Receptorji dopamina D2 v odvisnosti od nagnjene disfunkcije in kompulzivnega prehranjevanja pri debelih podganah (2010)

Komentar: Ta študija kaže, da kadar ima žival neomejen dostop, lahko močan naravni ojačevalec (zelo spodbudna hrana) povzroči upad receptorjev D2. Ta upad so opazili pri skoraj vseh podganah in je nastal precej hitro. Ko so odstranili "zelo okusno" hrano, podgane niso hotele jesti običajnega čaja. Podgane so še naprej popivale (kadar so le mogle), kljub povezovanju električnih šokov z "zelo okusno" porabo hrane.

• Celovita študija

Nat Neurosci. 2010 maj; 13(5): 635-641. Objavljeno na spletu 2010 marec 28. doi:  10.1038 / nn.2519

Minimalizem

Ugotovili smo, da je bil razvoj debelosti povezan s pojavom progresivnega poslabšanja primanjkljaja pri nevronskih odzivih. Podobne spremembe v homeostazi z nagradami, ki jih povzroča kokain ali heroin, se štejejo za ključne pri sprožitvi prehoda od navadnega k kompulzivnemu jemanju drog. Skladno s tem smo zaznali kompulzivno vedenje hranjenja pri debelih, a ne vitkih podganah, merjeno kot prijetno uživanje hrane, ki je bila odporna na motnje z averzivnim pogojenim dražljajem. Striralni receptorji D2 za stripam dopamin (D2R) so bili pri debelih podganah nižji, kot so poročali pri ljudeh, odvisnih od drog. Poleg tega je odstranjevanje striptičnih D2Rs, ki jih povzroča lentivirus, hitro pospešilo razvoj primanjkljajev, ki so podobni odvisnosti, in začetek kompulzivno iskane hrane pri podganah z razširjenim dostopom do prijetne hrane z veliko maščob. Ti podatki kažejo, da prekomerna poraba okusne hrane sproži zasvojenost kot nevroadaptivni odzivi v možganskih nagradnih krogih in vodi k kompulzivnemu prehranjevanju. Zato lahko skupni hedonski mehanizmi temeljijo na debelosti in odvisnosti od drog.

Predstavitev

Na hranjenje vplivata užitek in nagrada in pridobitev nagrade s hrano lahko močno motivira potrošnjo1, 2. Kljub temu pa hedonski mehanizmi, ki prispevajo k debelosti, še vedno niso dobro razumljeni. Pri hiperfagičnih ljudeh s prirojenim pomanjkanjem leptina se aktivnost v hrbtnem in ventralnem striatumu, ki sta jedra sestavnih delov možganskih nagradnih tokokrogov, občutno poveča kot odziv na slike hrane3, nadomestno zdravljenje z leptinom pa oslabi tako striatno aktivnost kot tudi "naklonjenost" hrane, o kateri poročajo sami . To kaže na to, da je striatum pomemben pri hedonskih vidikih prehranjevalnega vedenja. Pred kratkim se je pokazalo, da je aktiviranje striatuma kot odziv na zelo okusno hrano pri debelih posameznikih v primerjavi s suhimi kontrolami topo3. Poleg tega sta hipofunkcija hrbtnega striatuma in dolgoročno povečanje telesne mase najbolj izrazita pri osebah z alelom TaqIA genskega lokusa DRD4 – ANKK2, kar ima za posledico zmanjšano izražanje D1R v striati in dokazano kaže, da posamezniki povzročajo motnje odvisnosti od snovi2, 4 Ta in podobna opažanja so privedla do predloga, da je primanjkljaj pri obdelavi nagrad lahko pomemben dejavnik tveganja za razvoj debelosti in da lahko debeli posamezniki prisilno uživajo okusno hrano, da nadomestijo hiposenzibilnost nagrad5. Nejasno je predvsem, ali so primanjkljaji pri obdelavi nagrad sestavni in pred debelostjo ali pa lahko prekomerno uživanje okusne hrane povzroči disfunkcijo nagrad in s tem prispeva k debelosti, ki jo povzroča prehrana.

Ključna značilnost prekomerne telesne teže in debelih oseb je, da še naprej prenajedajo kljub znanim negativnim zdravstvenim in socialnim posledicam. Dejansko veliko posameznikov s prekomerno telesno težo izrazi željo po omejevanju svoje porabe hrane, vendar se kljub temu bori za nadzor nad vnosom in večkrat porabi več kot svoje energijske potrebe7, 8. Razvoj prehranjevalnega vedenja, ki je neobčutljiv za negativni izid, je analogen kompulzivnemu vedenju uživanja drog, ki ga opazimo pri odvisnikih od drog, kar je podobno kot neprepustno za negativne posledice9. Tu smo raziskali učinke razširjenega dostopa do prijetne prehrane z veliko maščob na občutljivost sistemov nagrajevanja možganov pri podganah. Preučili smo tudi povezavo med hedonsko disregulacijo, ki jo povzroča prehrana, in pojavom kompulzivnega iskanja hrane. Na koncu smo preučili vlogo strijatalnih D2R v teh vedenjskih odzivih, podobnih odvisnosti.

Zasvojenemu podobnemu primanjkljaju nagrad pri primorskih podganah

Da bi preizkusili učinke omejenega ali razširjenega dostopa do okusne prehrane z visoko vsebnostjo maščob, smo pripravili samce podgan Wistar (300-350 g) z bipolarno stimulacijsko elektrodo v lateralnem hipotalamusu in jih 10–14 d trenirali v diskretnem poskusu. trenutni prag možganske stimulacijske nagrade (BSR), dokler niso bili vzpostavljeni stabilni pragovi nagrajevanja4. V postopku BSR se podgane močno odzovejo, da dobijo nagrajevalno električno samostimulacijo s stalno vzpodbudno elektrodo, z minimalno intenzivnostjo stimulacije, ki ohranja vedenje samostimulacije, imenovano prag nagrajevanja10. Ker pragovi nagrajevanja ostajajo stabilni in nespremenjeni v daljšem časovnem obdobju pod osnovnimi pogoji, ta postopek zagotavlja občutljivo merilo odzivnosti možganskih sistemov nagrajevanja. Po vzpostavitvi stabilnih pragov BSR (opredeljenih kot <10% variacije pragov v treh zaporednih sejah) smo podgane razdelili v tri skupine, ki niso pokazale razlik v povprečni telesni teži ali pragu nagrajevanja med skupinami. Tri skupine so imele različen dostop do prehrane v slogu kavarne, sestavljene iz okusne energetsko goste hrane, ki je na voljo za prehrano ljudi (glej spletne metode). Podgane so imele dostop do prehrane na dan 0 h (podgane samo s čajem; n = 9), 1 h (podgane z omejenim dostopom; n = 11) ali 18–23 h (podgane s podaljšanim dostopom; n = 11) 40 zaporednih dni. Znano je, da diete v kavarnah povzročajo debelost pri podganah, ki jo povzroča prehrana11. Vse podgane so imele tudi ad libitum dostop do standardne laboratorijske čajnice, pri čemer so bili ves čas zabeleženi pragovi nagrajevanja, povečanje telesne mase in vnos kalorij.

Teža se je pri podganah z razširjenim dostopom do prehrane v kavarnah znatno povečala v primerjavi s skupinami, ki so samo za pašo ali omejenim dostopom (slika 1a). Teža se je povečala tudi pri podganah z omejenim dostopom v primerjavi s podganami, ki so samo za pašo, vendar ta učinek ni dosegel statističnega pomena. Razvoj debelosti pri podganah s podaljšanim dostopom je bil tesno povezan s poslabšanjem pomanjkanja funkcije nagrajevanja možganov, kar se odraža v postopno povišanih pragovih BSR (slika 1b). Ker med tremi skupinami (Dopolnilna slika 1) niso opazili razlik v latencah odziva na BSR, tega opažanja ne more upoštevati. Poročali so o podobnih primanjkljajih v funkciji nagrajevanja možganov pri podganah z razširjenim, a ne omejenim dostopom do intravenske kokainske ali heroinske samouprave12, 13, 14. Tako lahko razširjen dostop do okusne hrane z veliko maščob povzroči odvisnosti od podobnega pomanjkanja funkcije nagrajevanja možganov, ki je pomemben vir motivacije, ki lahko povzroči prenajedanje in prispeva k razvoju debelosti1, 6.

Slika 1: Disfunkcija povečanja telesne teže in nagrad pri podganah s podaljšanim dostopom do prehrane v kavarni.

(a) Povprečno (± sem) povečanje telesne mase pri podganah z omejenim dostopom in podaljšanim dostopom, ki so imele samo napitke (interakcija dostop × dan: F39,702 = 7.9, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo chow, post hoc test). (b) Povprečna (± sem) odstotna sprememba od izhodiščnih pragov za nagrado (dostop × čas interakcije: F78,1092 = 1.7, P <0.0005; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo čaj, post hoc test).

Ko smo podrobno preučili obnašanje hranjenja (sl. 2), smo ugotovili, da je skupni dnevni vnos kalorij podoben med podganami, ki so samo za pašo in omejenim dostopom (slika 2a, d). Nasprotno je skupni vnos kalorij pri podganah s podaljšanim dostopom skoraj dvakrat večji kot pri podganah z omejenim dostopom in klenicam (Slika 2a, d). Čeprav so podgane z omejenim dostopom in samo za zajezitev ohranjale približno enak dnevni vnos kalorij (sl. 2a, d), so podgane z omejenim dostopom dobivale le ~ 33% svojih dnevnih kalorij od črevesa (slika 2b, d), kar kaže, da so razvili vedenje, podobno hranjenju, in so med dostopom do 66 h do prehrane kavarne1 zaužili ~ 15% svojega dnevnega vnosa kalorij (slika 2d). Podgane s podaljšanim dostopom so pridobile le majhen del (~ 5%) njihovega skupnega vnosa kalorij iz črevesa (sl. 2b); skoraj izključno so uživali prehrano iz kavarne (sl. 2d). Sprememba prehranske preference v skupinah z omejenim dostopom in skupinam s podaljšanim dostopom se je odražala tudi v izrazitem povečanju vnosa maščob v primerjavi s podganami, ki so samo za papriko (slika 2c in dodatna slika 2). V skladu s prejšnjimi poročili16 se je pri podganah s podaljšanim dostopom sčasoma zmanjšala poraba prehrane kavarne. To lahko odraža razvoj strpnosti do okusnosti živil, ki so del prehrane v kavarni. Kljub temu je bila pri teh podganah prednost pri prehrani kafeterije v primerjavi s standardno prigrizkom enakomerno velika (dodatna slika 3). Ti podatki kažejo, da razširjen, vendar ne omejen dostop do prijetne prehrane z veliko maščobami povzroča odvisnosti od pomanjkanja nagrad, prenajedanja in izgube homeostatske energijske bilance. Nasprotno pa omejen dostop do prijetne hrane povzroča pretirane vzorce uživanja, vendar ne moti homeostatske energijske uravnoteženosti niti funkcije nagrajevanja možganov. Vendar pa je mogoče, da bi omejen dostop do prehrane v kavarnah več kot 40 zaporednih dni povzročil znatno povečanje telesne mase in motnje delovanja možganov.

Slika 2: Vzorci porabe pri podganah z razširjenim dostopom do prehrane v kavarnah.

(a) Povprečni (± sem) dnevni vnos kalorij pri podganah samo z omejenim dostopom in podaljšanim dostopom (dostop: F1,324 = 100.6, P <0.0001; čas: F18,324 = 7.8, P <0.0001; dostop × časovna interakcija: F18,324 = 4.6, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino samo s čajem, post hoc test). (b) Povprečni dnevni vnos kalorij (± sem) od chow (dostop: F2,504 = 349.1, P <0.0001; čas: F18,504 = 5.9, P <0.0001; dostop × čas interakcije: F36,504 = 3.52, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo čaj, post hoc test). (c) Povprečni dnevni vnos kalorij (± sem) iz maščob (dostop: F2,486 = 118.7, P <0.0001; čas: F18,486 = 8.8, P <0.0001; dostop × čas interakcije: F36,486 = 6.2, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo čaj, post hoc test). (d) Primerjava povprečnega (± sem) skupnega kaloričnega vnosa in kalorij, porabljenih izključno iz čaja, v celotnem 40-dnevnem obdobju dostopa (dostop: F2,54 = 25.0, P <0.0001; vir kalorij: F2,54 = 1235.2, P <0.0001; dostop × interakcija z viri kalorij: F2,54 = 485.7, P <0.0001; *** P <0.001 v primerjavi s skupnimi kalorijami v skupini, ki vsebuje samo čaj, ### P <0.001 v primerjavi s skupnimi kalorijami v ista skupina podgan, post hoc test).

Po 40 dneh podganam ni bilo več dovoljen dostop do okusne prehrane, vendar so še naprej imeli ad libitum dostop do standardne laboratorijske čajnice. V tem prisilnem obdobju abstinence smo dnevno ocenjevali pragove nagrajevanja in porabo čaja. Zvišanje pragov nagrajevanja se je pri podganah s podaljšanim dostopom ohranilo vsaj 2 tedna, ko niso več imeli dostopa do okusne prehrane (slika 3a). To je v nasprotju s sorazmerno prehodnimi (~ 48 h) primanjkljaji v funkciji nagrajevanja, o katerih so poročali pri podganah, ki so se vzdržale samostojnega uživanja kokaina13. V tem abstinenčnem obdobju se je opazilo tudi zmanjšanje vnosa kalorij (slika 3b) in postopno zmanjšanje telesne teže (slika 3c) pri podganah s podaljšanim dostopom in v manjši meri pri podganah z omejenim dostopom, v skladu z prejšnja poročila11, 15. Po 14 d abstinence so bile podgane usmrčene in namestitve elektrod so bile določene z barvanjem krezil vijolice (slika 3d).

Slika 3: Trajna disfunkcija nagrad in hipofagija med abstinenco pri podganah s podaljšanim dostopom do prehrane v kavarni.

(a) Povprečna odstotna sprememba od izhodiščnih pragov za nagrado (± sem) med abstinenco od okusne prehrane z visoko vsebnostjo maščob (dostop: F2,112 = 3.7, P <0.05; čas: F4,112 = 2.3, P> 0.05; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo chow, post hoc test). (b) Povprečni kalorični vnos (± sem) zadnji dan dostopa do diete z visoko vsebnostjo maščob (izhodišče) in med 14 dnevi abstinence, ko je bil na voljo samo standardni čaj (dostop: F2,168 = 41.7, P <0.0001 ; čas: F6,168 = 65.6, P <0.0001; dostop × čas interakcije: F12,168 = 38.3, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino, ki je imela samo čaj, post hoc test). (c) Sprememba povprečne telesne teže (± sem) v primerjavi s telesno težo zadnjega dne dostopa do diete z veliko maščobami (izhodišče) in med 14 dnevi abstinence, ko je bil na voljo le standardni čaj (dostop: F1,126 = 37.2, P <0.0001; čas: F7,126 = 3.1, P <0.01; dostop × čas interakcije: F7,126 = 40.9, P <0.0001; * P <0.05 v primerjavi s skupino samo s čajem, post hoc test). (d) Histološka rekonstrukcija lokacije stimulirajočih elektrod BSR v lateralnem hipotalamusu podgan samo s čajem (trikotniki), z omejenim dostopom (kvadrati) in podaljšanim dostopom (krogi).

Strijatalni D2R pri debelih podganah: vloga pri primanjkljaju

Nato smo preizkusili hipotezo, da lahko prekomerno uživanje okusne prehrambene kavarne zmanjša gostoto striatalnih D2R in prispeva k razvoju hiposenzibilnosti nagrajevanja, podobnega odvisnosti. Novi kohorti podgan samo z omejenim dostopom in omejenim dostopom je bil dovoljen dostop do prehrane v kavarni, dokler ni prišlo do statistično značilnega povečanja telesne teže pri podganah s podaljšanim dostopom v primerjavi s skupino, ki je prejemala samo čaj (P <0.05 ; Slika 4a). Striatalna ekspresija domnevno močno glikozilirane (~ 70 kDa) z membrano vezane oblike D2R je bila pri podganah s podaljšanim dostopom nižja kot pri podganah z omejenim dostopom ali samo chow (slika 4b; glej spletne metode). Ko smo podgane v vsaki dostopni skupini razdelili v dve podskupini na podlagi mediane razdelitve telesne teže (lahke ali težke), smo ugotovili jasno obratno razmerje med telesno težo in izražanjem striatalne D2R (slika 4a, c). Nismo zaznali nobenega statistično pomembnega zmanjšanja izražanja nezasveščenih nezrelih (~ 39 kDa) in vmesno glikoziliranih citoplazmatskih (~ 51 kDa) oblik D2R (dopolnilna slika 4) 17, kar kaže, da je izražanje striatnega D2R pri podganah s podaljšanim dostopom verjetno urejeni s pomočjo post-transkripcijskih mehanizmov.

Slika 4: Povečanje telesne mase je obratno povezano s stopnjami D2R.

(a) Podgane samo z omejenim dostopom in omejenim dostopom so bile razdeljene v dve skupini glede na pogoje dostopa na podlagi mediane delitve telesne teže: lahke (L) ali težke (H). (b) Celoten striatni kompleks smo zbrali od vseh podgan in ravni D2R v vsaki skupini, merjene z Western blot-om. Z membrano povezan pas D2R smo razločili pri 70 kDa, kontrola nalaganja beljakovin pa je prikazana spodaj (β-aktin, 43 kDa). Imunobloti polne dolžine so prikazani na dopolnilni sliki 12. (c) Relativne količine D2R v striatumu podgan samo s čajem, omejenim dostopom in podaljšanim dostopom so bile merjene z denzitometrijo (F2,6 = 5.2, P <0.05, glavno učinek dostopa; * P <0.05 in ** P <0.01 v primerjavi s skupino samo s čajem-L).

Nato smo preizkusili funkcionalno pomembnost zmanjšanja strij D2R, ki ga povzroča prehrana, za funkcijo nagrajevanja možganov, zasnovali in potrdili lentivirusni vektor, da smo dobili kratko lasno motečo RNA (shRNA), da bi srušili D2R (Lenti-D2Rsh; sl. 5 in dodatna slika 5). Pragi za nagrado so se začele povečevati pri podganah, ki so jih zdravile z Lenti-D2Rsh, skoraj takoj, ko jim je bil dovoljen razširjen dostop do prehrane v kafeteriji, medtem ko so pri podganah s podaljšanim dostopom, ki se zdravijo s praznim vektorjem lentivirusa (nadzor leče), v relativno kratkem obdobju nespremenjene. dostopa do prehrane kavarne (14 d; sl. 6a). Latencije odziva pri obeh skupinah podgan niso bile spremenjene, kar kaže, da ta učinek ni sekundarni pri pomanjkanju pri izvajanju nalog (dopolnilna slika 6). Pragi za nagrajevanje so bili nespremenjeni tudi pri podganah, ki so se zdravile z Lenti-D2Rsh ali Lenti, ki so imele dostop do črevesa le v istem obdobju (sl. 6b).

Pragi so bili vztrajno povišani med dodatnim 15 d abstinenco, ko so vse podgane imele dostop samo do standardne paprike (dodatna slika 7). Zaustavitev strijnega D2R je zato povečala občutljivost na hipofunkcijo nagrajevanja, ki jo povzroča dieta, vendar ni spremenila osnovne vrednosti sistemov nagrajevanja možganov.

Slika 5: Lentivirusno posredovano zaustavljanje strijnega D2R izraza.

(a) Grafični prikaz progastnih površin, na katerih je bil Lenti-D2Rsh preveč izražen. Zeleni krogi na levi progasti polobli predstavljajo lokacije, na katere so bile usmerjene virusne infuzije. Zeleno obarvanje na desni striatalni polobli je reprezentativno imunokemijsko obarvanje zelenih fluorescentnih beljakovin (GFP) iz možganov podgane Lenti-D2Rsh. (b) Reprezentativni imunoblot zmanjšane ekspresije D2R v striatumu podgan Lenti-D2Rsh. Imunobloti polne dolžine so prikazani na dodatni sliki 13. (c) Relativne količine D2R v striatumu podgan Lenti-control in Lenti-D2Rsh, kvantificirane z denzitometrijo (* P <0.05 v primerjavi s skupino Lenti-control, post hoc test ). (d) Okužbe glijskih celic v striatumu z vektorjem Lenti-D2Rsh niso odkrili. Zeleno obarvanje je GFP virusa; rdeča je astrocitni marker glialnih fibrilarnih kislih beljakovin (GFAP); jedra celic so označena z barvanjem DAPI v modri barvi. Bele puščice označujejo lokalizirano območje glioze, ki ga najdemo le na mestu injiciranja virusa v striatumu in ne v okoliških tkivih, v katera se je virus razpršil. Tudi na tem področju noben astrocit ni pozitiven na GFP. Rumene puščice na povečani sliki poudarjajo tipične GFP negativne astrocite, ki so bili zaznani. (e) Visoke ravni nevronskih okužb v striatumu z vektorjem Lenti-D2Rsh. Zeleno obarvanje je GFP virusa; rdeča je nevronski jedrski marker NeuN; jedra celic so označena z barvanjem DAPI v modri barvi. Rumene puščice na povečani sliki poudarjajo GFP-pozitivne in NeuN-pozitivne nevrone v striatumu. (f) Slika večje povečave virusno okuženega (GFP-pozitivnega) nevrona v striatumu podgan Lenti-D2Rsh, ki prikazuje tipične morfološke značilnosti srednje trnastih nevronov.

Slika 6: Zatiranje progastega D2R poveča ranljivost za nagrajevanje disfunkcije pri podganah s podaljšanim dostopom do prehrane v kavarni.

(a) Povprečna (± sem) odstotna sprememba od izhodiščnih pragov za nagrajevanje pri podganah Lenti-control in Lenti-D2Rsh, ki so imele 14 zaporednih dni razširjen dostop do kavarne (virus: F1,156 = 5.9, P <0.05; čas: F13,156 = 2.2, P <0.05; interakcija virus × čas: F13,156 = 2.2, P <0.05; #P <0.05, učinek interakcije). (b) Povprečna (± sem) odstotna sprememba od izhodiščnih pragov za nagrajevanje pri podganah Lenti-control in Lenti-D2Rsh, ki so imele dostop samo za čaj. (c) Povprečni (± sem) kalorični vnos podgan med 14 d samo čaja ali podaljšanim dostopom (dostop: F2,28 = 135.6, *** P <0.0001). (d) Povprečno (± sem) povečanje telesne mase med 14 d samo čaja ali podaljšanega dostopa (dostop: F2,28 = 96.4, P <0.0001; *** P <0.001, glavni učinek dostopa).

Ugotovili smo, da sta kalorični vnos (sl. 6c) in povečanje telesne mase (slika 6d) podobna v skupini Lenti-D2Rsh in ustreznih skupinah za nadzor Lenti v pogojih, ki so namenjeni samo za zajemanje ali podaljšani dostop (dodatni sliki 8 in 9). Tako strij D2R ni spremenil niti prehrane kavarne niti skupnega kaloričnega vnosa, ko je bila okusna hrana prosto dostopna za uživanje.

Obvezno prehranjevanje pri debelih podganah: vloga za strij D2R

Naslednjič smo preizkusili hipotezo, da se lahko pri podganah z razširjenim dostopom do prehrane v kavarni pojavi kompulzivno podobno prehranjevanje in da k temu lahko prispeva primanjkljaj signalizacije D2R v striatalu. Novi kohorti podgan samo z omejenim dostopom in podaljšanim dostopom je bil dovoljen dostop do prehrane v kavarni več kot 40 dni, dokler ni pri podaljšanih podganah prišlo do statistično pomembnega povečanja teže (P <0.05 v primerjavi s podganami samo z chow; podatki ne prikazano). Vsem trem skupinam podgan je bil nato dovoljen le 30-minutni dostop na dan do prehrane v kavarni za 5–7 dni v operantni komori, dokler ni bil dosežen stabilen vnos (opredeljen kot <10% variacija dnevnega vnosa). Polovica podgan v vsakem stanju dostopa je bila nato izpostavljena svetlobi (pogojeni dražljaj) v paru z udarci z nogo (kaznovana skupina), medtem ko so bile preostale podgane v vsaki skupini izpostavljene svetlobi, če ni bilo nožnega šoka (nekaznovana skupina). ). Na testni dan smo preučevali učinke samo izpostavljenosti svetlobi izbirne svetlobe na okusno uživanje hrane (slika 7; glej spletne metode). Ugotovili smo, da je bil povprečni vnos kalorij med 30-minutnimi začetnimi sejami pri podganah z omejenim dostopom in omejenim dostopom večji kot pri podganah s podaljšanim dostopom (slika 7a, b). To kaže na to, da so se podgane, ki so prejemale samo čaj in omejen dostop, med občasnimi 30-minutnimi sejami dostopa uživale na okusni hrani, kar se odraža v dejstvu, da so te podgane zaužile ~ 40–50% dnevnega kaloričnega vnosa, običajno približno 100 kCal, med temi sejami (slika 7a, b). Nasprotno pa se zdi, da so podgane s podaljšanim dostopom odporne na to prehranjevalno vedenje, podobno pijani, morda zato, ker je njihova zgodovina skoraj neomejenega dostopa do okusne hrane več kot 40 zaporednih dni vzpostavila vzorce prehranjevanja, ki so bili razmeroma neprilagodljivi za spremembe. Na testni dan nismo opazili nobenega statistično pomembnega učinka ponovitve svetlobe iztočnice na porabo hrane pri nekaznovanih podganah iz skupin z omejenim dostopom ali omejenim dostopom ali podaljšanim dostopom v primerjavi z vnosom v izhodiščnem obdobju (slika 7a). Lučka samo zato ni imela motivacijskega poudarka. Pri kaznovanih podganah je udarna svetloba, ki je bila seznanjena s šokom, znatno zmanjšala prijeten vnos hrane pri podganah, ki so imele samo chow in omejen dostop. Kljub temu svetloba ni vplivala na prijeten vnos hrane pri podganah s podaljšanim dostopom, kar kaže, da njihova poraba ni občutljiva na nenaklonjene okoljske znake, ki napovedujejo stisko. Izhodiščni vnos energije pri podganah s podaljšanim dostopom je bil nižji kot pri drugih skupinah. Ker pa je bil vnos chow-ja v podobnih časovnih obdobjih precej nižji (slika 7d), je malo verjetno, da to predstavlja "talni učinek", ki zmede naše ugotovitve. Naši podatki skupaj podpirajo idejo, da se lahko pri podganah s podaljšanim dostopom pojavlja kompulzivno vedenje pri prehranjevanju, ki je analogno kompulzivnemu jemanju kokaina pri podganah z zgodovino razširjenega dostopa do zdravila18.

Slika 7: Prisilno podobno odzivanje na okusno hrano.

(a) Povprečna (± sem) okusna prehrana pri nekaznovanih podganah med 30-minutnimi izhodiščnimi sejami in na testni dan, ko so bile podgane izpostavljene nevtralnemu pogojenemu dražljaju, ki prej ni bil seznanjen s škodljivim udarcem stopal (dostop: F2,20 = 5.2, P <0.05; #P <0.05 v primerjavi s podganami samo s čajem). (b) Povprečna (± sem) okusna prehrana pri kaznovanih podganah med 30-minutnimi izhodiščnimi sejami in na testni dan, ko so bile podgane izpostavljene kondicioniranemu dražljaju, ki je bil prej seznanjen s škodljivim udarcem stopal (dostop: F2,21 = 3.9 , P <0.05; iztočnica: F1,21 = 8.6, P <0.01; interakcija dostop × iztočnica: F2,21 = 4.7, P <0.05; * P <0.05 v primerjavi z vnosom med začetno sejo, #P <0.05 v primerjavi z podgane samo s čajem). (c) Povprečna (± sem) okusna prehrana med 30-minutnimi izhodiščnimi sejami in na testni dan pri podganah Lenti-control in Lenti-D2Rsh, ki so prej imele samo prehramben ali razširjen dostop do kavarne (iztočnica: F1,26, 29.7 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <30 v primerjavi z vnosom med izhodiščnimi sejami, post hoc test). (d) Povprečna (± sem) poraba čaja med 2-minutnimi začetnimi sejami in na testni dan pri podganah Lenti-control in Lenti-D1,26Rsh, ki so prej imele samo chow ali podaljšali dostop do prehrane v kavarni (iztočnica: F44.9 = 0.0001, P <0.05; * P <0.01, ** P <XNUMX v primerjavi z vnosom med izhodiščnimi sejami, post hoc test).

Na koncu smo preučili učinke pogojenega dražljaja, ki je povezan s kaznovanjem, na vnos hrane pri podganah Lenti-control in Lenti-D2Rsh, ki so prej imele dostop samo do chow ali podaljšale dostop do prehrane v kavarni (podgane s slike 6). Ugotovili smo, da je bil izhodiščni okusni vnos hrane med 30-minutnimi začetnimi sejami v vseh štirih skupinah podobno visok (~ 40 kCal) (slika 7c). Poleg tega je bila skupna dnevna poraba čaja (v domači kletki) podobna med vsemi štirimi skupinami podgan med kondicioniranjem in na testni dan (dopolnilna slika 10). 14 d predhodnega dostopa do jedilnice v kavarni torej ni zadostovalo za blokiranje prehranjevalnega vedenja, podobnega popivanju, na način, podoben tistemu pri podganah, ki so imele> 40 d podaljšan dostop do prehrane v kavarni (slika 7a, b). Averzivni dražljaj svetlobe je motil prijeten vnos hrane pri podganah Lenti-control in Lenti-D2Rsh, ki so prej imele dostop samo za čaj (slika 7c). Podobno je averzivni pogojeni dražljaj motil prijeten vnos hrane pri podganah Lenti-control, ki so prej imele 14 d podaljšan dostop do prehrane v kavarni. Nasprotno pa averzivni pogojeni dražljaj ni vplival na okusno uživanje hrane pri podganah Lenti-D2Rsh, ki so prej imele 14 d podaljšan dostop do prehrane v kavarni (slika 7c). Pragovi BSR so pri teh podganah ostali znatno povišani, ko so bili zabeleženi 48 ur po preskusu, medtem ko so pragovi ostali stabilni in nespremenjeni pri ostalih treh skupinah podgan

(Dopolnilna slika 11). Da bi preverili, da odpornost na pogojeno spodbudo, ki jo povzroča zaužit vnos hrane pri podganah s podaljšanim dostopom Lenti-D2Rsh, ni sekundarna pri okvari klasičnih kondicioniranja, smo preizkusili učinke averzivnega pogojenega dražljaja na uživanje manj prijetnega standardnega črevesja v vse štiri skupine podgan. V nasprotju s prekuhavanjem okusne hrane, smo ugotovili, da so vse štiri skupine podgan zaužile malo črevesa (~ 2 kCal) med minimi osnovnimi sejami 30 (sl. 7d) in da je bil vnos štirihranje motenj v vseh štirih skupinah moten. podobna razsežnost ob izpostavljenosti averzivno pogojenemu dražljaju (slika 7d). Ti podatki kažejo, da je odstranjevanje progastih D2R izrazito pospešilo pojav kompulzivnega uživanja okusne hrane, vendar le pri podganah z razširjenim dostopom. Ker je bilo kompulzivno prehranjevanje odkrito samo pri podganah Lenti-D2Rsh, ki so imele povišane pragove BSR, je lahko hipofunkcija nagrad, ki jo povzroča prehrana, nujna pomoč pri pojavu kompulzivnega iskanja hrane.

Razprava

Enostavnost dostopa do prijetne hrane z veliko maščob je pomemben dejavnik tveganja za debelost19. Ugotovili smo, da je razširjen dostop do zelo prijetne prehrane v jedilnici privedel do prenajedanja in povečanja telesne teže, skupaj s postopno zvišanjem pragov BSR pri podganah. Ta učinek na pragove BSR je mogoče razložiti s postopnim zmanjšanjem odzivnosti vezij za nagrajevanje možganov, razlago, ki je skladna z dejstvom, da lahko omejevanje hrane in izguba teže povečata20, medtem ko lahko akutno prekomerno hranjenje prehodno zmanjša21, odziv na BSR pri podganah. Ta ugotovitev predstavlja razširitev dela, ki kaže, da akutno prekomerno hranjenje podgan skozi intragastrično hranjeno cev21 in želodčno zadrževanje ali intravenska infuzija glukagona, ki posnema postprandijalno sitost22, 23, 24, zmanjšuje odzivnost za nagrajevanje stranskih hipotalamičnih BSR in povečuje odpornost podobne odzive stimulacija25. Prejšnje delo je tudi pokazalo, da večkratno krmljenje podgan skozi znotraj želodca, dokler se njihova teža ne poveča za ~ 200 g, podobno zniža stopnjo odzivnosti za BSR, učinek pa traja, dokler se telesna teža ne normalizira23. Kot v teh ugotovitvah pri podganah je bil odziv pri mačkah na stranski hipotalamični BSR zaviran s predhodnim hranjenjem na zasitost26, kar kaže, da se medsebojno delovanje med funkcijo nagrajevanja možganov in presnovnim stanjem ohrani, zato se verjetno tudi pri ljudeh. Enostavnost dostopa in posledično prenajedanje kafeteričnih diet pri ljudeh velja za pomemben okoljski dejavnik sedanje epidemije debelosti v zahodnih družbah19. Naši podatki kažejo, da se hipofunkcija nagrajevanja pojavi pri podganah, ki prostovoljno prejedajo okusno prehrano iz kavarne, podobno tisti, ki jo zaužijejo ljudje, in ta učinek se postopoma poslabša, ko pridobivajo večjo težo. Zlasti so imele vse podgane z dvigom praga nagrad ≥20% BSR elektrode, ki so nameščene znotraj ~ 500 μm dorsolateralno. Občutljivost nevronov, povezanih z nagradami, na tem področju se poveča z omejevanjem hrane na način, ki je občutljiv na hormon leptin, ki izvira iz maščobe, in ta možganska regija velja za pomemben substrat za nagrajevanje hrane27. Možganska vezja, ki uravnavajo hedoniko hrane, torej zavirajo s postingastičnimi signali, ki napovedujejo sitost, skladno z nedavnimi študijami slikanja na ljudeh, ki kažejo, da želodčna distanca28 in peptid postprandijalnega faktorja peptid YY3-36 (PYY) 29 modulirata aktivnost regij možganov vključen v obdelavo nagrad. Poleg tega sisteme nagrajevanja zavira tudi prekomerno pridobivanje teže. Nedavna poročila kažejo, da kroži leptin, ključni regulator energijske bilance, lahko prodre v možganska tkiva in zavira aktivnost nagradnih krogov3, 27, 30, 31.

Primanjkljaji nagrad pri podganah s prekomerno telesno težo lahko odražajo protislovno znižanje izhodiščne občutljivosti možganskih nagradnih tokokrogov, da nasprotujejo njihovemu prekomernemu spodbujanju z okusno hrano. Takšna hipofunkcija nagrajevanja, ki jo povzroča prehrana, lahko prispeva k razvoju debelosti s povečanjem motivacije za uživanje „obesogenih“ diet z visoko nagrado, da bi se izognili ali ublažili to stanje negativne nagrade6, 32. To bi lahko bila posledica hipofagije, ki smo jo opazili pri razširjenem dostopu podganah in v manjši meri pri podganah z omejenim dostopom, ko je bila okusna hrana umaknjena in je bila na voljo le manj okusna čaja. Tak scenarij je skladen tudi s podatki iz študij slikanja človeških možganov, v katerih je topa aktivacija striatuma kot odziv na zelo okusno hrano, zlasti pri posameznikih z genskimi polimorfizmi, za katere se domneva, da zmanjšujejo izražanje D2R v striatu, povezana z dolgotrajnim povečanjem telesne mase4. Ni jasno, ali se taka hiposenzibilnost nagrad pri debelih osebah kaže pred razvojem debelosti in je povezana izključno z genetskimi dejavniki („sindrom pomanjkanja nagrade“) ali pa lahko prenajedanje povzroči motnje v obdelavi nagrad. Naši podatki kažejo, da podaljšan dostop do okusne visokoenergijske hrane in posledično prenajedanje nagradita občutljivost in zato lahko predstavljata pomemben hedonski mehanizem, ki spodbuja razvoj debelosti. Podobno disfunkcijo nagrajevanja, kot jo tukaj poročajo pri debelih podganah, zaznamo tudi pri podganah z zgodovino razširjenega dostopa do intravenske uporabe kokaina ali heroina, ne pa tudi pri tistih z omejenim dostopom12, 13, 14. Poleg tega prehod iz naključno do kompulzivnega iskanja drog naj bi izhajalo iz poskusa ublažiti vztrajno stanje zmanjšane nagrade, ki jo povzroča ta disfunkcija nagrajevanja zaradi drog12, 32, 33. Tako naši podatki kažejo, da imata lahko debelost in odvisnost od drog osnovne hedonske mehanizme.

Zmanjšanje regulacije strijnega izražanja D2R je značilen nevroadaptivni odziv na preveliko porabo okusne hrane. Dejansko se pri osebah s prekomerno telesno težo kažejo zmanjšanja gostote D2R4, 34 in glodavci35, 36. Nasprotno pa imajo posamezniki z anoreksijo nervozo povišano strijatalno D2R37, izguba telesne teže pri debelih osebah po bariatrični (želodčni bypass) operaciji pa je povezana z zvišano strijsko D2R gostoto28. Genski polimorfizem, imenovan alel TaqIA A1, povzroči zmanjšanje strijatalne gostote D2R, posamezniki, ki zajemajo ta alel, pa so prekomerno zastopani v debelih populacija4. Alel TaqIA prav tako povečuje občutljivost na odvisnost od alkohola, opioidov in psihomotornih stimulansov38. Zmanjšanje gostote striatalne D2R, ki se pojavi bodisi zaradi konstitutivnih genetskih dejavnikov bodisi kot posledica prenajedanja, lahko zato prispeva k nevrobiološkim mehanizmom debelosti. Ugotovili smo, da so strijatalne ravni izoforme 70 kDa D2R, za katero se misli, da odraža membransko povezano D2R, obratno povezane s telesno maso pri podganah iz skupin, ki so bile samo za živali, z omejenim dostopom in s podaljšanim dostopom (slika 4). Zrušenje strijnega izražanja D2R, najbolj izrazito v dorsolateralnem striatumu (sl. 5), je povzročilo, da se pragovi BSR skoraj takoj povečajo po izpostavitvi kafeterijski dieti. Zmanjšanje izražanja strijnega D2R je zato hitro pospešilo pojav hipofunkcije nagrad pri podganah s podaljšanim dostopom do zelo prijetne hrane, kar je ugotovitev, ki je skladna s podatki o slikanju človeških možganov, ki kažejo, da primanjkljaj strijske gostote D2R prispeva k nagrajevanju hipofunkcije pri debelih osebah4.

Prav tako velja omeniti tri značilnosti podgan Lenti-D2Rsh. Prvič, čeprav je strij D2R v kombinaciji s podaljšanim dostopom do okusne prehrane privedel do zvišanja pragov BSR, pri teh podganah ni bilo razlik v vnosu kalorij ali povečanju telesne teže. To bi lahko odražalo to dejstvo, da so podgane imele samo 14 d dostop do prehrane v kavarnah; daljša obdobja dostopa bi lahko povzročila povečanje telesne teže sčasoma, podobno kot večje dovzetnost za povečanje telesne mase, opaženo pri ljudeh s pomanjkanjem strijatalne D2R signalizacije4. Prednost omejevanja dostopa do prehrane kavarne samo na 14 d je, da so bile podgane s podaljšanim dostopom edina skupina, ki je pokazala povišane pragove BSR, in to nam je omogočilo oceno potencialne vloge nagradne hipofunkcije pri razvoju kompulzivnih prehranjevanje (glej spodaj). Drugič, pragovi BSR so ostali stabilni in nespremenjeni pri podiranih podganah, ki so imele dostop samo do črevesa. To kaže, da samo zmanjšana strijska D2R ekspresija ni bila dovolj za sprožanje nagrajene hiposenzibilnosti; namesto tega se je zdelo, da deluje s prekomerno porabo okusne hrane, da bi pospešil nastanek tega stanja zmanjšane občutljivosti za nagrado. Drugi prilagodljivi odzivi v nagradnih sklopih možganov lahko zato sprožijo hiposenzibilnost nagrad pri podganah s podaljšanim dostopom do prehrane v kafeteriji. Glede na to opažamo, da agonist BXokumina agonist D2R zmanjšuje kroženje leptin39 in leptin vsaj deloma zavira hranjenje z zaviranjem strijčnih regij, ki nadzorujejo hedonske odzive na hrano3, 30, 31. Tako je možno, da znižanje regulacije strijatalnega D2R kot odziv na povečanje telesne teže poveča signalizacijo leptina in s tem poveča zaviralne učinke tega adipokina na sisteme nagrajevanja možganov. Na koncu opažamo, da smo svoje lentivirusne vektorje usmerili proti dorsolateralnemu striatumu. To je bilo predvsem iz tehničnih razlogov, saj nam je bočna namestitev kanile za dostavo virusa v striatum omogočila tudi namestitev hipotalamične stimulirajoče elektrode za določanje praga BSR. Tako je možno, da bi lahko ciljanje D2R-ov zaradi porušitve na drugih območjih striatuma, zlasti na dorzomedialnih in ventralnih območjih (jedro in lupina jedra), imelo povišane pragove BSR tudi, če ne bi bila prijetna prehrana.

Dorsolateralni striatum je bil močno vpleten v učenje navad na navade odziv na dražljaje, kar se kaže v razvoju navadnega vedenja, ki je neobčutljivo za razvrednotenje s predhodnim hranjenjem do nasičenja ali s seznanjanjem s škodljivimi dražljaji40. Z usmerjanjem pretežno na dorsolateralni striatum bi morda podrli populacije D2R, ki uravnavajo ranljivost podgan na razvoj kompulzivnega prehranjevanja. V skladu z vlogo striatalnih D2R pri kompulzivnem vedenju je tudi alel TaqIA človeškega lokusa DRD2 – ANKK1 - kar ima za posledico nizko striatalno gostoto D2R5, topi aktivacijo striata kot odziv na okusno hrano4 in povečuje ranljivost na debelost4 - povezan z primanjkljaji pri učenju, da bi se izognili dejanjem z negativnimi posledicami41. Izguba zaviralnega nadzora nad vedenjem, ki ima lahko negativen izid, je značilna tako za debelost kot za odvisnost od drog, pri kateri konzumacijsko vedenje vztraja kljub negativnim socialnim, zdravstvenim ali finančnim posledicam. Obnašanje jemanja kokaina pri podganah, ki so v preteklosti uživale veliko drog, lahko postane neprilagodljivo in odporno na motnje zaradi averzivnega pogojenega dražljaja, ki napoveduje negativen izid (nožni šok) Podobno bodo miši, ki so prej imele dostop do okusne prehrane z visoko vsebnostjo maščob, več časa preživele v neugodnem (močno osvetljenem) okolju, da bi dobile okusno hrano, kot miši, ki niso imeli izkušenj s prehrano18. Ugotovili smo, da je bila prijetna poraba hrane pri podganah z razširjenim dostopom do kavarniške prehrane podobno neobčutljiva na averzivni pogojeni dražljaj. Skladno z vlogo striatalnih D42R pri tem učinku je bilo pri podloženih striatalnih D2R podganah, ki so pred tem imele 2 d podaljšan dostop do prehrane v kavarni, vendar v kontrolnih skupinah, ugotovljeno kompulzivno prehranjevanje. Z vidika nevrocirkuitrije bi razširjen dostop do okusne hrane lahko sprožil plastičnost v kortikostriatalnih poteh, s čimer bi bile živali bolj ranljive za razvoj kompulzivnega vedenja, pri čemer primanjkljaji v striatalnem D14R signalizirajo ta proces. Dejansko je zmanjšana gostota striatnega D2R pri debelih posameznikih korelirana z zmanjšano presnovo v prefrontalni in orbitofrontalni kortikalni regiji2, ki izvajajo inhibitorni nadzor nad vedenjem43.

Zlasti je bilo kompulzivno uživanje okusne hrane odkrito samo pri podivjanih podganah, ki so prej imele razširjen dostop do prehrane kafeterije, ne pa pri kontrolnih podganah, ki so za isto časovno obdobje razširile dostop do prehrane kafeterije, niti pri podpornih podganah, ki so imele dostop samo za zajtrk Glavna razlika med podrtimi podganami s predhodnim razširjenim dostopom in drugimi skupinami je bila njihova vztrajno povišana praga BSR. To bi lahko odražalo skupne nevrobiološke izvore nagradne hipofunkcije in pojav kompulzivnega prehranjevanja, ki sta časovno sovpadajoča, vendar neodvisna pojava. Alternativno lahko hipofunkcija nagrajevanja, ki jo povzroča dieta, služi kot substrat za negativno okrepitev, ki olajša razvoj kompulzivno jesti14, 32, 33. Ne glede na osnovne mehanizme, naše ugotovitve kažejo, da se pri debelih podganah lahko pojavi prisilno odzivanje na okusno hrano, ki je podobno odvisnosti, in kažejo, da primanjkljaji strijatalnega signala D2R povečajo ranljivost za razvoj tega vedenja.

Če povzamemo, smo ugotovili, da prekomerna stimulacija sistemov nagrajevanja možganov s prekomernim uživanjem prijetne, energijsko goste hrane povzroči globoko stanje nagradne hiposenzibilnosti in razvoj nagajivega prehranjevanja. Ti neustrezni vedenjski odzivi pri debelih podganah verjetno izhajajo iz prehransko pomanjkljivih progastih D2R signalov. Prekomerno uživanje drog, ki zlorabljajo droge, podobno zmanjšuje striatalno gostoto D2R, povzroči globoko stanje nagradne hipofunkcije in sproži nastanek kompulzivnega vedenja drog. Naše ugotovitve zato podpirajo prejšnje delo4, 19, 42, 45, 46, 47, kar kaže na to, da lahko debelost in odvisnost od drog izhajata iz podobnih nevroadaptivnih odzivov v nagradnih sklopih možganov.

Metode

Podgane.

Moške podgane Wistar, ki so na začetku poskusov tehtale 300 – 350 g, so bile pridobljene iz reke Charles. Po prihodu so bile podgane nameščene posamično pri konstantni temperaturi v ciklu 12-h svetlo-temno (prižgejo se pri 2200 h). Podganam je bil ves čas poskusa dovoljen dostop do običajnega laboratorijskega pahljača in vode. Vse postopke je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Scripps Florida, podgane pa so bile obravnavane v skladu s smernicami Nacionalnih inštitutov za zdravje glede načel oskrbe živali.

Kirurški postopki.

Podgane, pripravljene z elektrodami, ki stimulirajo BSR, so bile najprej anestezirane z vdihavanjem 1 – 3% izoflurana v kisiku in nameščene v stereotaksični okvir (Kopf). Bipolarne BSR elektrode (dolžine 11 mm) so bile vgrajene v zadnjični bočni hipotalamus (anteroposteriorno, −0.5 mm od bregme; mediolateralno, ± 1.7 mm od srednje črte; dorsoventral, 8.3 mm od trajne; sekalna palica je bila nastavljena na 5 mm nad interuralno črto ) 47. Podgane, ki so prejemale injekcije virusa, so bile pripravljene tudi z dvostranskimi vodilnimi kanili (merilnik 23, dolžina 14 mm), nameščenimi nad striatom (anteroposteriorno, 2.8 mm od bregme; mediolateralno, ± 3.1 mm od srednje črte; dorsoventral, −2.4 mm od trajne) 48 in napolnjene s 14-mm slogi. Štiri vijake za lobanje iz nerjavečega jekla in zobni akril so držali elektrodo in kanile na mestu. Kirurško rano smo zdravili z lokalnim antibiotikom enkrat na 12 h za 5 d po operaciji. Podganam je bilo dovoljeno, da se 7 – 10 d okrevajo po operaciji, nato pa so bili usposobljeni v postopku praga BSR.

Postopek BSR.

Podgane so usposobili za odzivanje na BSR stimulacijo po postopku diskretnega preskusnega toka, podobnega tistemu, ki je opisan drugje10, 14. Na kratko, trenutni nivoji BSR so bili različni v izmenično padajočih in naraščajočih serijah v korakih 5-μA. V vsaki seji testiranja so bile predstavljene štiri izmenično padajoče / naraščajoče serije. Prag za vsako serijo je bil opredeljen kot vmesna točka med dvema zaporednima intenzivnostima toka, na katere so se podgane odzvale vsaj v treh od petih preskusov, in dvema zaporednima intenzivnostima trenutka, na katere podgane niso odgovorile v treh ali več od petih poskusov. Skupni prag seje je bil opredeljen kot srednja vrednost pragov za štiri posamezne serije. Vsaka preizkusna seja je trajala približno 30 min. Stabilni pragovi BSR so bili opredeljeni kot ≤10% nihanja pragov v zaporednih dneh 5, običajno določenih po 10 – 14 d treninga. Latenca odziva za vsako preskusno sejo je bila opredeljena kot srednja odzivnost odzivov vseh preskušanj, med katerimi je prišlo do pozitivnega odziva.

Viralna embalaža in dostava.

RNA s kratkimi lasmi je bila dostavljena in konstitutivno izražena z vektorskim sistemom pRNAT-U6.2 / Lenti (GenScript). Virusni delci so bili pripravljeni v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, celice HEK 293FT so bile okužene z vektorjem, ki je vseboval vložek shRNA (5′-GGATCCCGCGCAGCAGTCGAGCTTTCTTCAAGAGAGAAAGCTCGACTGCTGCGCTTTTTTCCAACTCGAG-3 ′) ali prazen vektor, plus ViraPower Packaging Mix (72) (hitro sredstvo za pakiranje) (24). Nato smo supernatant zbrali in koncentrirali z ultracentrifugiranjem (76,755 g, rotor Beckman Coulter SW 32 TI, 90 min, 4 ° C), titer virusa pa smo določili s sortiranjem celic, aktiviranim s fluorescenco, v skladu z navodili proizvajalca. Virus smo razdelili in ga shranili v svetlobno zaščitenih škatlah pri -80 ° C do uporabe.

Podgane s stabilnimi pragovi BSR so dobile dvostranske virusne injekcije na treh mestih v striatumu vsake možganske poloble (2 μl na injekcijo, 1 μl min – 1, 1 min med injekcijami, skupaj šest injekcij na podgana). Podganam je bilo dovoljeno vsaj okrevanje 2 – 3 d po intrastriatalnih injekcijah, preden se je ocenjevanje praga BSR nadaljevalo. Dnevna ocena praga BSR se je nadaljevala za 33 d po injiciranju virusa, da bi zagotovili največji propad D2R v strij, preden so podgane dopustile prehrano v kavarni. Med podganami s kontrolo Lenti in Lenti-D2Rsh med temi 33 d ni bilo razlik v pragu BSR (podatki niso prikazani).

Imunobloting.

Podgane so ubili približno 1 h po njihovem redno načrtovanem dostopu do prehrane v kavarni, možgani pa so bili hitro odstranjeni. Odseki možganov debeline ~ 1 – 2 mm so bili pripravljeni z uporabo koronalne matrike možganov (interval 1-mm rezine; Plastika ena) na ledenem bloku in odvzeti tkivni udarci hrbtnega striatuma (bregma: ~ 2.2 do –0.26 mm). Udarci tkiva iz strij so se hitro zbrali, hitro zamrznili in shranili pri –80 ° C do uporabe. Posamezni vzorci so bili odmrznjeni na ledu in enake količine progastega tkiva so združene na podlagi teže odvisne mediane razcepa dostopnih skupin (podgane 7 – 10 na bazen). Tkivo smo pred homogenizacijo resuspendirali v 500 μl ledeno hladnem puferju RIPA (Thermo Scientific), ki vsebuje natrijev ortovananada, zaviralce fosfataznega koktajla 1 in 2 (Sigma-Aldrich), levpeptin in pepstatin. Tkivni lizati so vreli 10 min v puferju za vzorce in jih naložili na 4% –20% ali 10% Tris-glicin SDS gele (Invitrogen). Beljakovine smo prenesli na nitrocelulozne membrane, blokirali 1 h pri ~ 23 – 25 ° C (5% nemastnega suhega mleka in 0.2% Tween-20 v PBS, pH 7.4) in inkubirali v primarnem protitelesu čez noč pri 4 ° C. Naslednja primarna protitelesa so bila razredčena v blokovski raztopini: mišji monoklonalni D2R (Santa Cruz, 1: 100) ali mišični monoklonalni β-aktinski (Santa Cruz, 1: 200). Po inkubaciji s hrenimi peroksidazno konjugiranimi protitelesi (Amersham, 1: 2,000) smo dodali hemiluminiscenčni ECL reagent. Zrela membransko povezana oblika D2DR (~ 70 kDa) 17, 49 je bila normalizirana na kontrolo nalaganja beljakovin (β-aktin; 43 kDa) in količinsko določena z denzitometrijo z uporabo programske opreme NIH Image J.

Imunokemijska analiza.

Podgane so anestezirale in transkardno perfulirale z 4% paraformaldehidom v PBS (pH 7.6). Možgani so bili odstranjeni, postfiksirani čez noč in shranjeni v saharozi (30% raztopina v PBS, pH 7.4) vsaj 72 h. Odseki zamrznjenega tkiva (debelina 30 μm) so bili zbrani iz mikrotoma in blokirani (3% BSA, 5% normalnega kozjega seruma in 0.3% Triton X-100 v PBS) za 1 h pri ~ 23 – 25 ° C. Naslednja primarna protitelesa so bila dodana v blokovsko raztopino in inkubirana čez noč pri 4 ° C: piščančja poliklonalna do GFP (Abcam, 1: 1,000); zajec monoklonalno do GFAP (Millipore, 1: 1,000); mišje monoklonsko do NeuN (Millipore, 1: 1,000). Odseke smo inkubirali s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s fluorescentnim barvilom, na ~ 23 – 25 ° C: barvilo proti piščancu – 488-nm (Jackson ImmunoResearch, 1: 1,000), barvilo proti zajcu – 594-nm (Invitrogen, 1: ) in barvilo anti-mouse – 1,000-nm (Invitrogen, 594: 1). Programi so bili nameščeni z nosilci za pritrditev Vectashielda, ki vsebujejo DAPI (Vector Labs) in pokriti. Slike so bile posnete s fluorescenčnim mikroskopom Olympus BX1000 (× cilj 61) ali Olympusovim konfokalnim mikroskopom (× ciljev 2 in × 10).

Postopek hranjenja.

Podgane so bile posamično nameščene na papirnati posteljnini (alfa blazinice; Shepherd Specialty Papers), da preprečimo, da bi se živilski izdelki umazali z ohlapnimi posteljnimi materiali. Prehrana v kavarni je bila sestavljena iz slanine, klobas, sira, kolača za peko, zmrzovanja in čokolade, ki so jih individualno stehtali, preden so jih dali na voljo podganam. Živilski izdelki iz prehrane v kavarni so bili dostavljeni v majhnih kovinskih posodah. Po hranjenju so bili vsi živilski proizvodi, vključno s standardno laboratorijsko kravjo, ponovno stehtani. Kalorični vnos iz različnih makronutrientov je bil izračunan s pomočjo hranilnih informacij, ki jih je navedel proizvajalec.

Cue-inducirano zatiranje hranjenja.

Postopki hranjenja so potekali v zvočno oslabljenih operantnih komorah, ki so bile po velikosti enake tistim, uporabljenim v poskusih BSR. Podgane so namestili v operantno komoro in so imeli 30 minut dostop do kavarne ali prehrane. Živila so bila dostavljena v majhnih kovinskih posodah. Vsi živilski predmeti so bili stehtani pred in po hranjenju, ki so se izvajale v običajnem obdobju hranjenja podgan. Poraba čaja je bila ocenjena z uživanjem 45 mg peletov, ki so po svoji sestavi enaki kot čaj v domačih kletkah podgan. Nato je bil podganam dovoljen 30-minutni dostop na dan do prehrane v kavarni, dokler ni bil dosežen stabilen vnos (opredeljen kot <10% razlike v dnevnem vnosu), kar je zahtevalo 5-7 dni. Po stabilizaciji vnosa okusne hrane v tem izhodiščnem obdobju so bile podgane v vsakem stanju dostopa razdeljene v dve skupini: kaznovani (tisti, ki so bili podvrženi nožnemu šoku) in nekaznovani (niso prejeli nožnega šoka). Nato so bile podgane štiri zaporedne dneve kondicioniranja v isti operacijski komori, v kateri so prej imeli dostop do okusne hrane. Med 30-minutnimi kondicijskimi sejami se je 10 minut aktivirala signalna lučka (pogojeni dražljaj), ugasnila 10 minut in nato ponovno vklopila 10 minut. Kaznovane podgane so prebolele nogo samo med predstavitvijo iztočne luči (0.5 mA za 1.0 s; 10 stimulacij v ~ 1-minutnih intervalih). Nekaznovanim podganam so na enak način predstavili iztočnico, vendar brez nožnega šoka. Na testni dan, dan po zadnji kondicijski seji, so podgane v kaznovanih skupinah prejemale občasni šok z nogami (skupaj pet stimulacij) v paru z aktivacijo lučke iztočnice za 5 minut. Nekaznovane podgane so bile v odsotnosti udarca stopal spet izpostavljene svetlobi. Po 5-minutnem obdobju kaznovanja je bil vsem podganam dovoljen dostop do okusne hrane za 30-minutno sejo s kondicioniranim dražljajem, ki se je občasno aktiviral (10 minut prižgane lučke, 10 minut izklopljene luči, 10 minut prižgane lučke).

Statistične analize.

Osnovni pragi za nagrado so bili opredeljeni kot povprečna vrednost praga za 5 d pred dostopom do prehrane kavarne za vsako osebo. Pragovi za nagrado so bili izraženi kot odstotek spremembe od osnovne vrednosti praga. Podatki o odstotnih vrednostih mejnih vrednosti za nagrado, povečanje telesne mase, poraba kalorij in poraba kalorij iz maščobe so bili analizirani z dvofaktorno, večkratno analizo variance, z dostopom (samo čebulo, omejen dostop ali razširjen dostop), virom kalorij ( standardna prehrana z jedmi ali kafeterijami), virus (nadzor Lenti ali Lenti-D2Rsh) in iztočnica (združena ali neporažena s kaznijo) kot dejavniki med subjekti in čas kot dejavnik znotraj subjektov. Po potrebi so glavne učinke v analizah variance nadalje analizirali Bonferroni post hoc testi. Vse statistične analize so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism.

Reference

Reference

Korespondenca z:

· Paul J Kenny ([e-pošta zaščitena])