Dekodiranje nevronskih vezij, ki nadzorujejo prisilno iskanje saharoze (2015) (MEHANIZEM BINGE)

Da bi prepoznali LH nevrone, ki zagotavljajo monosinaptični vhod v VTA in vivo in opazovali njihovo aktivnost med prosto gibljivim vedenjem, smo uporabili strategijo dvojnega virusa za selektivno izražanje kanalrodopsina-2 (ChR2) v LH nevronih, ki zagotavljajo monosinaptični vhod v VTA (Številke 1A in S1). Vbrizgali smo adeno-povezan virusni vektor (AAV₅), ki nosi ChR2-eYFP v konstrukciji, odvisni od Cre-rekombinaze, dvojno obrnjenega odprtega bralnega okvira (DIO) v LH za okužbo lokalnih somatov in vbrizga retrogradno potujoči virus herpes simplex (HSV), ki nosi Cre-rekombinazo, v VTA. Kasnejša rekombinacija je dovolila selektivno izražanje opsina in fluoroforja v LH nevronih, ki zagotavljajo monosinaptični vnos v VTA. Da bi potrdili svoj pristop, smo izvedli ex vivo snemanje celoceličnih obližev v vodoravnih rezinah možganov, ki vsebujejo LH in posneli iz nevronov, ki izražajo ChR2-eYFP, pa tudi sosednjih LH nevronov, ki so bili ChR2-eYFP negativni (Slika 1B). Zakasnitve svetlobnih zvokov, merjene od nastopa svetlobnega impulza do vrha akcijskega potenciala, so bile med 3–8 ms (Slika 1C). Ugotovili smo tudi, da nobena od neekspresijskih (ChR2-negativnih) celic ni pokazala vzbujevalnih odzivov na fotostimulacijo (n = 14; Slika 1C), kljub njihovi bližini celicam, ki izražajo ChR2.

Za izvedbo optogenetično posredovane fotoidentifikacije in vivo so v LH vsadili optrodo za snemanje nevronske aktivnosti med nalogo iskanja saharoze. V istem snemanju smo podali več vzorcev fotostimulacije za identifikacijo nevronov LH-VTA, ki izražajo ChR2 (Številke 1D in S1). Preučili smo porazdelitev latenc ekscitatornega odziva na vse nevrone LH, ki kažejo časovno zaklenjeno spremembo hitrosti sproženja kot odgovor na osvetljenost in opazili bimodalno porazdelitev (Slika 1E). Med snemanjem in vivo smo opazili populacijo nevronov z zakasnitvami v območju 3–8 ms. To je bilo enako območju zakasnitve, ugotovljenem v nevronih LH-VTA, ki izražajo ChR2, ko smo snemali ex vivo. Te enote smo poimenovali enote tipa 1 (Številke 1C, 1E in 1F). Poleg tega je obstajala ločena populacija celic s približno 100 ms zakasnitve fotoodziva (Številke 1E in 1G), in te enote "tipa 2" smo poimenovali. Opazili smo tudi nevrone, ki so bili inhibirani kot odziv na fotostimulacijo nevronov LH-VTA (Slika S2), in te enote "tipa 3" smo poimenovali. Primerjali smo trajanje akcijskega potenciala (merjeno od vrha do najnižjega) in povprečno hitrost streljanja za enote tipa 1 in Type 2 ter tudi tiste, ki niso pokazale odziva na fotografijo (Slika 1H). Porazdelitev trajanja akcijskega potenciala tipa 1 (Slika 1I) in vpišite 2 (Slika 1J) enot kaže, da ima večina enot tipa 1 trajanje akcijskega potenciala manj kot 500 μs (84%; n = 16/19, binomska porazdelitev, p = 0.002).

Čeprav enote tipa 1 ustrezajo standardnim merilom, ki jih je treba razvrstiti kot ChR2, ki izražajo (Cohen et al., 2012, Zhang et al., 2013), ni bilo jasno, ali je daljši latenčni fotoodziv enot 2 značilen za nevrone, ki izražajo ChR2, ki so se odzvali počasneje do fotostimulacije ali pa je bil ta učinek posledica omrežne aktivnosti. Glede na to, da LH-ekspresirajoči (tipa 2) LH nevroni projicirajo neposredno na VTA, je bila ena možnost, da so nevroni tipa 1 prejemali povratne informacije od VTA (Slika 1K). Druga možnost je bila, da so bili nevroni tipa 2 aktivirani z aksonskimi kolaterali iz nevronov tipa 1 (Slika 1L). Da bi razlikovali med tema dvema možnima modeloma vezja, smo zavirali VTA v povezavi s fotoidentifikacijo v LH.

Glede na naše modele vezij, bi pričakovali, da distalna inhibicija ne bo vplivala na fotosponke LR nevronov, ki izražajo ChR2. Če pa fotorepozivna, vendar ne izražena, LH nevroni uporabijo povratne informacije iz VTA, da izzovejo časovno zaklenjen odziv na osvetljenost (Slika 1K), bi pričakovali oslabitev fotosponav v teh nevronih po inhibiciji VTA. Izrazili smo ChR2 v LH-VTA celicah, kot je opisano zgoraj, toda tokrat smo izrazili tudi povečan halorhodopsin 3.0 (NpHR) v VTA in implantirali optično vlakno v VTA poleg optrode v LH (Slika 2A). V LH smo za vse tri epohe prinesli enake vzorce osvetlitve modre svetlobe, prav tako pa smo v drugi epohi fotoinhibicirali VTA z rumeno svetlobo (Slika 2A).

Fotonakcije tipov 1 na osvetlitev modre svetlobe v LH niso vplivale na fotonapetje VTA, kar je skladno z izražanjem ChR2 v nevronih tipa 1 LH-VTA (Slika 2B). V nasprotju s tem je večina enot tipa 2 (87%; n = 13/15, binomska porazdelitev, p = 0.004) pokazala znatno oslabitev fotoodzivov na impulze modre svetlobe, oddane v LH ob fotoinhibiciji VTA nevronov. Odzivi enot 1 in 2 med fotoinhibicijo VTA so se bistveno razlikovali (hi-kvadrat = 7.64, p = 0.0057; Številke 2B in 2C). Te razlike je mogoče videti tudi pri največjih Z rezultatih v posameznih obdobjih (Slika 2D) in z epohami rumene-ON normalizirane na epoho rumene OFF (Slika 2E). Ti podatki kažejo, da nevroni tipa 2 LH prejmejo vnos (neposredno ali posredno) iz VTA (Slika 1K) namesto prek lokalnih zavarovanj z aksonom (Slika 1L).

Z identifikacijo teh dveh različnih vrst nevronov LH v zanki LH-VTA smo želeli preučiti naravno pojavljajočo se živčno aktivnost med samoupravo saharoze (Slika 3A). Miši so bili usposobljeni za izvajanje odzivov z nosom za napoved napovedovanja dostave saharoze v sosednjih vratih (kot v Tye et al., 2008). Da bi lahko ločili nevronske odzive na nos in iztočnico, sta bila iztočnica in saharoza dostavljena po delnem urniku okrepitve, pri čemer je bilo 50% ponorov povezanih z oddajanjem iztočnice in saharoze.

Enote tipa 1 so pokazale fazne odzive na vstop v saharozni vhod, kot je razvidno iz reprezentativne enote tipa 1 (Slika 3B), kot tudi podatke o prebivalstvu za vse enote tipa 1 (Slika 3C). Fazni odzivi enot tipa 2 pa so večinoma odsevali odzive na nagradni napovedni znak (Številke 3D in 3E). Normalizirani vzorci streljanja vseh zabeleženih nevronov (n = 198, razdeljeni na enote tipa 1, 2, 3 in neodzivne enote) so prikazani za vsako komponento naloge: nosni udarci v paru z iztočnico, nosni udarci v odsotnosti iztočnice in vstop v pristanišče saharoze (Slika 3F). Vse enote tipa 1, ki so pokazale fazne spremembe aktivnosti, pomembne za nalogo (74%; n = 14/19), so bile fazno vznemirjene ali zavirane z vstopom v saharozo, majhno število pa je kazalo tudi fazno inhibicijo napovednega napovedovanja (Številke 3B, 3C in 3G). V nasprotju s tem so bile enote tipa 2 bolj heterogene, pri čemer so nevroni, ki odzivajo na naloge, selektivno kodirali znak (35%), vnos saharoze je bil selektiven (26%), ali pa sta bila vnos v iztočnico in vhod (12%; Številke 3D, 3E in 3H). Za ponazoritev moči odgovorov tipov 1 in Type 2 na dogodke, povezane z nalogami, smo vsako celico narisali na tridimenzionalno ploskev glede na točko Z (Slika 3JAZ). Da bi prikazali porazdelitev faznih sprememb pri streljanju na več dogodkov, povezanih z opravili, na kvalitativni ravni, smo narisali število celic vsakega tipa odziva, ki je padel v dano kategorijo (Slika 3J).

Glede na natančno določeno vlogo VTA pri napaki pri napovedovanju nagrad (npr. Fazno zmanjšanje sprožitve DA nevronov kot odziv na nepričakovano izpustitev nagrade in fazno vzbujanje kot odziv na nepričakovano izročitev nagrade) (Schultz et al., 1997), smo raziskali, ali bi LH nevroni kodirali nepričakovano opustitev nagrade saharoze. Da bi to naredili, smo med isto nalogo nagrajevanja zabeležili nevronsko aktivnost fotoodzivnih nevronov pri dobro usposobljenih živalih, vendar smo naključno izpustili 30% dajanja saharoze po napotku (Slika 4A).

Večina enot tipa 1 (88%; n = 15/17, binomska porazdelitev, p = 0.001) ni bila občutljiva na opustitev nagrade (Številke 4B in 4D), medtem ko je velika podskupina enot tipa 2 (67%; n = 12/18) pokazala bistveno drugačen odziv na preskuse, predstavljene z nagrado in izpuščene iz nagrad (Številke 4C in 4D). Ugotovili smo, da so nevroni LH-VTA (Type 1) kodirali dejanje vstopa v pristanišče, saj so bili ti vhodni odzivi trdovratni tudi ob opustitvi nagrad (Slika 4D), v nasprotju z enotami tipa 2 (hi-kvadrat = 10.9804, p = 0.0009).

Da bi ugotovili, ali so bili odzivi tipa 1 na vnos v pristanišče resnično kodirani pogojni odziv (CR), v nasprotju s splošnim nagrajevanjem ali raziskovalnim vedenjem, smo zabeležili v netreniranih miših, ki še niso opravile naloge. Na naivnih miših smo v pristanišče dostavili saharozo v odsotnosti napovedi (nepredvidena dostava nagrade) in ugotovili, da enote tipa 1 niso pokazale faznih odzivov na vnos v pristanišče (Številke 4E, 4F in 4I), v skladu z modelom, da nevroni tipa 1 kodirajo CR (Slika 4J).

Da bi ugotovili, ali je aktivnost enote tipa 2 skladna s profilom odziva na napovedno napovedno napoved, smo zabeležili tudi te nevrone v dobro usposobljenih živalih med nepredvideno dostavo nagrad (Slika 4G). Ugotovili smo, da se je podskupina enot tipa 2 odzvala na nepredvidene dobave saharoze (50%; Številke 4G – 4I). Skupaj so podnote enot tipa 2 občutljive na nepričakovano izpustitev nagrad (Številke 4C in 4D) in nepredvideno plačilo (Številke 4G – 4I), ki je skladen s profilom odziva na napako, predvideno z napako.

Kot smo prikazali zgoraj, enote tipa 1 predstavljajo nevralni korelacijo CR. Pomembno je, da se povečanje hitrosti streljanja začne pred CR, povečuje se do konca CR (Številke 3B, 3C in 4B). Da bi ugotovili, ali aktiviranje poti LH-VTA lahko spodbuja CR, smo želeli preskusiti sposobnost aktiviranja LH-VTA pri vožnji CR v nasprotju z negativno posledico. V miših divjega tipa smo izrazili ChR2-eYFP ali eYFP samo v celicah LH in implantirali optično vlakno preko VTA (Številke 5A in S4). Nasprotno, da bi preizkusili vlogo poti LH-VTA pri posredovanju CR ali vedenj, povezanih s hranjenjem, smo dvostransko izrazili NpHR-eYFP ali eYFP samo v celicah LH in nad VTA vsadili optično vlakno (Številke 5A in S4).

Zasnovali smo Pavlovsko pripravljalno nalogo, v kateri so morali miši, ki so prikrajšane za hrano, prečkati šokovo mrežo, da bi dobili nagrado saharoze (Slika 5B). V prvi "izhodiščni" epohi (z izključeno šok mrežo) smo preverili, ali je vsaka miš dobila nalogo Pavlovskega pogojenega pristopa. V drugi ("Shock") dobi je šok mreža vsako sekundo povzročala blage udarce stopal. Nazadnje, v tretji epohi (»Shock + Light«) smo še naprej izvajali nožne sunke, pa tudi osvetljene LH terminale v VTA z modro svetlobo (10 Hz) pri miših, ki izražajo ChR2 in ujemajoče se eYFP kontrole in rumeno svetlobo (konstantno) za miši, ki izražajo NpHR in njihove kontrole eYFP (Slika 5B).

Opazili smo bistveno višje število vhodov na posamezno ceno med epohom Shock + Light in bistveno višjo oceno razlike (Shock + Light epoch - Shock-only epoch) v miših ChR2 glede na eYFP miši (Slika 5C in Film S1). V nasprotju s tem pa je fotoinhibicija poti LH-VTA povzročila pomembno zmanjšanje vhodnih vnosov na račun in razlike v razlikah v miših NpHR glede na miši eYFP (Slika 5D in Film S2). Poskusi izumrtja znotraj seje, med katerimi niso sledile napovedi za pošiljke saharoze, so pokazale podobne trende (Slika S4).

Pomembno je, da smo želeli ugotoviti, ali so spremembe v iskanju saharoze, ki smo jih dobili, posledica sprememb v vedenju ali občutljivosti na bolezen, povezane s hranjenjem. Ugotovili smo, da fotoaktivacija LH-VTA projekcije bistveno poveča čas hranjenja pri dobro hranjenih miših v skupini ChR2 (Slika 5E). Vendar pa fotoinhibicija poti LH-VTA ni bistveno zmanjšala hranjenja (Slika 5F), čeprav so bile živalim prikrajšane za povečanje naše zmožnosti za odkrivanje zmanjšanja v primerjavi z osnovno dobo (primerjajte z na- \ t Slika 5E). V niti ChR2 (Slika 5G) ali skupina NpHR (Slika 5H) smo opazili razliko v zakasnitvi do umika repa iz vroče vode (Ben-Bassat in sod., 1959, Grotto in Sulman, 1967), kar kaže, da manipulacija projekcije LH-VTA ne spreminja analgezije.

Za preučevanje sestave komponent hitrega prenosa vhodov LH v VTA, ki so povzročali te učinke, smo v pripravi akutne rezine izvedli posnetke celovitih obližev z nevroni VTA in optično aktivirali vhode LH, ki izražajo ChR2-eYFP (Številke 6A in S5). Glede na to, da znotraj VTA obstaja dobro uveljavljena heterogenost, ki vključuje ∼65% DA nevronov, ∼30% GABA nevronov in ∼5% glutamatnih nevronov (Margolis et al., 2006, Nair-Roberts et al., 2008, Yamaguchi et al., 2007) smo med snemanjem celice napolnili z biocitinom, da smo omogočili identifikacijo celičnega tipa z uporabo post-hoc imunohistokemije za tirozin hidroksilazo (TH; Slika 6B), poleg beleženja hiperpolarizacijsko aktiviranega kationskega toka (I_h) in preslikavo lokacije celice (Številke 6B in S5).

Najprej smo v fotostimulaciji vhodov LH, ki izražajo ChR2, zabeležili tokovno spono in opazili, da je 23 nevronov 27 pokazal časovno zaklenjen odziv na fotostimulacijo LH vnosov (Slika 6C). Večina nevronov DA, vzorčenih v VTA, je dobila neto ekscitatorski vhod iz LH (56%), medtem ko je druga podskupina pokazala neto inhibicijo (30%; Slika 6C). Prostorska porazdelitev teh DA nevronov je preslikana na atlas za horizontalne rezine, ki vsebujejo VTA (Slika 6D).

Da bi ugotovili monosinaptični prispevek vhodov LH v nevrone VTA DA, smo uporabili preslikavo vezij s pomočjo ChR2, kjer smo snemali napetostne objemke v prisotnosti tetrodotoksina (TTX) in 4-aminopiridina (4AP; Petreanu et al., 2007) . V skladu z našimi opazovanji s trenutnih posnetkov smo opazili, da je večina posnetih nevronov VTA DA prejemala ekscitacijski monosinaptični vhod iz LH (67%) v primerjavi z nevroni VTA DA, ki so prejemali izključno inhibitorni monosinaptični vhod (11%), ali oba (22%; Številke 6E in S6).

Nevrone VTA GABA smo identificirali z injiciranjem Cre-odvisnega fluoroforja (AAV₅-DIO-mCherry) v VTA miši VGAT :: Cre in uporabil mCherry ekspresijo za usmerjanje snemanja VTA GABA nevronov (n = 24; Slika 6F). Šestinštirideset odstotkov nevronov VTA GABA se je odzvalo z neto ekscitacijo, medtem ko se je 54% z neto inhibicijo odzvalo na fotostimulacijo LH vnosov, ki izražajo ChR2 (Slika 6G). Prostorska porazdelitev teh celic je prikazana v Slika 6H. Po pregledu monosinaptičnega vnosa iz LH (kot je opisano zgoraj) smo ugotovili, da je 18% vzorčenih nevronov GABA dobilo izključno vzbujevalni vnos in da je 9% prejel izključno inhibitorni vnos (Slika 6JAZ). Vendar smo glede na nevrone VTA DA ugotovili, da je več nevronov VTA GABA prejelo vzbujajoči AMPAR in inhibitorni GABA_AR-posredovani monosinaptični vhod iz LH (73%; hi-kvadrat = 5.0505, p = 0.0246; Številke 6jaz in S6).

Glede na to, da so naši ex vivo posnetki zagotovili dokaze, ki podpirajo močan vnos tako GABAergičnih kot glutamatergičnih projekcij LH v VTA, smo nato vlogo vsake komponente preizkusili neodvisno. Za to smo uporabili transgene mišje linije, ki izražajo Cre-rekombinazo v nevronih, ki izražajo bodisi vezikularni glutamatni transporter 2 (VGLUT2) bodisi vezikularni GABA transporter (VGAT). Vbrizgali smo AAV₅-DIO-ChR2-eYFP ali AAV₅-DIO-eYFP v LH VGLUT2 :: Cre in VGAT :: Cre miši in vsadili optično vlakno preko VTA (Slika S7). Te živali so bile nato vodene na vsakem vedenjskem testu, prikazanem v Slika 5.

Nismo opazili nobenih zaznavnih razlik v številu vnosov v pristanišče, ki so bili narejeni med miši, ki izražajo ChR2 ali eYFP v LH^sijaj-VTA projekcija (Slika 7A) ali v LH^GABA-VTA projekcija (Slika 7B). Toda po video analizi smo opazili nenavadno grizenje v LH^GABA-VTA: skupina ChR2 ob osvetljevanju modre svetlobe (glej Filmi S3 in S4). V LH^sijaj-VTA miši, čeprav je prišlo do trenda zmanjšanja hranjenja po fotostimulaciji v skupini ChR2 v primerjavi s skupino eYFP, to ni bilo statistično pomembno (Slika 7C). V nasprotju s tem smo opazili močno povečanje časa, ki smo ga porabili za hranjenje pri nasičenih miših po osvetljevanju v LH^GABA-VTA: skupina ChR2 glede na kontrole (Slika 7D in Film S3). Pri nobeni skupini živali ni bilo vpliva stimulacije svetlobe v testu odtegnitve repa (Številke 7E in 7F).

Med hranjenjem, kot smo ga opravili med opravljanjem saharoze, smo ponovno opazili nenavadna motorična zaporedja, povezana s hranjenjem, ki niso bila usmerjena v hrano. V LH smo posneli reprezentativno miško^GABA-VTA: skupina ChR2 v prazni prozorni komori in po 20 Hz fotostimulaciji smo opazili nenavadna apetitivna motorna zaporedja, kot je lizanje in glodanje tal ali praznega prostora (Film S4). Kvantificirali smo ta „gnawing“ vedenja med hranjenjem v divjem tipu LH-VTA (Slika 7G), LH^sijaj-VTA (Slika 7H) in LH^GABA-VTA (Slika 7I) skupine in so pokazale, da je LH^GABA-VTA: ChR2 miši so brusile več kot divji tip ali LH^sijaj-VTA: ChR2 miši pri fotostimulaciji v primerjavi z njihovimi skupinami eYFP (Slika 7J). Razmislili smo o tem, ali se lahko neprimerno vedenje, povezano s hranjenjem, loči od ustrezno usmerjenega krmljenja na nižjih frekvencah. Vendar, ko smo testirali LH^GABA-VTA: Skupina ChR2 s 5 Hz in 10 Hz vlaki modre svetlobe, opazili smo sorazmerno razmerje med frekvenco stimulacije ter hranjenjem in grizenjem (Slika 7K).

Projekcija LH v VTA je bila raziskana s študijami trčenja električnih stimulacij (Bielajew in Shizgal, 1986) in je že dolgo domnevno igrala vlogo pri obdelavi plačil (Hoebel in Teitelbaum, 1962, Margules in Olds, 1962), vendar je to pokazala. izziv. Tukaj podajamo podrobno razčlenitev o tem, kako posamezne komponente zanke LH-VTA obdelujejo različne vidike naloge, povezane z nagrado.

Z uporabo optogenetsko posredovanega fototagiranja (Slika 1), smo identificirali dve ločeni populaciji nevronov LH: celice, ki pošiljajo projekcije v VTA (tip 1) in celice, ki prejemajo povratne informacije od VTA (tip 2; Slika 2) - čeprav ni nujno, da so te populacije medsebojno izključujoče, saj je možno, da bi nevroni LH pošiljali in prejemali vhode v in iz VTA. Zanimivo je, da smo ugotovili, da je relativno malo fotosenzitivnih nevronov izpadlo iz bimodalne porazdelitve inkapsuliralo ti dve populaciji (Številke S2B in 1E). Glede na to v kombinaciji z dolgo zakasnitvijo v fotoodzivih tipa 2 (~ 100 ms) domnevamo, da lahko obstaja ena prevladujoča pot, ki prispeva k aktivnosti nevronov tipa 2. Ker DA veže receptorje, povezane z G-proteini, je kinetika počasnejša od večine glutamatergičnih sinaps (Girault in Greengard, 2004) in lahko razloži to skupino foto-odzivnih enot z zakasnitvijo 100 ms. Možno je tudi, da lahko VTA posreduje povratne informacije preko drugih distalnih regij, preko ekscitacijskih vmesnih regij, kot je amigdala, ali z razgradnjo prek jedra nakopičenja (NAc) ali posteljnega jedra stria terminalis (BNST).

Zanimivo je, da medtem ko fotostimulacija enot tipa 1 vzbuja vznemirljive odzive v enotah tipa 2, enote tipa 1 in 2 kažejo različne lastnosti vedenjskega kodiranja. Število enot tipa 1 in tipa 2, ki selektivno kodirajo napovedno napovedno nagrado, se na primer bistveno razlikuje (n = 0/19 tipa 1 v primerjavi z n = 12/34 tipa 2, hi-kvadrat = 8.67, p = 0.003) . Ta paradoksalni odzivni vzorec je lahko posledica računskih procesov v vmesnem elementu vezja, kot je VTA, ki ima lahko aktivno vlogo med vedenjskimi nalogami, neaktiven pa med fotografiranjem. Poleg tega bi vedenjsko stanje živali lahko vplivalo na način obdelave teh podatkov.

Naši poskusi izpuščanja nagrad nam omogočajo razlikovanje med LH nevronskim kodiranjem CR in porabo brezpogojnega dražljaja (US). V teh poskusih se je podskupina enot tipa 2 odzvala na napovedno napovedno napako (CS) in ZDA ter pokazala tudi zmanjšanje stopnje sprožitve, ko so bile izpuščene pričakovane nagrade. Poleg tega podskupina enot tipa 2 kaže tudi fazno vzbujanje ob nepričakovanem nagrajevanju (Številke 4G in 4H). Ti podatki spominjajo na način, kako DA nevroni v VTA kodirajo napako napovedovanja nagrajevanja (Cohen et al., 2012, Schultz et al., 1997). Ugibamo, da lahko nevroni VTA oddajajo signale o napakah pri napovedovanju nagrad na podskupino nevronov LH, ki so dobro postavljeni za vključitev teh signalov za določitev ustreznega vedenjskega izhoda. Natančneje, LH je trdno povezan z množico drugih možganskih področij (Berthoud in Münzberg, 2011) in je vzročno povezan z homeostatskimi stanji, kot so spanje / vzburjenost in lakota / sitost (Carter et al., 2009, Jennings et al. , 2013).

O kompulzivnem vedenju pri iskanju nagrade se je razpravljalo predvsem v okviru zasvojenosti z drogami, pri čemer je bila klasična paradigma kompulzivnega iskanja drog preučiti, v kolikšni meri vedenje pri iskanju drog vztraja ob negativni posledici, kot je šok na nogi (Belin in sod., 2008, Pelloux in sod., 2007, Vanderschuren in Everitt, 2004). To nalogo smo prilagodili iskanju saharoze, da bi lahko raziskali, ali aktivacija poti LH-VTA zadostuje za spodbujanje kompulzivnega iskanja saharoze. Glede na to, da je ločena razlika med zdravili in naravno nagrado v tem, da nagrade za preživetje niso potrebne, obstajajo polemike glede tega, kakšno vedenje bi pomenilo kompulzivno vedenje pri iskanju saharoze ali hrane. Alternativna interpretacija naših podatkov je, da aktivacija poti LH-VTA preprosto poveča motivacijski nagon ali željo po iskanju apetitnih ojačevalcev. Ker se stopnja debelosti v zadnjih desetletjih povečuje (Mietus-Snyder in Lustig, 2008), so kompulzivno prenajedanje in zasvojenost s sladkorjem najpogostejša stanja, ki močno ogrožajo zdravje ljudi (Avena, 2007). Krmilno vedenje nasičenih (polnokrvnih) miši po aktivaciji poti LH-VTA spominja na prehranjevalno vedenje, ki ga opazimo pri ljudeh z diagnozo kompulzivne motnje prenajedanja (ali motnje prehranjevanja) (DSM-V).

Predlagano je bilo, da ponovljena dejanja vodijo k oblikovanju navad, ki same vodijo do kompulzivnega nagrajevanja, ki je značilno za zasvojenost (Everitt in Robbins, 2005). Naše ugotovitve, da LH-VTA nevroni šifrirajo le vhodne pristanke po kondicioniranju, kažejo, da ta pot selektivno kodira pogojni odziv, ne le motivirano delovanje. To je v skladu z našimi opažanji, da lahko optično aktiviranje te projekcije spodbudi nagnjenost k iskanju negativnih posledic (Slika 5C), kot tudi v odsotnosti potrebe (kot smo opazili pri nasičenih miših, \ t Slika 5E). Ta razlaga je dodatno utemeljena z našo ugotovitvijo, da fotoinhibicija poti LH-VTA selektivno zmanjšuje kompulzivno iskanje saharoze (Slika 5D), vendar ne zmanjša hranjenja miši z omejeno hrano (Slika 5F). Eden največjih izzivov pri zdravljenju kompulzivnega prenajedanja ali motenj prehranjevanja zaradi prenajedanja je tveganje za poslabšanje prehranjevalnega vedenja na splošno. Z translacijske perspektive smo lahko določili specifično nevronsko vezje kot potencialno tarčo za razvoj terapevtskih posegov za kompulzivno prenajedanje ali zasvojenost s sladkorjem, ne da bi žrtvovali naravno vedenje pri hranjenju.

Pokazali smo, da je poleg glutamatergične komponente LH-VTA (Kempadoo et al., 2013) v projekciji tudi pomembna komponenta GABAergic (Leinninger et al., 2009) in da LH nevroni sinapsirajo neposredno na DA in Nevroni GABA v VTA (Slika 6). Vendar pa obstaja razlika v ravnotežju ekscitatornega / inhibitornega vnosa na VTA DA in GABA nevrone.

Medtem ko smo za preverjanje identitete nevronov VTA uporabljali imunohistokemično obdelavo, smo merili tudi I_h, hiperpolarizacijsko aktiviran navznoter usmerjajoči nespecifični kationski tok (Lacey in sod., 1989, Ungless in Grace, 2012). Prisotnost tega toka se v elektrofizioloških študijah pogosto uporablja za identifikacijo DA nevronov, vendar se je izkazalo, da je prisoten le v subpopulacijah DA nevronov, označenih s projekcijskim ciljem (Lammel et al., 2011). Čeprav so v pregledu Fields in sodelavci že predlagali, da "LH nevroni sinapsirajo na projekcije VTA na PFC, ne pa tudi na tiste, ki projicirajo na NAc" (Fields et al., 2007), naši podatki kažejo, da je treba to polemiko ponovno odpreti za nadaljnjo preiskavo. Čeprav smo opazili podskupino DA nevronov, ki so prejeli neto vzbujanje iz LH in so imeli zelo majhen I_h (skladno z mPFC- ali NAc medialnim projektorjem nevronov DA), smo opazili tudi podskupino nevronov DA, ki so prejeli neto ekscitatorski vhod in pokazali veliko I_h (v skladu z značilnostmi DA nevronov, ki se širijo na stransko lupino NAc; Slika S5; Lammel in sod., 2011). Nasprotno pa so nevroni VTA DA, ki so prejeli neto zaviralni vložek, pokazali zelo majhen I_h ali pa mu ta tok ni ustrezal, kar je v skladu s predstavo, da LH pošilja pretežno inhibitorni vhod na nevrone VTA DA, ki projicirajo v mPFC ali medialno lupino NAc. Pokazali smo tudi, da je mogoče vhode LH opaziti tako v medialnem kot v lateralnem VTA, kar kaže na to, da LH zagotavlja vhode na VTA nevrone z različnimi projekcijskimi cilji, saj je znano, da cilj projekcije VTA nekoliko ustreza prostorski lokaciji vzdolž medialno-bočne osi Lammel in sod., 2008).

Vloga poti LH-VTA pri spodbujanju nagrajevanja je bila že prej pripisana glutamatergičnemu prenosu v VTA (Kempadoo et al., 2013), saj se za promotor CaMKIIα pogosto šteje, da je selektiven za ekscitacijske projekcijske nevrone. Naši podatki pa jasno kažejo, da izražanje ChR2 pod nadzorom promotorja CaMKIIα cilja tudi na nevrone GABAergične projekcije v LH (Slika 6).

Obnašanje izzove s fotostimulacijo LH^GABA-VTA pot je bila pomahana, napačno usmerjena in maladaptivna (Film S4). Ena razlaga je, da je aktiviranje LH^GABA-VTA pot pošlje mišku signal, ki povzroči prepoznavanje apetitnega ojačevala. Druga možnost je, da je LH^GABA-VTA pot lahko spodbudi spodbujevalni poudarek ali intenzivno "željo", skladno s signalnim osnovnim pogojem, vendar na nefiziološki ravni, ki povzroči to neprimerno vedenje, povezano s hranjenjem (Berridge in Robinson, 2003). V skladu s tem je možno, da je aktiviranje LH^GABA-VTA projekcija dejansko proizvaja intenzivne občutke hrepenenja ali poziva k hranjenju. Vendar pa naši poskusi kažejo, da aktivacija LH^GABA-VTA ne povzroča povečanja kompulzivnega iskanja saharoze, vendar je to verjetno posledica prekomernega grizenja in neprijetnega vedenja, ki se osredotoča na neživilske predmete v komori za testiranje. Čeprav je pri tej manipulaciji težko določiti izkušnjo miši, je jasno, da ustrezno usmerjeno vedenje, povezano s hranjenjem, zahteva koordinirano aktiviranje obeh GABAergičnih in glutamatergičnih komponent poti LH-VTA.

Optogenetske in farmakogenetične manipulacije so močna orodja za vzpostavitev vzročnih povezav, vendar ne razkrivajo endogenih, fizioloških lastnosti nevronskih elementov. Naša študija združuje informacije o sinaptični povezljivosti, naravni endogeni funkciji in vzročni vlogi poti LH-VTA, kar zagotavlja novo raven vpogleda v to, kako so informacije vključene v to vezje. Ti rezultati poudarjajo pomen preučevanja funkcionalne vloge nevronov s povezljivostjo, poleg genetskih označevalcev. Nevroni LH-VTA selektivno kodirajo delovanje nagrajevanja za nagrado, vendar ne kodirajo okoljskih dražljajev, medtem ko so nagrajeni dražljaji in napovedni napotki kodirani z diskretno populacijo nevronov LH za VTA. Poleg tega smo identificirali specifično projekcijo, ki je vzročno povezana z kompulzivnim iskanjem in prehranjevanjem s saharozo. Heterogenost v projekciji LH-VTA je potrebna za zagotavljanje prilagodljivega ravnotežja med motivacijo vožnje in uravnavanjem ustrezno usmerjenega apetitnega vedenja. Te ugotovitve zagotavljajo vpogled v patološka stanja, kot so kompulzivna motnja prenajedanja, zasvojenost s sladkorjem in debelost