF1, Coelhoso CC2, Tesone-Coelho C2, Linardi A3, Mello LE2, Silveira DX1, Santos-Junior JG4.

Minimalizem

Kronična izpostavljenost zdravilom in umik zdravil povzročata ekspresivno nevronsko plastičnost, ki bi jo lahko šteli za funkcionalne in patološke odzive. Ugotovljeno je, da ima nevronska plastičnost v limbičnem sistemu ključno vlogo pri relapsu kot tudi v kompulzivnih značilnostih odvisnosti od drog. Čeprav povečanje izraženosti FosB / DeltaFosB predstavlja eno najpomembnejših oblik nevronske plastičnosti pri zasvojenosti z drogami, ni jasno, ali predstavljajo funkcionalno ali patološko plastičnost. Pomembno je, da so posamezne razlike v prehodu iz rekreacijske rabe v odvisnost od drog. O teh razlikah so poročali v študijah, ki so vključevale paradigmo za lokomotorno senzibilizacijo, povzročeno z etanolom. V tej študiji smo raziskali, ali se senzibilizirani in nesenzibilizirani miši razlikujejo glede na izraz FosB / DeltaFosB. Odrasle moške švicarske miši so bile dnevno obdelane z etanolom ali slanico za 21dni. Glede na lokomotorno aktivnost v fazi pridobivanja so bile razvrščene kot senzibilizirane (EtOH_High) ali ne-senzibilizirane (EtOH_Low). Po 18h ali 5days so bili njihovi možgani obdelani za imunohistokemijo FosB / DeltaFosB. Na 5 dan umika smo opazili povečano izražanje FosB / DeltaFosB v skupini EtOH_High (v motorni skorji), v skupini EtOH_Low (v ventralnem tegmentalnem območju) in v obeh skupinah (v striatumu). Razlike so bile bolj dosledne v skupini EtOH_Low. Zato je bila vedenjska variabilnost, opažena v fazi pridobivanja etanolno inducirane senzorizacije lokomotorja, spremljala diferencialna nevronska plastičnost v karenci. Poleg tega se zdi, da so različni vzorci ekspresije FosB / DeltaFosB, odkriti v občutljivih in nesenzibiliziranih miših, bolj povezani s karenco kot s kronično izpostavljenostjo zdravilom. Nazadnje, povečanje izražanja FosB / DeltaFosB med karenco se lahko šteje kot posledica funkcionalne in patološke plastičnosti.

 


Izbor

  • Izraz DeltaFosB je pomembna oblika nevronske plastičnosti pri odvisnosti od drog

  • Vendar ni jasno, ali predstavlja funkcionalno ali patološko plastičnost.

  • Tukaj smo ugotovili razlike v DeltaFosB pri občutljivih in nesenzibiliziranih miših.

  • Te razlike so bolj povezane s karenco kot z izpostavljenostjo drog.

  • Predlagamo, da te spremembe predstavljajo funkcionalno in patološko plastičnost.


Ključne besede

  • FosB;
  • DeltaFosB;
  • Lokomotorna senzibilizacija;
  • Odstop;
  • Vedenjska spremenljivost;
  • Miši

1. Predstavitev

Izziv sedanjih nevrobioloških raziskav pri zasvojenosti z drogami je razumeti mehanizme nevronske plastičnosti, ki posredujejo prehod od rekreacijske uporabe k izgubi vedenjskega nadzora nad iskanjem drog in jemanjem drog. Ena od najpomembnejših teorij zasvojenosti z drogami, imenovana »temna stran zasvojenosti«, kaže, da gre za napredovanje od impulzivnosti (povezane s pozitivno okrepitvijo) do kompulzivnosti (povezane z negativno okrepitvijo). Ta napredek, v kolapsnem ciklu, zajema naslednja stanja: preobremenjenost / predvidevanje, zastrupitev, umik / negativni učinek (Koob in Le Moal, 2005, Koob in Le Moal, 2008 in Koob in Volkow, 2010). Iz tega scenarija se študije odvisnosti od drog osredotočajo na nevrobiološke mehanizme, povezane z negativnimi čustvenimi stanji, ki izhajajo iz akutne in dolgotrajne abstinence. V skladu s teorijo »temne strani odvisnosti« se zdi, da se pojavljajo dolgotrajne in vztrajne plastičnosti v nevronskih tokokrogih, katerih namen je omejiti nagrado. Vendar te spremembe plastičnosti vodijo do negativnega čustvenega stanja, ki se pojavi, ko se prepreči dostop do zdravila. Ta mehanizem zagotavlja močno motivacijsko spodbudo za vzpostavitev odvisnosti, pa tudi za njeno vzdrževanje (Koob in Le Moal, 2005 in Koob in Le Moal, 2008).

Lokomotorna senzibilizacija je uporaben živalski model, ki temelji na dejstvu, da so povečanja subjektivnih učinkov zdravil ob njihovi večkratni izpostavljenosti podobno povečanju v drogih stimuliranih lokomotornih učinkih (Vanderschuren in Kalivas, 2000 in Vanderschuren in Pierce, 2010). Čeprav lokomotorna senzibilizacija ne posnema več vedenj, povezanih z zasvojenostjo z drogami, so njene časovne morfološke in nevrokemijske lastnosti vzporedne s tistimi, ki vodijo v prehod iz rekreativne uporabe na samo odvisnost od drog (Robinson in Kolb, 1999, Vanderschuren in Kalivas, 2000 in Vanderschuren in Pierce, 2010). Tradicionalno protokol lokomotorne senzibilizacije obsega tri faze: pridobitev (ponavljajoča se izpostavljenost zdravilu), karenca in izziv (nov stik z zdravilom po karenci). Na žalost se je večina študij, ki so uporabljale lokomotorno senzibilizacijo, osredotočila le v fazi pridobivanja in izzivanja, s čimer se je prekinjalo obdobje prekinjanja.

Ugotovljeno je, da ponavljajoča se izpostavljenost mamilom (Perrotti et al., 2008) in kronični stres (Perrotti et al., 2004) poveča izražanje transkripcijskega faktorja fosB / deltafosB v kortikolimbičnem sistemu. Akumulacija FosB / DeltaFosB v teh regijah domnevno igra osrednjo vlogo pri odpornosti na stres (Berton et al., 2007 in Vialou et al., 2010) in v koristnih učinkih kokaina (\ tHarris et al., 2007 in Muschamp et al., 2012), etanol (Kaste et al., 2009 in Li et al., 2010) in opioidi (Zachariou et al., 2006 in Solecki et al., 2008). Zato je možno, da FosB / DeltaFosB modulira nekatere dogodke nevronske plastičnosti, povezane z etanolom povzročeno senzibilizacijo lokomotorja, pa tudi umik, ki sledi fazi pridobivanja lokomotorne senzibilizacije.

Omeniti je treba, da se med prehodom iz rekreacijske rabe v odvisnost od drog opazijo individualne razlike (Flagel et al., 2009, George in Koob, 2010 in Swendsen in Le Moal, 2011). Na primer, miši DBA / 2 J so bolj nagnjene k odzivanju kot senzibilizacija lokomotorne motnje, ki jo povzroča etanol (kot C57BL / 6 J) (Phillips et al., 1997 in Melón in Boehm, 2011a). V outbred švicarskih miših je bila vedenjska variabilnost v zvezi z lokomotorno senzibilizacijo, povzročeno z etanolom, prvič opisana Masur in dos Santos (1988). Od takrat dalje so druge študije pokazale pomembne nevrokemične lastnosti, povezane z vedenjsko variabilnostjo pri pridobivanju lokomotorne senzibilizacije, povzročene z etanolom (Souza-Formigoni et al., 1999, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012, Quadros et al., 2002a in Quadros et al., 2002b). Vendar pa te študije niso obravnavale vpliva vedenjske variabilnosti v karenci po akvizicijski fazi lokomotorne senzibilizacije. V nedavni študiji je naš laboratorij opisal pomembno razliko med senzibiliziranimi in ne-senzibiliziranimi švicarskimi mišmi glede izražanja kanabinoidnega receptorja tipa 1 (CB1R) med umikom. V tej študiji so senzibilizirane (vendar ne senzibilizirane miši) povečale izražanje CB1R v prefrontalnem korteksu, ventralnem tegmentalnem področju, amigdali, striatumu in hipokampusu (Coelhoso et al., 2013).

Glede na dobro uveljavljeno vedenjsko variabilnost pri brezkrvnih švicarskih miših glede preobčutljivosti lokomotorne motnje, ki jo povzroča etanol, in ker to variabilnost spremljajo različne nevrokemijske značilnosti med poznejšim umikom, je ta študija raziskala izražanje FosB / DeltaFosB pri senzibiliziranih in nesenzibiliziranih miših na začetku (18 h) in po 5 dneh umika.

2. Material in metode

2.1. Predmeti

Uporabljene so bile samske brezkrvne švicarske miši Webster (EPM-1 Colony, São Paulo, SP, Brazilija), prvotno pridobljene iz linije Albino Swiss Webster iz Centra za razvoj živalskih modelov v biologiji in medicini pri Universidade Federal de São Paulo. . Miši so bile na začetku testiranja stare 12 tednov (30–40 g). Skupine po 10 miši so bile nameščene v kletkah (40 × 34 × 17 cm) s posteljnino iz sekancev. Kolonijo živali pod nadzorom temperature (20–22 ° C) in vlažnosti (50%) smo vzdrževali v ciklu svetlobe / teme (12/12 h), prižgane luči ob 07:00 h, s peleti mišjega čaja in vodo iz pipe. libitum, razen med testiranjem. Miši so bili v teh pogojih bivanja vsaj 7 dni pred začetkom zdravljenja z zdravili in vedenjskimi testi. Skrb za živali in eksperimentalni postopki so potekali v skladu s protokoli, ki jih je odobril Odbor za etiko nege in uporabe živali Univerze (številka protokola: 2043/09), v skladu z Direktivo EU 2010/63 / EU za poskuse na živalih (http://ec.europa.eu/environmental/chemicals/lab_animals/legislation_en.htm).

2.2. Lokomotorna senzibilizacija

Protokol senzorizacije lokomotorja je temeljil na predhodni študiji iz lastnega laboratorija (Coelhoso et al., 2013). Na začetku protokola so vsem živalim intraperitonealno (ip) vbrizgali fiziološko raztopino in jih takoj testirali v avtomatizirani škatli aktivnosti (Insight, Brazilija) 15 minut, da so vzpostavili bazalno gibanje. Dva dni kasneje so živalim dnevno vbrizgavali etanol (2 g / kg, 15% m / v v 0.9% NaCl, ip - EtOH skupina, N = 40) ali fiziološka raztopina (podoben volumen, ip, - kontrolna skupina, N = 12), v 21 dneh. Takoj po 1., 7., 14. in 21. injekcijah so živali za 15 minut postavili v kletko z aktivnostmi. Vodoravno gibanje v vsaki situaciji je bilo izmerjeno s sistemom vedenjske analize (Pan Lab, Španija). Kot je bilo pričakovano ( Masur in dos Santos, 1988 in Coelhoso et al., 2013), vedenjska variabilnost lokomotorne aktivnosti na dan pridobitve 21st nam omogoča, da porazdelimo živali iz skupine EtOH v podskupine 2: EtOH_High (vzeto iz zgornjih 30% porazdelitve) in EtOH_Low (vzeto iz spodnjega 30% od distribucijo). Tako so bili v analizo vključeni le 60% živali. Ta strategija je identična tistim, uporabljenim v študijah, ki preučujejo individualno variabilnost v paradigmi senzitizacije etanola ( Masur in dos Santos, 1988, Souza-Formigoni et al., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012 in Coelhoso et al., 2013).

Po razvrstitvi, ki opredeljuje poskusne skupine, smo izvedli 2 neodvisna poskusa v skladu s časovnimi merili karence: (i) živali, predložene v fazo pridobivanja in žrtvovane po 18 urah umika, in (ii) živali, predložene v fazo pridobivanja in žrtvovane po 5 dneh odvzema. Ta študija je torej obsegala 3 eksperimentalne skupine (Control, EtOH_High in EtOH_Low), ki so bile razdeljene v 2 podskupini (18 ur in 5 dni umika) (N = 6 na podskupino). Izbira teh dveh časovnih oznak v karenci je bila posledica kinetičnih vidikov izražanja FosB in DeltaFosB po 18 urah odvzema (kot je razloženo v poglavju za razpravo) in po 5 dneh odvzema na podlagi predhodnih študij iz našega laboratorija ki je preučeval nekatere nevrokemijske značilnosti glede karence v paradigmi preobčutljivosti lokomotornih vlaken Fallopa et al., 2012 in Escosteguy-Neto et al., 2012). Na koncu smo za korelacijo med preobčutljivostjo lokomotorja in izražanjem FosB / DeltaFosB izračunali rezultat preobčutljivosti lokomotorja za vsako žival po formuli: score = (Locomotion v 21. dnevu - Locomotion v prvem dnevu) * 1 / Locomotion v 100. dan.

2.3. Imunohistokemija

Po karenci so živali globoko anestezirali s koktajlom, ki je vseboval ketamin (75 mg / kg, ip) in ksilazin (25 mg / kg, ip). Po izgubi roženicnega refleksa so bili transkardialno prepolnjeni s 100 ml 0.1 M fosfatne puferske raztopine [fosfatna puferirana fiziološka raztopina (PBS)], nato pa s 100 ml 4% paraformaldehida (PFA). Možgane so odstranili takoj po perfuziji, jih shranili v PFA 24 ur in nato 30 ur hranili v 48% raztopini saharoze / PBS. Serijski koronalni odseki (30 μm) so bili razrezani z zamrzovalnim mikrotomom in shranjeni v raztopini proti zmrzovanju, ki se je uporabljala v imunohistokemijskih postopkih s prosto plavajočim barvanjem.

Za imunohistokemijo je bila izvedena običajna tehnika avidin – biotin – imunoperoksidaza. V isti potek so bili vključeni možganski odseki vseh eksperimentalnih skupin, ki so bili 3 minut predhodno obdelani z vodikovo peroksidazo (15%) in nato 30 minut sprani s PBS. Nato so bili vsi odseki v 30 minutah izpostavljeni PBS-BSA .5%, da bi se izognili nespecifičnim reakcijam. Nato so odseke inkubirali čez noč s primarnim protitelesim kuncem anti-FosB / DeltaFosB (1: 3,000; Sigma Aldrich, St Louis, MO, ZDA, št. Kat. AV32519) v raztopini PBS-T (30 ml PBS, 300 μl Triton X-100). Nato so bili odseki inkubirani 2 uri v biotiniliranem kozjem anti-zajčjem IgG sekundarnem protitelesu (1: 600; Vector, Burlingame, CA, ZDA) pri sobni temperaturi. Odseke smo nato 90 minut obdelali s kompleksom avidin-biotin (standardni komplet Vectastain ABC; Vector, Burlingame, CA, ZDA) in podvrgli reakciji diaminobenzidina, intenzivirani z niklom. Med koraki so odseke izpirali v PBS in mešali na rotatorju. Odseki so bili nameščeni na stekla, prevlečena z želatino, posušeni, dehidrirani in prevlečeni.

Analizirane so bile naslednje encefalične regije: prefrontalni korteks [sprednja cingulacijska skorja (Cg1), predlimbna skorja (PrL) in infralimbični korteks (IL)], motorna skorja [primarna (M1) in sekundarna (M2)], hrbtni striatum [dorsomedial striatum DmS) in dorzolateralni striatum (DlS)], ventralni striatum (jedro nucleus accumbens (Acbco) in lupina (Acbsh), ventralni pallidum (VP)), hipokampus [piramidna plast Cornus Ammong 1 oziroma 3 (CA1 in CA3), zrnat sloj zobatega girusa (DG)], amigdala (bazolateralno jedro (BlA) in osrednje jedro (CeA)), ventromedialno jedro hipotalamusa (VMH) in ventralno tegmentalno območje [sprednji (VTAA) in zadnji (VTAP) dele] ( Glej Slika 1). Za zajem slik iz vsakega odseka s povečavo × 200 je bil uporabljen mikroskop Nikon Eclipse E20, povezan z računalnikom. Slike so bile shranjene kot .tiff arhiv za posteriorno analizo imunoreaktivnosti FosB / DeltaFosB. Imunoreaktivne celice smo prešteli s pomočjo programske opreme ImageJ (NIH Image, Bethesda, MD, ZDA). Možganske regije so bile označene na vsaki fotografiji v skladu s The Stereotaxic Mouse Brain Atlas (Franklin in Paxinos, 1997). Ker mikrofotografije, posnete z mikroskopom, predstavljajo 2.5 × 103 Μm2 v 20-kratni povečavi je kvantifikacija celic, označenih s FosB / DeltaFosB, izražena kot povprečje imunsko obarvanih celic na 2.5 × 103 Μm2. Vrednosti, dobljene v skupinah EtOH, so bile normalizirane na kontrolne vrednosti in izražene kot%. (Nadzor = 100%).

  •  
  • Slika 1.  

    Shematski prikaz možganskih regij, vzorčenih. Shematska risba koronalnih odsekov možganskih možganov, ki kažejo vzorčena območja (prilagojeno od. \ T Franklin in Paxinos, 1997). M1 = primarna motorična skorja; M2 = sekundarna motorična skorja, CG1 = sprednja cingulasta skorja, PrL = prelimbična skorja, IL = infralimbična skorja, Acbco = jedro nakopičenega jedra, Acbsh = jedro nakopičene lupine, VP = ventralni pallidum DmS = dorsomedial striatum, DlS = dorsolateral striatum, CA1 = Cornus Ammonis 1, CA3 = Cornus Ammonis 3; DG = zrnati sloj zobnega girusa, BlA = bazolateralno jedro amigdale, CeA = osrednje jedro amigdale, VmH = ventromedialno hipotalamično jedro, VTAA = sprednji del ventralnega tegmentalnega območja, VTAP = zadnji del ventralnega tegmentalnega območja.

2.4. Statistična analiza

Sprva je bil Shapiro – Wilk uporabljen za preverjanje normalnosti porazdelitve vseh spremenljivk. Rezultati vedenja so bili analizirani z enosmerno ANOVA za večkratno merjenje, pri čemer so kot dejavnik upoštevali 5 obdobij preobčutljivosti lokomotorja: bazalni, 1. dan, 7. dan, 14. dan in 21. dan. Histološke rezultate je analiziral dvosmerni ANOVA, ob upoštevanju kot dejavniki: obdobje odtegnitve (18 ur in 5 dni) in eksperimentalna skupina (Control, EtOH_High in EtOH_Low). Neparametrične spremenljivke so bile standardizirane v Z ocene, da bi zmanjšali razpršenost podatkov, in nato uporabljene v dvosmerni ANOVA, kot je bilo že opisano. Newman Keuls post-hoc je bil uporabljen po potrebi. Na koncu smo raziskali možne korelacije med FosB / DeltaFosB pozitivnimi celicami in rezultati lokomotorne senzibilizacije. Te korelacije so bile izračunane samo za jedra, kjer so bile ugotovljene statistične razlike med poskusnimi skupinami. Ker so bile te razlike omejene na 5 dni odvzema (glej razdelek z rezultati), se vrednosti FosB / DeltaFosB, upoštevane v teh korelacijah, nanašajo na to določeno časovno obdobje umika. Ker so bile te razlike omejene na 5 dni odvzema (glej razdelek z rezultati), se vrednosti FosB / DeltaFosB, upoštevane v tej korelaciji, nanašajo na ta določen čas odvzema. Raven pomembnosti je bila določena na 5% (p <0.05).

3. Rezultati

3.1. Lokomotorna senzibilizacija

ANOVA za ponovljene meritve je odkrila pomembne razlike v skupnem faktorju [F(2,32) = 68.33, p <0.001], v obdobju protokola [F(4,128) = 9.13, p <0.001] in interakcija med njimi [F(8,128) = 13.34, p <0.001]. V bazalnem gibanju ni bilo razlik in obe skupini EtOH sta se v prvem dnevu pridobivanja podobno povečali v primerjavi s kontrolno skupino (p <0.01). Vendar je EtOH_High (vendar ne EtOH_Low) predstavljal postopno povečanje gibalne aktivnosti v celotni fazi pridobivanja (p <0.01 glede na skupine Control in EtOH_Low v zadnjem dnevu prevzema; p <0.01 glede na njegovo gibalno aktivnost v prvem dnevu pridobitve) ( Slika 2). Ti podatki so potrdili rezultate iz prvotne študije ( Masur in dos Santos, 1988) in iz prejšnjega poročila ( Coelhoso et al., 2013) glede vedenjske variabilnosti v outbred švicarskih miših, ki so izpostavljene lokomotorni senzibilizaciji, povzročeni z etanolom.

  • Etanol spodbuja postopno in robustno povečanje gibanja skozi celotno kronično ...
  • Slika 2.  

    Etanol spodbuja postopno in močno povečanje gibanja med kroničnim zdravljenjem pri EtOH_High, v skupini EtOH_Low pa ne. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM N = 12 za skupine Control, EtOH_High in EtOH_Low. ⁎⁎P <0.01 v primerjavi s kontrolno skupino, v istem obdobju. ##P <0.01 glede na skupino EtOH_Low, v istem obdobju. ‡‡P <0.01 glede na bazalno gibalno aktivnost v isti skupini. ¥¥P <0.01 glede na gibalno aktivnost na 1st dan nakupa, znotraj iste skupine.

3.2. FosB / DeltaFosB izraz

Ilustrativna fotomikrografija imunoreaktivnosti FosB / DeltaFosB je prikazana na sliki Slika 3 in normalizirane vrednosti so prikazane v Slika 4, Slika 5, Slika 6 in Slika 7. Dvosmerna ANOVA je odkrila pomembne razlike v M1, M2, DmS, DlS, Acbco, Acbsh, VP in VTA (za ne-normalizirane vrednosti imunoreaktivnosti FosB / DeltaFosB in statistične analize vseh struktur, glej Tabela Suppl1 in Preglednica 1). V strukturah, kjer je bilo mogoče opaziti statistične razlike, so obstajali štirje različni vzorci izražanja FosB / DeltaFosB. V prvem, opaženem pri M1 in M2, je prišlo do povečanja izražanja FosB / DeltaFosB v petem dnevu odvzema etanola samo v skupini EtOH_High (v primerjavi z vrednostmi EtOH_High po 18 urah odvzema, pa tudi v Control in EtOH_Low skupine po 5 dneh umika) (glej Slika 4). Pri drugem vzorcu, opaženem pri VTAA, se je izražanje FosB / DeltaFosB povečalo po 5 dneh odvzema etanola samo v skupini EtOH_Low (v primerjavi z vrednostmi EtOH_Low po 18 urah odvzema in tudi pri kontrolni skupini po 5 dneh odvzema ) (glej Slika 5). V tretjem vzorcu, ki smo ga opazili pri DmS, Acbco in Acbsh, se je izražanje FosB / DeltaFosB povečalo po 5 dneh odvzema etanola v obeh skupinah EtOH_High in EtOH_Low (v primerjavi z njihovimi vrednostmi po 18 urah umika), vendar le pri skupini EtOH_Low razlikoval od kontrolne skupine (glej Slika 6). Nazadnje, v četrtem vzorcu, opaženem pri DlS in VP, se je izražanje FosB / DeltaFosB povečalo po 5 dneh odvzema etanola v obeh skupinah EtOH_High in EtOH_Low (v primerjavi z njihovimi vrednostmi po 18 urah umika), čeprav je bilo to povečanje statistično bolj izrazito v skupini EtOH_Low kot v skupini EtOH_High in samo skupina EtOH_Low se je razlikovala od skupine Control (glej Slika 7).

  • Ilustrativna fotomikrografija imunoreaktivnosti FosB / DeltaFosB pri × 20 ...
  • Slika 3.  

    Nazorna fotomikrografija imunske reaktivnosti FosB / DeltaFosB pri povečavi × 20. DmS = dorsomedial striatum; DlS = dorsolateralni striatum; Acbco = jedro nucleus accumbens; Acbsh = lupina nucleus accumbens; VP = ventralni palidum; VTAa = sprednji del ventralnega tegmentalnega območja.

  •  
  • Slika 4.  

    Izražanje FosB / DeltaFosB po 18 urah in 5 dneh karence v skupinah EtOH_High in EtOH_Low v M1 in M2. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM in predstavljajo normalizirane podatke glede na vrednosti kontrolnih skupin (črtkana črta - šteje se za 100%). Sive palice = 18 ur odvzema etanola; Črne palice = 5 dni odvzema etanola. ** P <0.01 glede na ustrezno kontrolno skupino; ## P <0.01 glede na njegovo vrednost ob 18 urah umika. ‡‡ P <0.01 glede na skupino EtOH_Low v istem obdobju. M1 = primarna motorična skorja, M2 = sekundarna motorična skorja.

  • Izraz FosB / DeltaFosB v 18h in 5dnevih odstopne dobe v EtOH_High ...
  • Slika 5.  

    Izražanje FosB / DeltaFosB po 18 urah in 5 dneh karence v skupinah EtOH_High in EtOH_Low v VTA. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM in predstavljajo normalizirane podatke glede na vrednosti kontrolnih skupin (črtkana črta - šteje se za 100%). Sive palice = 18 ur odvzema etanola; Črne palice = 5 dni odvzema etanola. ** P <0.01 glede na ustrezno kontrolno skupino; ## P <0.01 glede na njegovo vrednost pri 18 urah umika. VTA = ventralno tegmentalno območje.

  • Izraz FosB / DeltaFosB v 18h in 5dnevih odstopne dobe v EtOH_High ...
  • Slika 6.  

    Izražanje FosB / DeltaFosB po 18 urah in 5 dneh karence v skupinah EtOH_High in EtOH_Low v Acbco, Acbsh in DmS. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM in predstavljajo normalizirane podatke glede na vrednosti kontrolnih skupin (črtkana črta - šteje se za 100%). Sive palice = 18 ur odvzema etanola; Črne palice = 5 dni odvzema etanola. * P <0.05 ** P <0.01 glede na ustrezno kontrolno skupino; ## P <0.01 glede na njegovo vrednost pri 18 urah umika. Acbco = jedro accumbens jedro, Acbsh = jedro accumbens lupina, DmS = dorsomedial striatum.

  • Izraz FosB / DeltaFosB v 18h in 5dnevih odstopne dobe v EtOH_High ...
  • Slika 7.  

    Izražanje FosB / DeltaFosB po 18 urah in 5 dneh karence v skupinah EtOH_High in EtOH_Low v VP in DlS. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM in predstavljajo normalizirane podatke glede na vrednosti kontrolnih skupin (črtkana črta - šteje se za 100%). Sive palice = 18 ur odvzema etanola; Črne palice = 5 dni odvzema etanola. ** P <0.01 glede na ustrezno kontrolno skupino; # P <0.05 ## P <0.01 glede na njegovo vrednost pri 18 urah umika. ‡‡ P <0.01 glede na skupino EtOH_Low v istem obdobju. VP = ventralni palidum, DlS = dorsolateralni striatum.

  • Preglednica 1 

    Statistični parametri, dobljeni v dvosmerni ANOVA glede analize ekspresije FosB / DeltaFosB.

  • JedroFaktor obdobjaFaktor zdravljenjaObdobje * Zdravljenje
    M1F(1,30) = 5.61, P = 0.025F(2,30) = 3.21, P = 0.055F(2,30) = 2.61, P = 0.089
    M2F(1,30) = 4.72, P = 0.038F(2,30) = 1.53, P = 0.233F(2,30) = 3.45, P = 0.045
    CG1F(1,30) = 11.08 P = 0.002F(2,30) = 0.95, P = 0.398F(2,30) = 3.31, P = 0.050
    PrLF(1,30) = 8.53, P = 0.007F(2,30) = 1.72, P = 0.197F(2,30) = 2.74, P = 0.081
    ILF(1,30) = 3.77, P = 0.062F(2,30) = 1.91, P = 0.167F(2,30) = 0.98, P = 0.389
    AcbcoF(1,30) = 22.23 P <0.001F(2,30) = 2.63, P = 0.089F(2,30) = 5.68, P = 0.008
    AcbshF(1,30) = 50.44 P <0.001F(2,30) = 4.27, P = 0.023F(2,30) = 13.18, P <0.000
    VPF(1,30) = 38.01 P <0.001F(2,30) = 5.07, P = 0.013F(2,30) = 10.93, P <0.000
    DmSF(1,30) = 28.89 P <0.001F(2,30) = 3.75, P = 0.035F(2,30) = 7.71, P = 0.002
    DlSF(1,30) = 13.58 P = 0.001F(2,30) = 5.41, P = 0.011F(2,30) = 4.72, P = 0.017
    CA1F(1,30) = 4.81, P = 0.036F(2,30) = 7.37, P = 0.002F(2,30) = 1.62, P = 0.215
    CA3F(1,30) = 14.92 P = 0.001F(2,30) = 2.46, P = 0.102F(2,30) = 3.81, P = 0.034
    DGF(1,30) = 0.59, P = 0.447F(2,30) = 1.49, P = 0.241F(2,30) = 0.24, P = 0.785
    BlAF(1,30) = 6.47, P = 0.016F(2,30) = 0.12, P = 0.884F(2,30) = 1.71, P = 0.199
    CeAF(1,30) = 2.55, P = 0.121F(2,30) = 0.22, P = 0.801F(2,30) = 0.71, P = 0.501
    VmHF(1,30) = 6.51, P = 0.016F(2,30) = 0.71, P = 0.503F(2,30) = 1.75, P = 0.192
    VTAAF(1,30) = 9.64, P = 0.004F(2,30) = 3.76, P = 0.035F(2,30) = 2.65, P = 0.087
    VTAPF(1,30) = 6.05, P = 0.021F(2,30) = 1.79, P = 0.184F(2,30) = 1.64, P = 0.211
  • M1 = primarna motorična skorja; M2 = sekundarna motorična skorja, CG1 = sprednja cingulasta skorja, PrL = prelimbična skorja, IL = infralimbična skorja, Acbco = jedro nakopičenega jedra, Acbsh = jedro nakopičene lupine, VP = ventralni pallidum DmS = dorsomedial striatum, DlS = dorsolateral striatum, CA1 = Cornus Ammonis 1, CA3 = Cornus Ammonis 3; DG = zrnata plast zobnega girusa, BlA = bazolateralno jedro amigdale, CeA = osrednje jedro amigdale, VmH = ventromedialno hipotalamično jedro, VTAA = sprednji del ventralnega tegmentalnega območja; VTAP = zadnji del osrednjega tegmentalnega območja.

Za potrditev, da so bile spremembe v izražanju FosB / DeltaFosB posledica umika in ne izpostavljenosti etanolu, smo izvedli korelacije med oceno lokomotorne senzibilizacije in FosB / DeltaFosB imunsko označenih celic na 5th dan umika v zgoraj navedenih jedrih (M1, M2, Acbco, Acbsh, DmS, DlS, VP, VTAA). Kot je bilo pričakovano, ni bilo pomembnih povezav za nobeno od teh jeder (M1 - r2 = 0.027862, p = 0.987156; M2 - r2 = 0.048538, p = 0.196646; Acbco - r2 = 0.001920, p = 0.799669; Acbsh - r2 = 0.006743, p = 0.633991; DmS - r2 = 0.015880, p = 0.463960; DlS - r2 = 0.023991, p = 0.914182; VP - r2 = 0.002210, p = 0.785443; VTAA - r2 = 0.001482, p = 0.823630).

4. Diskusija

Rezultati, opaženi v tej študiji, kažejo, da je povečana ekspresija FosB / DeltaFosB, opažena v paradigmi senzorizacije lokomotorne inducirane z etanolom, verjetno povezana z umikom in ne s kronično izpostavljenostjo zdravilom. Vendar so vedenjsko variabilnost v razvoju lokomotorne senzibilizacije spremljale različne vzorce izražanja FosB / DeltaFosB med umikom. Vloga motorične skorje, ventralnega tegmentalnega območja in striatuma pri pridobivanju in izražanju paradigme lokomotorne senzibilizacije je dobro uveljavljena (Vanderschuren in Pierce, 2010). Poleg tega je deregulacija mezolimbične poti ena od osrednjih nevrobioloških značilnosti karenčne dobe, skupaj s pojavom podaljšane amigdale (Koob in Le Moal, 2005 in Koob in Le Moal, 2008). Vendar pa je le nekaj študij raziskalo karenco paradigme senzorizacije lokomotorja. Naši rezultati so se v tem obdobju soočili z zanimivimi spremembami v izražanju FosB / DeltaFosB v motorni skorji, ventralnem tegmentalnem področju in striatumu.

CDNA FosB kodira ekspresijo 33, 35 in 37 kDa proteinov. Akutna izpostavljenost dražljajem vodi do močne indukcije Fos s 33- in diskretnimi 35- in 37- kDa. Posledično je pri akutni aktivaciji prevladujoča ekspresija FosB povezana s 33 kDa (McClung et al., 2004 in Nestler, 2008). Med temi beljakovinami je še ena izjemna razlika: le 35–37 kDa beljakovine so zelo stabilne izoforme. Zaradi te visoke stabilnosti se te okrnjene oblike FosB, imenovane tudi DeltaFosB, kopičijo v možganih in so močno izražene kot odziv na kronične dražljaje, kot so zdravljenje s psihotropnimi zdravili, kronični elektrokonvulzivni napadi in stres (Kelz in Nestler, 2000, Nestler et al., 2001 in McClung et al., 2004). Posledica tega je, da se DeltaFosB obravnava kot trajno molekularno stikalo, ki posreduje oblike dolgotrajne živčne in vedenjske plastičnosti. Zanimivo je, da je elegantna študija z uporabo mišjih linij, ki izražajo različno FosB in DeltaFosB, pokazala, da je FosB bistvenega pomena za povečanje stresne tolerance in tudi nevtralizira korelacijo med psihostimulantom povzročeno lokomotorno senzibilizacijo in akumulacijo DeltaFosB v striatumu (Ohnishi et al., 2011). Zato bi lahko imeli obe beljakovini pomembno vlogo v eksperimentalnem protokolu, uporabljenem v tej študiji. Omeniti velja, da uporabljeno protitelo FosB prepozna tako FosB kot DeltaFosB. Ker se FosB zmanjša na izhodiščno raven v 6 urah po akutnem dražljaju (Nestler et al., 2001) in DeltaFosB se kopičita po večkratni izpostavljenosti dražljajem, zato smo se odločili, da bomo živali žrtvovali 18 ur po pridobitvi, da bi se izognili morebitnim pristranskostim pri obdelavi etanola zaradi izražanja FosB. Kljub temu, da smo tehnično natančni, se bomo v tej študiji sklicevali na izraz FosB / DeltaFosB. Pomembno je omeniti, da je bila ta strategija uporabljena v drugih študijah, vključno s tistimi, ki so uporabljale isto tukaj opisano primarno protitelo (Conversi et al., 2008, Li et al., 2010, Flak et al., 2012 in García-Pérez et al., 2012). Posledično bomo poleg teh eksperimentalnih omejitev razpravljali tudi o naših rezultatih ob upoštevanju vloge DeltaFosB v nevronski plastičnosti.

Ugotovljeno je, da kronična izpostavljenost zdravilom poveča izražanje FosB / DeltaFosB v več regijah možganov (Nestler et al., 2001 in Perrotti et al., 2008). Zanimivo je, da se v tej študiji niti miške, občutljive na etanol, niti miške, ki niso občutljive na etanol, niso razlikovale od miši s kronično fiziološko raztopino glede izražanja FosB / DeltaFosB 18 ur po fazi pridobivanja. Poleg tega ni bilo pomembnih korelacij med izražanjem FosB / DeltaFosB in rezultati lokomotorne preobčutljivosti. To razhajanje bi lahko vsaj delno razložili z razlikami v eksperimentalnem protokolu. Na primer, glede na izpostavljenost etanolu je bila v dveh študijah paradigma proste izbire steklenic uporabljena v 15 občasnih sejah pitja (Li et al., 2010) ali prehransko popolna tekoča prehrana, ki se samodejno daje v 17 dneh (kjer živali uživajo etanol v odmerkih od 8 do 12 g / kg / dan) (Perrotti et al., 2008). V drugi študiji, čeprav se avtorji nanašajo na kronično zdravljenje, je bil protokol sestavljen le iz izpostavljenosti etanolu 4 (Ryabinin in Wang, 1998). Torej, drugje uporabljeni protokoli se popolnoma razlikujejo od tukaj uporabljenega, ki je obsegal 21 dni zdravljenja, kjer je eksperimentator dajal dnevne injekcije etanola. Kljub tem razlikam obstaja več študij, ki vključujejo intraperitonealne injekcije, ki poročajo o povečanju izražanja FosB / DeltaFosB po protokolih preobčutljivosti lokomotornih naprav, ki jih povzročajo psihostimulansi (Brenhouse in Stellar, 2006, Conversi et al., 2008 in Vialou et al., 2012) in opioidi (Kaplan et al., 2011). Vendar so protokoli lokomotorne senzibilizacije v teh študijah vključevali veliko manj kot izpostavljenost zdravilom 21, v nekaterih izmed njih pa je bilo zdravilo aplicirano s prekinitvami. Nasprotno pa je naš protokol uporabljal enako zdravljenje, opisano v prejšnjih študijah, ki so vključevale dnevne injekcije etanola 21 (Masur in dos Santos, 1988, Souza-Formigoni et al., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011 in Abrahão et al., 2012). Obstajajo dokazi, da kljub temu, da kronična uporaba kokaina spodbuja kopičenje ekspresije DeltaFosB v jedru nucleus accumbens, spodbuja tudi toleranco na indukcijo mRNA DeltaFosB tako v ventralnem kot tudi v hrbtnem striatumu (Larson et al., 2010). Zato smo domnevali, da je lahko pomanjkanje razlik med našimi poskusnimi skupinami v fazi pridobivanja posledica tolerance glede na indukcijo FosB / DeltaFosB, saj je v tem protokolu prišlo do večjega obdobja pridobitve v primerjavi z obdobji, ki so se uporabljala za psihostimulante in opioide. v drugih študijah.

Študije z uporabo knockout in transgenskih miši so pokazale, da imajo mutantni miši FosB izboljšan vedenjski odziv na kokain, kot so stimulativni lokomotorni učinki in pogojena lokalna prednost. Poleg tega ekspresija bazalnega in kokain-inducibilnega DeltaFosB ni prisotna pri tej mutantni miši (Hiroi et al., 1997). V nasprotju s tem pa transgenske miši z inducibilno prekomerno ekspresijo DeltaFosB-a kažejo povečano občutljivost na koristne učinke kokaina in morfina (Muschamp et al., 2012). Ti rezultati so zagotovili neposredne dokaze o tesni povezavi med DeltaFosB in procesom nagrajevanja. Poleg ponavljajočih se izpostavljenosti zdravilom kronični stres povečuje tudi izražanje DeltaFosB v kortikolimbičnih vezjih (Perrotti et al., 2004). Zanimivo je, da so transgenske miši, ki prekomerno izražajo DeltaFosB, manj občutljive na pro-depresivne učinke kapa-opioidnega agonista, za katerega je znano, da inducira disforijo in stresne učinke pri glodalcih (Muschamp et al., 2012). Torej, poleg postopka nagrajevanja, DeltaFosB igra tudi osrednjo vlogo pri čustvenih vidikih pojavov. V tem scenariju bi odtegnitev lahko sprožila tudi izražanje FosB / DeltaFosB, saj je stres ključna sestavina umika zdravila. Ta perspektiva je v skladu z našimi rezultati, ker ni bilo povezav med izražanjem FosB / DeltaFosB in ocenami preobčutljivosti, poleg tega pa so povečanje izražanja FosB / DeltaFosB opazili šele peti dan umika.

Zanimivo je, da so se v nekaterih strukturah povečale vrednosti FosB / DeltaFosB v skupini EtOH_High in EtOH_Low, čeprav so bile izrazitejše v prejšnji skupini, kar kaže na to, da bi ta povečanja lahko imela različne funkcionalne posledice glede na njihovo intenzivnost. To hipotezo je mogoče pojasniti z več različnimi funkcionalnimi vlogami FosB / DeltaFosB. Na primer, podgane, ki so bile kronično izpostavljene kokainu, so povečale izražanje DeltaFosB v jedru accumbens med karenco, učinek, ki je bil pozitivno povezan s prednostjo kokaina, vendar negativno z novostjo. Poleg tega stres med umikom poveča vedenjski odziv na psihostimulante s povečanjem izražanja DeltaFosB v kortikolimbičnih nevronih (Nikulina et al., 2012). Torej bi lahko DeltaFosB napovedal disregulacijo hedonske obdelave, ki se pojavi med dolgotrajnim umikom (Marttila et al., 2007). Po drugi strani sta odpornost na stres in antidepresivni odzivi povezani z večjo ekspresijo DeltaFosB v striatumu (Vialou et al., 2010). Zato špekuliramo, da bi povečanje FosB / DeltaFosB na striatumu v EtOH_High lahko okrepilo učinke etanola, kar bi povečalo dovzetnost za poznejše izpostavljenosti zdravilom. Po drugi strani pa bi lahko intenzivnejše povečanje FosB / DeltaFosB, opaženo v skupini EtOH_Low, zmanjšalo občutljivost tako na disforijo kot na učinke stresa, kar bi zmanjšalo negativne učinke okrepitve poznejše izpostavljenosti drog in posledično pojasnilo večjo odpornost pri tem skupine. Zanimivo je, da je imel ta paradoks nevrokemično osnovo. Na primer, transgene miši, ki prekomerno izražajo FosB v srednje velikih hrbteničnih GABAergičnih nevronih iz nucleus accumbens, so imele povečane ravni obeh mu- in kapa-opioidnih receptorjev (Sim-Selley et al., 2011) in ti receptorji povečajo in inhibirajo mezolimbični ton (Manzanares et al., 1991 in Devine et al., 1993). Nadalje, izražanje celičnega tipa bi lahko tudi drastično spremenilo funkcionalne posledice povečanega FosB / DeltaFosB. V elegantni študiji z uporabo miši, ki prekomerno izražajo DeltaFosB v D1- ali D2-izraženih nevronih v nucleus accumbens, je bilo ugotovljeno, da DeltaFosB v D1- (vendar ne v D2-) nevronih izboljša vedenjske odzive na kokain (Grueter et al., 2013).

Zanimivo je, da je pri motorični skorji prišlo do povečanja izražanja FosB / DeltaFosB samo v skupini EtOH_High in je bilo omejeno na 5. dan umika. Pomanjkanje povečanja po 18 urah odtegnitve bi lahko razložili z možnim mehanizmom tolerance v izražanju FosB / DeltaFosB v tej regiji po kronični izpostavljenosti etanolu. Poleg tega naši rezultati kažejo, da v karenci obstajajo aktivne nevrokemične spremembe v motorični skorji, kljub dejstvu, da živali v tem obdobju niso bile manipulirane. To je zanimivo, ker bi ta plastičnost lahko imela vsaj delno vlogo pri vzdrževanju preobčutljivosti lokomotornih naprav. Čeprav trajne hiperlokomocije po nekajdnevnem umiku tukaj niso preučevali, obstaja več študij, vključno s prejšnjimi iz našega laboratorija, ki kažejo, da so občutljive miši (vendar ne senzibilizirane) okrepile gibanje, ko so jih po dani karenci izzvale z etanolom (Masur in dos Santos, 1988, Souza-Formigoni et al., 1999, Quadros et al., 2002a, Quadros et al., 2002b, Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012, Fallopa et al., 2012 in Coelhoso et al., 2013).

Nazadnje je treba omeniti, da je samo skupina EtOH_Low pokazala povečano ekspresijo FosB / DeltaFosB v prednjem (ne pa posteriornem) delu ventralnega tegmentalnega območja. Ti deli imajo različne projekcije in nevrokemijske profile, njihovo sodelovanje v procesu nagrajevanja pa je odvisno od več dejavnikov (Ikemoto, 2007). Na primer, samo-dajanje etanola podganam je povezano z zadnjim delom, ne pa tudi z ventralnim delom ventralnega tegmentalnega območja (Rodd-Henricks et al., 2000 in Rodd et al., 2004). Poleg tega ima endokanabinoidni sistem, kot tudi GABA-A, dopaminergični D1-D3 in serotoninergični receptorji 5HT3 pomembno vlogo pri obnašanju etanola (Linsenbardt in Boehm, 2009, Rodd et al., 2010, Melón in Boehm, 2011b in Hauser et al., 2011). Vendar je GABA-B v prednjem delu ventralnega tegmentalnega območja pomemben v smislu nagrajevanja (Moore in Boehm, 2009) in stimulativni lokomotorni učinki (Boehm et al., 2002) etanola. Poleg tega so holinergični nikotinski receptorji v anteriornem delu vključeni v povečane ravni akumalnega dopamina, ki jih povzroča etanol (Ericson et al., 2008). Torej, ne glede na poseben profil teh delov, je možno, da so spremembe, opažene v skupini EtOH_Low v sprednjih delih, povezane z nagrajevanjem. Kronični kokain, ne kronični morfij ali kronična izpostavljenost stresu poveča DeltaFosB v ventralnem tegmentalnem območju, zlasti v celični populaciji gama-aminobutirne kisline (GABA) (Perrotti et al., 2005). To dejstvo bi lahko pojasnilo normalno raven FosB / DeltaFosB skozi umik, ki se je pojavil v ventralnem tegmentalnem območju miši EtOH_High, ne glede na domnevno visoko stresno izkušnjo v tem obdobju. Poleg tega ti podatki vsaj delno potrjujejo hipotezo, da bi se lahko povečanje izražanja FosB / DeltaFosB v času odtegnitve v EtOH_Low označilo kot adaptivni odziv.

Posamezne razlike, opažene med prehodom iz rekreacijske uporabe na odvisnost od drog, so izjemne (Flagel et al., 2009, George in Koob, 2010 in Swendsen in Le Moal, 2011). Posledično je nujno preučiti nevrobiološke značilnosti, povezane z individualno variabilnostjo. Vedenjska senzibilizacija je živalski model, ki se pogosto uporablja za raziskovanje nevrobioloških značilnosti odvisnosti od drog. Osnova tega modela je, da se subjektivni učinki zdravil povečujejo ob ponavljajoči se izpostavljenosti. Po pridobitvi je lokomotorna senzibilizacija dolgotrajna in je v neposredni časovni povezavi z morfološkimi in nevrokemičnimi spremembami mezolimbične poti in številnimi encefaličnimi jedri, povezanimi s čustveno in motoričnim vedenjem (Robinson in Kolb, 1999 in Vanderschuren in Pierce, 2010). Pionirsko študijo, ki jo je izvedel Masur in dos Santos (1988) pokazali, da obstaja velika vedenjska variabilnost v outbred švicarskih miših glede na etanolom povzročeno senzibilizacijo lokomotorja. Od takrat so druge študije pokazale pomembno povezavo med nevrokemičnimi značilnostmi in vedenjsko variabilnostjo, predvsem tistimi, ki so povezane z dopaminergičnimi (Abrahão et al., 2011, Abrahão et al., 2012 in Souza-Formigoni et al., 1999) in glutamatergične sisteme (Quadros et al., 2002a in Quadros et al., 2002b). Poleg tega je prejšnja študija iz našega laboratorija, ki je uporabljala paradigmo za lokomotorno senzibilizacijo, inducirano z etanolom, pokazala, da so senzibilizirane (vendar ne senzibilizirane) miši predstavljale izjemno povečanje tipa kanabinoidnega receptorja 1 (CB1R) v karenci (Coelhoso et al., 2013). Tu smo identificirali različne vzorce izraza FosB / DeltaFosB med umikom med skupinami EtOH_High in EtOH_Low.

Če povzamemo, vedenjska variabilnost, opažena v fazi pridobivanja senzorizacije lokomotorja, povzročene z etanolom, spremlja izrazita nevronska plastičnost v karenci. Zanimivo je, da naši rezultati kažejo, da so različni vzorci ekspresije FosB / DeltaFosB, odkriti v občutljivih in ne senzibiliziranih miših, bolj povezani s karenco kot s kronično izpostavljenostjo zdravilom, verjetno zaradi tolerance za FosB / DeltaFosB transkripcijo, povzročeno z zdravilom.

Spodaj so navedeni dodatni podatki v zvezi s tem členom.

Priznanja

RFP in CCC sta prejela magistrsko štipendijo CAPES in FAPESP. CTC, LEM, DXS in JGSJ so odobreni s strani FAPESP in CNPq.

Reference

  •  
  • Ustrezni avtor na naslovu: Rua Cesário Mota Jr, 61, 12 andar, São Paulo, SP 01221-020, Brazilija. Tel./faks: + 55 11 33312008.
  • 1
  • Ti avtorji so enako sodelovali pri tej študiji.

Avtorske pravice © 2013 Elsevier Inc.